abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil SL6ncMcPkBrzjCpJjbJTzBx 00002 S0066-782X2008001700002 S0066-782X(08)09100502 10.1590/S0066-782X2008001700002 Artigos Originais O polimorfismo VNTR no gene codificador do antagonista do receptor da interleucina-1 está associado com a doença arterial coronariana Arman Ahmet Soylu Ozer Yildirim Ahmet Furman Andrzej Ercelen Nesrin Aydogan Hakki Coker Ajda Tezel Tuna Istambul Universidade Marmara Faculdade de Engenharia Departamento de Cardiologia Turquia 11 2008 91 5 293 298 14 02 2008 24 01 2008 28 08 2007 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: A Doença Arterial Coronariana (DAC) é a aterosclerose das artérias coronárias que transportam o sangue para o coração. A aterosclerose é uma doença inflamatória. As variações gênicas das citocinas - como as associadas à família IL1 - fazem parte da patogênese da aterosclerose. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi determinar a relação entre os polimorfismos da família IL1 (VNTR do IL1RN, posições -511 e +3953 do IL1B) e a DAC na população turca. MÉTODOS: Um total de 427 indivíduos foram submetidos à angiografia coronariana e em seguida divididos da seguinte forma: 170 no grupo controle e 257 no grupo de pacientes com DAC. Os sujeitos com DAC foram divididos em dois subgrupos: 91 no grupo de Doença Coronariana em um único vaso (Single Vessel Disease - SVD) e 166 no grupo Doença Coronariana em múltiplos vasos (Multiple Vessel Disease - MVD). Os genótipos de IL1RN e IL1B (-511, +3953) foram determinados por reação em cadeia da polimerase (RCP), seguida de análise da digestão por enzima de restrição. RESULTADOS: Não foram observadas diferenças significantes nas distribuições de genótipos de IL1RN e IL1B (-511 e +3953) entre os sujeitos com DAC e os controles, ou entre sujeitos com MVD e controles. No entanto, observou-se uma relação significante no genótipo IL1RN 2/2 entre sujeitos portadores de SVD e controles (P= 0,016, x2: 10,289, OR: 2,94IC 95% 1,183 - 7,229). Tampouco foi observada diferença estatisticamente significante nas freqüências dos alelos de IL1RN e IL1B (-511 e +3953) entre os sujeitos com DAC e controles, os sujeitos com MVD e controles, ou ainda os sujeitos SVD e controles. CONCLUSÃO: Não foi observada nenhuma relação na freqüência alélica e nem na distribuição genotípica dos polimorfismos de IL1RN e IL1B entre sujeitos com DAC e grupos controle. No entanto, o genótipo IL1RN 2/2 pode representar um fator de risco para sujeitos com SVD na população turca.

 Interleucina 1 repetições mini-satélites aterosclerose coronariana população Turquia 05 01 2009

ARTIGO ORIGINAL

BIOLOGIA MOLECULAR

O polimorfismo VNTR no gene codificador do antagonista do receptor da interleucina-1 está associado com a doença arterial coronariana

Ahmet Arman; Ozer Soylu; Ahmet Yildirim; Andrzej Furman; Nesrin Ercelen; Hakki Aydogan; Ajda Coker; Tuna Tezel

Departamento de Cardiologia da Faculdade de Engenharia da Universidade Marmara, Hospital Dr. Siyami Ersek; Instituto de Ciências Ambientais, Universidade Bogazici; Departamento de Genética Médica, Hospital Americano; Departamento de Biologia, Artes e Ciências da Universidade Marmara, Istambul, Turquia

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: A Doença Arterial Coronariana (DAC) é a aterosclerose das artérias coronárias que transportam o sangue para o coração. A aterosclerose é uma doença inflamatória. As variações gênicas das citocinas – como as associadas à família IL1 – fazem parte da patogênese da aterosclerose.

OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi determinar a relação entre os polimorfismos da família IL1 (VNTR do IL1RN, posições -511 e +3953 do IL1B) e a DAC na população turca.

MÉTODOS: Um total de 427 indivíduos foram submetidos à angiografia coronariana e em seguida divididos da seguinte forma: 170 no grupo controle e 257 no grupo de pacientes com DAC. Os sujeitos com DAC foram divididos em dois subgrupos: 91 no grupo de Doença Coronariana em um único vaso (Single Vessel Disease - SVD) e 166 no grupo Doença Coronariana em múltiplos vasos (Multiple Vessel Disease - MVD). Os genótipos de IL1RN e IL1B (-511, +3953) foram determinados por reação em cadeia da polimerase (RCP), seguida de análise da digestão por enzima de restrição.

RESULTADOS: Não foram observadas diferenças significantes nas distribuições de genótipos de IL1RN e IL1B (-511 e +3953) entre os sujeitos com DAC e os controles, ou entre sujeitos com MVD e controles. No entanto, observou-se uma relação significante no genótipo IL1RN 2/2 entre sujeitos portadores de SVD e controles (P= 0,016, x2: 10,289, OR: 2,94IC 95% 1,183 - 7,229). Tampouco foi observada diferença estatisticamente significante nas freqüências dos alelos de IL1RN e IL1B (-511 e +3953) entre os sujeitos com DAC e controles, os sujeitos com MVD e controles, ou ainda os sujeitos SVD e controles.

CONCLUSÃO: Não foi observada nenhuma relação na freqüência alélica e nem na distribuição genotípica dos polimorfismos de IL1RN e IL1B entre sujeitos com DAC e grupos controle. No entanto, o genótipo IL1RN 2/2 pode representar um fator de risco para sujeitos com SVD na população turca.

Palavras-chave: Interleucina 1, repetições mini-satélites, aterosclerose coronariana, população, Turquia / epidemiologia.

Introdução

A aterosclerose é uma doença inflamatória que afeta as artérias grandes ou médias e causa gangrena, acidente vascular cerebral e doença coronariana. A doença arterial coronariana (DAC) é uma doença cardíaca causada pela aterosclerose das artérias coronárias1. Fatores como crescimento e coagulação, citocinas, moléculas de adesão e seus efeitos nas células endoteliais (CE) e células de músculos lisos (SMC- Smooth Muscle Cells) foram estudados para maior compreensão dos processos da aterosclerose2. A inflamação das paredes da artéria desencadeia a produção de citocinas pró-inflamatórias primárias como a Interleucina-1β (IL-1β), o Fator de Necrose Tumoral α (TNFα), que pode induzir a citocina pró-inflamatória secundária (IL-6), a quimiocina (IL-8) e a produção da molécula de adesão (E-selectina)3.

A família IL-1 tem três membros muito bem estudados, dois agonistas - IL-1α e IL-1β - e o antagonista IL-1Ra. A IL-1Ra inibe a ação inflamatória induzida pela IL-1 ao bloquear a ligação de IL-1 ao receptor tipo I da IL-1 (IL-1RI)4. IL-1Ra se expressa pelo gene IL1RN, que apresenta uma variação de comprimento dentro do intron 25 causada por número variável de repetições em tandem (Variable Number of Tandem Repeats - VNTR) com 86 pares de bases (bp).6 De acordo com o número de repetições de 86 bp há seis alelos correspondentes às repetições 1, 2, 3, 4, 5, 66-7. Os polimorfismos de nucleotídio único (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) foram determinados na posição promotora -511 C/T8 e no exon 5 na posição +3953 C/T do gene IL1B9. Considera-se que estes polimorfismos dos genes IL1RN e IL1B exerçam influência sobre a expressão gênica8-9.

Há vários relatos demonstrando a relação entre VNTR e SNPs nos genes da família IL1 e as doenças. Foi demonstrado que o genótipo 2/2 da IL1RN é significantemente associado com a doença coronariana em um único vaso (SVD) na população de Sheffield, na Inglaterra10. Foi observada grande importância entre o alelo 2 do IL1RN e a DAC em pacientes com diabetes tipo 211. O alelo 2 do IL1RN tem também um efeito protetor sobre a reestenose após angioplastia transluminal percutânea coronariana (PTCA)12. Porém, nenhuma relação foi demonstrada entre os SNPs da IL1B e a DAC10,13.

O objetivo deste estudo foi investigar a existência de relação entre polimorfismos nos genes IL1RN (VNTR) e IL1B (-511, +3953) e DAC na Turquia. Nossos resultados demonstraram que nem a distribuição genotípica dos SNP de IL1B (+3953) e nem de IL1B (-511), assim como a freqüência de seus alelos, são suscetíveis à DAC. Porém, os portadores do genótipo IL1RN 2/2 podem ser suscetíveis à SVD na população turca.

Métodos

Sujeitos

A população do estudo foi selecionada entre pacientes que se submeteram à angiografia coronariana no Hospital Dr. Siyami Ersek entre 2003 e 2006. As indicações para arteriografia coronariana em nossa clínica seguem as indicações para angiografia coronariana14. De acordo com os resultados da angiografia coronariana,12,15 os participantes que apresentassem estenose > 70 % em pelo menos uma das grandes artérias coronárias eram considerados pacientes com DAC (n= 257); os demais que apresentassem estenose < 30 % seriam aceitos como grupo normal (n= 170). O grupo DAC foi dividido em dois subgrupos: Doença coronariana em vaso único (SVD - n= 91) e Doença coronariana em múltiplos vasos (MVD - n= 166).

Avaliação do fator de risco

Dados sobre idade, sexo, história familiar de DAC, tabagismo, e história de hipertensão foram obtidos pelo preenchimento de um questionário. Peso, altura, pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD) foram medidos. O índice de massa corpórea (IMC) foi calculado pelas medidas de peso e altura. A presença de Diabetes Melito (DM) foi definida por níveis glicêmicos repetidos em jejum > 126 mg/dl, pelo uso de medicação antidiabetes ou ambos. Os níveis de colesterol total (TC), lipoproteínas de alta densidade (HDL) e lipoproteínas de baixa densidade (LDL) foram determinados por métodos enzimáticos, e também medidos por métodos enzimáticos após precipitação com sulfato de dextrano16. Todos os pacientes–inclusive o grupo controle – foram informados sobre o estudo, e todos assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

Genotipagem

Amostras de sangue foram colhidas de 427 participantes e mantidas em tubos com EDTA. O isolamento genômico de DNA foi feito usando-se o kit GENTRA DNA. Amplificamos a região VNTR no íntron 2 do gene IL1RN, do IL1B (-511) e do IL1B (nas regiões +3953 do exon 5 conforme descrito anteriormente)17. Os genótipos do gene IL1RN foram determinados pelo tamanho das unidades de repetição dos produtos da PCR. O genótipo de IL1B (-511) foi determinado com base no tamanho dos produtos de digestão da PCR com Aval, e o genótipo de IL1B (+3953) nos produtos de digestão com Taq I.

Análise estatística

Os testes x2 e U de Mann-Whitney foram utilizados para a comparação de dois grupos de sujeitos segundo os fatores de risco para DAC. As freqüências dos alelos e dos genótipos entre casos e controles foram comparadas pelo modelo de Hardy-Weinberg usando a análise x2. A análise de regressão logística multivariada foi utilizada para a avaliação da distribuição dos genótipos de IL1RN e IL1B nos grupos controle e de casos. Os resultados foram expressos por OR (odds ratio) e intervalo de confiança (IC) 95%. O modelo final foi ajustado para idade, sexo, história familiar de DAC, tabagismo e história de hipertensão. As freqüências dos alelos e a distribuição dos genótipos entre os casos e os controles foram comparadas e os valores calculados pelo teste x2. A probabilidade para valores de p<0,05 (bicaudal) foi considerada estatisticamente significante. O software SPSS 11.5 foi utilizado para a análise estatística.

Aprovação pelo comitê de ética

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética da Universidade de Marmara na Turquia, e preserva todos os direitos dos participantes. Todas as aprovações foram emitidas pelo Comitê de Ética.

Resultados

As características de referência para os grupos controle e DAC estão demonstrados na Tabela I. Diferenças significantes entre DAC e controles com relação a sexo (P= <0,001), história familiar de DAC (P= 0,014), Diabetes (P<0,001), história de hipertensão (P= <0,001) e tabagismo (P= <0,001) estão demonstradas na Tabela 1.

A distribuição genotípica e a freqüência dos alelos de VNTR do IL1RN estão demonstrados na Tabela 2. Dos seis genótipos no gene de IL1RN quatro foram observados nos sujeitos com DAC e nos sujeitos controle. Entre estes genótipos, apenas IL1RN 2/2 apresentou diferença significante entre os sujeitos com SVC e os sadios (P= 0,016, x2: 10,289, 3 GL, OR: 2,94IC 95% 1,183-7.229). No entanto, nenhuma diferença estatisticamente significante foi observada entre os dois controles e DAC (P= 0,262) e entre MVD e controles (P= 0,257). A distribuição genotípica entre SVD e MVD também se mostrou estatisticamente significante (P= 0,003, x2: 13,806, 3 GL, OR: 5,22IC 95% 1,995-14,195). Nenhuma relação foi identificada entre controles e casos para as freqüências alélicas de IL1RN: DAC (P= 0,211), MVD (P= 0,247), SVD (P= 0,423); (Tabela 2).

A distribuição genotípica e a freqüência dos alelos de IL1B (-511) nos grupos DAC, SVD, MVD e controle estão demonstradas na Tabela 3. O genótipo de IL1B -511 não demonstrou diferença significante entre os grupos DAC e controle (P= 0,242), SVD e controle (P= 0,712) e MVD e controle (P= 0,142). Da mesma forma, não foram observadas diferenças significantes na distribuição alélica entre os controles e DAC (P= 0,442), SVD (P= 0,098), e MVD (P= 0,142) (Tabela 3).

A distribuição dos genótipos e a freqüência de alelos de IL1B +3953 nos grupos DAC, SVD, MVD e controle estão demonstradas na Tabela 4. Quando o genótipo de IL1B +3953 foi comparado entre os grupos, não se observou diferença significante entre os grupos controle e DAC (P= 0,629), SVD (P= 0,907) e MVD (P= 0,472). Da mesma forma, não foram observadas diferenças significantes na distribuição de alelos entre os controles e DAC (P= 0,569), SVD (P= 0,750), e MVD (P= 0,591) (Tabela 4).

Observou-se que a homozigose para o alelo IL1RN 2 é significante entre SVD e grupos controle (x2: 7,510, P= 0,010, OR: 3,253, IC 95%: 1,349-7,844). Esta associação, no entanto, não é identificada em heterozigotos para o alelo IL1RN 2 (P=0,757). (Tabela 5). Uma associação significante foi ainda encontrada em homozigotos para o alelo IL1RN 2 entre os grupos MVD e SVD (x2: 7,160, P= 0,011, OR: 2,838, IC 95%: 1,278-6,299); (Tabela 5). Além disso, o efeito relativo do polimorfismo da família IL1 sobre o risco de DAC não pôde ser observado em modelo de regressão logística múltipla incluindo os efeitos dominantes, recessivos e co-dominantes (Tabela 6).

Discussão

A DAC é a maior causa de mortalidade e morbidade nos Estados Unidos, nos países europeus, e também na Turquia18. A etiologia e os processos de desenvolvimento da DAC não são bem conhecidos; porém, já está demonstrado que tanto os processos inflamatórios quando a genética desempenham um papel importante na patogênese da aterosclerose2. Muitos estudos epidemiológicos já investigaram a associação entre DAC e os polimorfismos de genes de citocinas inflamatórias19. Uma das citocinas pró-inflamatórias candidatas associadas à susceptibilidade de DAC é a IL-1β, que afeta a maioria das células e está envolvida em casos de imunidade, sepse, infecção e inflamação. Opostamente, a IL-1Ra age como um agente anti-inflamatório que inibe a ação de IL-120.

Francis e cols.10 identificaram a associação entre o genótipo IL-1RN 2/2 e SVD na população caucasiana de Sheffield, no Reino Unido, mas não na população londrina. Nenhuma diferença significante foi observada para MVD em nenhum dos grupos populacionais10. Outros relatos tampouco encontraram significância estatística entre o alelo IL1RN 2 e SVD ou entre o alelo IL1RN 2 e CAD21,13. Além disso, foi relatado anteriormente que o alelo IL1RN 2 mantém associação significante com DAC em pacientes com diabete do tipo 211. O alelo IL1RN 2 tem, ainda, um efeito protetor sobre a reestenose após PTCA12 e há relatos da associação entre a presença de IL1RN 2 e aterosclerose da carótida22. Foi também relatado que o risco de futuro infarto de miocárdio aumentou com o alelo IL1RN 2 e altos níveis de PCR em pacientes jovens23. Em nosso estudo, observamos uma associação entre SVD e o genótipo IL1RN 2/2 (P= 0,016, OR: 2,94IC 95% 1,183-7,229); porém, nenhuma associação estatística entre os alelos IL1RN e DAC (P= 0,211) ou MVD (P= 0,247) ou SVD (P=0,423). Além disso, a análise da distribuição genotípica indicou que os homozigotos portadores de IL1RN2 apresentavam diferenças estatisticamente significantes entre os grupos SVD e controle (x2: 7,510, P= 0,010, OR: 3,253, IC 95%: 1,349-7,844). Indivíduos homozigotos para o alelo IL1RN 2 têm probabilidade 3,25 vezes maior para apresentar SVD do que indivíduos portadores dos outros genótipos. No entanto, a heterozigose para IL1RN 2 não demonstrou a mesma associação (P=0,757). Os homozigotos para IL1RN 2 demonstraram diferença significante entre os grupos MVD e SVD (x2: 7,160, P= 0,011, OR: 2,838, IC 95%: 1,278-6,299). Indivíduos com alelo IL1RN 2 em homozigose têm probabilidade 2,83 vezes maior para SVD do que para MVD. No entanto, a heterozigose na expressão de IL1RN 2 não demonstrou a mesma associação (P=0,234; Tabela 5). Além disso, não encontramos nenhuma influência estatisticamente significante nos polimorfismos da família IL1 (efeitos dominantes, recessivos e co-dominantes) sobre o risco para DAC (Tabela 6). Muito embora os polimorfismos da família IL1 não tenham demonstrado efeito direto com relação à DAC, podem modular alguns dos processos para o desenvolvimento da DAC.

Parece haver um equilíbrio entre a IL-1 e a proteína IL-1Ra, exceto no caso de doenças autoimunes24. Os resultados referentes à função do alelo IL1RN 2 na expressão de IL-1Ra são controversos. Já foi relatado que o alelo IL1RN 2 está associado a níveis aumentados de IL-1Ra in vitro,25-27, a níveis reduzidos na colite ulcerativa, mas a níveis semelhantes para doenças intestinais inflamatórias em pacientes sul-africanos28. Estes resultados implicam que o papel do polimorfismo de IL1RN 2 ao afetar a expressão da proteína IL-1Ra depende do tipo de célula e da origem étnica.

Foi sugerido anteriormente que a IL-1β pode desempenhar um papel importante na patogênese da aterosclerose pelo estímulo das células do músculo liso vascular. Foram também detectados níveis aumentados de mRNA para IL-1β em placas ateroscleróticas29. Os polimorfismos na expressão do gene IL-1B podem afetar a gravidade ou a susceptibilidade a diferentes doenças. Foram demonstrados dois importantes SNPs no gene IL1B: uma substituição C>T na posição –511 da região promotora e uma substituição C>T no exon 5 na posição +3953 8,9.

Resultados controversos e diferentes foram relatados para os efeitos do polimorfismo de IL1B (-511) sobre a produção de IL-1Ra e de IL-1β:indivíduos com alelo 2 de IL1B (-511) apresentam níveis mais altos de IL-1Ra26. A produção de IL-1β induzida por LPS apresentou-se aumentada de 2 a 3 vezes por um alelo T na posição -51130. Não se observou relação significante entre os alelos -511 de IL1B e DAC10,13. No entanto, Iacoviello e cols.31 indicaram que o genótipo de IL1B (-511) 1/1 (C/C) demonstrou estar associado ao IM em idade jovem31. Na mesma linha, Zhang e cols.32 relataram que o polimorfismo de IL1B (-511) se mostrou associado à severidade da doença coronariana na população chinesa32. No entanto, não detectamos nenhum risco de DAC relacionado ao polimorfismo de IL1B (-511) na população turca. Não foram observadas diferenças significantes nas freqüências dos alelos 1 e 2 ou dos genótipos 1/1 e 2/2 de IL1B (-511) entre os grupos SVD e controle ou MVD e controle ou DAC e controle (Tabela 3).

Outro polimorfismo na expressão do gene de IL1B está localizado na posição +3953 no exon 5. Considera-se que influencie a expressão de IL-1β. Resultados diferentes foram relatados sobre o efeito do alelo de IL1B (+3953) sobre a produção de proteína de IL-1β. Alguns estudos demonstraram associação entre IL1B (+3953) e níveis plasmáticos aumentados de IL-1β9,30. Outros, porém, não detectaram nenhum efeito sobre os níveis de IL-133-35. Não há estudos disponíveis sobre a relação entre a DAC e o polimorfismo do gene de IL1B (+3953). Tampouco se registrou relação entre a freqüência do alelo ou a distribuição do genótipo de IL1B (+3953) e DAC na população britânica10. A mesma ausência de relação entre DAC e o polimorfismo de IL1B (+3953) foi observada na população turca (Tabela 4).

O presente estudo demonstrou que homozigotos com o alelo 2 do gene IL-1RN podem estar sob fator de risco para SVD. Resultados controversos foram obtidos para a associação entre IL1RN 2 e DAC em estudos e locais diferentes, o que demonstra que a origem étnica e a localização geográfica desempenham um papel importante para que esta associação ocorra.

Agradecimentos

A presente pesquisa teve o apoio do Fundo de Pesquisa da Universidade Marmara e subvenção parcial do Hospital Americano na Turquia. Nossos agradecimentos ao Professor Philip E. Auron, do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Duquesne, pela revisão crítica do texto.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação Acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Correspondência:

Ahmet Arman

Department of Engineering, Marmara University, Goztepe Campus

34722, Istanbul,Turkey

E-mail:

aarman@eng.marmara.edu.tr

Artigo recebido em 28/08/07; revisado recebido em 24/01/08; aceito em 14/02/08

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IL- 1B and IL-1Ra gene polymorphisms and disease severity in rheumatoid arthritis: interaction with their plasma levels Genes Immun 2001 222 8 4 2 Buchs N di Giovine FS Silvestri T Vannier E Duff GW Miossec P Original Articles Interleukin-1 receptor antagonist gene VNTR polymorphism is associated with coronary artery disease

BACKGROUND: Coronary Artery Disease (CAD) is the atherosclerosis of coronary arteries that carry blood to the heart muscle. Atherosclerosis is an inflammatory disease. Cytokine gene variations such as those associated with the IL1 family are involved in the pathogenesis of atherosclerosis. OBJECTIVE: The purpose of this study was to determine the relationship between IL1 family polymorphisms (IL1RN VNTR, IL1B positions -511 and +3953) and CAD in Turkish population. METHODS: 427 individuals were submitted to coronary angiography and were grouped as 170 control subjects and 257 CAD patients. The CAD subjects were divided into two subgroups: 91 Single Vessel Disease (SVD) and 166 Multiple Vessel Disease (MVD) subjects. The genotypes of IL1RN and of IL1B (-511, +3953) were determined by polymerase chain reaction (PCR) followed by restriction digestion analysis. RESULTS: No significant difference was found in IL1RN and IL1B (-511 and +3953) genotype distributions between CAD and control subjects or MVD and control subjects. However, significant association was seen in IL1RN 2/2 genotype between SVD and control subjects (P= 0.016, x2: 10.289, OR: 2.94, 95% CI: 1.183-7.229). Similarly, no statistically significant difference was found in IL1RN and IL1B (-511 and +3953) allele frequencies between CAD and control subjects, MVD and control subjects or SVD and control subjects. CONCLUSION: No association was found in either allele frequency or genotype distribution of IL1RN and IL1B polymorphisms between CAD and the control groups. However; IL1RN 2/2 genotype may be a risk factor for SVD in the Turkish population.

 Interleukin 1 mini-satellite repeats coronary arteriosclerosis population Turkey

ORIGINAL ARTICLE

Interleukin-1 receptor antagonist gene VNTR polymorphism is associated with coronary artery disease

Ahmet Arman; Ozer Soylu; Ahmet Yildirim; Andrzej Furman; Nesrin Ercelen; Hakki Aydogan; Ajda Coker; Tuna Tezel

Departamento de Cardiologia da Faculdade de Engenharia da Universidade Marmara, Hospital Dr. Siyami Ersek; Instituto de Ciências Ambientais, Universidade Bogazici; Departamento de Genética Médica, Hospital Americano; Departamento de Biologia, Artes e Ciências da Universidade Marmara, Istambul, Turquia

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SUMMARY

BACKGROUND: Coronary Artery Disease (CAD) is the atherosclerosis of coronary arteries that carry blood to the heart muscle. Atherosclerosis is an inflammatory disease. Cytokine gene variations such as those associated with the IL1 family are involved in the pathogenesis of atherosclerosis.

OBJECTIVE: The purpose of this study was to determine the relationship between IL1 family polymorphisms (IL1RN VNTR, IL1B positions -511 and +3953) and CAD in Turkish population.

METHODS: 427 individuals were submitted to coronary angiography and were grouped as 170 control subjects and 257 CAD patients. The CAD subjects were divided into two subgroups: 91 Single Vessel Disease (SVD) and 166 Multiple Vessel Disease (MVD) subjects. The genotypes of IL1RN and of IL1B (-511, +3953) were determined by polymerase chain reaction (PCR) followed by restriction digestion analysis.

RESULTS: No significant difference was found in IL1RN and IL1B (-511 and +3953) genotype distributions between CAD and control subjects or MVD and control subjects. However, significant association was seen in IL1RN 2/2 genotype between SVD and control subjects (P= 0.016, x2: 10.289, OR: 2.94, 95% CI: 1.183-7.229). Similarly, no statistically significant difference was found in IL1RN and IL1B (-511 and +3953) allele frequencies between CAD and control subjects, MVD and control subjects or SVD and control subjects.

CONCLUSION: No association was found in either allele frequency or genotype distribution of IL1RN and IL1B polymorphisms between CAD and the control groups. However; IL1RN 2/2 genotype may be a risk factor for SVD in the Turkish population.

Key words: Interleukin 1; mini-satellite repeats; coronary arteriosclerosis; population; Turkey / epidemiology.

Introduction

Atherosclerosis is an inflammatory disease that affects medium or large arteries causing gangrene, stroke and heart diseases. Coronary Artery Disease (CAD) is a multifactorial heart disease caused by atherosclerosis of coronary arteries1. Growth and clotting factors, cytokines, adhesion molecules and their effects on vascular Endothelial Cells (EC) and Smooth Muscle Cells (SMC) were studied for insight into atherosclerotic processes2. Inflammation in the artery wall triggers the production of primary proinflammatory cytokines such as Interleukin-1β (IL-1β), Tissue Necrosis Factor α (TNFα) which can induce the secondary proinflammatory cytokine (IL-6), the chemokine (IL-8), and adhesion molecule (E-selectin) production3.

The IL-1 family has three well-studied members, two agonists, IL-1α and IL-1β, and the antagonist IL-1Ra. IL-1Ra inhibits IL-1-induced inflammation action by blocking the binding of IL-1 to IL-1 Type I Receptor (IL-1RI)4. IL-1Ra is expressing from IL1RN gene which has a length variation within intron 25 caused by 86 bp Variable Number of Tandem Repeats (VNTR)6. According to the number of 86 bp repeats, there are six alleles corresponding to 1, 2, 3, 4, 5, 6 repeats6-7. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been determined at promoter position -511 C/T8 and in exon 5 at position +3953 C/T of IL1B gene9. These polymorphisms in IL1RN and IL1B genes are thought to influence gene expression8-9.

There are various reports showing a relationship between VNTR and SNPs on the IL1 gene family and diseases. IL1RN genotype 2/2 has been found to be significantly associated with Single Vessel Disease (SVD) in Sheffield English population10. Significant relevance was found between IL1RN allele 2 and CAD with Type 2 diabetes11. Also IL1RN allele 2 has a protective effect on restenosis after Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty (PTCA)12. But no association was found between IL1B SNPs and CAD10,13.

The purpose of this study was to investigate whether polymorphisms in IL1RN (VNTR) and IL1B (-511, +3953) genes are associated with CAD in Turkey. Our results showed that neither IL1B (+3953) nor IL1B (-511) SNP genotype distributions and allele frequencies are susceptible to CAD, but people carrying IL1RN 2/2 genotype may be susceptible to SVD in the Turkish population.

Methods

Subjects

The study population was selected from patients undergoing coronary angiography at Dr. Siyami Ersek Hospital between 2003-2006. Indications for coronary arteriography in our clinic are based on guidelines for coronary angiography14. According to coronary angiography results12,15 participants who presented > 70 % stenoses in at least one of the major coronary arteries were considered as CAD (n= 257) and the remainders who presented < 30 % stenosis were accepted in the normal group (n= 170). CAD group was divided into two subgroups: SVD (only one coronary artery stenosis; n= 91) and Multiple Vessel Disease (MVD; more than one coronary artery stenosis; n= 166).

Risk factor assessment

Age, gender, family history of CAD, smoking habit, history of hypertension were obtained by filling a questionnaire form. Weight, height, Systolic (SBP) and Diastolic Blood Pressures (DBP) were measured. Body Mass Index (BMI) was calculated from height and weight measurements. The presence of Diabetes Mellitus (DM) was defined by repeated fasting glucose level > glucose 126 mg/dl, the use of antidiabetic drugs or both. Total Cholesterol (TC) and High Density Lipoprotein (HDL), Low Density Lipoprotein (LDL) cholesterol levels were determined enzymatically, and also measured enzymatically after dextrane sulfate magnesium precipitation16. Information about the study was given to all patients and control group, the informed consent was received from each of them.

Genotyping

Blood samples were taken from 427 participants and kept in tubes with EDTA. Genomic DNA isolation was done using GENTRA DNA isolation kit. We have amplified vntr region in intron 2 of IL1RN gene, IL1B (-511) and IL1B (+3953 exon 5 regions as described previously17. Genotypes of IL1RN gene were determined by repeating unit size of PCR products. IL1B (-511) genotype was done based on the size of digested PCR products with AvaI, and IL1B (+3953) genotype was determined based on the digested PCR products with Taq I.

Statistical analysis

Mann-Whitney U and x2 tests were used for the comparison of two groups of individuals according to CAD risk factors. Allele and genotype frequencies among cases and controls were compared with Hardy-Weinberg predictions using x2 –analysis. Multivariate logistic regression analysis was done to assess the distribution of IL1RN, IL1B genotypes in the control groups and cases. The results were expressed as odds ratio (OR) and 95% Confidence Interval (CI). The final model was adjusted for age, gender, family history of CAD, smoking habit, history of hypertension. Allele frequencies and genotype distribution among cases and controls were compared and values were calculated by x2 test. Probability for p<0.05 values (2-sided) were considered statistically significant. SPSS 11.5 software program was used for all statistical analysis.

Ethics approval

This research was approved by the ethics committee of Marmara University in Turkey. All human subjects' rights in this research are protected and any necessary approval was secured from the ethics committee.

Results

Baseline characteristics of control and CAD groups can be found in Table I. Significant difference between CAD and control subjects for gender (P= <0.001), family history of CAD (P= 0.014), Diabetes (P<0.001) History of Hypertension (P= <0.001) and current smoking (P= <0.001) can be found in Table 1.

Genotype distribution and allele frequency of IL1RN VNTR are shown in Table 2. Four of six genotypes at IL1RN gene were observed in CAD and control subjects. Among all these genotypes, only IL1RN 2/2 is significantly different between SVD and healthy controls (P= 0.016, x2: 10.289, 3 df, OR: 2.94, 95% CI: 1.183-7.229). However, no significant difference was found between both controls and CAD (P= 0.262) and MVD vs control subjects (P= 0.257). Also, the genotype distribution between SVD and MVD was found to be statistically significant (P= 0.003, x2: 13.806, 3 df, OR: 5.22, 95% CI: 1.995-14.195). For IL1RN allele frequencies, no association was detected between control and cases: CAD (P= 0.211), MVD (P= 0.247), SVD (P= 0.423) (Table 2).

Genotype distribution and allele frequency of IL1B (-511) in CAD, SVD, MVD and control groups are shown in Table 3. The IL1B -511 genotype showed no significant difference between CAD and controls (P= 0.242), SVD and control (P= 0.712) and MVD and control (P= 0.142). Similarly, no significant differences were observed in allelic distribution between controls and CAD (P= 0.442), SVD (P= 0.098), and MVD (P= 0.142) (Table 3).

The allelic frequency and genotype distribution of IL1B +3953 in CAD, SVD and MVD and control groups are shown in Table 4. When genotype distribution of IL1B +3953 was compared among groups, no significant difference was observed between control groups and CAD (P= 0.629), SVD (P= 0.907), and MVD (P= 0.472). Also, no significant difference was observed in allelic distribution between controls and CAD (P= 0.569), SVD (P= 0.750) and MVD (P= 0.591) (Table 4).

Genotypes are expressed as number of patients (proportion in % within brackets), p values are from chi square test.

Homozygosity for IL1RN 2 allele was found significant between SVD and control groups (x2: 7.510, P= 0.010, OR: 3.253, % 95 CI: 1.349-7.844), However, this association can not be seen in heterozygosity for IL1RN 2 allele (P=0.757) (Table 5). Also, significant association was found in homozygosity for IL1RN 2 allele between MVD and SVD groups (x2: 7.160, P= 0.011, OR: 2.838, % 95 CI: 1.278-6.299); (Table 5). Additionally, the relative effect of the IL1 family polymorphism on the risk of CAD was not seen in a multiple logistic regression model including dominant, recessive and co-dominant effects (Table 6).

Discussion

CAD is the major cause of mortality and morbidity in the United States, European countries and also in Turkey18. The etiology and development processes of CAD are not well understood, but it has been shown that both inflammation and genetics play an important role in the pathogenesis of atherosclerosis2. Many epidemiological studies have investigated the association between CAD and inflammatory cytokine gene polymorphisms19. One of the candidate proinflammatory cytokines associated with CAD susceptibility is IL-1β, which affects the majority of cells and is involved in immunity, sepsis, infection and inflammation. In contrast, IL-1Ra acts as an anti-inflammatory agent that inhibits the action of IL-120.

Francis et al10 found the association between IL-1RN 2/2 genotype and SVD in the UK Caucasian Sheffield population, but not in the London population. Also, no significant difference was found for MVD in either population group10. Other reports did not find any statistical significance between IL1RN 2 allele and SVD or IL1RN 2 allele and CAD21,13. Furthermore, it has been reported that IL1RN 2 allele is significantly associated with CAD in the Type 2 diabetes patients11. Also, IL1RN 2 allele has a protective effect on restenosis after PTCA12 and an association between IL1RN 2 and carotid atherosclerosis was reported22. It was also reported that future Myocardial Infarction risk was increased with IL1RN 2 allele and high CRP levels in young patients23. In this study, we found an association between SVD and IL1RN 2/2 genotype (P= 0.016, OR: 2.94, 95% CI: 1.183-7.229), but no statistical association between IL1RN alleles and CAD (P= 0.211) or MVD (P= 0.247) or SVD (P=0.423). In addition, Genotype distribution analysis indicated that homozygous IL1RN 2 carrier was significantly different between SVD and control groups (x2: 7.510, P= 0.010, OR: 3.253, % 95 CI: 1.349-7.844). People with homozygous IL1RN allele 2 are 3.25 times more likely to have had SVD than people carrying the other genotypes. However, heterozygosity for IL1RN 2 carrier did not show this association (P=0.757). Also homozygous IL1RN 2 carrier was significantly different between MVD and SVD groups (x2: 7.160, P= 0.011, OR: 2.838, % 95 CI: 1.278-6.299). People carrying homozygous IL1RN allele 2 are 2.83 times more likely to have SVD than MVD. However, heterozygosity for IL1RN 2 carrier did not show that association (P=0.234; Table 5). Futhermore, we could not find any statistically significant influence of IL1 family polymorphisms (dominant, recessive and co-dominant effects) on the risk of CAD (Table 6). Even though IL1 family polymorphisms did not show any direct relative effect on risks of CAD, those polymorphisms may modulate some of processes for the development of CAD.

There appears to be a balance between IL-1 and IL-1Ra protein, except in the case of autoimmune diseases24. There are controversial results for the function of IL1RN 2 allele in IL-1Ra expression. It has been reported that IL1RN 2 allele is associated with increased IL-1Ra levels in vitro25-27, decreased levels in Ulcerative colitis27 but at similar levels for South African patients with inflammatory bowel disease28. The results above imply that IL1RN 2 polymorphism function in affecting IL-1Ra protein expression depends on cell type and ethnic origin.

It has been suggested that IL-1β may play an important role in the pathogenesis of atherosclerosis by the stimulation of vascular SMC. Also, increased levels of IL-1β mRNA was detected in atherosclerotic plaques29. The polymorphisms in IL-1B gene can affect severity or susceptibility to different diseases. Two important SNPs at -511 C/T in the promoter and +3953 C/T in exon 5 of IL1B gene are shown respectively8,9.

Different controversial results have been reported for the effect of IL1B (-511) polymorphism on the production of IL-1Ra and IL-1β. It has been reported that individuals who have IL1B (-511) allele 2 show higher levels of IL-1Ra26. LPS-induced IL-1β production was increased 2-3 fold by a T allele at -511 position30. No significant relationship between -511 alleles of IL1B and CAD has been determined10,13. However, Iacoviello et al31 indicated that the IL1B (-511) 1/1 (C/C) genotype was associated with MI at young age31. Similarly, Zhang et al32 reported that IL1B (-511) polymorphism was associated to the severity of coronary heart disease in the Chinese population32. However, we did not find any risk for CAD related to IL1B (-511) polymorphism in the Turkish population. No significant differences were found in the frequencies of allele 1 and 2 or the genotypes of 1/1 and 2/2 of IL1B (-511) between SVD and control or MVD and control or CAD and control groups (Table 3).

Another polymorphism in the IL1B gene is located at position +3953 in exon 5 and thought to influence IL-1β expression. Different results were reported on the effect of IL1B (+3953) allele on IL-1β protein production. Some studies showed that an association was seen between IL1B (+3953) and increased plasma levels of IL-1β9,30, but others found no affect on IL-1 levels33-35. No studies are available on the relationship between CAD and polymorphism in the IL1B gene (+3953). No association was seen between either IL1B (+3953) allele frequency or genotype distribution and CAD in the British population10. Similarly, no relationship was found between CAD and IL1B (+3953) polymorphism in the Turkish population (Table 4).

The present study has shown that the homozygote carrier of IL-1RN allele 2 may be a risk factor for SVD. Controversial results were obtained for the association between IL1RN 2 and CAD from the different studies and different locations. This showed that ethnic background and different geographical locations play an important role for that association.

Acknowledgement

This research was supported by the FEN-YLS-100105-0068 grant by Marmara University Research Fund and by a partial grant from American Hospital in Turkey. Professor Philip E. Auron, Duquesne University Department of Biological Sciences, are acknowledged for their critical review of the manuscript.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This study is not associated with any graduation program.

References