FUNDAMENTO: A hipertensão arterial é uma desordem caracterizada por alterações relevantes no tecido ósseo. O alendronato sódico tem indicação no tratamento de doenças ósseas, por causa de sua afinidade pela hidroxiapatita, inibindo as reabsorções ósseas. OBJETIVO: Analisar a ação local do alendronato sódico na reparação óssea de ratos espontaneamente hipertensos (SHR). MÉTODOS: Um defeito ósseo foi criado no fêmur esquerdo de 80 ratos. De acordo com o material utilizado no local, criaram-se quatro grupos: controle (C), amido (Am), alendronato 1 mol (A1) e alendronato 2 mol (A2). Após 7 e 21 dias, os animais foram sacrificados. Foram realizadas análises histológicas e histomorfométricas e os dados foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey (5%). RESULTADOS: Aos 7 dias, observou-se, na área do defeito, tecido conjuntivo com hemorragia e inflamação em todos os grupos. Alguns apresentavam matriz osteóide. Os grupos A1 e A2 apresentaram, ainda, uma rede de fibrina. Aos 21 dias, as trabéculas ósseas fechavam praticamente a extensão do defeito nos grupos C e Am. No grupo A1 de animais machos, observaram-se trabéculas que se irradiavam do canal medular até a área do defeito. Nos grupos A1 e A2, constatou-se apenas a presença de tecido conjuntivo com mínima deposição de osteóide. Um achado histológico marcante foi a formação de tecido ósseo extracortical subperiosteal nos animais dos grupos A1 e A2. CONCLUSÃO: Concluiu-se que a administração do alendronato sódico não contribuiu para o reparo ósseo nos ratos SHR, mas possivelmente tenha sido responsável pelas formações ósseas extracorticais observadas.
Ação local do alendronato sódico na reparação óssea de ratos espontaneamente hipertensos (SHR)
IUniversidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP)
IIFaculdade de Pindamonhangaba (FAPI)
IIIUniversidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP) - São José dos Campos, Pindamonhangaba, Araraquara, SP - Brasil
A hipertensão arterial sistêmica (HAS) consiste numa desordem de grande prevalência na população mundial, que pode causar alterações metabólicas no tecido ósseo dos indivíduos1-4.
Está comprovada a relação existente entre as alterações do metabolismo do cálcio e a tendência à perda óssea e à diminuição da densidade mineral óssea nos indivíduos hipertensos. As principais alterações do metabolismo do cálcio evidenciadas na HAS estão representadas pela elevação dos níveis do paratormônio sérico e do cálcio sérico ionizado, pela diminuição do conteúdo de cálcio ósseo e pela hipercalciúria1-4.
Os ratos espontaneamente hipertensos (SHR) têm sido empregados como modelo de estudo da hipertensão arterial, já que estes animais reproduzem a doença com muita similaridade àquela manifestada nos humanos, por apresentarem as mesmas anormalidades no metabolismo do cálcio2,5-6. Além disso, os SHR são considerados animais osteopênicos, uma vez que apresentam alta taxa de remodelação do esqueleto, com predomínio da reabsorção óssea sobre o processo de neoformação óssea7.
Apesar dos estudos demonstrarem que a HAS afeta o metabolismo do tecido ósseo, pouco se conhece a respeito da influência dessa doença especificamente na reparação óssea. Pereira e cols.8 constataram que a formação óssea em animais hipertensos foi maior que a observada em normotensos.
Uma vez que se reconhecem as alterações ósseas presentes em indivíduos com hipertensão arterial, utilizou-se neste estudo o alendronato sódico como medicamento no local do defeito ósseo, a fim de observar seus efeitos na reparação óssea nos SHR.
O alendronato sódico é um medicamento do grupo dos bisfosfonatos, amplamente utilizado no tratamento de doenças caracterizadas pela reabsorção óssea9-10. Entretanto, poucas são as pesquisas referentes ao seu uso, local ou sistêmico, estimulando a formação óssea11-14. A forma de administração e a dosagem são fatores importantes a serem elucidados, já que existem controvérsias a respeito do real mecanismo de ação deste medicamento e da sua ação sobre o tecido ósseo dos indivíduos hipertensos.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - São José dos Campos (Protocolo nº 013/2006-PA/CEP).
Um defeito ósseo monocortical de 2,5 mm de diâmetro foi criado na região proximal da diáfise do fêmur esquerdo de oitenta ratos espontaneamente hipertensos (quarenta machos e quarenta fêmeas). Os animais apresentavam seis meses de idade e pesavam aproximadamente 300g.
Foram criados quatro grupos experimentais de vinte animais: C (controle), Am (amido), A1 (alendronato 1mol) e A2 (alendronato 2mol). No grupo controle (C) os ratos foram submetidos apenas à cirurgia, não recebendo preenchimento do defeito. Os animais do grupo amido (Am), após o ato cirúrgico, receberam apenas o amido, excipiente utilizado no experimento. Os animais do grupo (A1) receberam 1mol de alendronato sódico, associado ao amido, para o completo preenchimento do defeito ósseo. Finalmente, o grupo (A2) teve o defeito cirúrgico totalmente preenchido por 2mol de alendronato sódico, também associado ao amido.
Seguindo o protocolo desenvolvido por Fernandes12, foi realizada a administração local de alendronato sódico na quantidade de 1mol (A1) e 2mol (A2) para o preenchimento dos defeitos ósseos. As proporções dos materiais foram calculadas de acordo com o peso molecular (PM) do alendronato sódico, que equivale a 325g/mol. O cálculo das quantidades em peso foi realizada utilizando-se 0,01mol para mensurarmos quantias volumétricas apropriadas ao tamanho do defeito ósseo, isto é, utilizamos 3,25g no grupo experimental A1 e 6,5g no grupo experimental A2. Com esta quantidade de material, preenchemos 26% do defeito com alendronato sódico no grupo A1 e 52% no grupo A2, sendo o restante dos defeitos ósseos preenchidos com 74% e 48% de amido, respectivamente.
O sacrifício dos animais foi executado por meio de anestesia e decapitação em guilhotina, decorridos sete e 21 dias da data da cirurgia. Os fêmures foram removidos, fixados em solução de formaldeído a 10% e descalcificados em solução de ácido fórmico a 20%, durante aproximadamente dez dias. Após o processamento histológico, as lâminas coradas com hematoxilina e eosina (HE), foram então examinadas sob microscopia de luz e os aspectos histológicos do osso neoformado foram avaliados em toda extensão do defeito. Foram observadas as características das trabéculas ósseas, dos espaços medulares e da remodelação do tecido. A morfologia das células ósseas e do periósteo também foi analisada e descrita.
Para a análise histomorfométrica, foram selecionados seis cortes de cada espécime e as lâminas foram fotografadas no centro do defeito com um aumento original de cem vezes. As imagens digitalizadas foram transferidas para um microcomputador e submetidas à análise histométrica da neoformação óssea, através do programa de análise de imagens Image-J (Versão 1,32 para
Aos sete dias, encontrava-se em todos os grupos experimentais um tecido conjuntivo frouxo, com focos de hemorragia e infiltrado inflamatório ocupando a área do defeito ósseo. Nesse mesmo período, alguns espécimes dos grupos controle (C) e amido (Am), apresentavam focos de tecido osteóide em meio ao tecido conjuntivo (
Uma característica histológica observada aos sete dias nos grupos A1 e A2, em particular neste último, foi a presença de pequenas formações ósseas extracorticais subperiosteais na região oposta ao defeito ósseo (
Aos 21 dias, constatava-se o fechamento do defeito em toda a sua extensão, com a presença de um tecido ósseo neoformado que se continuava com o tecido cortical adjacente ao defeito nos grupos C e Am (
O periósteo se mostrava bem organizado nos animais dos grupos C e Am. Este se constituía por uma camada superficial de tecido conjuntivo fibroso e uma camada profunda formada por osteoblastos achatados (
Nos animais machos do grupo A1, aos 21 dias, observava-se a presença de trabéculas ósseas imaturas, interpostas por tecido conjuntivo frouxo, que se irradiavam do interior do canal medular até a área do defeito, porém sem fechá-lo por completo (
As formações ósseas extracorticais subperiosteais observadas na região oposta ao defeito ósseo estavam presentes em todos os grupos tratados com A1 e A2 aos 21 dias e mostravam-se mais expressivas nas fêmeas quando comparado aos animais machos. O tecido encontrava-se recoberto pelo periósteo e tecido muscular. Continha osteócitos em grande quantidade, que se encontravam abrigados em lacunas de menores proporções quando comparado aos grupos de sete dias. Os espaços medulares contendo tecido conjuntivo frouxo e vasos sangüíneos também se mostravam reduzidos. O osso apresentava maior maturação (
O resultado da análise estatística descritiva está representado por um gráfico de colunas na
A análise de variância ANOVA demonstrou que o efeito interação entre os sexos dos animais (p=0,34) e entre sexo e período de observação (p=0,06) não foi significante. O teste de Tukey (5%) foi realizado e a formação dos grupos homogêneos está representada na
Os resultados demonstraram que, aos sete dias, o grupo C de animais machos apresentou maior formação óssea. Aos 21 dias, os animais dos grupos C e Am exibiram maior formação óssea. O grupo A1, de animais machos, foi o único que demonstrou formação óssea na área do defeito aos 21 dias, com resultado mais próximo aos grupos C e Am. O restante dos animais tratados com alendronato aos 21 dias mostrou menor neoformação óssea na área do defeito.
A hipertensão arterial sistêmica consiste em uma doença relacionada a alterações ósseas importantes, que pode originar principalmente a diminuição da densidade mineral óssea1,4,15-17. Alguns autores sugerem que existe uma relação positiva entre as alterações dos fatores de regulação do cálcio e a tendência à perda óssea nos indivíduos hipertensos18,19.
No presente estudo, avaliou-se a ação local do alendronato sódico na reparação de defeitos ósseos no fêmur de SHR, de ambos os sexos e aos sete e 21 dias. Observou-se que os SHR mostraram reparação óssea mais retardada quando comparada ao estudo de Pereira e cols.8 realizado em ratos SHR e ao estudo de Fernandes12 em ratos normotensos WKY. Os resultados deste trabalho confirmam dados da literatura sobre a presença de alterações ósseas nos animais hipertensos.
Estudos realizados em ratos tipo SHR demonstram que, com o passar do tempo, a hipercalciúria e a ativação secundária das glândulas paratireóides levam a um menor crescimento do tecido ósseo e a uma diminuição da massa mineral óssea total1,5, culminando em desordens ósseas. Na HAS, os baixos níveis de íons cálcio no soro, principalmente devido à presença de hipercalciúria, podem estimular um aumento compensatório na produção do PTH. Este é o principal hormônio relacionado com o controle do nível plasmático de cálcio no organismo, desta forma, níveis elevados de PTH tendem a contribuir para o processo de remodelação óssea, pois estimulam a atividade osteoclástica e mobilizam o cálcio presente no esqueleto, podendo levar a uma diminuição da densidade mineral óssea20.
A análise histológica deste estudo mostrou resultados que diferiram daquele encontrado por Pereira e cols.8. O autor observou que aos sete dias, os SHR apresentavam a formação de trabéculas ósseas na maioria dos espécimes estudados. Neste estudo, no período de sete dias, a maioria dos grupos ainda apresentava um tecido conjuntivo frouxo com focos de hemorragia na área do defeito ósseo, sugerindo que a fase de substituição do coágulo por tecido de granulação não havia se completado. Alguns espécimes dos grupos C e Am apresentavam focos de tecido osteóide em meio ao tecido conjuntivo, caracterizando uma formação óssea imatura na primeira semana do experimento.
Alguns autores relatam características ósseas distintas entre os animais tipo SHR machos e fêmeas. Os estudos mostram que os animais fêmeas apresentam peso corpóreo, comprimento e volume ósseos reduzidos15 e taxas de reabsorções ósseas mais elevadas7. No entanto, Pereira e cols.8 observaram que o processo de reparo ósseo nos ratos normotensos e hipertensos não apresentou diferenças entre os sexos. Neste estudo não se observou diferença estatística na reparação óssea entre os sexos dos animais, somente quando se avaliou a interação do sexo com todos os outros fatores estudados.
O alendronato sódico foi utilizado como medicamento no defeito ósseo, com o objetivo de biodisponibilizar a molécula no local e observar seus efeitos na reparação óssea dos SHR.
O mecanismo molecular pelos quais os bisfosfonatos inibem a reabsorção óssea não é completamente entendido. Sabe-se que está relacionado com a inibição dos osteoclastos nas lacunas de reabsorção, afetando o metabolismo intracelular e induzindo à apoptose dessas células. Através de uma ação indireta, os bisfosfonatos também atuam estimulando os osteoblastos a produzirem mediadores químicos que inibem o recrutamento dos osteoclastos. Tudo isso contribui para um aumento da densidade mineral óssea21-22.
Nos últimos dez anos, tem-se estudado o uso do alendronato sódico com o objetivo de inibir a reabsorção óssea decorrente de procedimentos cirúrgicos e melhorar a reparação tecidual23-26, com destaque para a reparação do tecido ósseo11-14. No contexto da hipertensão arterial sistêmica, não existem relatos alusivos aos efeitos do alendronato sódico sobre o tecido ósseo e poucos são os estudos que empregam localmente o medicamento para avaliar os processos de reparação óssea.
Jaime e cols.13 demonstraram que o medicamento não contribuiu para a reparação óssea, quando administrado localmente no defeito ósseo da calvária de ratas ovarectomizadas. Fernandes12 estudando a ação local do alendronato sódico, da hidroxiapatita e da associação desses medicamentos no reparo ósseo de fêmures de ratos, também não observou a ação positiva do alendronato sódico.
Os resultados desta pesquisa demonstram que os animais dos grupos A1 e A2 apresentaram menor neoformação óssea quando comparados àqueles dos grupos C e Am, independente do sexo ou período de observação. Dados semelhantes foram obtidos por Fernandes12, que mostrou a influência do alendronato sódico retardando o processo de reparação óssea na área do defeito ósseo.
Os estudos realizados
As pesquisas têm demonstrado que os bisfosfonatos apresentam uma ação bifásica, estimulando a proliferação celular e a formação de tecido osteóide nas concentrações mais baixas e inibindo esses processos nas maiores concentrações27-28. As concentrações mais elevadas do medicamento parecem influenciar a viabilidade das células, prejudicando suas funções metabólicas29 e provocando morte celular.
Possivelmente, a concentração molar empregada neste trabalho possa ter afetado a viabilidade celular, ocasionando degeneração hidrópica do tecido conjuntivo, e, por isso, ter causado uma ação tecidual citotóxica que interferiu na reparação óssea nos grupos A1 e A2. Contudo, a análise histomorfológica apresentou um achado interessante, que foi a formação de tecido ósseo extracortical subperiosteal, em todos os grupos tratados com alendronato 1mol e 2mol. Este fato foi mais evidente nos SHR fêmeas do grupo A2, aos 21 dias do experimento (
Essa característica também foi evidenciada por Fernandes12 em ratos normotensos, em todos os grupos tratados com alendronato sódico. O autor sugere que este fenômeno possa ter sido desencadeado pela penetração do medicamento sob o periósteo, no momento da inserção do material. A partir deste estudo, acredita-se que o alendronato sódico possa ter sido incorporado ao tecido ósseo, uma vez que houve a inserção do medicamento no interior do canal medular no momento da cirurgia. De tal modo, uma vez depositado no osso, o alendronato pode ter sido liberado aos poucos do tecido ósseo e estimulado as células osteoblásticas quiescentes presentes no periósteo. Essa formação óssea não ocorreu de forma tão evidente na área do defeito ósseo, provavelmente devido à desorganização das células do periósteo no momento do procedimento cirúrgico.
O alendronato sódico é um medicamento rapidamente reabsorvido quando não se deposita no tecido ósseo. No entanto, quando incorporado aos cristais de hidroxiapatita, é liberado lentamente com o passar do tempo9-10. Isso poderia estimular as células mesenquimais indiferenciadas e as células do endósteo e periósteo a produzirem tecido ósseo.
Com base nessa teoria, também se pretende justificar o padrão de formação óssea encontrado no grupo A1, de ratos machos ao final dos 21 dias. Nesses animais, a formação das trabéculas ósseas se projetava a partir da medula óssea à região do defeito. Tal neoformação pode ser explicada através do estímulo das células mesenquimais indiferenciadas e das células osteoblásticas do endósteo pela ação do alendronato sódico que foi incorporado ao tecido ósseo. Acredita-se que moléculas de alendronato possam ter sido liberadas lentamente, em concentrações viáveis sem causar danos ao tecido.
De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, conclui-se que a aplicação local do alendronato sódico não contribuiu para a reparação óssea nos SHR, entretanto o medicamento possivelmente contribuiu para a formação do tecido ósseo extracortical subperiosteal encontrado.
Os resultados demonstraram que a reparação óssea entre os grupos experimentais foi maior no período de 21 dias quando comparada ao período de sete dias. Não houve diferença no processo de reparação óssea entre os animais machos e fêmeas.
Apesar dos resultados estatísticos terem demonstrado que a aplicação local do alendronato sódico não contribuiu para o processo de reparação óssea nos SHR, acredita-se que variações na metodologia, como novas formas de administração e diferentes concentrações molares, podem gerar resultados positivos, principalmente devido ao achado histológico da neoformação extracortical subperiosteal encontrado exclusivamente nos grupos tratados com alendronato. Portanto, acredita-se que há a necessidade de estudos mais aprofundados para elucidar a ação local do alendronato sódico no processo de formação óssea, bem como avaliar sua ação sobre o tecido ósseo na presença da hipertensão arterial.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Este artigo é parte de tese de mestrado de Mônica Dal Pian Nobre pela Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP).
Correspondência: Mônica Dal Pian Nobre Avenida Lúcio Costa, 17600/103, Recreio dos Bandeirantes 22795-006, Rio de Janeiro, RJ - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 30/07/2007; revisado recebido em 01/10/2007; aceito em 14/11/2007.
BACKGROUND: The arterial hypertension is a disorder characterized by relevant alterations in the bone tissue. The sodium alendronate is indicated in the treatment of bone diseases, because of its affinity with the hydroxyapatite, inhibiting the bone reabsorptions. OBJECTIVE: To analyze local action of the sodium alendronate in the bone repair of spontaneously hypertensive rat (SHR). METHODS: A bone defect was created in the left femur of 80 rat. In agreement with the material used at the place, four groups were created: control (C), starch (St), alendronate 1 mol (A1) and alendronate 2 mol (A2). After 7 and 21 days, the animals were sacrificed. Histomorfometrical and histological analyses were accomplished and the data were submitted the variance analysis (ANOVA) and test of Tukey (5%). RESULTS: At 7 days, in the area of the defect, conjunctive tissue with hemorrhage and inflammation in all of the groups was observed. Some presented osteoid matrix. The groups A1 and A2 presented, further, a fibrin net. At 21 days, the bone trabeculae practically closed the extension of the defect in the groups C and St. In the group A1 of male animals, trabeculae were observed that irradiated from the medullary canal to the area of the defect. In the groups A1 and A2, only presence of conjunctive fabric with low osteoid deposit was observed. An outstanding histological discovery was the formation of extracortical subperiosteal bone tissue in animals of the groups A1 and A2. CONCLUSION: The administration of sodium alendronate did not contribute to bone repair in SHR rat, but possibly has been responsible for the extracortical bone formation observed.
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IIFaculdade de Pindamonhangaba (FAPI)
IIIUniversidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP) - São José dos Campos, Pindamonhangaba, Araraquara, SP - Brazil
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The systemic arterial hypertension consists of a disorder of great prevalence in the world population, that can cause metabolic alterations in the bone tissue of the indivíduals1-4.
The existent relationship between the alterations of the calcium metabolism and the tendency to bone loss and decrease of bone mineral density in hypertensive individuals is proven. The main alterations of calcium metabolism evidenced in the systemic arterial hypertension are represented by elevation of parathormone serum and ionized calcium levels, by the decrease of bone calcium content and by hypercalciuria1-4. Spontaneously hypertensive rat (SHR) have been used as study model of the arterial hypertension, as these animals reproduce the disease with a lot of similarity to manifested in humans, as they present the same abnormalities in the calcium metabolism2,5,6. Besides, the SHR rat are considered bone defficient animals, as they present high rate of skeleton remodeling, with prevalence of the bone reabsorption over the process of new bone formation7.
In spite of studies demonstrating that the systemic arterial hypertension affects the metabolism of the bone tissue, little is known regarding the influence of this disease specifically in the bone repair. Pereira at al8 verified that the bone formation in hypertensive animals was larger than observed in normotensive animals.
As bone alterations are recognized in individuals with arterial hypertension, in this study the sodium alendronate was used as medication in the place of the bone defect, in order to observe their effects in the bone repair in SHR rat.
The sodium alendronate is a medication of the bisphosphonates group, largely used in the treatment of diseases characterized by bone reabsorption9,10. However, little are the researches regarding its use, local or systemic, stimulating the bone formation11-14. The form of administration and the dosage are important factors to be elucidated, since controversies exist regarding the real mechanism of action of this medication and of its action on the bone tissue of hypertensive individuals.
This study was approved by the Institutional Review Board of
A monocortical bone defect of 2,5 diameter mm was created in the area proximal of the tibial shaft of the left femur of 80 SHR rat (40 males and 40 females). The animals were six months of age and they weighed 300 g approximately.
Four experimental groups of 20 animals were created: C (control), St (starch), A1 (alendronate 1 mol) and A2 (alendronate 2 mol). In the control group (C), the rat were submitted to surgery only, not receiving filling of the defect. The animals of the starch (St group), after surgery, only received the starch, excipient used in the experiment. The animals of group A1 received 1 mol of sodium alendronate, associated to the starch, for the complete filling of the bone defect. Finally, the group A2 had the surgical defect totally filled out by 2 mol of sodium alendronate, also associated to the starch.
Following the protocol developed by Fernandes12, in 2005, the local administration of sodium alendronate was accomplished in the amount of 1 mol (A1) and 2 mol (A2) for the filling of the bone defects. The proportions of the materials were calculated in agreement with the molecular weight of the sodium alendronate, that is equal to 325 g/mol. The calculation of the amounts in weight was accomplished using 0,01 mol to measure the appropriate volumetric amounts to the size of the bone defect, that is, 3,25 g were used in the experimental group A1 and 6,5 g in the experimental group A2. With this amount of material, 26% of the defect were filled out with sodium alendronate in the group A1 and 52% in the group A2. The remaining of the bone defects were filled out with 74% and 48% of starch, respectively.
The animals were sacrificed through anesthesia and decapitation by guillotine, 7 and 21 days after surgery. The femurs were removed, preserved in formaldehyde solution to 10% and decalcified in solution of formic acid to 20%, during approximately 10 days. After the histological processing, blades stained with hematoxilin and eosin (HE) were examined under light microscopy and the histological aspects of the newly formed bone were appraised in the whole extension of the defect. The characteristics of the bone trabeculae, medullary spaces and remodelation of the tissue were observed. The morphology of the bone cells and periosteo was also analyzed and described.
For the histomorfometrical analysis, six cuts of each specimen were selected and the blades were photographed in the center of the defect, with original increase of 100 times. The digitalized images were transferred to a microcomputer and submitted the histometrical analysis of the newly formed bone, through the program of image nalysis Image-J (version 1.32 for Windows; National Institutes of Health, Bethesda, United States). A retícule (small net) with 100 points of equidistant intersection (total area of 3.000 µm2) was positioned over the image and the points that were placed upon the newly formed bone tissue were counted. The results were transformed in percentual averages of bone new formation and submitted to descriptive statistical analysis and the variance analysis to three factors (ANOVA), using as significance level the margin of error of 5%. The three analyzed factors were: the treatment accomplished in each experimental group (C, St, A1 and A2), the gender of the animals (male and female) and the observation period (7 and 21 days). When statistically significant differences were found, the test of multiple comparison of Tukey was applied (5%). For the accomplishment of statistical analysis and making of the graph, the softwares Statistica 6.0 and Excel 2003 were used.
At 7 days, in all experimental groups a slack conjunctive tissue, with hemorrhage focuses and infiltrated inflammatory occupying the area of the bone defect were found. In this same period, some specimens of the groups C and St presented focuses of osteoid tissue amid the conjunctive tissue (
A histological characteristic observed at 7 days in the groups A1 and A2, specially in the latter, was the presence of small extracortical subperiosteal bone formations in the region opposite to the bone defect (
At 21 days, the closing of the defect was verified in continuation to the cortical tissue adjacent to the defect in the groups C and St (
The periosteo appeared to be very organized in animals of the groups C and St. This was constituted by a superficial layer of fibrous conjunctive tissue and a deep layer formed by flat osteoblasts (
In the male animals of the group A1, at 21 days, presence of immature bone trabeculae was observed, interposed by slack conjunctive tissue, that irradiated from the interior of the medullary canal to the area of the defect, however without closing it entirely (
The extracortical subperiosteal bone formation observed in the area opposite to the bone defect were present in the groups A1 and A2 at 21 days and they were more expressive in the females comparad to the males. The tissue, covered by periosteo and muscular tissue, contained osteocytes in great quantity, that were sheltered in gaps of smaller proportions, compared to the groups of 7 days. The medullary spaces containing slack conjunctive tissue and blood vessels were also reduced. The bone presented greater maturation (
The result of the descriptive statistical analysis is represented in
The ANOVA variance analysis demonstrated that the effect interaction among the gender of the animals (p = 0,34) and between gender and observation period (p = 0,06) was not significant. The test of Tukey (5%) was accomplished and the formation of the homogeneous groups is represented in
The results demonstrated that, at 7 days, the group C of male animals presented larger bone formation. At 21 days, the animals of the groups C and St exhibited larger bone formation. The group A1 of male animals was the only that demonstrated bone formation in the area of the defect at 21 days, with result closer to the groups C and St. The remaining of the animals treated with alendronate at 21 days demonstrated smaller new bone formation in the area of the defect.
The systemic arterial hypertension consists of a disease related to important bone alterations, that can cause mainly the decrease of the bone mineral density1,4,15-17. Some authors suggest the existence of positive relationship between the alterations of the factors of regulation of the calcium and the tendency to the bone loss in hypertensive individuals18,19.
In the present study, the local action of sodium alendronate was evaluated in the repair of bone defects in the femur of SHR rat of both gender, at 7 and 21 days. It was observed that the SHR rat demonstrated more retarded bone repair when compared to study by Pereira et al8, accomplished in SHR rat, and to the study of Fernandes12, accomplished in normotensive rat of the Wistar-Kyoto (WKY) lineage. The results of this study confirm data of the literature regarding presence of bone alterations in hypertensive animals.
Studies accomplished in SHR rat demonstrate that, in the course of time, the hypercalciuria and the secondary activation of the parathyroid glands lead to smaller growth of the bone tissue and the decrease of total bone mineral mass1,5, culminating in bone disorders. In the systemic arterial hypertension, the low levels of calcium ions in the serum, mainly due to the hypercalciuria, can stimulate the compensatory increase in the production of PTH, the main hormone related to the control of the plasmatic level of calcium in the organism. In this way, high levels of PTH tend to contribute to the process of bone remodeling, as they stimulate the osteoclastic activity and mobilize the calcium in the skeleton, and could lead to the decrease of the bone mineral density20.
The histological analysis of this study presented results that differed of those found by Pereira at al8. Those authors observed that, at 7 days, the SHR rat presented formation of bone trabeculae in most of the studied specimens. In this study, in the period of 7 days, most of the groups still presented slack conjunctive tissue with hemorrhage focuses in the area of the bone defect, suggesting that the phase of substitution of the clot for granulation tissue was not completed. Some specimens of the groups C and St presented focuses of osteoid tissue amid the conjunctive tissue, characterizing immature bone formation in the first week of the experiment.
At 21 days, the groups C and St presented closing of practically the whole extension of the bone defect in most of the specimens, with the presence of a newly formed bone tissue in continuation to the adjacent cortical tissue. In these specimens, the presence of mature bone trabeculae was observed disposed amid slack conjunctive tissue. It was also verified that the bone trabeculae, joined by anastomosis, were surrounded by flat osteoblastos, similar to the one was noticed by Pereira at al8.
Some authors report different bone characteristics between the SHR male and female rat. The studies demonstrate that the female present corporal weight, length and reduced bone volume15, and higher rate of bone reabsorption7. However, Pereira at al8 observed that the process of bone repair in normotensive and hypertensive rat did not present differences among the gender. In this study, no statistical difference was observed in the bone repair among the gender of the animals, except when the interaction of the gender was evaluated with all the other studied factors.
The sodium alendronate was used as medication in the bone defect, with the objective of making available the molecule in the place and to observe their effects in the bone repair of SHR.
The molecular mechanism by which the biphosphonate inhibits the bone reabsorption is not completely understood. It is known that it is related to the inhibition of the osteoclasts in the reabsorption gaps, affecting the intracellular metabolism and inducing apoptosis of those cells. Through an indirect action, the biphosphonates also act stimulating the osteoblasts to produce chemical mediators that inhibit the recruitment of the osteoclasts. All this contributes to the increase of the bone mineral density21-22.
In the last ten years, there have been studies regarding the use of sodium alendronate with the objective to inhibit the bone reabsorption due to surgical procedures and to improve tissue repair23-26, mainly for repair of the bone tissue11-14. Within the context of the systemic arterial hypertension, allusive reports do not exist to the effects of sodium alendronate in the bone fabric and few are the studies that use the medication locally to evaluate the processes of bone repair.
Jaime at al13 demonstrated that the medication did not contribute to the bone repair, when administered locally in the bone defect of the calvaria of female, ovaryectomized rat. Fernandes12, studying the local action of sodium alendronate, of hydroxyapatite and association of these medication in the bone repair of femurs of rat, also did not observe the positive action of the sodium alendronate.
In this study, it was observed that the group treated with alendronate 2 mol presented lesser bone formation at the end of 21 days, when compared to the group treated with alendronate 1 mol, with significant difference in the SHR male rat. This data can be explained by the fact of sodium alendronate causing cytotoxic effects when administered in higher concentrations22,23.
Besides, the results of this research demonstrate that the animals of the groups A1 and A2 presented smaller bone new formation when compared to those of the groups C and St, independently of gender or observation period. Similar data were obtained by Fernandes12, that demonstrated the influence of sodium alendronate delaying the process of bone repair in the area of the bone defect.
Studies accomplished in vitro demonstrate the anabolic action of alendronate, stimulating the bone new formation27-28. Giuliani at al27 observed that the sodium alendronate stimulated the formation of osteoblastic cells in the bone marrow of rat, when administered in low concentrations, and inhibited the process in higher concentrations. Im at al28 demonstrated that the use of alendronate in the culture of osteoblastic cells stimulated the cellular proliferation in the concentration of 10-8 mol.
The researches have demonstrated that the biphosphonates cause bi-phase action, stimulating the cellular proliferation and the formation of osteoid tissue in the lower concentrations and inhibiting these processes in the higher concentration27-28. The higher concentrations of the medication seem to influence the viability of the cells, impairing their metabolic functions29 and provoking cellular death.
It is possible that the molar concentration used in this study has affected the cellular viability, causing hydropic degeneration of the conjunctive tissue, and, for this, it might have caused cytotoxic tissue action that interfered in the bone repair in the groups A1 and A2. At 7 days the presence of conjunctive tissue with infiltrated inflammatory, frequently associated to a fibrin net in the area of the defect of the groups A1 and A2 (
The extracortical subperiosteal bone tissue was on the opposite side to the bone defect and it presented characteristics of remodeled mature tissue, with increased medullary spaces in relation to the adjacent cortical bone and with a great number of gaps occupied by bulky osteocytes.
This characteristic was also evidenced by Fernandes12 in normotensive rat, in all of the groups treated with sodium alendronate. The author suggests that this phenomenon might have been brought on by the penetration of the medication under the periosteo, at the moment of insertion of the material. Starting from this study, it is believed that the sodium alendronate might have been incorporated to the bone fabric, as there was the insertion of the medication inside the medullary canal at time of the surgery. In this way, once deposited in the bone, the alendronate might have been liberated little by little from the bone tissue and stimulated the quiescent osteoblastic cells in the periosteo. This bone formation did not happen in such an evident way in the area of the bone defect, probably due to the disorganization of the periosteo cells at time of the surgical procedure.
The sodium alendronate is a quickly reabsorbed medication when it is not deposited in the bone tissue. However, when incorporated to the hydroxyapatite crystals, it is liberated slowly over the time9,10. This could stimulate the mesenchymal stem cells and the cells of the endosteo and periosteo to produce bone tissue.
Based on this theory, it is also intended to justify the pattern of bone formation found in the group A1, of male rat, at the end of 21 days. In these animals, the formation of the bone trabeculae projected starting from the bone marrow to the area of the defect. Such new formation can be explained by the stimulation of the mesenchymal stem cells and of the osteoblastic cells of the endosteo by the action of sodium alendronate incorporated to the bone fabric. It is believed that alendronate molecules might have been liberated slowly, in viable concentrations, not causing damages to the tissue.
In agreement with the results obtained in this study, it is concluded that the local application of sodium alendronate did not contribute to the bone repair in the SHR; however, the medication possibly contributed to the formation of extracortical subperiosteal bone tissue.
The results demonstrated that the bone repair among the experimental groups was larger in the period of 21 days when compared to the period of 7 days. There was no difference in the process of bone repair among the male and female animals.
In spite of the statistical results having demonstrated that the local application of the sodium alendronate did not contribute to the process of bone repair in SHR rat, it is believed that variations in the methodology, as new forms of administration and different molar concentrations, can generate positive results, mainly due to the histological finding of the extracortical subperiosteal new formation found exclusively in the groups treated with alendronate. It is believed, therefore, that there is need of more profound studies to elucidate the local action of sodium alendronate in the process of bone formation, as well as to evaluate its action on the bone tissue in the presence of arterial hypertension.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
There were no external funding sources for this study.
This article is part of the thesis of master submitted by Mônica Dal Pian Nobre, from