FUNDAMENTO: Diversos fármacos podem causar aumento do intervalo QT, bem como da sua dispersão (QTd) em registros eletrocardiográficos (ECG). O QTd pode ser um marcador potencialmente sensível ao aumento do risco de arritmias cardíacas e morte súbita cardíaca. Metformina é uma substância de eficácia anti-hiperglicêmica utilizada no tratamento do diabete. Entretanto, estudos têm relacionado efeitos dose-dependentes da metformina sobre a glicemia e marcadores de riscos cardiovasculares. OBJETIVO: Avaliar os efeitos dose-resposta da metformina sobre o QT e QTd de ratos diabéticos. MÉTODOS: Ratos Wistar machos foram distribuídos em cinco grupos: controle não-tratado (C), diabético não-tratado (D), diabéticos tratados com metformina nas doses 3,5, 30 e 74 µg/kg/pc (DM 3,5, DM 30 e DM 74). O diabete foi induzido por uma injeção de aloxana (40 mg/kg, i.v.). O ECG foi registrado (1º, 15º e 30º dias) através de quatro eletrodos inseridos na camada subcutânea das patas. Ambos os intervalos, RR e QT, foram medidos, e então os valores do QT corrigido e da dispersão de QT foram calculados. RESULTADOS: Os grupos DM 3,5 e DM 30 mostraram significativa redução da glicemia (p< 0,05) quando comparados à alta dose (DM 74). Ratos do grupo DM 74 apresentaram aumento dos intervalos QTc, QTd e QTcd, enquanto os ratos dos grupos DM 3,5 e DM 30 apresentaram menor prolongamento desses intervalos. CONCLUSÃO: A metformina em altas doses proporcionou maior dispersão do intervalo QT, em razão, provavelmente, do aumento da não-homogeneidade do processo de repolarização ventricular, enquanto em baixas doses houve diminuição do intervalo QT em ratos diabéticos.
Os efeitos da metformina sobre a dispersão do intervalo QT e QTc de ratos diabéticos
Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, SP - Brasil
O diabete é uma desordem metabólica caracterizada pelo aumento da glicemia, decorrente de alterações no metabolismo de proteínas, lipídeos e carboidratos, resultante de secreção deficiente ou de resistência periférica à insulina. Essas alterações aumentam a tendência ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares e neuropatias, as quais representam uma das maiores causas de morte de pacientes1,2. As alterações promovidas no metabolismo de carboidratos e de lipídeos e mudanças eletrolíticas de cálcio e potássio no sangue podem causar modificações na estrutura e fisiologia cardiovascular, que, por sua vez, alteram o registro do eletrocardiograma3,4.
O eletrocardiograma (ECG) é um dos métodos mais importantes no diagnóstico de cardiopatias5. Dependendo da extensão e das áreas lesadas, a propagação do potencial de ação no músculo cardíaco altera as ondas do ECG e os respectivos intervalos.
Entre as principais alterações observadas, encontra-se o aumento do intervalo QT, também chamado síndrome do QT longo (LQTS). A LQTS pode ter origem congênita, quando ocorrem anormalidades nos canais de sódio ou potássio, ou adquirida, em razão do uso de medicamentos, anormalidades elétricas ou distúrbios metabólicos. O intervalo QT corresponde ao tempo necessário para a completa excitação elétrica e a recuperação dos ventrículos, sendo, portanto, a medida da duração da sístole "elétrica", a qual inclui a despolarização e a repolarização ventricular, ou seja, é a duração total da atividade elétrica ventricular 6. O intervalo QT varia inversamente com a freqüência cardíaca (FC), de modo que quanto maior a FC, menor o QT, e vice-versa. Assim, ele deve ser corrigido em relação à FC, gerando o QTc, que é preferencialmente usado7. Outros parâmetros a serem avaliados são a dispersão do QT e do QTc (QTd e QTcd, respectivamente). Esta seria provocada por tempos de repolarização não-homogêneos, sendo definida como a diferença entre o QT máximo e o mínimo nas doze derivações eletrocardiográficas8. A análise da dispersão do QT é um método não-invasivo para detecção da heterogeneidade da repolarização ventricular, sendo um marcador de arritmogênese9. Além disso, há estudos associando o aumento desse intervalo a um maior risco de morte súbita10,11 e como índice prognóstico na insuficiência cardíaca e na cardiomiopatia hipertrófica8,12. Em diabéticos, o aumento do intervalo QT é considerado precursor de aumento do risco de morte súbita13.
Medicamentos, dependendo de sua dosagem, podem prolongar a duração do potencial de ação ventricular e o intervalo QT por meio de diferentes mecanismos iônicos.
A biguanida metformina é um agente anti-hiperglicemiante usado para diminuir a glicemia e conseqüentemente melhorar o perfil metabólico. Ela reduz os níveis de glicose sangüínea pela inibição da gliconeogênese e, na presença de insulina, estimula a captação de glicose periférica pelos tecidos, principalmente músculos esqueléticos, e diminui a absorção de glicose pelo trato gastrointestinal. Seu efeito direto sobre as células b ainda é caso de debate. A metformina não causa hipoglicemia, mas reduz os níveis de hemoglobina glicosilada e melhora o perfil lipídico e a atividade fibrinolítica14,15.
Apesar dos efeitos benéficos da metformina, estudos demonstram que o uso de altas doses de metformina não diminui a hiperglicemia e aumenta os riscos cardiovasculares16-20.
Distúrbios gastrointestinais, como diarréia, são freqüentes, e a absorção intestinal de vitaminas B, especialmente folato, é reduzida durante terapia crônica. Freqüentemente, essa deficiência aumenta os níveis plasmáticos de homocisteína, que acelera a progressão de doença vascular por causa do efeito adverso sobre os vasos sangüíneos, fatores de coagulação e endotélio. Um estudo verificou que há associação entre os níveis elevados de homocisteína e o índice geral de mortalidade em pacientes com doença aterogênica15.
Em algumas circunstâncias, a metformina pode induzir acidose láctica especialmente em pacientes clinicamente predispostos a esta complicação, como falência cardíaca ou infarto do miocárdio15.
Além disso, resultados preliminares (não publicados) mostraram que altas doses de metformina, como as recomendadas a pacientes humanos, promoveram grande aumento de glicogênio cardíaco em ratos aloxanizados, enquanto em baixas doses esse aumento foi menor. Nos diabéticos, o aumento da concentração de glicogênio no ventrículo aparentemente está associado à gravidade do diabete e torna o coração mais suscetível aos efeitos da isquemia21,22, além de causar inadequado funcionamento do coração, pois seu acúmulo no tecido condutor é a causa de disfunção dos nodos sinusal e atrioventricular23.
Com base nesses achados, investigamos os efeitos de baixas e altas doses de metformina sobre a glicemia e o intervalo QT e suas derivadas QTc, QTd, e QTcd de ratos diabéticos por aloxana.
Para o desenvolvimento deste trabalho, foram utilizados ratos machos, albinos, Wistar, com idade de 10 semanas, fornecidos pelo Centro de Bioterismo da Unicamp. Os ratos foram mantidos no Biotério do Departamento de Fisiologia e Biofísica, sendo adaptados durante duas semanas. Os ratos são alimentados com ração (Purina para roedores) e água
Antes que o diabete melito fosse induzido, os ratos foram mantidos sob jejum de 24 horas, com livre acesso a água. Após serem anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/kg de peso corporal), os ratos receberam uma injeção de aloxana em salina (40 mg/kg/pc, i.v., pH 4,5, Sigma®)24,25. O estabelecimento do diabete foi verificado pela presença de glicose na urina, no dia seguinte.
Após indução do diabete, o tratamento foi iniciado. Os ratos dos grupos tratados receberam metformina (Lipha, Lion, França) diluída na água de beber (3,5, 30 e 74 µg/g/pc) durante 30 dias, formando os seguintes grupos: controle (C; n = 5); diabete (D; n = 6); diabete metformina [3,5 µg/g/pc] (DM3.5; n = 8); diabete metformina [30 µg/g/pc] (DM30; n = 7); diabete metformina [74 µg/g/pc] (DM74; n = 8).
Ratos anestesiados (Pentobarbital sódico, 40 mg/kg/pc) foram mantidos em posição supina e com respiração espontânea para registrar o ECG. Os eletrodos foram conectados aos canais do computador (
A glicose plasmática foi determinada pelo método da glicose oxidase, usando
Os resultados foram relatados como média ± DPM. A avaliação dos dados foi feita por meio da análise de variância por dois fatores, seguida do teste de Tukey. Foram considerados significativos os valores cujas diferenças foram demonstradas menores que 5%.
Os níveis de glicose sangüínea não diferiram entre os ratos de todos os grupos no início do período experimental (primeirodia). No final do experimento, níveis similares foram observados em ratos do grupo controle.
A administração de aloxana induziu uma hiperglicemia severa no 15º dia que foi mantida até o 30º dia em ratos do grupo D (563 ± 61 mg/dl, p < 0,001; comparado com a glicemia antes da administração de aloxana). Os ratos que receberam diariamente doses de 3,5 (DM3,5) e 30 (DM30) mg/kg de metformina mostraram menor nível de glicemia no 15º (381 ± 37 e 360 ± 14, respectivamente) e 30º dias de tratamento quando comparados com ratos do grupo diabético controle. A administração de 74 mg/kg de metformina reduziu marginalmente a glicose sangüínea após 30 dias em comparação aos ratos diabéticos controle (p > 0,05) (
A
A
A
O diabete tipo 2 é caracterizado por alterações no metabolismo de glicose e gordura, por causa, em parte, da resistência da ação da insulina nos tecidos periféricos. A ausência de tratamento pode levar a várias complicações, como o aumento de risco cardiovascular1,2.
A biguanida metformina é um anti-hiperglicemiante usado no tratamento de diabéticos tipo 2. Entretanto, o mecanismo de ação da metformina ainda é obscuro.
Estudos mostraram que a metformina ativa a AMP proteína quinase ativada (AMPK) em hepatócitos e músculo esquelético de ratos28. Recentes pesquisas indicam que a AMPK desempenha um papel na regulação do metabolismo de glicose e lipídeos. A AMPK é uma enzima que promove a disponibilização de energia, sendo ativada pela contração do músculo esquelético e durante isquemia miocárdica, e está envolvida na estimulação do transporte de glicose e na oxidação de ácidos graxos. No fígado, a ativação da AMPK resulta em aumento da oxidação de ácidos graxos e diminuição da produção de glicose, colesterol e triglicerídeos29. Esse efeito contribui para a diminuição da glicemia, melhora o perfil metabólico e provoca o aumento de glicogênio no fígado e nos músculos, além de promover benefícios ao perfil lipídico sangüíneo30,31.
Outros estudos, entretanto, indicaram que, em animais diabéticos, altas doses de metformina não reduziram a hiperglicemia, podendo, ainda, aumentar os riscos cardiovasculares16-20.
Nossos resultados (
A ineficácia de altas doses de metformina em diminuir a glicemia pode ter sido provocada pela redução da responsividade das células b à glicose. Um estudo
Além disso, foi observado que a metformina, em doses terapêuticas, estimulou a atividade da tirosina quinase da subunidade b na porção intracelular do seu receptor. Entretanto, altas doses de metformina inibiram a atividade da tirosina quinase e, conseqüentemente, a ação da insulina33.
O diabete,
As alterações promovidas no metabolismo de carboidratos e de lipídeos e nas concentrações dos eletrólitos podem causar modificações na estrutura e na fisiologia cardiovascular, as quais podem ser registradas no eletrocardiograma. Um dos problemas mais comumente detectados em diabéticos é o aumento do intervalo QT e suas derivadas QTc, QTd e QTcd. Esse fato se deve ao retardo na despolarização e/ou na repolarização do potencial de ação cardíaco, provocando o aumento do risco de arritmias e de morte súbita35.
Apesar de o intervalo QT ser utilizado como um meio não-invasivo para identificar risco de desenvolver arritmias ventriculares malignas e morte súbita, de fato espera-se que haja imperfeições no sistema proposto. O ideal na utilização da fórmula QT max - QT min é obter um ECG de 12 derivações com uma onda T bem definida em cada derivação36. Em nosso estudo, este foi um fator limitante, em razão de apenas podermos registrar 6 derivações em ratos, conforme metodologia aplicada por outros autores37. Além disso, em diversas situações foi impossível detectar o final da onda T. Nesta situação, a metodologia indica que o mais adequado é excluir esse intervalo da análise36, tal como efetuamos em nossos resultados. Entretanto, apesar dessas limitações, algumas medidas foram tomadas para minimizar as divergências na medida da dispersão. Houve utilização do mesmo eletrodo em todos os registros eletrocardiográficos, bem como padronização do local colocado, e a realização do ECG foi sempre pela manhã para diminuirmos os possíveis efeitos do ritmo circadiano. Além disso, um único observador analisou o intervalo QT em três batimentos consecutivos para diminuir erros de contagem26. Após determinação dos valores, não houve diferença estatística entre os resultados calculados.
Assim, apesar dos fatores limitantes do estudo, a
As causas do aumento do intervalo são desconhecidas. Entretanto, essa alteração observada em eletrocardiograma pode ser explicada em razão da mais comum manifestação clínica do diabete melito, a poliúria38. A poliúria observada em diabéticos é tradicionalmente atribuída à diurese osmótica secundária ao aumento da glicemia (glicosúria)37. A excessiva perda urinária causa diminuição de potássio39 que pode ser responsável pelo aumento do período de repolarização da membrana40, com resultante aumento do intervalo QT. A
O aumento da dispersão do intervalo QT pode também ser resultante de alterações nos canais de K+ voltagem dependentes41. De fato, o diabete pode alterar a magnitude dos canais de K+ envolvidos no processo de repolarização da membrana dos cardiomiócitos34, afetando, então, o tecido cardíaco.
O tratamento de ratos diabéticos com altas doses de metformina (74 µg/g) causou aumento do QT e suas derivadas (QTd, QTc, QTcd), no 15º e 30º dias do período experimental (
Esse aumento pode ser decorrente da hipercalcemia observada nesse grupo (
Fatores não avaliados neste estudo, entretanto, também podem ter contribuído para o aumento do intervalo QT. A atividade persistente da AMPK, como ocorre durante o tratamento com metformina em altas doses, pode promover mutação no PRKAG2, o gene g2 da subunidade reguladora da proteína quinase AMP-ativada. Essa mutação pode aumentar a captação de glicose pela estimulação da translocação de transportadores de glicose GLUT-4 para a membrana plasmática e elevar a atividade da hexoquinase, levando ao acúmulo de glicogênio que pode causar disfunção no nodo sinusal e atrioventricular22,24.
Além disso, a ativação da AMPK também promove aumento da glicólise e da oxidação de ácidos graxos em cardiomiócitos de uma maneira dose-dependente. O aumento da oxidação de ácidos graxos inibe a oxidação de glicose, e a acetil-coA produzida pode inibir o complexo piruvato-desidrogenase, limitando, assim, a oxidação de piruvato. Esses eventos levam ao aumento da glicólise, e, nessa situação, os prótons e o lactato produzidos se acumulam, o que provoca diminuição do pH, sobrecarga de cálcio intracelular e conseqüente morte celular, reduzindo, assim, a capacidade funcional cardíaca16.
Em doses baixas e intermediárias, a metformina, no entanto, diminuiu o intervalo QT e suas derivadas, sugerindo que houve melhora na condução elétrica ventricular. Além disso, os eletrólitos do soro (cálcio, potássio e sódio), que são outros fatores que podem alterar a condutividade elétrica, não sofreram alterações nesses grupos.
Assim, como em outros estudos, pode ser questionado se realmente a dispersão do QTc oferece uma medida mais precisa e segura do que a medida isolada do QTc como marcador de risco cardiovascular, ou se é meramente mais uma medida de precisão a ser adicionada ao arsenal clínico de acesso ao risco cardiovascular. Independentemente desse questionamento, conclui-se que sua determinação, por ser simples e de relativo baixo custo, é importante para estudar a influência de drogas sobre parâmetros cardiovasculares. Pelas limitações na metodologia utilizada neste trabalho, os resultados e comentários aqui apresentados baseiam-se somente em dados obtidos nas nossas condições experimentais, para não se incorrer no risco de extrapolações que não sejam pertinentes.
O aumento significativo da dispersão do intervalo QT foi observado com altas doses de metformina. Doses baixas e intermediárias de metformina diminuíram a dispersão do intervalo QT.
Agradecemos a assistência do CNPq e do Grupo Lipha, Lion, França pelo fornecimento de metformina.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado pelo CNPQ.
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Eunice Cristina da Silva Costa pela Universidade Estadual de Campinas.
Correspondência: Eunice Cristina da Silva Costa Rua Izabel Negrão Bertotti, 30/102-B - Mansões Santo Antônio 13087-508 - Campinas, SP - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 13/08/2007; revisado recebido em 31/10/2007; aceito em 19/11/2007.
BACKGROUND: Several drugs can cause prolonged QT interval, as well as prolonged QT dispersion (QTd) in electrocardiographic (EKG) recordings. QTd may be a potentially sensitive marker of increased risk of cardiac arrhythmias and sudden cardiac death. Metformin is an effective antihyperglycemic agent used in the treatment of diabetes. However, studies have correlated dose-dependent effects of metformin on glycemia and cardiovascular risk markers. OBJECTIVE: To evaluate the dose-response effects of metformin on QT and QTd of diabetic rats. METHODS: Male Wistar rats were distributed in five groups: non-treated control (C), non-treated diabetics (D), diabetics treated with metmorfin at the doses of 3.5, 30 and 74 µg/kg/bw (DM 3.5, DM 30 and DM 74). Diabetes was induced by an alloxan injection (40 mg/kg, IV). EKG was recorded (days 1, 15 and 30) using four electrodes inserted into the subcutaneous layer of the paws. Both RR and QT intervals were measured, and then corrected QT and QT dispersion values were calculated. RESULTS: The DM 3.5 and DM 30 groups showed a significant reduction of glycemia (p< 0.05) when compared with the high dose (DM 74). Rats of the DM 74 group presented prolonged QTc, QTd and QTcd intervals, whereas rats of the DM 3.5 and DM 30 groups presented less prolonged intervals. CONCLUSION: Metformin at high doses provided greater dispersion of the QT interval probably because of the increased ventricular repolarization inhomogeneity, whereas at low doses decreased QT intervals were observed in diabetic rats.
Effects of metformin on QT and QTc interval dispersion of diabetic rats
Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, SP - Brazil
Diabetes is a metabolic disorder characterized by increased blood glucose resulting from alterations in protein, lipid and carbohydrate metabolism due to impaired secretion of or peripheral resistance to insulin. These alterations increase the tendency to the development of cardiovascular diseases and neuropathies, which represent one of the major causes of death of patients1,2. Alterations in carbohydrate and lipid metabolism as well as electrolytic changes in blood calcium and potassium may cause modifications in the cardiovascular structure and physiology which, in turn, lead to alterations in electrocardiographic recording3,4.
Electrocardiogram (ECG) is one of the most important methods in the diagnosis of heart diseases5. Depending on the extent and areas damaged, the propagation of action potentials in the heart muscle changes ECG waves and their respective intervals.
Among the main changes observed is the QT interval prolongation, also known as long QT syndrome (LQTS). LQTS may be congenital – when abnormalities in sodium or potassium channels occur, or acquired – resulting from the use of medications, electrical abnormalities or metabolic disorders. The QT interval corresponds to the time necessary for the complete ventricular electrical excitation and recovery and is, therefore, the measurement of the duration of the "electrical" systole, which includes ventricular depolarization and repolarization, that is, the total duration of the ventricular electrical activity6. The QT interval varies inversely with heart rate (HR), so that the higher the HR, the shorter the QT and vice versa. Accordingly, it should be corrected for HR, thus generating the QTc, which is preferably used7. Other parameters to be assessed are QT dispersion and QTc dispersion (QTd and QTcd, respectively). This dispersion would result from inhomogeneity of repolarization times, and is defined as the difference between the maximum and minimum QT in the twelve electrocardiographic leads8. QT dispersion is a marker of arrhythmogenesis, and its analysis is a noninvasive method for the detection of ventricular repolarization heterogeneity9. Additionally, some studies associate increased QTd intervals with a higher risk of sudden death10,11 and as a prognostic index in heart failure and hypertrophic cardiomyopathy8,12. In diabetic individuals, increased QT interval is considered a precursor of increased risk of sudden death13.
Depending on their dosages, certain medications may prolong the duration of the ventricular action potential and the QT interval by means of different ionic mechanisms.
The biguanide metformin is an antihyperglicemic agent used to reduce blood glucose and consequently to improve the metabolic profile. It reduces blood glucose levels by inhibiting gluconeogenesis and in the presence of insulin it stimulates peripheral glucose uptake by the tissues – mainly skeletal muscles - and decreases absorption of glucose from the gastrointestinal tract. Its direct effect on b cells is still debatable. Metformin does not cause hypoglycemia, but rather reduces glycosylated hemoglobin levels and improves the lipid profile and fibrinolytic activity14,15.
Despite the beneficial effects of metformin, studies have demonstrated that its use at high doses does not decrease hyperglycemia and increases the cardiovascular risks16-20.
Gastrointestinal disorders such as diarrhea are common, and the intestinal absorption of group B vitamins, especially folate, is impaired during chronic therapy. Frequently, this deficiency increases plasma homocysteine levels, which accelerate the progression of vascular disease due to adverse effects on blood vessels, clotting factors, and endothelium. One study found an association between high homocysteine levels and the overall mortality in patients with atherogenic disease15.
In some circumstances, metformin may lead to lactic acidosis, especially in patients with clinical conditions that predisposed to this complication, such as heart failure or myocardial infarction15.
Additionally, preliminary results (unpublished) showed that high metformin doses such as those recommended for human patients promoted a great increase in cardiac glycogen in alloxanized rats, whereas at low doses this increase was milder. In diabetic patients, the increased glycogen concentration in the ventricles is apparently associated with the severity of diabetes, and makes the heart more susceptible to the effects of ischemia21,22, in addition to leading to cardiac malfunctioning, since its accumulation in the conductive tissue is the cause of sinus and atrioventricular node dysfunction23.
Based on these findings, we investigated the effects of low and high metformin doses on blood glucose and on the QT interval, as well as on QTc, QTd, and QTcd of alloxan diabetic rats.
Male albino Wistar rats aged 10 weeks were supplied by Unicamp's vivarium to be used in this study. They were kept in the vivarium of the Department of Physiology and Biophysics for adaptation for two weeks. The rats were fed on feed (Purina rodent) and had ad libitum access to water in a photoperiodic cycle of 12 h light and 12 h dark, at 22 ± 2º C. The experimental protocol was approved by the Ethics Committee on Animal Experimentation of Unicamp under number 262-1.
Before induction of diabetes, the rats were fasted for 24 hours with free access to water. After being anesthetized with sodium pentobarbital (40 mg/kg of body weight), the rats were injected with alloxan in saline (40 mg/kg/bw, IV, pH 4.5, SigmaTM)24,25. Established diabetes was verified by the presence of glucose in urine the next day.
After induction of diabetes, the treatment was started. The rats in the groups treated received metformin (Lipha, Lyon, France) diluted in drinking water (3.5, 30 and 74 µg/g/bw) for 30 days, thus comprising the following groups: control (C; n = 5); diabetes (D; n = 6); diabetes metformin [3,5 µg/g/bw] (DM3.5; n = 8); diabetes metformin [30 µg/g/bw] (DM30; n = 7); and diabetes metformin [74 µg/g/bw] (DM74; n = 8).
Anesthetized rats (sodium pentobarbital, 40 mg/kg/bw) were kept in the supine position with spontaneous breathing for ECG recording. The electrodes were connected to the computer channels (Heart Ware System), and six standard waves were recorded (I, II, III, aVR, aVR and aVF) with a 2N sensitivity at a 50-mm/second speed. The QT interval was measured in three consecutive beats from the beginning of the QRS-complex to the point of return of the T wave to the isoelectric line, defined as the TP segment26. QTd was calculated in absolute values, by subtracting the shortest QT interval from the longest (QT = QT max – Qt min). This value was converted into a percentage (%QTd) by correcting the QTd for the shortest QT interval and multiplying this value by 100 (%QTd = Qt max – QT min/QT min x 100). The QT interval was corrected for the heart rate using Bazett's formula (QTc = QT/ÖR-R) and the QTc interval dispersion was further calculated by subtracting the minimum QTc interval from the maximum QTc interval (QTcd = QTcmax - QTcmin). The percentage QTcd was also calculated (%QTcd = Qtcmax - QTcmin/ Qtcmin x 100). The analyses were made by a single observer blinded to the treatment the animals received, so as to minimize divergences in the dispersion measurement.
Plasma glucose was determined with the glucose oxidase method, using a commercial kit (Laborlab, Sao Paulo, Brazil). Na+ and K+ were determined using the selective ion electrode method (RocheTM). Total serum calcium was measured using the colorimetric method with cresolftaleine (o-cresolftaleine complexone – RocheTM)27, with an automated analyzer (HitachiTM).
The results were expressed as mean ± MSD. Data were evaluated using the analysis of variance for two factors, followed by Tukey's test. Significant values were considered those whose differences were lower than 5%.
Blood glucose levels did not differ among the rats of all groups at the beginning of the experimental period (day 1). At the end of the experiment, similar levels were observed in rats of the control group.
Administration of alloxan induced severe hyperglycemia on day 15, which was maintained until day 30 in the rats of group D (563 ± 61 mg/dl, p < 0.001; compared with blood glucose prior to alloxan administration). Rats that received daily metformin doses of 3.5 (DME.5) and 30 (DM30) mg/kg showed lower blood glucose levels on days 15 and 30 (381 ± 37 and 360 ± 14, respectively) of treatment when compared with rats of the control diabetic group. The administration of metfomin at 74 mg/kg marginally reduced blood glucose after day 30 in comparison with control diabetic rats (p >0.05) (
It also shows an increase in Ca2+ concentration only in the group treated with metformin at high doses. No alterations were observed in the other parameters.
Type-2 diabetes is characterized by alterations in glucose and lipid metabolism, partly due to resistance to insulin action in peripheral tissues. If untreated, it may lead to several complications such as increased cardiovascular risk1,2.
The biguanide metformin is an antihyperglycemic agent used in the treatment of type-2 diabetics. However, the action mechanism of metformin is still unclear.
Studies have shown that metformin activates AMP activated protein kinase (AMPK) in liver cells and skeletal muscle of rats28. Recent studies indicate that AMPK plays a role in the regulation of glucose and lipid metabolism. AMPK is an enzyme that promotes energy availability and is activated by skeletal muscle contraction and during myocardial ischemia; it is involved in the stimulation of glucose transport and fatty acid oxidation.
In the liver, AMPK activation results in increased fatty acid oxidation and decreased production of glucose, cholesterol and triglyceride29. This effect contributes to a reduction in blood glucose and improvement of the metabolic profile, and leads to increased glycogen in the liver and muscles, in addition to promoting benefits to blood lipid profile30,31.
However, other studies demonstrated that high-dose metformin did not reduce hyperglycemia in diabetic animals, but could increase the cardiovascular risks16-20.
Our results (
The inefficacy of high doses of metformin in reducing blood glucose may have been caused by decreased b-cell responsiveness to glucose. An in vitro study with b cells showed that metformin at high doses (1 mM) and prolonged exposure (24 hours) activated AMPK and thus partially inhibited the synthesis and release of insulin in b cells, which caused the reduction of their glucose responsiveness32.
Additionally, metformin at therapeutic doses was observed to stimulate the tyrosine kinase activity of the intracellular portion of the b subunity of its receptor. However, high doses of metformin inhibited tyrosine kinase activity and, consequently, insulin action33.
Diabetes, per se, causes changes in MAP kinase and in glucose transporters. The enhancement of K+ currents in ventricular cells depends on the activation of MAP kinase, which reflects the synthesis of new channels. The decrease of insulin in diabetics probably leads to a reduction in K+ currents in the epicardium, thus causing increased duration of the cardiac action potential34.
The alterations promoted in carbohydrate and lipid metabolism and in electrolyte concentrations may cause changes in the cardiovascular physiology and structure, which can be recorded in the electrocardiogram. One of the most common problems detected in diabetics is prolongation of the QT interval, as well as of QTc, QTd and QTcd. This is due to a late depolarization and/or repolarization of the cardiac action potential, thus leading to an increased risk of arrhythmias and sudden death35.
Although the QT interval is used as a noninvasive method to identify the risk of developing malignant ventricular arrhythmias and sudden death, flaws are actually expected in the system proposed. When the equation QT max – QT min is used, a 12-lead ECG with a well-defined T-wave in each lead should ideally be obtained36. This was a limitation in our study because only six leads can be recorded in rats according to the methodology used by other authors37. Additionally, in several situations it was impossible to detect the end of the T-wave. In this circumstance, the methodology indicates that excluding this interval from the analysis is the most proper thing to do36, as we did in our results. However, despite these limitations, some measures were taken to minimize the discrepancies in the dispersion measurement. The same electrode was used in all electrocardiographic recordings; the site where it was placed was also standardized. The ECG was always performed in the morning so as to lessen the possible effects of the circadian rhythm. Additionally, one single observer analyzed the QT interval in three consecutive beats, in order to decrease counting errors26. After determination of the values, no statistically significant difference was found between the results calculated.
Thus, despite the limitations of the study, the QTc, QTd and QTcd intervals increased in alloxan diabetic rats, as shown in
The causes of the increased intervals are unknown. However, this alteration observed in the electrocardiogram may be explained in function of polyuria, which is the most common clinical manifestation of diabetes mellitus38. Polyuria observed in diabetic patients is traditionally attributed to the osmotic diuresis secondary to increased blood glucose (glicosuria)37. The excessive urinary loss causes a reduction of potassium39 which can be responsible for the increased membrane repolarization period40, with a consequent increase in the QT interval. The reduction in serum K concentration observed in rats of the diabetes group is shown in
The increased QT interval dispersion may also result from alterations in voltage-gated K+ channels41. In fact, diabetes may change the magnitude of K+ channels involved in the cardiomyocyte membrane repolarization process34, thus affecting the cardiac tissue.
Treatment of diabetic rats with high doses of metformin (74 µg/g) caused an increase in QT, QTd, QTc, and QTcd on days 15 and 30 of the experimental period (
This increase may result from the hypercalcemia observed in this group (
However, factors that were not evaluated in this study may also have contributed to the increased QT interval. Persistent AMPK activity, as occurs during treatment with metformin at high doses, may promote mutations in PRKAG2, the gene for g2 regulatory subunity of AMP-activated protein kinase. This mutation may increase glucose uptake by stimulating translocation of the glucose transporter GLUT-4 to the plasma membrane and increase hexokinase activity, thus leading to glycogen accumulation, which may cause sinus node and atrioventricular node dysfunction22,24.
Additionally, AMPK activation also promotes a dose-dependent increase in glycolysis and fatty acid oxidation in cardiomyocytes. Increased fatty acid oxidation inhibits glucose oxidation, and the acetyl-coA produced may inhibit the pyruvate-dehydrogenase complex, thus limiting pyruvate oxidation. These events lead to increased glycolysis and, in this situation, the protons and lactate produced accumulate and provoke a decrease in pH, intracellular calcium overload and subsequent cell death, thus reducing the cardiac functional capacity16.
However, metformin at low and medium doses decreased the QT, QTc, QTd, and QTcd intervals, thus suggesting improved ventricular electric conduction. Additionally, serum electrolytes (calcium, potassium and sodium), which are other factors that may affect the electric conductivity, did not change in these groups.
Thus, like in other studies, it is questionable whether QTc dispersion is actually a more accurate and safe measurement than the measurement of QTc alone as a marker of cardiovascular risk, or whether it is merely one more accurate measure to be added to the clinical armamentarium of assessment of the cardiovascular risk. Regardless of this discussion, we conclude that since QTc dispersion measurement is simple and relatively inexpensive, it is important in order to study the influence of drugs on cardiovascular parameters. Because of the limitations of the methodology used in this study, the results and comments presented are based only on data obtained under our experimental conditions, so as not to incur the risk of improper extrapolations.
A significant increase in QT interval dispersion was observed with high metformin doses. Low and medium metformin doses decreased QT interval dispersion.
We would like to thank CNPq for their assistance and Lipha Group, Lyon, France, for supplying metformin.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by CNPQ.
This article is part of the thesis of doctoral submitted by Eunice Cristina da Silva Costa, from
Mailing address: Eunice Cristina da Silva Costa Rua Izabel Negrão Bertotti, 30/102-B - Mansões Santo Antônio 13087-508 - Campinas, SP - Brazil E-mail:
Manuscript received August 13, 2007; revised manuscript received October 31, 2007; accepted November 19, 2007.