OBJETIVO: Avaliar a importância da interação entre a integrina Mac-1 dos leucócitos (a Mb 2) e a glicoproteína (GP) Iba das plaquetas para o recrutamento de leucócitos após a lesão vascular e o efeito da neutralização da interação Mac-1-GPIba sobre a proliferação celular e a hiperplasia neointimal desencadeadas por lesão vascular. MÉTODOS: Um peptídeo denominado M2 ou anticorpo anti-M2 foi desenvolvido para bloquear a interação Mac-1-GPIba . Esse peptídeo foi injetado e comparado com anticorpo-controle em camundongos C57B1/6J submetidos a lesão vascular da artéria femoral com corda-guia. Um, cinco ou 28 dias após a lesão vascular, as artérias femorais foram retiradas para a realização de morfometria e imuno-histoquímica. RESULTADOS: O bloqueio da interação Mac-1-GPIba promoveu uma redução estatisticamente significativa do número de leucócitos na camada média no primeiro dia após a lesão vascular (controle: 7,9±5,0% do total de células versus anti-M2: 2,0±1,6%, p=0,021), bem como determinou uma diminuição estatisticamente significativa do acúmulo de leucócitos na neoíntima em cinco e 28 dias (controle: 42,3±12,9% versus anti-M2: 24,6±10,8%, p=0,047 e controle: 7,9±3,0% versus anti-M2: 3,3±1,3%, p=0,012; respectivamente). A proliferação celular na camada média do vaso em cinco dias pós-lesão foi reduzida com o bloqueio da interação Mac-1-GPIba (controle: 5,0±2,9% do total de células versus anti-M2: 1,8±0,5%; p=0,043), assim como houve diminuição significativa da proliferação celular na camada íntima do vaso em 28 dias (controle: 3,8±1,7% versus anti-M2: 2,0±1,2%; p=0,047). O bloqueio da interação Mac-1-GPIba também determinou uma redução estatisticamente significativa do espessamento intimal em 28 dias pós-lesão (controle: 10.395±3.549 µm² versus anti-M2: 4.561±4.915 µm²; p=0,012). CONCLUSÃO: O recrutamento de leucócitos após a lesão vascular é dependente da interação Mac-1-GPIba e a neutralização dessa interação inibe a proliferação celular e a formação neointimal.
Importância da interação entre a integrina Mac-1 dos leucócitos e a glicoproteína Iba das plaquetas para o recrutamento de leucócitos pelas plaquetas e para a resposta inflamatória à lesão vascular
Instituto do Coração (InCor) - Universidade de São Paulo, Brigham and Women's Hospital/Harvard University, Boston, Massachussets, EUA, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)/Universidade Federal do Rio Grande do Sul, The Cleveland Clinic Foundation of Medicine, Houston, Texas, EUA
Evidências crescentes de estudos experimentais e clínicos fundamentam a compreensão da aterosclerose e da reestenose como um processo inflamatório. Nesse contexto, a inflamação é caracterizada pela interação entre plaquetas, leucócitos e células endoteliais1.
Estudos experimentais e clínicos sugerem uma função central dos leucócitos na proliferação neointimal decorrente da lesão vascular. Em modelos experimentais de lesão vascular, os leucócitos recrutados são apontados como precursores da proliferação neointimal2,3.
Uma vez aderidas à parede vascular, as plaquetas formam uma superfície adesiva para o recrutamento de leucócitos circulantes, que envolve as seguintes etapas: adesão mediada por seletinas e rolamento sobre a superfície de plaquetas, ativação dos leucócitos, firme adesão mediada por integrinas e diapedese4-6.
A etapa de firme adesão de leucócitos à superfície de plaquetas ativadas é mediada por integrinas da família b 2, onde se destaca a integrina Mac-1, também conhecida como antígeno do macrófago-1, a Mb 2 ou CD11b/CD18.
Um estudo em camundongos com deficiência de integrina Mac-1 e submetidos a lesão vascular evidenciou diminuição da migração e do acúmulo de leucócitos na parede arterial e atenuação da proliferação neointimal7. Outro estudo, que avaliou o bloqueio da integrina Mac-1 com um anticorpo
Simon e cols. recentemente localizaram o sítio de ligação da integrina Mac-1 dos leucócitos com a glicoproteína (GP) Iba das plaquetas dentro do segmento a M(P201-K217) do domínio a MI9, o que possibilitou o desenvolvimento de um peptídeo denominado M2 ou anti-M2.
Estudos
O presente estudo tem como objetivos avaliar a importância da interação entre a integrina Mac-1 dos leucócitos e a glicoproteína Iba das plaquetas para o recrutamento de leucócitos após a lesão vascular e o efeito da neutralização da interação entre a integrina Mac-1 e a glicoproteína Iba sobre a proliferação celular e a hiperplasia neointimal desencadeadas por lesão vascular.
Peptídeos correspondentes ao sítio de ligação da integrina Mac-1 nos receptores GPIba de camundongos (SGSG-214LYFRHWLQENANNVYL229-C) e peptídeos controle (SGSG-VEAFHLNYYRNNVWLQ-C) foram obtidos do W.M. Keck Biotechnology Resource Center – Yale University (New Haven, CT, EUA). Os peptídeos foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenados a -80°C.
Cinqüenta e três camundongos machos C57BI/6J, com idade entre oito e dez semanas, foram obtidos do viveiro da Harvard University (Boston, MA, EUA).
O marcador do antígeno comum leucocitário (CD45) – anticorpo anti-CD45 – foi adquirido da BD Biosciences (San Diego, CA, EUA); o marcador específico para neutrófilos de camundongos – anticorpo monoclonal 7/4 – foi fornecido pela Serotec (Indianápolis, IN, EUA); o marcador Mac-3 específico para macrófagos de camundongos – anticorpo monoclonal M3/84 – foi adquirido da BD Biosciences e a bromodeoxiuridina (BrdU) foi fornecida pela
Um anticorpo policlonal peptídeo-específico denominado peptídeo M2 ou anticorpo anti-M2, com afinidade ao sítio de ligação da integrina Mac-1 ao receptor GPIba , foi desenvolvido mediante a imunização de coelhos com o peptídeo C-201PITQLLGRTHTATGIRK217 acoplado a KLH (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, EUA), correspondendo a seqüência humana a m (P201-K217).
A seguir, foram realizados testes sangüíneos que demonstraram altos títulos de anti-soro ligados à fase sólida imobilizada contendo a seqüência de aminoácidos C-P201-K217.
A última etapa foi a purificação do anticorpo policlonal peptídeo-específico – anticorpo anti-M2 ou peptídeo M2 – por cromatografia de afinidade (Zymed Laboratories).
Imunoglobulina IgG de coelhos não imunizados foi usada como anticorpo de controle.
Os camundongos C57BI/6J foram randomizados e divididos em dois grupos de tratamento:
1- peptídeo M2 de coelhos; e
2- imunoglobulina IgG de coelhos não imunizados.
O peptídeo M2 ou anticorpo anti-M2 foi injetado com o objetivo de bloquear a interação da integrina Mac-1 dos leucócitos com a GPIba das plaquetas, visando, desse modo, inibir a adesão de leucócitos na superfície do vaso coberta por plaquetas. A imunoglobulina IgG de coelhos não-imunizados foi injetada para servir como controle, visto que não interage com a integrina Mac-1 dos leucócitos ou com a GPIba das plaquetas, assim como não apresenta efeito inibitório na adesão entre leucócitos e plaquetas.
Os anticorpos foram injetados via intraperitoneal em uma dose de 250 µg, quatro horas antes da lesão da artéria femoral (dia 0) e posteriormente em uma dose de 100 µg intraperitoneal nos dias 2, 4, 6, 8, 10 e 12 após a lesão da artéria femoral.
Camundongos C57B1/6J machos com idade entre oito e dez semanas foram anestesiados no dia zero (0) com quetamina (80 mg/kg SC) e xilazina (5 mg/kg SC). A seguir, foi realizada uma incisão na virilha, dissecção e exposição da artéria femoral, clampeamento temporário da artéria femoral no nível do ligamento inguinal e arteriotomia distal à artéria epigástrica sob visualização com microscópio cirúrgico.
Uma corda-guia 0,010" foi inserida na artéria femoral pelo orifício da arteriotomia, o clampeamento foi removido e a corda-guia foi avançada até a bifurcação com a aorta e recuada até a posição anterior por três vezes (total de três inserções), visando causar lesão endoluminal na artéria femoral comum. Após a retirada da corda-guia, o local da arteriotomia foi ligado.
Esse modelo experimental, descrito por Roque e cols.11 e utilizado no presente estudo por um operador sem conhecimento dos grupos de tratamento, se assemelha muito ao processo de reparo à lesão vascular observado em humanos após intervenção coronariana percutânea com implante de
Todos os animais sobreviveram até o momento da eutanásia planejada sem sangramento ou infecção.
Os procedimentos e cuidados com animais foram revisados e aprovados pelo Harvard Medical School Standing Committee on Animals que segue as regras estabelecidas pela American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care e pelo National Institutes of Health.
Um dia (anticorpo de controle: n= 6; anti-M2: n= 6), cinco dias (anticorpo de controle: n= 9; anti-M2: n= 9) ou 28 dias (anticorpo de controle: n= 9; anti-M2: n= 9) após a lesão vascular, foi administrada anestesia, a cavidade peitoral foi aberta e a eutanásia dos animais foi realizada por sangramento mediante incisão no átrio direito.
Um cateter tipo butterfly (medida= 22) foi inserido no ventrículo esquerdo para perfusão
As artérias femorais direita e esquerda foram retiradas e imersas em paraformaldeído tamponado para posterior análise de morfometria e imuno-histoquímica.
Todos os animais receberam BrdU na dose de 50 mg/kg intraperitoneal (IP), 18 horas e uma hora antes da eutanásia, para avaliar a proliferação celular na parede da artéria femoral.
O baço e o intestino delgado de três animais foram utilizados como controle das reações de imuno-histoquímica, em razão da presença de abundante tecido linfóide (leucócitos) nesses tecidos.
As artérias femorais retiradas foram inicialmente fixadas em formalina e posteriormente processadas e emblocadas em parafina. Foram realizados dois cortes transversais com 1 mm de distância entre eles, os quais foram corados pela técnica de hematoxilina/eosina e pela coloração de Verhoeff.
Um pesquisador sem conhecimento do grupo tratamento aferiu as áreas luminal, intimal e medial de cada plano transversal, utilizando um microscópio equipado com uma câmera CCD acoplada a um computador com o software NIH Image v1.60.
A área luminal foi definida como a área interna cercada pela camada de células endoteliais; a área intimal foi definida como a área entre o lúmen e a lâmina elástica interna; e a área medial foi definida como a área entre as lâminas elásticas interna e externa.
Também foi calculada a razão entre as áreas intimal e medial (área intimal/área medial), para avaliar o efeito da inibição da interação Mac-1-GPIba nessa relação, assim como para permitir futuras comparações com modelos experimentais utilizando animais de maior porte.
A área delimitada pela lâmina elástica externa foi aferida para avaliar o comportamento do tamanho do vaso nos dois grupos no decorrer do tempo, ou seja, determinar se houve remodelamento positivo ou negativo do vaso.
Os resultados dos dois cortes transversais de cada artéria foram utilizados para o cálculo da média, a qual foi considerada na avaliação e análise estatística dos dados.
Para o cálculo da área medial e a avaliação da lâmina elástica externa em condições basais, ou seja, antes da lesão ou tratamento com anticorpo anti-M2, um grupo de camundongos (n=5) foi sacrificado para a realização de morfometria quantitativa.
A imuno-histoquímica foi realizada utilizando a técnica de imunoperoxidase pelo sistema avidina-biotina, mediante o uso de anticorpos específicos para cada célula.
O anticorpo anti-CD45 (antígeno comum leucocitário) de camundongos foi utilizado como marcador de leucócitos, o anticorpo monoclonal 7/4 foi usado para a identificação de neutrófilos e o anticorpo monoclonal M3/84 ou anti-CD163 foi utilizado como marcador de macrófagos.
A BrdU utiliza a substituição de nucleotídeo para trocar timidina por uridina na estrutura do DNA de células em divisão, tanto
Cortes transversais de artéria femoral, corados imunologicamente, foram avaliados para quantificar o número de células positivamente imunocoradas em relação ao número total de células.
Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP); as comparações entre os grupos foram realizadas por teste
Primeiramente examinou-se o recrutamento de leucócitos pós-lesão em relação ao tempo. A função da interação a Mb 2-GPIba nesse processo foi estabelecida, visto que houve diferença no acúmulo de leucócitos na parede do vaso do grupo de camundongos tratados com o peptídeo M2 ou anti-M2 em comparação ao grupo controle.
As células inflamatórias CD45-positivas (leucócitos) invasoras da camada média do vaso no primeiro dia pós-lesão foram reduzidas em 75%, ou seja, de 7,9±5,0% do total de células na camada média do grupo de camundongos tratados com IgG não-imune (controle) para 2,0±1,6% no grupo tratado com anti-M2 (p=0,021) (
O acúmulo de leucócitos na neoíntima em desenvolvimento também foi significativamente reduzido mediante o tratamento com anti-M2, pois houve uma redução de 42% em cinco dias (controle: 42,3±12,9% do total de células na neoíntima
A análise de células CD45-positivas foi expandida por técnicas imunológicas de coloração utilizando marcadores celulares específicos, com o objetivo de quantificar a presença de neutrófilos e macrófagos.
O acúmulo de neutrófilos (células positivas para o anticorpo monoclonal 7/4) dentro da camada média do vaso no primeiro dia pós-lesão foi reduzido em 75% no grupo de camundongos tratados com anti-M2, em relação ao grupo controle (controle: 8,9±6,7%
Não foram detectados neutrófilos nas camadas íntima e média, em 28 dias pós-lesão, em ambos os grupos de tratamento (
Os macrófagos (células positivas para Mac-3) foram praticamente indetectáveis no primeiro dia pós-lesão (<0,5% do total de células da camada média). Em cinco dias pós-lesão, o acúmulo de macrófagos na neoíntima foi reduzido em 53% no grupo de camundongos tratados com anti-M2, em relação ao grupo controle (controle: 13,8±6,2%
Proliferação celular expressiva foi observada em cinco dias após a lesão vascular no grupo de camundongos tratados com anticorpo controle e a proliferação celular continuou ainda evidente em 28 dias.
O tratamento de camundongos com o anticorpo anti-M2 determinou, entretanto, uma redução estatisticamente significativa de 64% da proliferação celular na camada média do vaso em cinco dias após a lesão (controle: 5,0±2,9% do total de células na camada média do vaso
Em camundongos tratados com o anticorpo controle, o espessamento intimal iniciou cinco dias após a lesão e progrediu significativamente entre cinco e 28 dias pós-lesão. O bloqueio da interação a Mb 2-GPIba , promovido pelo tratamento com o anticorpo anti-M2 ou peptídeo M2, resultou na diminuição do espessamento intimal (neoíntima) em cinco dias após a lesão, em relação ao grupo controle (controle: 921±534 µm2
O bloqueio da interação a Mb 2-GPIba em camundongos tratados com o anticorpo anti-M2 ou peptídeo M2 determinou, portanto, uma redução de 56% do espessamento intimal em 28 dias, em relação ao grupo-controle (
A área da camada média não foi afetada pelo tratamento com o anticorpo anti-M2. Assim sendo, a relação entre as áreas da camada íntima e da camada média, expressa pela razão área intimal/área medial (I:M), em 28 dias, foi 56% inferior nos camundongos tratados com o anticorpo anti-M2, em comparação ao grupo controle (controle: 1,20 ± 0,62
O espessamento das camadas íntima e média foi acompanhado por progressivo aumento de tamanho do vaso (remodelamento positivo), conforme avaliado pela aferição da área da lâmina elástica externa em diferentes períodos de tempo (
O remodelamento positivo do vaso foi semelhante nos dois grupos de tratamento, tanto em cinco dias (p=0,12) quanto em 28 dias após a lesão vascular (p=0,99).
Neste estudo, foi demonstrado que o anticorpo que possui como alvo o segmento P201-K217 do domínio Ia M reduz o acúmulo de leucócitos, a proliferação celular e o espessamento da neoíntima após a lesão vascular
A integrina a Mb 2 regula importantes funções leucocitárias como adesão, migração, coagulação, proteólise, fagocitose, estresse oxidativo e sinalização por ligar-se a diversos ligantes, tais como fibrinogênio15,16, ICAM-117, fator X18, C3bi15, GPIba 9,19 e JAM-320.
A identificação precisa do ligante responsável pelo acúmulo de leucócitos nos locais de lesão vascular cobertos por plaquetas aderidas era até o momento desconhecida. Embora estudos prévios tenham mostrado que a integrina a Mb 2 facilita diretamente o recrutamento de leucócitos nos locais de deposição de plaquetas e fibrina6, a verdadeira importância biológica de contra-receptores de plaquetas para a Mb 2, tais como GPIba , JAM-3 e fibrinogênio ligado à GPIIb/IIIa, é pouco conhecida.
Um estudo de Rogers e cols.8, no qual foi efetuado o bloqueio da integrina a Mb 2 com o anticorpo monoclonal M1/70, não foi conclusivo em relação à identificação do contra-receptor fisiológico para a integrina a Mb 2, porque o M1/70 é um anticorpo
Outro estudo de Simon e cols.7 identificou a a Mb 2 como um determinante molecular de espessamento da neoíntima após lesão vascular. Verificou-se que a ausência seletiva de a Mb 2 em camundongos deficientes da integrina Mac-1 prejudica a migração de leucócitos transplaquetários para o interior da parede do vaso, diminuindo o acúmulo de leucócitos na camada média do vaso e o espessamento da neoíntima após angioplastia experimental. Nesse mesmo estudo, a deficiência de a Mb 2 foi associada com uma redução de 67% no acúmulo precoce de leucócitos7.
De modo interessante, a magnitude da redução do acúmulo precoce de leucócitos no estudo anteriormente descrito foi similar àquela obtida com o bloqueio da interação a Mb 2-GPIba através do peptídeo M2 no presente estudo (75% de inibição de células CD45 positivas), sugerindo que o recrutamento de leucócitos é largamente dependente da interação entre a Mb 2 e GPIba . Essa observação também é consistente com outra decorrente de um estudo
A relativa especificidade da ação inibitória do anti-M2 em relação a GPIba , ou seja, não interage com a ICAM-1, o fibrinogênio e a JAM-3, sugere uma contribuição pequena de outros ligantes para a integrina a Mb 2 no contexto da lesão vascular, com endotélio desnudo e deposição plaquetária10.
Outros potenciais ligantes para a integrina a Mb 2 presentes na membrana das plaquetas incluem o fibrinogênio que se liga a GPIIb/IIIa15,16, a ICAM-221 e a JAM-320.
A interação leucócito-plaqueta, mediada por pontes de fibrinogênio entre a Mb 2 e GPIIb/IIIa, foi estudada por Ostrovsky e cols.22, que demonstraram, em um estudo experimental
Embora a integrina a Mb 2 se ligue com a ICAM-1, esse receptor não é encontrado em plaquetas, as quais expressam um receptor similar – ICAM-2. Diacovo e cols. demonstraram que o bloqueio da ICAM-2 não tem efeito na firme adesão de neutrófilos sobre uma superfície de plaquetas ativadas, sob fluxo contínuo6.
Por fim, Santoso e cols.20 publicaram recentemente que a integrina a Mb 2 também pode se ligar a JAM-3 das plaquetas, cooperando com a GPIba para a adesão entre neutrófilos e plaquetas
Um estudo
No presente estudo, os dados do experimento de lesão vascular em camundongos permitem concluir que o recrutamento de leucócitos, após a lesão vascular, é dependente da interação entre a integrina Mac-1 e a GPIba , pois um anticorpo específico (anti-M2 ou peptídeo M2) direcionado ao bloqueio do segmento P201-K217 do domínio Ia M, que é responsável pela interação da integrina Mac-1 do leucócito com a GPIba da plaqueta, promoveu uma redução estatisticamente significativa de 75% no acúmulo de leucócitos na camada média da parede do vaso, no primeiro dia pós-lesão, e reduziu em 42% e 58% o acúmulo de leucócitos na camada íntima da parede do vaso, em cinco e 28 dias após a lesão vascular, respectivamente.
Da mesma forma, os dados da morfometria desse experimento de lesão vascular evidenciaram, através da neutralização da interação Mac-1-GPIba , que essa interação modula a proliferação celular vascular e a formação neointimal. O anticorpo anti-M2 direcionado ao bloqueio da interação Mac-1-GPIba foi capaz de reduzir significativamente a proliferação celular na camada média da parede do vaso em 64%, no quinto dia pós-lesão, e a proliferação celular na camada íntima em 47%, em 28 dias após a lesão, assim como também diminuiu a formação neointimal em 56%, em 28 dias após a lesão vascular (p=0,012).
Embora o tratamento com o anti-M2 tenha reduzido o espessamento da neoíntima em 56%, um efeito inibitório menos robusto, quando comparado ao percentual de 80% de inibição do espessamento da neoíntima, com a completa deficiência de a Mb 2 em camundongos geneticamente modificados, em relação a camundongos selvagens, o resultado do anti-M2, nesse primeiro estudo
Um estudo em ratos submetidos à lesão da artéria carótida com cateter-balão mostrou redução de 45% do espessamento neointimal no grupo de ratos tratados com rapamicina, em 14 dias, em comparação ao grupo controle23. Outro estudo, realizado por Gallo e cols.24, demonstrou que a administração de rapamicina via intramuscular em suínos, três dias antes e 14 dias após a angioplastia com cateter-balão superdimensionado, em artéria coronária, reduziu o espessamento da neoíntima em 50%, em relação ao grupo controle no período de 28 dias24.
Do mesmo modo, o resultado do anti-M2 foi melhor ou pelo menos comparável à maioria dos estudos com paclitaxel. Drachman e cols.25 evidenciaram uma redução de 50% do espessamento neointimal em artérias ilíacas de coelhos tratados com paclitaxel e submetidos a implante de
Deve-se ressaltar que a rapamicina e o paclitaxel são os fármacos antiproliferativos celulares atualmente utilizados nos
O primeiro estudo com
O primeiro estudo com
Diante dos resultados dos estudos experimentais e clínicos com a rapamicina e o paclitaxel, assim como do resultado inicial do bloqueio da interação Mac-1-GPIba com o anticorpo anti-M2, nesse estudo experimental, pode-se inferir a existência de um potencial benefício angiográfico e clínico para o anti-M2 ou peptídeo M2. Obviamente, diferenças na metodologia, via de administração dos fármacos e espécie de animais utilizados nos estudos experimentais citados com rapamicina e paclitaxel devem ser considerados na avaliação dos resultados quando comparados aos obtidos no presente estudo.
A neutralização da interação Mac-1-GPIba mediante o bloqueio do segmento a M(P201-K217), com o anticorpo anti-M2, parece, portanto, ser uma novidade terapêutica promissora para a prevenção da reestenose após a intervenção coronariana percutânea. Entretanto, estudos adicionais com a liberação local de anti-M2 em diferentes doses são fortemente recomendados, visto que a liberação local provou ter um papel fundamental para o sucesso dos
Além disso, o anti-M2 reduz a firme adesão e a transmigração de leucócitos em locais de deposição de plaquetas, um dos primeiros passos da inflamação vascular. Assim sendo, o anti-M2 apresenta um efeito potencial contra a inflamação vascular e igualmente parece ser promissor no controle e/ou prevenção da doença arterial coronária e vascular agressiva/progressiva.
Uma das limitações deste estudo é que não se pode descartar a contribuição de outros ligantes do receptor a Mb 2 e funções desse, assim como não se pode excluir a participação de outras moléculas de adesão celular na resposta biológica à lesão vascular.
Igualmente, não foi avaliada a função da camada adventícia da parede do vaso como uma fonte de células inflamatórias infiltrantes, o que constitui outra limitação do estudo. Leucócitos podem infiltrar a parede do vaso tanto através do lúmen quanto através da adventícia, entretanto o recrutamento de leucócitos, via camada adventícia, é difícil de ser avaliado de forma confiável nesse modelo experimental pela necessidade de dissecção e isolamento da artéria dos tecidos circundantes para a realização da lesão com a corda-guia.
Ademais, embora o espessamento das camadas íntima e média tenha sido acompanhado por progressivo aumento de tamanho do vaso ou remodelamento positivo, que foi similar nos camundongos tratados com anticorpo anti-M2 ou controle, as células da camada vascular adventícia influenciam o remodelamento vascular5, sugerindo que modelos experimentais alternativos de lesão vascular serão necessários para investigar as respostas da camada vascular adventícia à lesão.
Por fim, o modelo experimental utilizado não contempla a presença de placa aterosclerótica preexistente no local do processo inflamatório e o implante de
O recrutamento de leucócitos após a lesão vascular é dependente da interação entre a integrina Mac-1 dos leucócitos (a Mb 2) e a glicoproteína Iba das plaquetas e a neutralização da interação Mac-1-GPIba inibe a proliferação celular e a formação neointimal.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Este artigo é parte de tese de doutorado de Alexandre do Canto Zago pela Universidade de São Paulo-USP e Harvard University.
Alexandre do Canto Zago Rua Ramiro Barcelos, 2350 - 2º andar- Hemodinâmica 90035-003 - Porto Alegre, RS - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 20/12/06; revisado recebido em 28/03/07; aceito em 09/05/07.
OBJECTIVE: To assess the importance of the interaction between leukocyte integrin Mac-1 (a Mb 2) and platelet glycoprotein (GP) Ib-a for leukocyte recruitment after vascular injury and the effect of the neutralization of the Mac-1-GPIba interaction on cell proliferation and the neointimal hyperplasia triggered by the vascular injury. METHODS: A peptide called M2 or anti-M2 antibody was developed to block the Mac-1-GPIba interaction. This peptide was injected and compared to a control-peptide in C57B1/6J mice submitted to vascular injury of the femoral artery with a guide wire. One, five or 28 days after the vascular injury, the femoral arteries were removed for morphometric and immunohistochemical analyses. RESULTS: The blocking of the Mac-1-GPIba interaction promoted a statistically significant reduction in the number of leukocytes in the neointimal layer on the first day after the vascular injury (control: 7.9±5.0% of the cell total versus anti-M2: 2.0±1.6%, p=0.021), as well as determined a statistically significant decrease in leukocyte accumulation in the neointimal layer on days 5 and 28 (control: 42.3±12.9% versus anti-M2: 24.6±10.8%, p=0.047 and control: 7.9±3.0% versus anti-M2: 3.3±1.3%, p=0.012; respectively). Cell proliferation in the neointimal layer of the vessel five days post-injury was reduced with the blocking of the Mac-1-GPIba interaction (control: 5.0±2.9% of the cell total versus anti-M2: 1.8±0.5%; p=0.043), along with a significant decrease in cell proliferation in the vessel neointimal layer 28 days post-injury (control: 3.8±1.7% versus anti-M2: 2.0±1.2%; p=0.047). The blocking of the Mac-1-GPIba interaction also determined a statistically significant decrease of the intimal thickening 28 days post-injury (control: 10,395±3,549 µm² versus anti-M2: 4,561±4,915 µm²; p=0.012). CONCLUSION: Leukocyte recruitment after a vascular injury depends on the Mac-1-GPIba interaction and the neutralization of this interaction inhibits cell proliferation and neointimal formation.
Instituto do Coração (InCor) - Universidade de São Paulo, Brigham and Women's Hospital/Harvard University, Boston, Massachussets, EUA, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)/Universidade Federal do Rio Grande do Sul, The Cleveland Clinic Foundation of Medicine, Houston, Texas, EUA
Increasing evidence of experimental and clinical studies supports the perception of atherosclerosis and re-stenosis as an inflammatory process. In this context, the inflammation is characterized by the interaction between platelets, leukocytes and endothelial cells1.
Experimental and clinical studies suggest a central role of leukocytes in neointimal proliferation due to vascular injury. In experimental models of vascular injury, the recruited leukocytes are pointed out as the precursors of the neointimal proliferation2,3.
Once adhered to the vascular wall, the platelets form an adhesive surface for the circulating leukocyte recruitment, which involves the following phases: adhesion mediated by selectins and rolling over the platelet surface, leukocyte activation, firm adhesion mediated by integrins and diapedesis4-6.
The phase of leukocyte firm adhesion to activated platelet surface is mediated by integrins from the b2 family, of which integrin Mac-1 is emphasized, also known as macrophage-1 antigen, aMb2 or CD11b/CD18.
A study in mice with integrin Mac-1 deficiency and submitted to vascular injury showed a decreased migration and accumulation of leukocytes on the arterial wall as well as attenuation of the neointimal proliferation7. Another study, which evaluated the blocking of integrin Mac-1 with a pan ligand antibody called M1/70, showed decreased leukocyte recruitment and neointimal proliferation 14 days after balloon angioplasty or stent implantation in rabbits8.
Simon and cols.9 recently located the binding site of integrin Mac-1 of the leukocytes with the Iba glycoprotein (GP) of platelets inside the segment aM(P201-K217) of the aMI9 domain, which allowed the development of a peptide called M2 or anti-M2.
The present study aims at evaluating the importance of the interaction between leukocyte integrin Mac-1 and platelet Iba glycoprotein for leukocyte recruitment after the vascular injury and the effect of the interaction neutralization between integrin Mac-1 and Iba glycoprotein on cell proliferation and neointimal hyperplasia triggered by vascular injury.
Peptides corresponding to the binding site of integrin Mac-1 on GPIba receptors of mice (SGSG-214LYFRHWLQENANNVYL229-C) and control peptides (SGSG-VEAFHLNYYRNNVWLQ-C) were obtained from W.M. Keck Biotechnology Resource Center – Yale University (New Haven, CT, EUA). The peptides were diluted in dimetilsulphoxide (DMSO) and stored at -80°C.
Fifty-three male C57BI/6J mice, aged 8 to 10 weeks, were obtained from the Animal Facility of Harvard University (Boston, MA, USA).
The common antigen leukocyte marker (CD45) –anti-CD45 antibody – was obtained from BD Biosciences (San Diego, CA, EUA); the specific marker for mouse neutrophils – monoclonal antibody 7/4 was supplied by Serotec (Indianapolis, IN, EUA); the Mac-3 marker, specific for mouse macrophages –monoclonal antibody M3/84 – was obtained from BD Biosciences and the bromodeoxyuridine (BrdU) was supplied by
A peptide-specific polyclonal antibody called peptide M2 or anti-M2 antibody, with affinity to the binding site of integrin Mac-1 to GPIba receptor, was developed through the immunization of rabbits with the C-201 PITQLLGRTHTATGIRK217 peptide coupled to KLH (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), corresponding to the human sequence am (P201-K217).
Subsequently, blood tests were conducted, which demonstrated high titers of anti-serum bound to the immobilized solid phase containing the C-P201-K217amino acid sequence.
The last phase was the purification of the peptide-specific polyclonal antibody – anti-M2 antibody or M2 peptide – by affinity chromatography (Zymed Laboratories).
IgG immunoglobulin from non-immunized rabbits was used as control antibody.
The C57BI/6J mice were randomly divided into two groups of treatment:
1- Rabbit M2 peptide and;
2- IgG immunoglobulin from non-immunized rabbits.
The M2 peptide or anti-M2 antibody was injected with the objective of blocking the interaction of integrin Mac-1 of the leukocytes with the platelet GPIba, aiming at inhibiting the leukocyte adhesion to the vessel surface covered by platelets. The IgG immunoglobulin from non-immunized rabbits was injected to serve as control, as it does not interact with Mac-1 integrin of the leukocytes or the platelet GPIba and does not present any inhibitory effect on the adhesion between leukocytes and platelets.
The antibodies were injected intraperitoneally in a single dose of 250 µg, 4 hours before the femoral artery injury (day 0) and subsequently in a single dose of 100 µg intraperitoneally on days 2, 4, 6, 8, 10 and 12 after the femoral artery injury.
Male C57B1/6J mice aged 8 to 10 weeks were anesthetized on day 0 with ketamine (80 mg/kg SC) and xylazine (5 mg/kg SC). Subsequently, an incision in the groin was made, followed by dissection and exposure of the femoral artery, temporary clamping of the femoral artery at the inguinal ligament level and arteriotomy distal to the epigastric artery under visualization with the surgical microscope.
A 0.010" guide wire was inserted into the femoral artery through the arteriotomy orifice, the clamp was removed and the guide wire was advanced until the bifurcation with the aorta and retreated to the anterior position three times (total of three insertions), aiming at causing an endoluminal injury to the common femoral artery. After the guide wire removal, the arteriotomy site was ligated.
This experimental model, described by Roque and cols.11 and used in the present study by a surgeon blinded to the treatment groups, is very similar to the process of vascular injury repair observed in humans after a percutaneous coronary intervention with stent implantation. The vascular injury technique by guide wire determines the stripping of the endothelium, deposition of platelets and fibrin and accentuated vascular inflammation, which makes this model useful to demonstrate the function of inflammatory cells (leukocytes) recruited at the neointimal formation modulation12-14.
All animals survived until the moment of the planned euthanasia without bleeding or infection.
All animals received humane care throughout the experiment and the procedures were revised and approved by the Harvard Medical School Standing Committee on Animals, which follows the criteria established by the American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care and by the National Institutes of Health.
Anesthesia was administrated, the thoracic cavity was open and the animals' euthanasia was carried out by bleeding through an incision to the right atrium 1 (one) day (control antibody: n=6; anti-M2: n=6), 5 days (control antibody: n= 9; anti-M2: n= 9) or 28 days (control antibody: n= 9; anti-M2: n= 9) after the vascular injury.
A 22-gauge butterfly catheter was inserted into the left ventricle for
The right and left femoral arteries were removed and immersed in buffered paraformaldehyde for posterior morphometric and immunohistochemical analysis.
All animals received BrdU at a dose of 50 mg/kg intraperitoneally (IP), 18 hours and one hour before the euthanasia, for the assessment of cell proliferation on the femoral artery wall.
The spleen and small intestine of three animals were used as controls for the immunohistochemical reactions due to the presence of abundant lymphoid tissue (leukocytes) in these organs.
The removed femoral arteries were initially formalin-fixed and later processed and paraffin-embedded. Two 1-mm distant cross-sectional cuts were performed, which were stained by the hematoxylin-eosin and Verhoeff techniques.
A researcher blinded to the treatment groups measured the luminal, intimal and medial areas of each transversal plane, using a microscope equipped with a CCD camera coupled to a computer running the NIH Image software, v1.60.
The luminal area was defined as the internal area surrounded by the layer of endothelial cells; the intimal area was defined as the area between the lumen and the internal elastic lamina; and the medial area was defined as the area between the internal and external elastic laminas.
The ratio between the intimal and the medial areas (intimal area/medial area) was also calculated to assess the effect of the inhibition of the Mac-1-GPIba interaction on this ratio, as well as to allow future comparisons with experimental models using larger animals.
The area delimitated by the external elastic lamina was measured to evaluate the vessel size behavior in the two groups throughout time, i.e., to determine whether there was positive or negative remodeling of the vessel.
The results of the two cross-sectional cuts of each artery were used to calculate the mean, which was considered in the evaluation and statistical analysis of the data.
To calculate the medial area and the assessment of the external elastic lamina in basal conditions, i.e., before the injury or treatment with anti-M2 antibody, a group of mice (n=5) was euthanized to perform the quantitative morphometry.
The immunohistochemical analysis was performed using the immunoperoxidase technique by the avidin-biotin system, with specific antibodies for each cell.
The anti-CD45 antibody (common leukocyte antigen) of mice was used as a leukocyte marker; the monoclonal antibody 7/4 was used for neutrophil identification and the monoclonal antibody M3/84 or anti-CD163 was used as a macrophage marker.
The BrdU uses the substitution of nucleotides to replace thymidine by uridine in the DNA structure of the dividing cells,
Cross-sectional cuts of the femoral artery, immunologically stained, were assessed to quantify the number of cells positively immunostained in relation to the total number of cells.
The data are presented as mean ± standard deviation (SD); the comparisons between the groups were carried out by non-paired
Initially, the post-injury leukocyte recruitment was assessed in relation to time. The function of the aMb2-GPIba interaction in this process was established, as there was a difference in the accumulation of leukocytes on the vessel wall of mice treated with M2 peptide or anti-M2 in comparison to the control group.
The CD45-positive inflammatory cells (leucocytes), which invaded the medial layer of the vessel on the first day post-injury were reduced by 75%, that is, from 7.9±5.0% of the total cells in the medial layer in the group of mice treated with non-immune IgG (control) to 2.0±1.6% in the group treated with anti-M2 (p=0.021) (
The accumulation of leukocytes in the developing neointimal was also significantly reduced by the anti-M2 treatment, as there was a reduction of 42% in five days (control: 42.3±12.9% of the total cells in the neointimal
The analysis of CD45-positive cells was extended through immunological staining techniques using specific cell markers, with the objective of quantifying the presence of neutrophils and macrophages.
The accumulation of neutrophils (cells that are positive for the monoclonal antibody 7/4) on the medial layer of the vessel on the first day post-injury was reduced by 75% in the group of mice treated with anti-M2, in comparison with the control group (control: 8.9±6.7%
No neutrophils were detected on the intimal and medial layers on the 28th day post-injury, in either treatment groups (
The macrophages (Mac-3-positive cells) were practically undetectable on the 1st day post-injury (<0.5% of the total cells on the medial layer). On the 5th day post-injury, the macrophage accumulation in the neointimal layer was reduced by 53% in the group of mice treated with anti-M2, in relation to the control group (control: 13.8±6.2%
Significant cell proliferation was observed 5 days after the vascular injury in the group of mice treated with the control antibody and the cell proliferation was still evident on the 28th day post-injury.
The treatment of mice with the anti-M2 antibody determined, however, a statistically significant decrease of 64% in cell proliferation in the medial layer of the vessel five days post-injury (control: 5.0±2.9% of the total cells in the medial layer of the vessel
In mice treated with the control antibody, the intimal thickening started 5 days post-injury and progressed significantly between 5 and 28 days post-injury. The blocking of the
aMb2-GPIba interaction, promoted by the treatment with anti-M2 antibody or M2 peptide, resulted in the decrease of the intimal (neointimal) thickening 5 days post-injury, in relation to the control group (control: 921±534 µm2
The blocking of the aMb2-GPIba interaction in mice treated with the anti-M2 antibody or M2 peptide determined, therefore, a reduction of 56% in the intimal thickening 28 days post-injury in relation to the control-group (
The medial layer area was not affected by the treatment with the anti-M2 antibody. Hence, the relation between the intimal and medial layer areas expressed by the intimal area/medial area ratio (I:M) 28 days post-injury was 56% lower in mice treated with the M-2 antibody in comparison with the control group (control: 1.20 ± 0.62
Quantitative morphometry of the external elastic lamina of the femoral artery of mice treated with anti-M2 antibody after the vascular injury
The thickening of the intimal and medial layers was followed by progressive increase in vessel size (positive remodeling), assessed by the measurement of the area of the external elastic lamina in different periods of time (
The positive remodeling of the vessel was similar in the two groups of treatment, 5 days (p=0.12) as well as 28 days after the vascular injury (p=0.99).
The present study demonstrated that the antibody, which has as target the segment P201-K217 of the IaM domain, reduces leukocyte accumulation, cell proliferation and neointimal thickening after vascular injury
The aMb2 integrin regulates important leukocyte functions such as adhesion, migration, coagulation, proteolysis, phagocytosis, oxidative stress and signaling as it binds to several ligands such as fibrinogen15,16, factor X17, C3bi18, GPIba9,19 and JAM-320.
The accurate identification of the ligand responsible for the accumulation of leukocytes at the vascular injury site, covered by adhered platelets, was, to date, still unknown. Although previous studies had shown that aMb2 integrin directly promotes leukocyte recruitment at the sites of platelet and fibrin deposition6, the actual biological importance of platelet contra-receptors for aMb2, such as GPIba, JAM-3 and fibrinogen bound to GPIIb/IIIa, is still quite unknown.
A previous study by Rogers and cols.8 ,in which the blocking of aMb2 integrin with the monoclonal antibody M1/70 was carried out, was not conclusive regarding the identification of the physiological contra-receptor for aMb2 integrin, because M1/70 is a
Another study by Simon and cols.7 identified aMb2 as a molecular determinant of neointimal thickening after vascular injury. It was observed that the selective absence of aMb2 in mice deficient for integrin Mac-1 impaired transplatelet leukocyte migration to the inner vessel wall, decreasing the accumulation of leukocytes in the medial layer and neointimal thickening after experimental angioplasty. In the same study, aMb2 deficiency was associated with a reduction of 67% in the early accumulation of leukocytes7 .
It is noteworthy the fact that the magnitude of the reduction in the early leukocyte accumulation in the previously described study was similar to that obtained with the blocking of the aMb2 -GPIba interaction through the M2 peptide in the present study (75% of inhibition of CD45-positive cells), suggesting that leukocyte recruitment is largely dependent on the interaction between aMb2 and GPIba. This finding is also consistent with another, observed in a previous
The relative specificity of the inhibitory action of anti-M2 in relation to GPIba, that is, it does not react with ICAM-1, fibrinogen and JAM-3, suggests a small contribution of other ligands for aMb2 integrin in the context of vascular injury, with stripped endothelium and platelet deposition10.
Other potential ligands for aMb2 integrin present in the platelet membrane include fibrinogen, which binds to GPIIb/IIIa15,16, ICAM-221 and JAM-320.
The leukocyte-platelet interaction, mediated by fibrinogen bridges between aMb2 and GPIIb/IIIa, was studied by Ostrovsky and cols.22, who demonstrated in an experimental
Although aMb2 integrin binds to ICAM-1, this receptor is not found in platelets, which express a similar receptor – ICAM-2. Diacovo and cols. demonstrated that the blocking of ICAM-2 has no effect on the firm adhesion of neutrophils over a surface of activated platelets, under continuous flow6.
Finally, Santoso and cols.20 recently reported that aMb2 integrin can also bind to JAM-3 of platelets, cooperating with GPIba for the adhesion between neutrophils and platelets
An
In the present study, the data of the vascular injury experiment in mice allow us to conclude that leukocyte recruitment, after the vascular injury, depends on the interaction between Mac-1 integrin and GPIba, as a specific antibody (anti-M2 or M2 peptide) directed at blocking the P201-K217 segment of the IaM domain, which is responsible for the interaction of leukocyte Mac-1 integrin and platelet GPIba, promoted a statistically significant reduction of 75% in the leukocyte accumulation in the medial layer of the vessel, on the first day post-injury and reduced by 42% and 58% the leukocyte accumulation in the intimal layer of the vessel, 5 and 28 days after the vascular injury, respectively.
Similarly, the morphometric data of this vascular injury experiment showed, through the neutralization of the Mac-1-GPIba interaction, that the latter modulates cell proliferation and neointimal formation. The anti-M2 antibody directed at blocking the Mac-1-GPIba interaction was able to significantly reduce cell proliferation in the medial layer of the vessel wall by 64% on the 5th day post-injury and cell proliferation in the intimal layer by 47%, on the 28th day post-injury, as well as decrease neointimal formation by 56% on the 28th day after the vascular injury (p=0.012).
Although the treatment with anti-M2 has reduced neointimal thickening by 56%, a less robust inhibitory effect when compared to the 80% of neointimal thickening inhibition with complete aMb2 deficiency in genetically modified mice in comparison to the wild-type ones, the anti-M2 outcome, in this first
A study in rats submitted to carotid artery injury with balloon-catheter showed a reduction of 45% of neointimal thickening in the group of rats treated with rapamycin, after 14 days, when compared to the control group23. Another study, carried out by Gallo and cols.24, showed that the administration of rapamycin i.m., 3 days before and 14 days after angioplasty with over-dimensioned balloon-catheter in the coronary artery, reduced neointimal thickening by 50% in relation to the control group in the period of 28 days24.
Similarly, the outcome of anti-M2 was better, or at least comparable, to most studies carried out with paclitaxel. Drachman and cols.25 showed a reduction of 50% in the neointimal thickening in iliac arteries of rabbits treated with paclitaxel and submitted to stent implantation, in relation to the control group25.
A study carried out in rats, using a model of carotid artery injury, showed a reduction of 70% in the neointimal thickening in the group treated with paclitaxel26. Two studies in swine treated with super-dimensioned stents, in the coronary artery, showed that paclitaxel-eluting covered stents reduced neointimal thickening by 40%, in a period of 4 weeks, in comparison with the control group27,28.
It is noteworthy that rapamycin and paclitaxel are the anti-cell-proliferation drugs largely used in drug-eluting stents, also called drug-coated stents or medicated stents.
The first study with rapamycin-eluting stent in humans showed an angiographic restenosis rate equal to 0% at 4 and 12 months29,30. The randomized studies showed a statistically significant reduction of the intra-stent restenosis rates at 8 months of 35.4%-41.7% for the conventional stent versus 3.2-3.9% for the rapamycin-eluting stent31,32.
Similarly, the RESEARCH study, which evaluated the performance of the rapamycin-eluting stent in the real world, i.e., in patients that were not selected by inclusion or exclusion criteria, confirmed these promising results in Intervention Cardiology practice, with an intra-stent restenosis rate of 6.3% at 6 months33.
The first study with paclitaxel-eluting stent in humans also showed an angiographic restenosis rate at 6 months of 0%34, whereas the randomized studies showed a reduction of the angiographic restenosis rate at 6-9 months from 17.9-24.4% for the conventional stent to 2.3-5.5% for the paclitaxel-eluting stent35,36. The T-SEARCH study evaluated the results of the paclitaxel-eluting stent in the real world and showed the need for target-vessel revascularization in patients selected by clinical criteria in only 5.4% of them, within a one-year period.37.
Considering the results of the experimental and clinical studies with rapamycin and paclitaxel, as well as the initial outcome of the blocking of the Mac-1-GPIba interaction with anti-M2 antibody in this experimental study, it can inferred that there is a potential angiographic and clinical benefit for anti-M2 antibody or M2 peptide. It is clear that differences in methodology, the drug administration pathway and the species of animals used in the mentioned experimental studies with rapamycin and paclitaxel must be tsaken into account in the assessment of results when compared to those obtained in the present study.
The neutralization of the Mac-1-GPIba interaction through the blocking of the aM(P201-K217) segment with anti-M2 antibody, seems, therefore, to be a promising new therapeutic approach to prevent restenosis after percutaneous coronary intervention. However, additional studies with the local release of anti-M2 at different doses are strongly recommended, considering that the local release showed to have a crucial role for the successful use of anti-cell-proliferation drug-eluting stents.
Additionally, anti-M2 reduces firm adhesion and transmigration of leukocytes in sites of platelet deposition, one of the first steps of vascular inflammation. Hence, anti-M2 has a potential effect against vascular inflammation and seems to be promising in the control and/or prevention of coronary artery disease and aggressive/progressive vascular disease.
One of the limitations of the present study is that one cannot rule out the contribution of other ligands of the aMb2 receptor and its functions, as well as exclude the participation of other cell adhesion molecules in the biological response to the vascular injury. Likewise, the function of the adventitial layer of the vessel wall was not assessed as a source of infiltrating inflammatory cells, which constitutes another study limitation.
Leucocytes can infiltrate the wall through the lumen as well as through the adventitia; however, leukocyte recruitment through the adventitia layer is difficult to reliably assess in this experimental model due to the need for dissection and isolation of the artery from the adjacent tissues to cause the injury with guide wire.
Additionally, although the thickening of the intimal and media layers was followed by the progressive increase in vessel size or positive remodeling, which was similar in the mice treated with anti-M2 antibody or control, the cells from adventitia layer influenced vascular remodeling5, suggesting that alternative experimental models of vascular injury will be necessary to investigate the responses of the adventitia layer to the injury.
Finally, the experimental model used does not contemplate the presence of the pre-existing atherosclerotic plaque in the inflammatory process site and the stent implantation, factors that might be considered additional limitations to this study, as it differs from the clinical treatment of atherosclerotic lesions with stent implantation.
Leukocyte recruitment after a vascular injury depends on the interaction between the leukocyte Mac-1-integrin (aMb2) and the platelet Iba glycoprotein and the neutralization of the Mac-1-GPIba interaction inhibits cell proliferation and neointimal formation.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by Harvard University.
This article is part of the thesis of doctoral submitted by Alexandre do Canto Zago, from Universidade de São Paulo-USP and Harvard University.
Alexandre do Canto Zago Rua Ramiro Barcelos, 2350, 2º andar - Hemodinâmica 90035-003 - Porto Alegre, RS - Brazil E-mail:
Manuscript received on 12/20/06; revised manuscript received on 03/28/07; accepted on 05/09/07.