abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil F3d9f7bqPpMvvsCyvxW8KBQ 00002 S0066-782X2007001500002 S0066-782X(07)08900302 10.1590/S0066-782X2007001500002 Artigos Originais Efeitos do betacaroteno e do tabagismo sobre a remodelação cardíaca pós-infarto do miocárdio Zornoff Leonardo A. M. Duarte Daniella R. Minicucci Marcos F. Azevedo Paula S. Matsubara Beatriz B. Matsubara Luiz S. Campana Álvaro O. Paiva Sergio A. R. Botucatu São Paulo Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina de Botucatu Brazil 09 2007 89 3 151 157 26 03 2007 01 03 2007 18 12 2006 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

OBJETIVO: Analisar os efeitos do betacaroteno no processo de remodelação ventricular após o infarto agudo do miocárdio (IAM), em ratos expostos à fumaça do cigarro. MÉTODOS: Após o IAM, os animais foram divididos em quatro grupos: 1) grupo C, 24 animais que receberam dieta-padrão; 2) grupo BC, 26 animais que receberam betacaroteno; 3) grupo EFC, 26 animais que receberam dieta-padrão e foram expostos à fumaça de cigarro; e 4) grupo BC+EFC, 20 animais que receberam betacaroteno e foram expostos à fumaça de cigarro. Após seis meses, foi realizado estudo morfofuncional. Utilizou-se significância de 5%. RESULTADOS: Em relação às áreas diastólicas (AD) e sistólicas (AS), os valores do grupo BC foram maiores que os do grupo C. Considerando a AD/peso corporal (PC) e AS/PC, os valores do grupo BC+EFC foram maiores que os valores de C. Em relação à fração de variação de área, foram observadas diferenças significativas entre EFC (valores menores) e C (valores maiores) e entre BC (valores menores) e C (valores maiores). Não foram observadas diferenças entre os grupos em relação ao tamanho do infarto. O grupo EFC apresentou valores maiores da área seccional dos miócitos (ASM) que os animais-controle. Em adição, o grupo BC+EFC apresentou maiores valores de ASM que BC, EFC e C. CONCLUSÃO: Após o infarto do miocárdio, o tabagismo e o betacaroteno promoveram intensificação do processo de remodelação cardíaca; houve potencialização dos efeitos deletérios no processo de remodelação com os dois tratamentos em conjunto.

 Betacaroteno tabagismo infarto do miocárdio remodelação ventricular 25 09 2007

ARTIGO ORIGINAL

Efeitos do betacaroteno e do tabagismo sobre a remodelação cardíaca pós-infarto do miocárdio

Leonardo A. M. Zornoff; Daniella R. Duarte; Marcos F. Minicucci; Paula S. Azevedo; Beatriz B. Matsubara; Luiz S. Matsubara; Álvaro O. Campana; Sergio A. R. Paiva

Faculdade de Medicina de Botucatu da Universidade Estadual de São Paulo - Botucatu, SP - Brasil

Correspondência

RESUMO

OBJETIVO: Analisar os efeitos do betacaroteno no processo de remodelação ventricular após o infarto agudo do miocárdio (IAM), em ratos expostos à fumaça do cigarro.

MÉTODOS: Após o IAM, os animais foram divididos em quatro grupos: 1) grupo C, 24 animais que receberam dieta-padrão; 2) grupo BC, 26 animais que receberam betacaroteno; 3) grupo EFC, 26 animais que receberam dieta-padrão e foram expostos à fumaça de cigarro; e 4) grupo BC+EFC, 20 animais que receberam betacaroteno e foram expostos à fumaça de cigarro. Após seis meses, foi realizado estudo morfofuncional. Utilizou-se significância de 5%.

RESULTADOS: Em relação às áreas diastólicas (AD) e sistólicas (AS), os valores do grupo BC foram maiores que os do grupo C. Considerando a AD/peso corporal (PC) e AS/PC, os valores do grupo BC+EFC foram maiores que os valores de C. Em relação à fração de variação de área, foram observadas diferenças significativas entre EFC (valores menores) e C (valores maiores) e entre BC (valores menores) e C (valores maiores). Não foram observadas diferenças entre os grupos em relação ao tamanho do infarto. O grupo EFC apresentou valores maiores da área seccional dos miócitos (ASM) que os animais-controle. Em adição, o grupo BC+EFC apresentou maiores valores de ASM que BC, EFC e C.

CONCLUSÃO: Após o infarto do miocárdio, o tabagismo e o betacaroteno promoveram intensificação do processo de remodelação cardíaca; houve potencialização dos efeitos deletérios no processo de remodelação com os dois tratamentos em conjunto.

Palavras-chave: Betacaroteno, tabagismo, infarto do miocárdio, remodelação ventricular.

Introdução

As doenças cardiovasculares estão em primeiro lugar entre as causas de morte no Brasil, correspondendo a 32% do total de óbitos1. Entre as doenças cardiovasculares, o infarto do miocárdio destaca-se como a patologia com maior índice de mortalidade2.

Especula-se que o tabagismo tenha influência na prevalência de infarto do miocárdio por meio de diversos mecanismos, dentre os quais poderíamos citar lesão aterosclerótica, aumento da agregação plaquetária, aumento dos níveis das moléculas de adesão e fibrinogênio e vasoconstrição3,4.

Apesar de a associação entre a exposição à fumaça do cigarro e o infarto do miocárdio ser universalmente aceita, os efeitos do tabagismo ou de compostos produzidos pela queima do cigarro diretamente sobre o coração são menos conhecidos. No modelo de agressão cardíaca envolvendo a exposição à fumaça de cigarro, nosso grupo observou que a suplementação da dieta com betacaroteno atenuou o processo de remodelação cardíaca induzido pela exposição à fumaça de cigarro em ratos, em parte por sua capacidade de diminuir o estresse oxidativo5.

Em recente estudo de nosso laboratório, a exposição à fumaça do cigarro por seis meses resultou em intensificação da remodelação após IAM6. Nesse contexto, é relevante considerar que o estresse oxidativo é aceito como um dos mais importantes moduladores da remodelação ventricular após o IAM7-9. Dessa forma, substâncias com capacidade antioxidante, como o betacaroteno, poderiam atenuar esse processo.

Considerando que a exposição à fumaça de cigarro intensifica o processo de remodelação cardíaca após o infarto, pode-se propor a hipótese de que a administração de betacaroteno atenuaria as alterações relacionadas à remodelação cardíaca pós-IAM em ratos expostos à fumaça de cigarro. Assim, o objetivo desse estudo foi analisar os efeitos da suplementação de betacaroteno no processo de remodelação cardíaca, em ratos submetidos ao infarto do miocárdio experimental e expostos à fumaça de cigarro.

Métodos

Infarto do miocárdio - O protocolo experimental do presente trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal de nossa instituição e está em conformidade com os Princípios Éticos na Experimentação Animal, adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal.

Foram utilizados ratos Wistar, machos, provenientes do Biotério da Unicamp. Os animais foram mantidos em gaiolas para recuperação, alimentados com ração comercial padrão e livre acesso à água, com controle de luz (ciclos de 12 horas), de temperatura (aproximadamente 25° C) e de umidade.

O infarto do miocárdio foi produzido de acordo com método descrito previamente10. Após o IAM, os animais foram observados por período de seis meses.

Grupos experimentais - Quarenta e oito horas após o IAM, os animais foram alocados em quatro grupos experimentais: 1) grupo C, n = 24 - formado pelos animais que receberam a dieta mencionada, sem suplementação de betacaroteno e sem exposição à fumaça de cigarro; 2) grupo BC, n = 26 - formado pelos animais que receberam betacaroteno, na forma de cristal adicionado e misturado na dieta, na dose de 500 mg de betacaroteno/kg de dieta e que não foram expostos à fumaça de cigarro; 3) grupo EFC, n = 26 - formado pelos animais que receberam a dieta sem suplementação com betacaroteno e que foram expostos à fumaça de cigarro; e 4) grupo BC+EFC, n = 20 - formado pelos animais que receberam betacaroteno na mesma forma que o BC e foram expostos à fumaça de cigarro. A quantidade de dieta oferecida aos grupos "não-fumantes" (C e BC) foi ajustada de acordo com as ingestões diárias observadas nos grupos "fumantes" (EFC e BC+EFC).

Exposição ao fumo - Para expor os animais à fumaça do cigarro, foi utilizado o método proposto por Wang e cols.11, já padronizado em nosso laboratório5,7. No fim do período de estudo experimental, os animais foram expostos à fumaça de 40 cigarros/dia.

Avaliação morfológica e funcional pelo ecocardiograma - Após seis meses do infarto do miocárdio, os animais sobreviventes foram submetidos ao estudo ecocardiográfico. Utilizou-se equipamento da Hewlett-Packard (modelo Sonos 2000) ou da Philips (modelo TDI 5500) dotado de transdutor eletrônico de 12 MHz. As estruturas cardíacas foram medidas de acordo com as recomendações da American Society of Echocardiography12 e já validadas no modelo de ratos infartados13. As áreas diastólicas (AD) e sistólicas (AS) foram medidas no modo bidimensional, por meio de planimetria e ajustadas ao peso corporal (PC) dos animais. A função sistólica do ventrículo esquerdo foi avaliada calculando-se a fração de variação de área (FVA=AD-AS/AD x 100)13.

Avaliação funcional por meio do coração isolado - Entre um e três dias após o estudo ecocardiográfico, os animais receberam pentobarbital sódico (50 mg/kg) e heparina (1.000 UI) por via intraperitoneal e foram submetidos a estudo funcional in vitro por meio da técnica com o coração isolado. Nessa preparação, em que o coração opera em condições isovolumétricas, foram obtidos os registros da pressão sistólica (PS), da derivada positiva (dp/dt) e da derivada negativa (-dp/dt) de pressão máximas14.

Estudo morfométrico - Após o estudo funcional, amostras de tecido cardíaco foram fixadas em solução de formol a 10% por período de 48 horas, segundo método já descrito15, para aferição da área seccional transversa dos miócitos (ASM) e da fração de colágeno intersticial (CI).

A extensão do músculo infartado e viável nas circunferências endocárdica e epicárdica foi determinada por planimetria. O tamanho do infarto foi calculado pela divisão das circunferências ventriculares endocárdica e epicárdica da região infartada pelas circunferências endocárdica e epicárdica totais. As medidas foram realizadas em cortes transversais do ventrículo esquerdo, cinco a seis milímetros do ápice, assumindo-se que, nessa região, os cortes apresentam relação linear com a soma das medições das áreas de todos os cortes do coração16,17.

Método estatístico - Com relação às variáveis morfológicas e funcionais, foi aplicada a análise de variância (ANOVA) de um e de dois fatores. Na ANOVA de uma via, 3 graus de liberdade foram aplicados para detectar diferenças entre os tratamentos. Ocorrendo interação significativa entre os fatores (p < 0,05), foram realizadas comparações múltiplas, utilizando-se o teste de Tukey. Quando não ocorreu a interação (p > 0,05), as variáveis estudadas foram testadas quanto aos efeitos dos fatores de modo separado. Os resultados foram apresentados em valores médios e em erros-padrão (SE) da média dos quatro grupos estudados (C, BC, EFC e BC+EFC). O nível de significância adotado foi de 5%.

Empregou-se, para a análise dos testes de ANOVA de uma e de duas vias, o pacote estatístico SigmaStat for Windows v 2.03 da SPSS.

Resultados

As tabelas 1 e 2 sumarizam os resultados do estudo ecocardiográfico. Considerando a análise da ANOVA de uma via, podem-se observar diferenças entre os grupos na relação diâmetro do átrio esquerdo (AE) ajustado pelo PC, onda A, freqüência cardíaca (FC), AD/PC no eixo menor, AS/PC no eixo menor e FVA. Em relação à AD/PC e AS/PC, os valores do grupo BC foram maiores que os do grupo C; em relação à onda A e FAV, os valores do grupo BC foram menores que os dos animais-controle. Em relação à AE/PC, AD/PC e AS/PC, os valores do grupo BC+EFC foram maiores que os valores de C. Em relação à FC, tanto os valores de EFC como os de BC+EFC foram maiores que os valores de C.

Considerando a análise ANOVA de duas vias, em relação à FAV, foram observadas diferenças significativas entre EFC (valores menores) e C (valores maiores) e entre BC (valores menores) e C (valores maiores). Em adição, houve interação significativa entre os grupos, sugerindo que o efeito do fumo dependeu do betacaroteno. Assim, os valores de FAV foram maiores no grupo BC + EFC do que nos animais que receberam tratamentos isolados (fig. 1). Em relação às outras variáveis, não foram observadas interações. Não tendo ocorrido interação significativa entre fatores (exposição à fumaça de cigarro e suplementação da dieta com betacaroteno), entende-se que os efeitos de um fator não dependeram do outro fator. Dessa forma, os valores de AE/PC, AD/PC no eixo maior, AD/PC no eixo menor e AS/PC no eixo menor foram maiores, e os valores das ondas A e E foram menores nos animais suplementados com betacaroteno (BC e BC+EFC) que nos animais não suplementados com betacaroteno (C e EFC). Em relação à FC, os valores dos animais fumantes (EFC e BC+EFC) foram maiores que os verificados nos animais não-fumantes (C e BC).

Os dados relativos ao estudo funcional do coração isolado estão apresentados na tabela 3. Considerando a ANOVA de uma via, foram observadas diferenças em relação à –dp/dt máxima, desde que os valores de BC foram menores que os valores de BC+EFC. Considerando a ANOVA de duas vias, ocorreu interação estatisticamente significativa entre o fumo e a suplementação do betacaroteno. A análise da –dp/dt máxima mostrou diferenças entre o grupo BC (valores menores) em relação ao grupo BC+EFC (valores maiores) e entre EFC (valores menores) e BC+EFC (valores maiores). Em relação à PS máxima, houve interação estatisticamente significativa entre o fumo e a suplementação do betacaroteno. Na análise, observaram-se diferenças entre BC (valores menores) e C (valores maiores) e entre BC (valores menores) e BC+EFC (valores maiores). Em relação ao volume máximo injetado no balão, houve interação estatisticamente significativa entre o fumo e a suplementação do betacaroteno (fig. 2). A análise mostrou diferenças entre os valores de EFC (valores menores) e C (valores maiores) e entre BC (valores menores) e BC+EFC (valores maiores).

Os dados relativos às analises morfométricas estão na tabela 4. Não foram observadas diferenças entre os grupos em relação ao tamanho do infarto. Considerando a ANOVA de uma via, observaram-se diferenças entre os grupos em relação ao PC, PVD/PC, ASM e teor de água dos pulmões, VD e VE. O grupo EFC apresentou valores maiores de PVD/PC e ASM que os animais-controle. Em adição, o grupo BC+EFC apresentou maiores valores de ASM que BC, EFC e C. Em relação ao teor de água dos pulmões, o grupo EFC apresentou valores maiores que C (C = 22,0±3,0, EFC = 29,0±2,0; p < 0,05). Em adição, o grupo BC+EFC apresentou maiores valores de teor de água no VD (C = 4,63±0,33, BC+EFC = 5,69±0,14; p < 0,05) e VE (C = 5,11±0,25, BC+EFC = 6,81±0,31; p < 0,05) que o grupo C.

Considerando a ANOVA de duas vias, foi observada interação em relação ao PVC/PC e ASM. Em relação ao PVD/PC, observou-se diferença significativa entre EFC (valores maiores) e C (valores menores). A relação PVD/PC foi menor no grupo BC+EFC que no grupo EFC. Em relação aos valores de ASM, os valores de EFC foram maiores que C, os valores de BC+EFC foram maiores que BC e que EFC (fig. 3). Em relação ao teor de água, os animais fumantes (EFC e BC+EFC) apresentaram maiores valores que os animais não-fumantes (C e BC).

Discussão

O objetivo do presente trabalho foi analisar os efeitos da suplementação de betacaroteno no processo de remodelação ventricular, após o infarto agudo do miocárdio, em ratos expostos à fumaça do cigarro. Nossa hipótese era que os efeitos antioxidantes do betacaroteno resultariam em atenuação do processo de remodelação pós-IAM em animais expostos à fumaça de cigarro. Diferentemente da nossa hipótese, entretanto, nossos resultados sugerem que o betacaroteno intensificou o processo de remodelação cardíaca pós-infarto nessa situação. Em adição, a suplementação de betacaroteno potencializou os efeitos morfológicos deletérios induzidos pelo infarto.

A remodelação cardíaca pode ser definida como alterações genéticas que resultam em modificações moleculares, celulares e intersticiais cardíacas. Essas alterações podem se manifestar clinicamente como alterações de volume, massa, constituição, geometria e/ou de função cardíaca18-20. Apesar da extrema complexidade do processo de remodelação ventricular após o infarto do miocárdio, esse termo é freqüentemente utilizado como sinônimo de crescimento celular, detectado pelo aumento da cavidade ventricular18-20. Um aspecto relevante desse processo refere-se ao fato de que a remodelação ventricular pós-infarto do miocárdio está associada a pior prognóstico, pois sua presença e intensidade estão relacionadas com fibrose, disfunção ventricular progressiva, arritmias e maior mortalidade21.

Os mecanismos que modulam o processo de remodelação após o infarto não estão completamente esclarecidos. Atualmente é aceito que o aumento do estresse oxidativo, decorrente do acúmulo das espécies reativas de oxigênio, possa ser um dos mecanismos desencadeantes ou reguladores das adaptações cardíacas em resposta à determinada agressão22-24. Assim, situações caracterizadas por aumento do estresse oxidativo após o infarto poderiam potencializar o processo de remodelação.

Uma das condições caracterizadas por aumento do estresse oxidativo é o hábito de fumar. Devemos considerar, entretanto, que poucos estudos analisaram os efeitos do tabagismo no processo de remodelação ventricular após o infarto do miocárdio. A nicotina promoveu dilatação do ventrículo esquerdo em ratos submetidos ao infarto do miocárdio. Aparentemente, esse fenômeno ocorre à custa do aumento da expansão do infarto, já que se detectou parede infartada mais delgada nos animais tratados25. Em nosso laboratório, a exposição à fumaça do cigarro por seis meses resultou em intensificação da remodelação, o que foi acompanhado de piora de variáveis funcionais7. Assim, a exposição à fumaça do cigarro parece promover remodelação tanto em condições normais como em situações de agressão cardíaca.

No presente trabalho, os animais expostos à fumaça do cigarro apresentaram aumento das dimensões sistólicas e diastólicas do VE e aumento da área seccional dos miócitos em relação aos animais-controle. Portanto, podemos inferir que a exposição à fumaça do cigarro intensificou o processo de remodelação ventricular após o infarto, em concordância com estudos citados anteriormente6,7.

Considerando que tanto o infarto agudo do miocárdio como a exposição à fumaça do cigarro representam condições de aumento do estresse oxidativo, formulamos a hipótese de que a administração de betacaroteno atenuaria a remodelação ventricular secundária a essas agressões. Entretanto, contrariamente à nossa hipótese, os animais expostos aos dois tratamentos (betacaroteno e exposição à fumaça do cigarro) apresentaram intensificação adicional da remodelação cardíaca, representada pelo aumento do átrio esquerdo e pela área seccional dos miócitos. Em adição, o grupo suplementado apresentou aumento das dimensões sistólicas e diastólicas do VE, em relação aos animais do grupo controle. Até o momento, os mecanismos responsáveis por esses efeitos deletérios do betacaroteno no processo de remodelação pós-infarto não estão esclarecidos. Porém, a despeito desse fato, em relação às perspectivas clínicas do estudo, nosso trabalho sugere cautela com o uso de antioxidantes, particularmente o betacaroteno e na presença de tabagismo, para proteção cardiovascular após o infarto do miocárdio.

A remodelação cardíaca resulta, invariavelmente, em queda progressiva da função ventricular. Inicialmente, em conseqüência do crescimento celular, a remodelação pode contribuir para manter ou restaurar a função cardíaca. Cronicamente, entretanto, ocorrem alterações bioquímicas, genéticas e estruturais que vão resultar em disfunção ventricular progressiva. Em nosso estudo, os resultados funcionais estão parcialmente discordantes desse conceito. No grupo suplementado com betacaroteno, variáveis ecocardiográficas e do coração isolado confirmam disfunção ventricular esquerda em relação ao grupo-controle. No grupo betacaroteno e fumo, entretanto, apesar da mais intensa remodelação, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas em relação ao grupo-controle. Entretanto, encontramos melhora da função em algumas variáveis desse grupo em relação ao grupo BC. Uma explicação para esse fato pode estar relacionada aos efeitos agudos ou crônicos da exposição à fumaça do cigarro.

Em nosso trabalho, tanto o estudo ecocardiográfico como a análise com o coração isolado foram feitos no período da tarde. Entretanto, os animais foram expostos à fumaça do cigarro no período da manhã. Assim, poderíamos inferir que a análise funcional pode ter sofrido influência da estimulação inotrópica positiva aguda do cigarro. Essa limitação deve ser considerada na interpretação de nossos resultados. Corroborando essa hipótese, os animais fumantes apresentaram maior freqüência cardíaca e maior teor de água em alguns dos órgãos analisados, compatível com situação de disfunção ventricular crônica.

Em suma, os dados obtidos nesse estudo permitem as seguintes conclusões: a exposição dos ratos à fumaça de cigarro, após o infarto do miocárdio, promoveu intensificação do processo de remodelação cardíaca; a suplementação da dieta com betacaroteno resultou em aumento da remodelação cardíaca provocada pelo infarto miocárdico experimental; houve potencialização dos efeitos deletérios no processo de remodelação com os dois tratamentos em conjunto.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflitos de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP.

Vinculação Acadêmica

Esse artigo é parte de tese de livre-docência de Leonardo A. M. Zornoff, pela Faculdade de Medicina de Botucatu.

Correspondência:

Leonardo A. M. Zornoff

Faculdade de Medicina de Botucatu

Departamento de Clínica Médica

18618-000

Botucatu, SP - Brasil

E-mail:

lzornoff@fmb.unesp.br

Artigo recebido em 18/12/06; revisado recebido em 01/03/07; aceito em 26/03/07.

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Nicotine-modified post-infarction left ventricular remodeling Am J Physiol 1999 H1103 6 276 Villarreal FJ Hong D Omens J Original Articles Effects of beta-carotene and smoking on heart remodeling after myocardial infarction

OBJECTIVE: To analyze the effects of beta-carotene on the ventricular remodeling process following myocardial infarction (MI) in rats exposed to cigarette smoke. METHODS: After acute myocardial infarction (AMI), the animals were divided into four groups: 1) Group C, 24 animals that were given standard diet; 2) Group BC, 26 animals that were given beta-carotene; 3) Group ECS, 26 animals that were given standard diet and were exposed to cigarette smoke; and 4) Group BC+ECS, 20 animals that were given beta-carotene and were exposed to cigarette smoke. After six months, a morphofunctional study was performed. We used a 5% significance level. RESULTS: As regards diastolic areas (DA) and systolic areas (SA), the values for the BC group were higher than those for the C group. If DA/body weight (BW) and SA/BW are considered, the values for group BC+ECS were higher than the values for group C. As regards the fractional area change, we observed significant differences between ECS (lower values) and C (higher values) and between BC (lower values) and C (higher values). Differences between groups regarding infarction size were not observed. The ECS group presented higher values for myocyte cross-section area (MCA) than control animals. Additionally, the BC+ECS group presented higher MCA values than the BC, ECS and C groups. CONCLUSION: After myocardial infarction, smoking and beta-carotene intensified the heart remodeling process; harmful effects of the remodeling process were heightened when the two treatments were used in conjunction.

 Betacarotene smoking myocardial infarction ventricular remodeling

ORIGINAL ARTICLE

Effects of beta-carotene and smoking on heart remodeling after myocardial infarction

Leonardo A. M. Zornoff; Daniella R. Duarte; Marcos F. Minicucci; Paula S. Azevedo; Beatriz B. Matsubara; Luiz S. Matsubara;Álvaro O. Campana; Sergio A. R. Paiva

Faculdade de Medicina de Botucatu da Universidade Estadual de São Paulo, Botucatu, SP - Brazil

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SUMMARY

OBJECTIVE: To analyze the effects of beta-carotene on the ventricular remodeling process following myocardial infarction (MI) in rats exposed to cigarette smoke.

METHODS: After acute myocardial infarction (AMI), the animals were divided into four groups: 1) Group C, 24 animals that were given standard diet; 2) Group BC, 26 animals that were given beta-carotene; 3) Group ECS, 26 animals that were given standard diet and were exposed to cigarette smoke; and 4) Group BC+ECS, 20 animals that were given beta-carotene and were exposed to cigarette smoke. After six months, a morphofunctional study was performed. We used a 5% significance level.

RESULTS: As regards diastolic areas (DA) and systolic areas (SA), the values for the BC group were higher than those for the C group. If DA/body weight (BW) and SA/BW are considered, the values for group BC+ECS were higher than the values for group C. As regards the fractional area change, we observed significant differences between ECS (lower values) and C (higher values) and between BC (lower values) and C (higher values). Differences between groups regarding infarction size were not observed. The ECS group presented higher values for myocyte cross-section area (MCA) than control animals. Additionally, the BC+ECS group presented higher MCA values than the BC, ECS and C groups.

CONCLUSION: After myocardial infarction, smoking and beta-carotene intensified the heart remodeling process; harmful effects of the remodeling process were heightened when the two treatments were used in conjunction.

Key words: Betacarotene; smoking; myocardial infarction; ventricular remodeling.

Introduction

Cardiovascular diseases rank first among the causes of death in Brazil, and account for 32% of the total deaths1. Among cardiovascular diseases, myocardial infarction stands out as the pathology with the highest mortality rate2.

Smoking is thought to have an influence on the prevalence of myocardial infarction by means of several mechanisms, including atherosclerotic injury, increase in platelet aggregation, increase in the levels of adhesion molecules and fibrinogen and vasoconstriction3,4

Although the association between exposure to smoke and myocardial infarction is universally accepted, the direct effects of smoking or of compounds produced during cigarette burning on the heart are less known. In the heart aggression model that involves exposure to cigarette smoke, our group observed that dietary supplementation with beta-carotene mitigated the heart remodeling process induced by cigarette smoke exposure in rats, partly because of its ability to reduce oxidative stress5.

In a recent study carried out in our laboratory, exposure to cigarette smoke for six months after AMI led to intensification in remodeling6. In this context, it is important to consider that oxidative stress is accepted as one of the most important modulators of post-AMI ventricular remodeling7-9. Thus, antioxidant substances such as beta-carotene might mitigate this process.

Considering that cigarette smoke exposure intensifies post-infarction heart remodeling process, we advance the hypothesis that the administration of beta-carotene could mitigate alterations relating to post-AMI heart remodeling in rats exposed to cigarette smoke. Therefore,the objective of this study was to analyze the effects of beta-carotene supplementation on the heart remodeling process in rats submitted to experimental myocardial infarction and exposed to cigarette smoke.

Methods

Myocardial infarction - The experimental protocol of this study was approved by the Animal Experiment Ethics Committee of our institution and complies with the Animal Experiment Ethical principles adopted by the Brazilian College for Animal Experiments.

We used male Wistar rats, from Unicamp’s Laboratory Animal Facility. The animals were kept in cages for recovery, and fed on standard commercial feed and water ad lib, with controlled light (12-hour cycles), temperature (approximately 25° C) and humidity.

Myocardial infarction was produced according to the method previously described10. After AMI, animals were observed for a six-month period.

Experimental groups - Forty-eight hours after the AMI the animals were placed in four experimental groups: 1) Group C, n = 24 - formed by animals that were given the diet mentioned above, with no beta-carotene supplements and with no exposure to cigarette smoke; 2) Group BC, n = 26 - formed by animals that were given beta-carotene, in the form of crystal added to and mixed with the diet, at a dosage of 500 mg of beta-carotene/kg of feed, with no exposure to cigarette smoke; 3) Group ECS, n = 26 - formed by the animals that were given feed with no beta-carotene supplementation and were exposed to cigarette smoke; and 4) Group BC+ECS, n = 20 - formed by animals that were given beta-carotene in the same form as Group BC and were exposed to cigarette smoke. The amount of feed offered to the "non smoking" groups (C and BC) was adjusted according to the daily intake observed in the "smoking" groups (ECS and BC+ECS).

Exposure to smoke - In order to expose the animals to cigarette smoke we used the method proposed by Wang et al11, that had been standardized in our laboratory5,7. At the end of the period of the experimental study, the animals had been exposed to the smoke of 40 cigarettes/day.

Morphological and functional assessment through echocardiogram - Six months after the myocardial infarction, the surviving animals were submitted to echocardiographic study. We used a Hewlett-Packard (Sonos 2000 model) or Philips (TDI 5500) model, equipped with a 12-MHz electronic transducer. The heart structures were measured according to the recommendations of the American Society of Echocardiography12 which have been validated for the infarcted rat model13. Diastolic (DA) and systolic areas (SA) were measured using the bidimensional mode, by means of planimetry and adjusted for the animals’ body weight (BW). The left ventricular systolic function was assessed by calculating the variation fraction of the area (FAC=DA-SA/DA x 100)13.

Functional assessment by means of the isolated heart - Between one and three days after the echocardiographic study, the animals were administered sodium pentobarbital (50 mg/kg) and heparin (1,000 UI) intraperitoneally and were submitted to in vitro functional study using the isolated heart technique. In this preparation, where the heart operates in isovolumetric conditions, we obtained the values for systolic pressure (SP), for the positive derivative (dp/dt) and negative derivative (-dp/dt) of the maximum pressures14.

Morphometric study - After the functional study, heart tissue samples were fixated in a 10% formol solution for a 48-hour period, according to the method previously described15, to measure the myocyte cross-section area (MCA) and the interstitial collagen fraction (IC).

The extent of infarcted muscle, as well as of viable muscle in the endocardial and epicardial circumferences was determined by planimetry. Infarction size was calculated by dividing endocardial and epicardial ventricular circumferences in the infarcted area by total endocardial and epicardial circumferences. The measurements were taken in cross-sectional planes of the left ventricle, five to six millimeters from the apex, assuming that in this region the planes present a linear relation with the sum of the measurements of the areas of all the heart planes16,17.

Statistical method - As regards morphological and functional variables, we employed analysis of variance (ANOVA) of one and two factors. In the one-way ANOVA, three degrees of freedom were applied to identify differences between treatments. If there was significant interaction between factors (p < 0.05), multiple comparisons were carried out using Tukey test. When there was no interaction (p > 0.05), the variables studied were tested as to the effects of the factors separately. The results were presented as mean values and standard errors (SE) of mean for the four groups studied (C, BC, ECS and BC+ECS). The level of significance adopted was 5%.

SigmaStat for Windows v 2.03, a statistics software package developed by SPSS, was employed to analyze the one and two-way ANOVA tests.

Results

Tables 1 and 2 summarize the results of the echocardiographic study. Considering the one-way ANOVA analysis, we observed differences between the groups regarding the ratio of left atrial diameter (LA) adjusted for BW, A-wave, heart rate (HR), DA/BW on the short axis, SA/BW on the short axis and FAC. As regards DA/BW and SA/BW, the values for Group BC were higher than those found for Group C. As regards the A-wave and FAV, the values found for Group BC were lower than those found for control animals. As regards LA/BW, DA/BW and SA/BW, the values for Group BC+ECS were higher than those found for Group C. As regards HR, the values for ECS and those for BC+ECS alike were higher than those for C.

As regards FAC in the two-way ANOVA analysis, significant differences were observed between ECS (lower values) and C (higher values) and between BC (lower values) and C (higher values). Additionally, there was significant interaction between the groups, suggesting that the effect of smoke depended on beta-carotene. Therefore, FAC values were higher for Group BC + ECS than for the animals submitted to isolated treatments (fig. 1). As regards other variables, no interactions were observed. Since no significant interactions occurred between factors (exposure to cigarette smoke and beta-carotene dietary supplements), it is understood that the effects of a factor did not depend on the other one. Thus, the values of LA/BW, DA/BW on the long axis, DA/BW on the short axis and SA/BW on the short axis were higher, and the values of the A and E-wave were lower for animals receiving beta-carotene supplements (BC and BC+ECS) than for animals that did not receive beta-carotene supplements (C and ECS). As regards HR, the values for smoking animals (ECS and BC+ECS) were higher than those observed for non-smoking animals (C and BC).

Data relating to the functional study of the isolated heart are shown on table 3. In the one-way ANOVA, differences were observed regarding maximum –dp/dt, since BC values were lower than BC+ECS values. In the two-way ANOVA, there was a statistically significant interaction between smoke and beta-carotene supplements. The analysis of –maximum -dp/dt showed differences between Group BC (lower values) as compared with Group BC+ECS (higher values), and between ECS (lower values) and BC+ECS (higher values). As regards maximum SP, there was a statistically significant interaction between smoking and beta-carotene supplements. In the analysis we observed differences between BC (lower values) and C (higher values) and between BC (lower values) and BC+ECS (higher values). As regards the maximum volume injected into the balloon, there was a statistically significant interaction between smoking and beta-carotene supplements (fig. 2). The analysis showed differences between ECS (lower values) and C (higher values), and between BC (lower values) and BC+ECS (higher values).

Data relating to the morphometric analyses are on table 4. No differences were observed between the groups as regards infarction size. In the one-way ANOVA analysis, we observed differences between the groups regarding BW, RVW/BW, MCA and lung water content, RV and LV. Group ECS presented higher values for RVW/BW and MCA than control animals. Additionally, Group BC+ECS presented higher values for MCA than Groups BC, ECS and C. As regards lung water content, Group ECS presented higher values than Group C (C = 22.0±3.0, ECS = 29.0±2.0; p < 0.05). Additionally, Group BC+ECS presented higher values for water content in RV (C = 4.63±0.33, BC+ECS = 5.69±0.14; p < 0.05) and LV (C = 5.11±0.25, BC+ECS = 6.81±0.31; p < 0.05) than Group C.

In the two-way ANOVA, we observed interaction as regards PVC/BW and MCA. As concerns RVW/BW, a significant difference was observed between ECS (higher values) and C (lower values). The RVW/BW ratio was smaller for Group BC+ECS than for Group ECS. As for MCA values, values for ECS were higher than for C, values for BC+ECS were higher than for BC and ECS (fig. 3). As for water content, smoking animals (ECS and BC+ECS) presented higher values than non-smoking animals (C and BC).

Discussion

The objective of this study was to analyze the effects of beta-carotene supplements on the ventricular remodeling process following acute myocardial infarction in rats exposed to cigarette smoke. Our hypothesis was that the antioxidant effects of beta-carotene would mitigate post-AMI remodeling process in animals exposed to cigarette smoke. Contrary to our hypothesis, however, our results suggest that beta-carotene intensified the heart remodeling process following infarction in this situation. Additionally, beta-carotene supplements heightened the harmful morphological effects induced by infarction.

Heart remodeling can be defined as genetic alterations that result in changes in heart molecules, cells and interstice. These changes can manifest themselves clinically as changes in volume, mass, constitution, geometry and/or heart function18-20. Although the ventricular remodeling process after myocardial infarction is highly complex, this term is frequently used as a synonym for cellular growth, evidenced by the increase of ventricular cavity18-20. A relevant aspect of this process relates to the fact that ventricular remodeling after myocardial infarction is associated with a worse prognosis, because its presence and intensity are related to fibrosis, progressive ventricular dysfunction, arrhythmias and increased mortality21.

The mechanisms that modulate the post-infarction remodeling process are not yet fully understood. It is currently accepted that the increase in oxidative stress as a result of the accumulation of reactive oxygen species may be one of the mechanisms that trigger or regulate heart adaptations in response to a certain aggression22-24. Therefore, situations characterized by an increase in oxidative stress after infarction could heighten the remodeling process.

An increase in oxidative stress is associated with smoking. We must take into account, however, that few studies analyzed the effects of smoking on the process of ventricular remodeling after myocardial infarction. Nicotine promoted left ventricular dilation in rats submitted to myocardial infarction. This phenomenon apparently occurs at the expense of the increase in infarct expansion, since thinner infarcted walls have been found in treated animals25. In our laboratory, exposure to cigarette smoke for six months resulted in the intensification of remodeling, which was accompanied by the worsening of functional variables7. Thus, exposure to cigarette smoke seems to provoke remodeling in normal conditions and in situations involving heart aggression as well.

In this study, animals exposed to cigarette smoke presented increased LV systolic and diastolic dimensions and increased myocyte cross-section as compared with control animals. We can therefore infer that exposure to cigarette smoke intensified the process of ventricular remodeling after infarction, which is in agreement with previously mentioned studies6,7.

Considering that acute myocardial infarction and exposure to cigarette smoke alike are conditions where there is increase in oxidative stress, we advanced the hypothesis that the administration of beta-carotene would mitigate ventricular remodeling secondary to these aggressions. However, contrary to our hypothesis, animals exposed to both treatments (beta-carotene and exposure to cigarette smoke) presented additional intensification of heart remodeling, attested by the increase in left atrium area and in myocyte cross-section area. Additionally the group that received supplements presented an increase in LV systolic and diastolic sizes as compared with control group animals. So far, the mechanisms that are responsible for these harmful effects of beta-carotene on the post-infarction remodeling process remain unclear. Despite this fact, however, as regards the clinical perspectives of this study, our paper suggests caution in the administration of antioxidants, especially beta-carotene and in the presence of smoking for cardiovascular protection after myocardial infarction.

Heart remodeling invariably causes a progressive decrease of ventricular function. At first, as a consequence of cellular growth, remodeling can contribute to maintain or restore heart function. Chronically, however, biochemical, genetic and structural changes occur that result in progressive ventricular dysfunction. In our study, the functional results are in partial disagreement with this concept. In the group that received beta-carotene supplements, echocardiographic and isolated heart variables confirm left ventricular dysfunction as compared with the control group. In the beta-carotene and smoking group, however, despite intense remodeling, no statistically significant differences were observed as compared with the control group. But we observed function improvement in some of the variables for this group as compared with Group BC. An explanation for this fact may have to do with the acute or chronic effects of exposure to cigarette smoke.

In our study, both the echocardiographic study and the analysis of the isolated heart were performed in the afternoon but the animals had been exposed to cigarette smoke during the morning. We could therefore infer that functional analysis may have been influenced by the acute positive inotropic stimulation of cigarettes. This limitation should be taken into account when interpreting our results. This hypothesis is supported by the fact that smoking animals presented higher heart rates and higher water content in some of the organs analyzed, which is compatible with chronic ventricular dysfunction.

In summary, the data obtained in this study allow the following conclusions: exposure of rats to cigarette smoke after myocardial infarction intensified the heart remodeling process; beta-carotene dietary supplements increased the heart remodeling process caused by experimental myocardial infarction; the harmful effects of the remodeling process were heightened when the two treatments were employed in conjunction.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was funded by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP.

Study Association

This article is part of the thesis associate professor submitted by Leonardo A. M. Zornoff, from Faculdade de Medicina de Botucatu.

References

Mailing address:

Leonardo A. M. Zornoff

Faculdade de Medicina de Botucatu-Departamento de Clínica Médica

18618-000

Botucatu, SP - Brazil

E-mail:

lzornoff@fmb.unesp.br

Manuscript received December 18, 2006; revised manuscript received March 1st, 2007; accepted March 26, 2007.