abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil ggNXQBRbJXJCGwybsjjrg8J 00005 S0066-782X2007001400005 S0066-782X(07)08900205 10.1590/S0066-782X2007001400005 Artigos Originais O bloqueio da síntese do óxido nítrico promove aumento da hipertrofia e da fibrose cardíaca em ratos submetidos a treinamento aeróbio Souza Hugo Celso Dutra de Penteado Daniel Martins Dias Martin-Pinge Marli Cardoso Barbosa Neto Octávio Teixeira Vicente de Paula Antunes Blanco João Henrique Dutra Silva Valdo José Dias da Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Brazil Uberaba MG Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro Brasil Universidade Estadual de Londrina Brazil 08 2007 89 2 99 104 26 02 2007 23 01 2007 08 12 2006 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

OBJETIVO: O presente estudo avaliou as adaptações teciduais cardíacas em ratos submetidos a treinamento aeróbio, após o bloqueio da síntese de óxido nítrico (NO). MÉTODOS: Os animais (n = 48) foram divididos em quatro grupos: sedentários (grupo CONTROLE), hipertensos após administração de Ng-nitro-L-arginina metil éster durante sete dias (grupo L-NAME), treinados por meio de natação durante oito semanas (grupo TREINADO) e treinados e tratados com L-NAME na última semana (grupo TREINADO L-NAME). Em todos os animais foi registrada a pressão arterial (PA) e realizada a avaliação morfométrica cardíaca. RESULTADOS: Os grupos L-NAME e TREINADO L-NAME apresentaram-se hipertensos em relação aos demais (p < 0,05), porém a elevação da PA no grupo TREINADO L-NAME foi significativamente menor em relação ao L-NAME (p < 0,05). Os grupos TREINADO e TREINADO L-NAME apresentaram índice de peso cardíaco maior que os grupos CONTROLE e L-NAME (p < 0,05). Também apresentaram maiores índices de área cardíaca macroscópica e de fibrose cardíaca em relação aos demais (p < 0,05) e, quando comparados, o grupo TREINADO L-NAME mostrou-se significativamente superior (p < 0,05). CONCLUSÃO: O bloqueio a curto prazo da síntese de NO, em animais sedentários, induziu hipertensão, sem no entanto causar hipertrofia cardíaca. Nos animais treinados, a inibição da síntese de NO atenuou a hipertensão e promoveu hipertrofia cardíaca com aumento expressivo da fibrose miocárdica, sugerindo importante papel do NO nas adaptações teciduais cardíacas induzidas pelo treinamento físico aeróbio.

 Hipertensão exercício aeróbico óxido nítrico cardiomegalia fibrose endomiocárdica 05 09 2007

ARTIGO ORIGINAL

O bloqueio da síntese do óxido nítrico promove aumento da hipertrofia e da fibrose cardíaca em ratos submetidos a treinamento aeróbio

Hugo Celso Dutra de Souza; Daniel Martins Dias Penteado; Marli Cardoso Martin-Pinge; Octávio Barbosa Neto; Vicente de Paula Antunes Teixeira; João Henrique Dutra Blanco; Valdo José Dias da Silva

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP, Universidade Estadual de Londrina e Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro - Ribeirão Preto, SP - Londrina, PR - Uberaba, MG - Brasil

Correspondência

RESUMO

OBJETIVO: O presente estudo avaliou as adaptações teciduais cardíacas em ratos submetidos a treinamento aeróbio, após o bloqueio da síntese de óxido nítrico (NO).

MÉTODOS: Os animais (n = 48) foram divididos em quatro grupos: sedentários (grupo CONTROLE), hipertensos após administração de Ng-nitro-L-arginina metil éster durante sete dias (grupo L-NAME), treinados por meio de natação durante oito semanas (grupo TREINADO) e treinados e tratados com L-NAME na última semana (grupo TREINADO L-NAME). Em todos os animais foi registrada a pressão arterial (PA) e realizada a avaliação morfométrica cardíaca.

RESULTADOS: Os grupos L-NAME e TREINADO L-NAME apresentaram-se hipertensos em relação aos demais (p < 0,05), porém a elevação da PA no grupo TREINADO L-NAME foi significativamente menor em relação ao L-NAME (p < 0,05). Os grupos TREINADO e TREINADO L-NAME apresentaram índice de peso cardíaco maior que os grupos CONTROLE e L-NAME (p < 0,05). Também apresentaram maiores índices de área cardíaca macroscópica e de fibrose cardíaca em relação aos demais (p < 0,05) e, quando comparados, o grupo TREINADO L-NAME mostrou-se significativamente superior (p < 0,05).

CONCLUSÃO: O bloqueio a curto prazo da síntese de NO, em animais sedentários, induziu hipertensão, sem no entanto causar hipertrofia cardíaca. Nos animais treinados, a inibição da síntese de NO atenuou a hipertensão e promoveu hipertrofia cardíaca com aumento expressivo da fibrose miocárdica, sugerindo importante papel do NO nas adaptações teciduais cardíacas induzidas pelo treinamento físico aeróbio. (Arq Bras Cardiol 2007;89(2):99-104)

Palavras-chave: Hipertensão, exercício aeróbico, óxido nítrico, cardiomegalia, fibrose endomiocárdica.

Introdução

A descoberta de fatores endógenos derivados do endotélio, em especial o óxido nítrico (NO)1, iniciou um novo capítulo na compreensão dos mecanismos das doenças cardiovasculares e dos métodos de prevenção e tratamento.

O NO, além de sua potente ação vasodilatadora, promove outros importantes efeitos vasculares, renais e cardíacos, incluindo a ação antiagregante plaquetária, a modulação do ritmo de filtração glomerular e o efeito sobre os remodelamentos vascular e cardíaco2,3. Por sua vez, a diminuição endógena da produção do NO está relacionada à redução da vasodilatação endotélio-dependente em pacientes com hipertensão, hipercolesterolemia, diabete ou arteriosclerose4.

Com relação ao remodelamento cardíaco, o NO parece ser um importante fator endógeno na modulação do crescimento hipertrófico, tanto de modo indireto, por meio de seu efeito hipotensivo, via dilatação arterial periférica, promovendo diminuição da pós-carga, como pela dilatação do sistema venoso, diminuindo a pré-carga5,6. Adicionalmente, outros estudos demonstraram que o NO também participaria do remodelamento cardíaco por meio mais direto, uma vez que sua diminuição promoveria alterações morfológicas significativas, como focos de necrose, aumento da fibrose, apoptose, diminuição da angiogênese cardíaca e conseqüente hipertrofia patológica7-11. Entretanto, os efeitos da inibição tanto aguda como crônica da síntese de NO com análogos da L-arginina, como Ng-monometil-L-arginina (L-NMMA) ou Ng-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), que resultam em conseqüente elevação da pressão arterial (PA), apresentam dados controversos na literatura no que se refere ao desenvolvimento de hipertrofia cardíaca2,3,12-15.

Por outro lado, o exercício físico aeróbio tem sido muito utilizado como terapia anti-hipertensiva, com o objetivo de atenuar os efeitos dos fatores de risco cardiovascular. Além disso, tem sido demonstrado que o exercício físico aeróbio, além de promover importantes alterações no controle autonômico cardiocirculatório16-18, também promoveria adaptações teciduais, principalmente cardíacas19-21. Essas adaptações seriam caracterizadas por hipertrofia cardíaca excêntrica (adição de sarcômeros em série), melhorando a função de ejeção, o que promoveria aumento da expectativa de vida e prevenção de eventos cardíacos. Apesar de diversos mecanismos terem sido apontados para explicar tais adaptações, a eventual participação do NO nessa modalidade de hipertrofia miocárdica fisiológica decorrente do treinamento físico foi pouco investigada.

Dessa forma, este estudo, baseando-se nas afirmações descritas anteriormente, teve por objetivo avaliar os efeitos do bloqueio a curto prazo da síntese do NO sobre as adaptações teciduais cardíacas em ratos submetidos a treinamento físico aeróbio.

Métodos

Todos os procedimentos experimentais envolvidos na pesquisa em questão foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP.

Animais - Ratos Wistar machos (120 g a 150 g) foram separados em caixas individuais com temperatura controlada (21ºC) e ciclo claro/escuro de 12 horas. Os animais foram tratados com ração e água ad libitum por três dias antes do início do procedimento experimental.

Grupos experimentais - Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais: 1) grupo de ratos normotensos tratados com ração e água ad libitum durante oito semanas (grupo CONTROLE; n = 12); 2) grupo de ratos tratados com ração e água ad libitum durante oito semanas e com L-NAME dissolvido na água de beber (70 mg/kg) na última semana (grupo L-NAME; n = 12); 3) grupo de ratos treinados por meio de natação durante oito semanas (grupo TREINADO; n = 12) e 4) grupo de ratos treinados por meio de natação durante oito semanas e tratados na última semana com L-NAME (grupo TREINADO L-NAME; n = 12).

Treinamento físico - O treinamento físico foi realizado durante oito semanas por meio de natação em aquário de vidro (100 cm de comprimento, 80 cm de largura e 80 cm de altura) com água preaquecida à temperatura de 30ºC. O treinamento era precedido por duas semanas de adaptação ao exercício na água, ou seja, o tempo inicial de adaptação ao treinamento foi de 10 minutos, aumentando nesse período até atingir 45 minutos. O treinamento aeróbio, após a adaptação, foi realizado em subgrupos de quatro animais durante uma hora por dia, seis dias por semana. Os grupos de animais não-treinados foram submetidos ao estresse da água por dois minutos durante o mesmo período dos treinados.

Protocolo experimental - No sexto dia da última semana, os animais foram submetidos a cirurgia, sob anestesia de tribromoetanol (250 mg/kg, i.p.), com implante de cânula na artéria femoral para monitorização da PA. Após a cirurgia, os animais permaneceram 24 horas em recuperação sob o mesmo tratamento. O registro da PA em animais acordados foi realizado durante 30 minutos por meio do acoplamento de cânula arterial a um transdutor de pressão (ADInstruments – MLT0380), que enviava o sinal a um amplificador (ADInstruments – ML110), o qual fornecia o sinal para um sistema computadorizado de aquisição de dados (ADInstruments – PowerLab 8/30). Após registro da PA, os animais foram sacrificados e os corações foram retirados, fotografados e fixados em formaldeído (10%). Morfometria macroscópica foi realizada por meio do software Image J (NIH, 2004), seguindo o manual de operação disponível eletronicamente22. A seguir, os corações foram seccionados transversalmente em duas regiões, ambas com 3 mm de espessura: a primeira, na altura da inserção da veia cava inferior no átrio direito; e a segunda, no terço médio do ventrículo esquerdo. Após as secções, os dois fragmentos obtidos foram processados para rotina de inclusão em parafina. Os métodos histoquímicos utilizados foram: colorações da hematoxilina-eosina (HE), para mensuração da espessura do ventrículo esquerdo, e Picro-sírius, para quantificação das áreas de fibrose cardíaca. Após coloração por HE e Picro-sírius, a espessura do ventrículo esquerdo, bem como a área de fibrose miocárdica, foram quantificadas por meio de câmara de vídeo acoplada ao microscópio de luz comum, que enviava as imagens do microscópio a um sistema analisador de imagens (KS 300 Kontron-Zeiss®). Esse sistema é constituído, basicamente, por um microscópio de luz acoplado a uma câmara de vídeo em cores, a um monitor de vídeo de alta definição, e a uma unidade de processamento com placa para captura de vídeo. A espessura do ventrículo esquerdo de cada caso foi estimada fazendo-se quatro medições distribuídas uniformemente pela área visível no vídeo, abrangendo os lados direito, esquerdo, superior e inferior do corte transversal do ventrículo esquerdo sobre a lâmina. A lâmina foi colocada em uma posição antes do condensador e foi utilizada objetiva com aumento de cinco vezes para essas medidas. Um valor médio de espessura do ventrículo esquerdo foi calculado para cada caso a partir dos quatro valores de espessura medida nas quatro posições distintas marcadas sobre o corte transversal do ventrículo esquerdo. Para quantificação da fibrose cardíaca foi utilizado o método do cálculo da média acumulada, estimando o número de campos representativos. Em cada caso foram quantificados oito campos. Para o cálculo da fibrose foi determinada a média aritmética dos oito campos. Utilizou-se um microscópio de luz comum e um filtro polarizador para que as áreas de fibrose estivessem evidenciadas pela coloração Picro-sírius e quantificadas morfometricamente.

Análise estatística - Os resultados foram apresentados como médias ± erros padrão das médias (EPM). Para a análise estatística, foi elaborada uma planilha eletrônica e as informações foram analisadas por meio do programa eletrônico Sigma-Stat®, versão 2.03. A análise das variáveis normais homocedásticas foi feita utilizando-se a análise de variância ANOVA associada ao teste post-hoc de Tukey. Foram consideradas estatisticamente significantes as diferenças em que p era menor que 5% (p < 0,05).

Resultados

Os grupos L-NAME e TREINADO L-NAME apresentaram-se hipertensos em relação aos grupos CONTROLE e TREINADO. Quando os grupos hipertensos foram comparados, o grupo L-NAME apresentou-se significativamente mais hipertenso que o grupo TREINADO L-NAME (p < 0,05). Quanto à freqüência cardíaca (FC), o grupo L-NAME apresentou-se taquicárdico em relação aos demais (p < 0,05). Por outro lado, os grupos TREINADO e TREINADO L-NAME apresentaram-se bradicárdicos em relação ao grupo CONTROLE (p < 0,001). Quando comparados, o grupo TREINADO L-NAME apresentou bradicardia mais intensa que o grupo TREINADO (p < 0,05). Esses dados estão apresentados, de forma resumida, na tabela 1.

A figura 1 apresenta os parâmetros morfométricos cardíacos em todos os grupos estudados. A figura 1A representa o índice de peso cardíaco (mg/g) de todos os grupos, demonstrando que os grupos TREINADO (3,57 ± 0,04 mg/g) e TREINADO L-NAME (3,79 ± 0,08 mg/g) apresentaram aumento em relação aos grupos CONTROLE (3,2 ± 0,04 mg/g) e L-NAME (3,29 ± 0,04 mg/g) (p < 0,05). A figura 1A também demonstra que o grupo TREINADO L-NAME apresentou índice de peso cardíaco superior ao do grupo TREINADO (p < 0,05). Na figura 1B verifica-se que não houve diferença entre os grupos estudados quanto à espessura da parede do ventrículo esquerdo. A figura 1C, por sua vez, demonstra que na análise da área macroscópica cardíaca não foram observadas alterações entre os grupos CONTROLE (1,20 ± 0,05 mm²) e L-NAME (1,14 ± 0,03 mm²), embora os grupos TREINADO (1,49 ± 0,03 mm²) e TREINADO L-NAME (1,66 ± 0,03 mm²) tenham diferido dos anteriores e entre si (p < 0,05), tendo o grupo TREINADO L-NAME apresentado os maiores valores. A figura 1D representa a análise do porcentual de fibrose cardíaca por área em todos os grupos estudados, demonstrando que os grupos TREINADO (0,71 ± 0,07%) e TREINADO L-NAME (0,86 ± 0,03%) apresentaram maior porcentual de fibrose em relação aos grupos CONTROLE (0,56 ± 0,03%) e L-NAME (0,60 ± 0,05%) (p < 0,05), e que, quando comparados, o grupo TREINADO L-NAME também apresentou o maior porcentual (p < 0,05). A figura 2 apresenta um corte histológico representativo de cada grupo estudado e evidencia o aumento da fibrose encontrada nos grupos TREINADO e TREINADO L-NAME.

Discussão

O bloqueio da síntese do NO com L-NAME em ratos não-treinados promoveu hipertensão arterial, porém não foi observada qualquer alteração morfométrica visível no tecido cardíaco comparativamente ao grupo de normotensos não-treinados. Por outro lado, o treinamento físico aeróbio, por meio da natação, atenuou a hipertensão arterial induzida pelo L-NAME na última semana de treinamento. Adicionalmente, o bloqueio da síntese do NO durante sete dias, em ratos submetidos a treinamento aeróbio, induziu alterações morfométricas cardíacas significativas.

Ao que tudo indica, a atenuação da hipertensão arterial no grupo treinado e tratado na última semana com L-NAME evidencia o efeito preventivo do exercício físico na evolução desse modelo de hipertensão arterial experimental. Entretanto, com o presente estudo não é possível apontar o mecanismo responsável pela atenuação da hipertensão. Por sua vez, diversos estudos que demonstraram a importância da atividade física como prevenção e tratamento da hipertensão arterial apontaram alguns mecanismos que poderiam contribuir para a atenuação da PA, tanto em animais experimentais como em humanos. Entre os mecanismos apontados, a diminuição da atividade simpática tanto cardíaca como vascular associada à diminuição da resistência vascular periférica parecem envolvidas18,23,24. Outros estudos demonstraram que o treinamento físico promoveria diminuição da PA, por meio da queda do débito cardíaco, além de diminuição das catecolaminas séricas e do estresse oxidativo25-27. Adicionalmente, também parece ocorrer melhora da função vasodilatadora endotelial e alterações do sistema renina-angiotensina-aldosterona28-32.

Quanto à ausência de hipertrofia cardíaca, em ratos não-treinados e submetidos a hipertensão experimental por meio do tratamento com L-NAME, é possível que o tempo de inibição da síntese do NO por sete dias não seja suficiente para induzir hipertrofia. Diversos autores demonstraram a existência de hipertrofia cardíaca promovida pelo bloqueio crônico da síntese do NO em estudos com mais de quatro semanas de tratamento, embora com doses diárias de L-NAME menores que a utilizada neste estudo3,33. Por outro lado, o presente estudo se propôs a investigar o comportamento da PA e das alterações morfométricas cardíacas em animais submetidos a protocolo prévio de treinamento aeróbio, cujo objetivo maior foi avaliar a capacidade do treinamento prévio em atenuar essas possíveis alterações, portanto de forma preventiva. O fato relevante deste estudo foi observar que, embora não tenha sido evidenciada no animal sedentário hipertenso, a hipertrofia cardíaca esteve presente nos grupos de animais submetidos a treinamento aeróbio prévio durante oito semanas. Os dois grupos apresentaram, aparentemente, hipertrofia excêntrica, uma vez que não foi observada diferença na espessura do ventrículo entre todos os grupos estudados associada a aumento da área-macro dos grupos treinados. Esse tipo de hipertrofia cardíaca, denominado hipertrofia fisiológica, é conseqüência do remodelamento induzido pelo exercício, principalmente o aeróbio, decorrendo de adaptações mecânicas, como o estiramento da parede ventricular pela sobrecarga de volume promovida pelo aumento do retorno venoso. Tal estiramento induz o cardiomiócito a adicionar sarcômeros em série, aumentando, dessa forma, a força contrátil34. Por outro lado, a hipertrofia cardíaca concêntrica, presente em condições patológicas como a hipertensão arterial, decorre da adição de sarcômeros em paralelo, porém com grande proliferação de fibroblastos e conseqüente aumento da matriz extracelular (fibrose), da apoptose e da necrose tecidual. Esse conjunto de eventos, conseqüentemente, leva à falência cardíaca34,35.

Embora neste estudo não tenha sido observada hipertrofia concêntrica, característica do estado hipertensivo, foi evidenciado grande aumento da fibrose no grupo TREINADO L-NAME, demonstrando importante papel do NO no remodelamento cardíaco induzido pelo exercício. Também foi observado aumento, embora em menor grau, da fibrose cardíaca no grupo TREINADO, porém sabe-se que esse aumento é comum, uma vez que resulta da hipertrofia fisiológica conseqüente ao aumento proporcional de todos os constituintes teciduais, ou seja, tecido contrátil (cardiomiócito) e tecido não-contrátil (tecido conjuntivo e matriz extracelular)35.

O aumento considerável da formação de fibrose apresentado no grupo TREINADO L-NAME parece refletir o importante papel do NO no remodelamento cardíaco induzido pelo exercício físico. Alguns autores demonstraram que a hipertrofia patológica induzida pelo permanente estado hipertensivo é decorrente da ação de fatores humorais, principalmente a angiotensina II36. A cascata intracelular de eventos, induzida por esses fatores, parece promover, entre outros efeitos, aumento da fibrose cardíaca, elevação considerável da apoptose de cardiomiócitos, depressão contrátil e disfunção cardíaca em resposta à ß-estimulação, evoluindo progressivamente para cardiomiopatia letal37-39. O NO, nessas condições, tem o papel de impedir ou atenuar a hipertrofia miocárdica, a proliferação de fibroblastos cardíacos e a apoptose do cardiomiócito. Esse efeito parece depender da produção e da liberação de bradicinina via receptor AT2R da angiotensina II, levando à formação do NO (bradicinina/NO-dependente), contrapondo a hipertrofia patológica induzida pela ativação do receptor AT111. Por outro lado, embora o mecanismo ainda não tenha sido elucidado, o NO também está envolvido no processo da angiogênese, o que explicaria o aumento da fibrose cardíaca observada no grupo TREINADO L-NAME40. O exercício, de forma geral, induz a angiogênese em diversos tecidos, quando estimulados. No músculo cardíaco não é diferente, e o aumento da demanda induzida pelo exercício promove o aumento da angiogênese intramiocárdica10. Como a produção do NO estava bloqueada pelo L-NAME, é possível que a fibrose encontrada resulte da diminuição do processo de angiogênese decorrente da diminuição da vascularização dos cardiomiócitos. Entretanto, mais estudos serão necessários para esclarecer os mecanismos pelos quais o NO atuaria no processo da angiogênese em condições patológicas e no exercício.

Conclusão

O bloqueio a curto prazo da síntese do NO com L-NAME causou grave hipertensão, mas não promoveu hipertrofia cardíaca nos animais sedentários não-treinados. Em ratos submetidos a treinamento físico aeróbio prévio, a inibição da síntese de NO acarretou menor elevação da PA, porém associada a aumento expressivo da hipertrofia cardíaca e da fibrose miocárdica. Tais achados, possivelmente, sugerem um importante papel do NO no remodelamento cardíaco observado na hipertrofia cardíaca fisiológica do treinamento físico.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflitos de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado pela FAPESP e FAEPA.

Correspondência:

Hugo Celso Dutra de Souza

Rua Luís Basso, 130

14040-150 - Ribeirão Preto, SP - Brasil

E-mail:

hugocds@fmrp.usp.br

Artigo recebido em 08/12/06; revisado recebido em 23/01/07; aceito em 26/02/07.

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OBJECTIVE: The objective of the present study was to evaluate cardiac tissue adaptations in rats submitted to aerobic training after nitric oxide (NO) synthesis blockade. METHODS: The animals (n=48) were divided into four groups: sedentary (CONTROL group); hypertensive after administration of NG-nitro-L-arginine methyl ester for 7 days (L-NAME Group); trained for 8 weeks through swimming exercises (TRAINED Group);trained and treated with L-NAME during the last week (L-NAME TRAINED Group). All the animals were submitted to the experiment procedures for blood pressure (BP) readings and cardiac morphometric evaluation. RESULTS: In comparison to the other groups, the L-NAME and L-NAME TRAINED groups were hypertensive (p<0.05); however, BP elevation in the L-NAME TRAINED group was significantly lower than the L-NAME group (p<0.05). The heart weight indexes for the TRAINED and L-NAME TRAINED groups were higher than the CONTROL and L-NAME groups (p<0.05). Also they had presented higher rates of macroscopic cardiac area and cardiac fibrosis in relation to the rest (p<0.05); comparisons revealed that the values for the L-NAME TRAINED group were significantly higher (p<0.05) than the others. CONCLUSION: Short term NO synthesis blockade in sedentary animals induced hypertension but did not cause cardiac hypertrophy. In the trained animals, the inhibition of NO synthesis attenuated hypertension, induced cardiac hypertrophy and significantly increased myocardial fibrosis, indicating that NO plays an important role in cardiac tissue adaptations caused by aerobic exercise.

 Hypertension exercise nitric oxide cardiomegaly endomyocardial fibrosis

ORIGINAL ARTICLE

Nitric oxide synthesis blockade increases hypertrophy and cardiac fibrosis in rats submitted to aerobic training

Hugo Celso Dutra de Souza; Daniel Martins Dias Penteado; Marli Cardoso Martin-Pinge; Octávio Barbosa Neto; Vicente de Paula Antunes Teixeira; João Henrique Dutra Blanco; Valdo José Dias da Silva

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade Estadual de Londrina, Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro - Ribeirão Preto, SP, Londrina, PR, Uberaba, MG - Brazil

Mailing address

SUMMARY

OBJECTIVE: The objective of the present study was to evaluate cardiac tissue adaptations in rats submitted to aerobic training after nitric oxide (NO) synthesis blockade.

METHODS: The animals (n=48) were divided into four groups: sedentary (CONTROL group); hypertensive after administration of NG-nitro-L-arginine methyl ester for 7 days (L-NAME Group); trained for 8 weeks through swimming exercises (TRAINED Group);trained and treated with L-NAME during the last week (L-NAME TRAINED Group). All the animals were submitted to the experiment procedures for blood pressure (BP) readings and cardiac morphometric evaluation.

RESULTS: In comparison to the other groups, the L-NAME and L-NAME TRAINED groups were hypertensive (p<0.05); however, BP elevation in the L-NAME TRAINED group was significantly lower than the L-NAME group (p<0.05). The heart weight indexes for the TRAINED and L-NAME TRAINED groups were higher than the CONTROL and L-NAME groups (p<0.05). Also they had presented higher rates of macroscopic cardiac area and cardiac fibrosis in relation to the rest (p<0.05); comparisons revealed that the values for the L-NAME TRAINED group were significantly higher (p<0.05) than the others.

CONCLUSION: Short term NO synthesis blockade in sedentary animals induced hypertension but did not cause cardiac hypertrophy. In the trained animals, the inhibition of NO synthesis attenuated hypertension, induced cardiac hypertrophy and significantly increased myocardial fibrosis, indicating that NO plays an important role in cardiac tissue adaptations caused by aerobic exercise.

Key words: Hypertension; exercise; nitric oxide; cardiomegaly; endomyocardial fibrosis.

Introduction

The discovery of endothelial derived endogenous factors, particularly nitric oxide (NO)1, began a new chapter in the understanding of cardiovascular pathology mechanisms, as well as in methods of prevention and treatment.

NO, in addition to its potent vasodilator action, induces other important vascular, renal and cardiac effects including inhibiting platelet aggregation, modulation of the glomerular filtration rate and effect on vascular and cardiac remodeling2,3. In turn the diminished endogenous NO production is related to the reduction of endothelial-dependent vasodilatation in patients with hypertension, hypercholesterolemia, diabetes or arteriosclerosis4.

In relation to cardiac remodeling, NO seems to be an important endogenous factor in the modulation of hypertrophic growth, both indirectly through its hypotensive effect via peripheral artery dilatation, promoting afterload reduction and through via ditation of the venous system reducing the preload5,6. Additionally, other studies have shown that NO is also more directly involved in cardiac remodeling, since its reduction causes significant morphological alterations such as necrosis foci, increased fibrosis, apoptosis, reduction of cardiac angiogenesis and consequent pathological hypertrophy7-11. Nevertheless, literature on cardiac hypertrophy development and the effects of acute or chronic NO synthesis inhibition with L-arginine analogous agents, such as NG-monomethyl-L-arginine (L-NMMA) or NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) that result in the consequent elevation of BP is controversial2,3,12-15.

On the other hand, aerobic exercise has been widely used as an anti-hypertensive therapy to attenuate the effects of cardiovascular risk factors. It has also been demonstrated that aerobic exercise, in addition to promoting significant alterations in cardiocirculatory autonomic control16-18, also induces tissue adaptations, mainly in the heart19-21. These adaptations promote excentric cardiac hypertrophy (addition of sarcomeres in series), which improves ejection function, promotes increased life expectancy and helps prevent cardiac events. Even though various mechanisms have been indicated to explain these adaptations, very few studies have been conducted on the possible participation of NO in this physiological myocardial hypertrophy modality as a result of physical exercise.

Thus, based on the abovementioned facts, the objective of the present study was to evaluate the effects of short term NO synthesis blockade on cardiac tissue adaptations in rats submitted to aerobic exercise.

Methods

All experimental procedures involved in this study were approved by the ethics committee for animal experiments of the University of São Paulo, Ribeirão Preto School of Medicine.

Animals - Male Wistar rats (120 – 150g) were separated in individual cages with controlled temperature (21ºC) and a 12 hour light/dark cycle. The animals were given animal feed and water ad libitum for 3 days before the start of the experimental procedure.

Experiment groups - The animals were divided into 4 experimental groups: 1) normotensive rats treated with animal feed and water ad libitum for 8 weeks (CONTROL group; n=12); 2) rats treated with animal feed and water ad libitum for 8 weeks, with L-NAME dissolved in the drinking water (70mg/kg) during the last week (L-NAME group; n=12); 3) rats submitted to swim training for 8 weeks (TRAINED group; n=12); 4) rats submitted to swim training for 8 weeks and given L-NAME during the last week (L-NAME TRAINED group; n=12).

Physical training - The 8-week swim training program was conducted in a glass aquarium (100 cm long, 80 cm wide and 80 cm high) with heated water (30ºC). Before beginning the training program, the animals were submitted to a two-week adaptation program, that is, the water exercise began with 10 minutes and was gradually increased to 45 minutes. After the adaptation program, the animals were further divided into subgroups of 4 animals and trained for 1 hour per day, 6 days per week. The animal groups that were not trained were submitted to water stress for 2 minutes per day during the training timeframe.

Experimental protocol - On the sixth day of the last week, the animals underwent surgery with tribromoethanol anesthesia (250 mg/kg, i.p.), to insert the femoral artery cannula for BP monitoring. The animals remained sedated with tribromoethanol for 24 hours after the surgery. When the animals came to, BP was recorded for 30 minutes using a pressure transducer (ADInstruments – MLT0380) connected to the artery cannula that sent the signal to an amplifier (ADInstruments – ML110) and then to a computerized data acquisition system (ADInstruments - PowerLab 8/30). After the BP measurements were recorded, the animals were sacrificed and their hearts were removed, photographed and fixed in formaldehyde (10%). The macroscopic morphometry was conducted using Image J (NIH, 2004) software as per the instructions in the online operation manual22. Next, 3mm thick cross sections of the heart were taken from two regions: one at the entry point of the inferior vena cava into the right atrium and the other at the mid third of the left ventricle. The two section fragments were then processed and embedded in paraffin. The histochemical methods used were: hematoxylin–eosin (HE) staining to measure left ventricle thickness, and Picro-sirius staining to quantify the cardiac fibrosis areas. After HE and Picro-sirius staining, the left ventricle thickness and myocardial fibrosis area were quantified using a video camera connected to a standard light microscope that sent the microscopy images to an image analysis system (KS 300 Kontron-Zeiss™). This system is basically comprised of a standard light microscope connected to a color video camera, a high definition video monitor and a processing unit with a video card.

The left ventricle thickness of each case was estimated using four equally distributed measurements in the area visible on the video which covered the right, left, upper and lower sides of left ventricle cross section on the slide. The slide was positioned before the condenser and an x5 objective lens was used for these measurements. An average left ventricle thickness was calculated for each case using the measurements from the four distinct positions on the left ventricle cross section. Quantification of cardiac fibrosis was performed using the accumulated mean calculation method, estimating the number of representative fields. Eight fields were quantified for each case. Fibrosis was calculated using the arithmetic mean of the eight fields. A standard light microscope and polarizer filter were used for visualization of the Pico-sirius stained fibrosis areas; these areas were quantified morphometrically.

Statistical analysis - The results were presented as MEAN ± SEM. A computer spreadsheet was prepared for statistical analysis of the information using the software program Sigma-Stat™, version 2.03. Analysis of normal homoscedastic variables was conducted using ANOVA variance analysis with the Tukey post-hoc test. Statistically significant difference was established as p less than 5% (p<0.05).

Results

Table 1 shows that the L-NAME and L-NAME TRAINED groups were hypertensive in relation to the CONTROL and TRAINED groups. Comparison of the hypertensive groups revealed that the L-NAME group was significantly more hypertensive than the L-NAME TRAINED group (p<0.05). In relation to heart rate (HR) the L-NAME group, in comparison to the other groups, was tachycardic (p<0.05). On the other hand, the TRAINED and L-NAME TRAINED groups were bradycardic in relation to the CONTROL group (p<0.001). When compared to the TRAINED group, the L-NAME TRAINED group presented more intense bradycardia (p<0.05). Figure 1 shows the morphometric cardiac parameters for all study groups. Figure 1A represents the heart weight index (mg/g) for all groups and shows increases for the TRAINED (3.57 ± 0.04 mg/g) and L-NAME TRAINED (3.79 ± 0.08 mg/g) groups in relation to the CONTROL (3.2 ± 0.04 mg/g) and L-NAME (3.29 ± 0.04 mg/g) groups (p<0.05). Figure 1A also shows that the L-NAME TRAINED group presented higher heart weight indexes than the TRAINED group (p<0.05).

figure 1C demonstrates that the cardiac macroscopic areas were unaltered for the CONTROL (1.20 ± 0.05 mm2) and L-NAME (1.14 ± 0.03 mm2) groups; however, alterations were seen in the TRAINED (1.49 ± 0.03 mm2) and L-NAME TRAINED (1.66 ± 0.03 mm2) groups in comparison to previous and individual measurements (p<0.05), and the L-NAME TRAINED group presented the highest values. Figure 1D represents the analysis of cardiac fibrosis percentages by area for all study groups and shows that the TRAINED (0.71 ± 0.07 %) and L-NAME TRAINED (0.86 ± 0.03 %) groups presented greater percentages of fibrosis in relation to the CONTROL (0.56 ± 0.03 %) and L-NAME groups (0.60 ± 0.05 %) (p<0.05), and when compared, the L-NAME TRAINED group also presented the highest percentage (p<0.05). Figure 2 shows a representative histological section for each study group and demonstrates the increased fibrosis found in the TRAINED and L-NAME TRAINED groups.

Discussion

The NO synthesis blockade using L-NAME in the sedentary rats caused hypertension, however, no visible morphometric alterations were observed in the cardiac tissue when compared with the sedentary normotensive group. On the other hand, aerobic swim training alleviated the L-NAME induced hypertension during the last week of exercise. Additionally, the NO synthesis blockade during seven days in rats submitted to aerobic exercise induced significant morphometric cardiac alterations.

According to all indications, attenuation of hypertension in the TRAINED AND L-NAME TRAINED groups, demonstrated the preventative effect of physical exercise during the progression of this experimental hypertension model. Nevertheless, in this study we were not able to identify the mechanism responsible for hypertension attenuation. On the other hand, various studies have demonstrated the importance of physical activity as a preventative measure and treatment for hypertension indicate some mechanisms that could contribute to BP attenuation for both experimental animals and humans. Among the mechanisms indicated, it appears that the reduction of cardiac and vascular sympathetic activity associated with diminished peripheral vascular resistance is involved18,23,24. Other studies also demonstrated that physical training promotes BP reduction through the drop in cardiac output, reduction of serum catecholamine levels and oxidative stress25-27. Improvement in endothelial vasodilatation function and alterations in the renin-angiotensin-aldosterone system also appear to be involved28-32.

In relation to the absence of cardiac hypertrophy in the sedentary rats submitted to experimental L-NAME induced hypertension, it is possible that NO synthesis inhibition over a period of seven days was not sufficient to cause hypertrophy. Various authors that have demonstrated cardiac hypertrophy induced by chronic NO synthesis blockade, used treatment timeframes of more than four weeks even though the daily L-NAME doses were lower than those used in our study3,33. On the other hand, the purpose of the present study was to investigate blood pressure trends and cardiac morphometric alterations in animals submitted to an established aerobic exercise protocol with the main objective of evaluating the ability of the established training program to preventively attenuate these alterations. The relevant fact of this study was the observation that the hypertensive sedentary animals did not present cardiac hypertrophy. whereas the animals submitted to the 8-week aerobic exercise program did. It appears that the two groups presented excentric hypertrophysince, for all study groups, no difference was observed in ventricle thicknesses which coul be associated with an increase in the macro area of the trained groups. This type of cardiac hypertrophy, called physiologic, is a result of remodeling induced by exercise and in particular aerobic exercise. It is caused by mechanical adaptations such as ventricle wall dilation due to the volume overload induced by the increased venous return. This dilation causes the cardiomyocytes to add sarcomeres in series which increases contractile strength34. On the other hand, concentric cardiac hypertrophy occurs in pathological conditions such as hypertension. It is caused by the addition of sarcomeres in parallel, however, with a large proliferation of fibroblasts, which increases the extracellular matrix (fibrosis), apoptosis and necrotic tissue. As a consequence, this series of events leads to heart failure34,35.

Even though concentric hypertrophy, characteristic of the hypertension, was not observed in this study, the L-NAME TRAINED animals presented significant increases of fibrosis, demonstrating the important role of NO in exercise induced cardiac remodeling. The TRAINED group also presented increased cardiac fibrosis, although to a lesser degree, however, it is well known that this is common and is a result of physiological hypertrophy due to the proportional increase of all tissue components, or in other words, contractile tissue (cardiomyocyte) and non-contractile tissue (connective tissue and extracellular matrix)35.

The considerable increase of fibrosis presented by the L-NAME TRAINED group seems to reflect the important role of NO in exercise induced cardiac remodeling. Some authors have demonstrated that hypertension induced pathological hypertrophy is a result of the action of humoral factors, mainly angiotensin II36. The intracellular cascade of events induced by these factors appears to promote, among other effects, increased cardiac fibrosis, considerable cardiomyocyte apoptosis elevation, contractile depression and cardiac dysfunction in response to b-stimulation which gradually progresses to lethal cardiomyopathy37-39. The role of NO, in these situations is to prevent or attenuate myocardial hypertrophy, cardiac fibroblast proliferation and cardiomyocyte apoptosis. This effect appears to depend on the production and release of bradykinin via the AT2R angiotensin II receptor, leading to the formation of NO (bradykinin/NO-dependent), offsetting the pathological hypertrophy induced by the activation of the AT1 receptor11. On the other hand, even though the mechanism is unclear, NO is also involved in the angiogenesis process, which explains the increased cardiac fibrosis observed in the L-NAME TRAINED group40. Generally speaking, exercise induces angiogenesis in various tissues when they are stimulated. This is also true for the heart muscle and the increased demand induced by exercise promotes increased intramyocardial angiogenesis10. Since the NO production was blocked by L-NAME, it is possible that the fibrosis was caused by the reduction in the angiogenesis process as a result of the diminished cardiomyocyte vascularization. Nevertheless, further studies are required to clarify the NO mechanisms in the angiogenesis process in relation to pathological conditions and exercise.

In conclusion, the short term NO synthesis blockade with L-NAME caused severe hypertension but did not promote cardiac hypertrophy in the sedentary animals. In the rats submitted to the established aerobic exercise program, the inhibition of the NO synthesis resulted in a lower BP elevation; however, it was associated with a significant increase of cardiac hypertrophy and myocardial fibrosis. These findings, suggest the potentially significant role of NO in the cardiac remodeling observed in the physiological cardiac hypertrophy resulting from physical exercise.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was funded by FAPESP and FAEPA.

References

Mailing address:

Hugo Celso Dutra de Souza

Rua Luís Basso, 130

14040-150 - Ribeirão Preto, SP - Brazil

E-mail:

hugocds@fmrp.usp.br

Manuscript received December 8, 2006; revised manuscript received January 23, 2007; accepted February 26, 2007