abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil BRwSCkgGwVwD855H4HhM9Ps 00004 S0066-782X2007001400004 S0066-782X(07)08900204 10.1590/S0066-782X2007001400004 Artigos Originais Comparação de diferentes métodos para medida do tamanho do infarto experimental crônico em Ratos Minicucci Marcos F. Azevedo Paula S. Duarte Daniella R. Matsubara Beatriz B. Matsubara Luiz S. Campana Álvaro O. Paiva Sergio A. R. Zornoff Leonardo A. M. Botucatu São Paulo Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina de Botucatu Brazil 08 2007 89 2 93 98 26 06 2007 16 02 2007 05 12 2006 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

OBJETIVO: Avaliar as diferenças entre três métodos para medida do infarto experimental em ratos, em relação ao método tradicional. MÉTODOS: A área infartada por histologia (AREA), o perímetro interno da cavidade infartada por histologia (PER) e o perímetro interno por ecocardiograma (ECO) foram comparados ao método tradicional (análise histológica das circunferências epicárdicas e endocárdicas da região infartada - CIR). Utilizaram-se ANOVA de medidas repetidas, complementada com o teste de comparações múltiplas de Dunn, o método de concordância de Bland & Altman e o teste de correlação de Spearman. A significância foi p < 0,05. RESULTADOS: Foram analisados dados de 122 animais, após 3 a 6 meses do infarto. Houve diferença na avaliação do tamanho do infarto entre CIR e os outros três métodos (p < 0,001): CIR = 42,4% (35,9-48,8), PER = 50,3% (39,1-57,0), AREA = 27,3% (20,2-34,3), ECO = 46,1% (39,9-52,6). Assim, a medida por área resultou em subestimação de 15% do tamanho do infarto, enquanto as medidas por ecocardiograma e pelo perímetro interno por meio de histologia resultaram em superestimação do tamanho do infarto de 4% e 5%, respectivamente. Em relação ao ECO e PER, apesar de a diferença entre os métodos ser de apenas 1,27%, o intervalo de concordância variou de 24,1% a -26,7%, sugerindo baixa concordância entre os métodos. Em relação às associações, houve correlações estatisticamente significativas entre: CIR e PER (r = 0,88 e p < 0,0001); CIR e AREA (r = 0,87 e p < 0,0001) e CIR e ECO (r = 0,42 e p < 0,0001). CONCLUSÃO: Na determinação do tamanho do infarto, apesar da alta correlação, houve baixa concordância entre os métodos.

 Infarto do miocárdio ratos 05 09 2007

ARTIGO ORIGINAL

Comparação de diferentes métodos para medida do tamanho do infarto experimental crônico em Ratos

Marcos F. Minicucci; Paula S. Azevedo; Daniella R. Duarte; Beatriz B. Matsubara; Luiz S. Matsubara; Álvaro O. Campana; Sergio A. R. Paiva; Leonardo A. M. Zornoff

Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP - Botucatu, SP - Brasil

Correspondência

RESUMO

OBJETIVO: Avaliar as diferenças entre três métodos para medida do infarto experimental em ratos, em relação ao método tradicional.

MÉTODOS: A área infartada por histologia (AREA), o perímetro interno da cavidade infartada por histologia (PER) e o perímetro interno por ecocardiograma (ECO) foram comparados ao método tradicional (análise histológica das circunferências epicárdicas e endocárdicas da região infartada – CIR). Utilizaram-se ANOVA de medidas repetidas, complementada com o teste de comparações múltiplas de Dunn, o método de concordância de Bland & Altman e o teste de correlação de Spearman. A significância foi p < 0,05.

RESULTADOS: Foram analisados dados de 122 animais, após 3 a 6 meses do infarto. Houve diferença na avaliação do tamanho do infarto entre CIR e os outros três métodos (p < 0,001): CIR = 42,4% (35,9-48,8), PER = 50,3% (39,1-57,0), AREA = 27,3% (20,2-34,3), ECO = 46,1% (39,9-52,6). Assim, a medida por área resultou em subestimação de 15% do tamanho do infarto, enquanto as medidas por ecocardiograma e pelo perímetro interno por meio de histologia resultaram em superestimação do tamanho do infarto de 4% e 5%, respectivamente. Em relação ao ECO e PER, apesar de a diferença entre os métodos ser de apenas 1,27%, o intervalo de concordância variou de 24,1% a –26,7%, sugerindo baixa concordância entre os métodos. Em relação às associações, houve correlações estatisticamente significativas entre: CIR e PER (r = 0,88 e p < 0,0001); CIR e AREA (r = 0,87 e p < 0,0001) e CIR e ECO (r = 0,42 e p < 0,0001).

CONCLUSÃO: Na determinação do tamanho do infarto, apesar da alta correlação, houve baixa concordância entre os métodos. (Arq Bras Cardiol 2007;89(2):93-98)

Palavras-chave: Infarto do miocárdio/fisiopatologia, ratos.

Introdução

O modelo do infarto agudo do miocárdio experimental vem sendo amplamente usado, há alguns anos, para o estudo das alterações fisiopatológicas que ocorrem durante e após o insulto isquêmico.

Dentre os vários modelos existentes, destaca-se o infarto experimental em ratos. Esse fato ocorre pela praticidade, pelo custo relativamente baixo em comparação com outros animais, mas, principalmente, pela reprodutibilidade dos resultados em relação aos estudos clínicos realizados posteriormente1,2.

Um dos aspectos mais relevantes desse modelo refere-se ao tamanho do infarto. Aceita-se que as conseqüências hemodinâmicas agudas da oclusão coronariana guardam estreita relação com o tamanho do infarto3-6. Cronicamente, podem ocorrer alterações na composição, na massa, no volume e na geometria cardíaca, as quais são chamadas coletivamente de remodelação cardíaca7-9. O grau de remodelação ventricular está diretamente associado a pior prognóstico, em razão da maior incidência na formação de aneurismas, ruptura ventricular, arritmias e da associação com a progressão da disfunção ventricular. De maneira similar ao que ocorre com as alterações agudas, o tamanho do infarto é o principal determinante da presença e intensidade da remodelação ventricular após o infarto agudo do miocárdio (IAM)7-9. Desse modo, a determinação do tamanho do infarto é ponto crítico no estudo das repercussões morfológicas e funcionais após o infarto.

Em estudos experimentais, o tamanho do infarto vem sendo avaliado preferencialmente por quatro diferentes métodos: 1) determinação da área infartada em relação à área do ventrículo esquerdo, determinada por histologia ou por planimetria (nesse último, a área infartada e o montante total do miocárdio são avaliados com auxílio de transiluminação); 2) histologia com a determinação do perímetro interno da região infartada em relação ao perímetro total da cavidade; 3) histologia com a determinação das circunferências epicárdicas e endocárdicas dos segmentos infartados e não-infartados e 4) ecocardiograma com a determinação do perímetro interno da região infartada em relação ao perímetro total da cavidade. A potencial limitação ao emprego dessas quatro diferentes técnicas é que o tamanho do infarto pode variar, o que dependerá do método utilizado. No entanto, o exato grau de variabilidade de cada técnica permanece por ser determinado. Portanto, o objetivo deste trabalho foi analisar as diferenças na estimativa dos tamanhos de infarto pelos quatro diferentes métodos.

Métodos

O protocolo experimental do presente trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal de nossa instituição, em conformidade com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal.

Infarto experimental - Foram utilizados ratos Wistar machos que pesavam entre 200 e 250 gramas. O infarto agudo foi produzido de acordo com método já descrito previamente10,11. Em resumo, os ratos foram anestesiados com éter e submetidos a toracotomia lateral esquerda. Após exteriorização do coração, o átrio esquerdo foi afastado e a artéria coronária esquerda ligada com fio mononáilon 5.00 entre a saída da artéria pulmonar e o átrio esquerdo. A seguir, o coração retornou ao tórax, os pulmões foram inflados com pressão positiva e o tórax fechado por suturas com algodão 10.

Os animais foram mantidos em gaiolas para recuperação, alimentados com ração comercial padrão e livre acesso à água, com controle de luz – ciclos de 12 horas, temperatura de aproximadamente 25º C e umidade controlada.

Estudo ecocardiográfico - Após período de observação de 3 a 6 meses, os animais sobreviventes (n = 122) foram anestesiados com cloridrato de cetamina (50 mg/kg) e cloridrato de xilidino (1 mg/kg), por via intramuscular, para o estudo ecocardiográfico11. Após tricotomia da região anterior do tórax, os animais foram posicionados em decúbito dorsal, em canaleta especialmente projetada, a qual permite leve rotação lateral esquerda para realização do exame, utilizando-se equipamento da Philips (modelo TDI 5500) dotado de transdutor eletrônico multifreqüencial até 12 MHz. As medidas das estruturas cardíacas foram efetuadas nas imagens monodimensionais, obtidas com o feixe de ultra-som orientado pela imagem bidimensional, na posição paraesternal eixo menor. Todas as medidas foram efetuadas de acordo com as recomendações da American Society of Echocardiography12 e já validadas no modelo de ratos infartados13. O tamanho do infarto foi estimado pela determinação do perímetro interno da região infartada (segmento hipocinético/acinético) em relação ao perímetro total da cavidade (ECO). Esses valores foram medidos no modo bidimensional, por meio de planimetria, em dois planos paraesternais: eixo longo e eixo menor, avaliados no plano medial.

Estudo morfométrico - Após o estudo ecocardiográfico, os animais foram sacrificados e os corações retirados e dissecados, separando-se os ventrículos direito e esquerdo, incluindo o septo interventricular. Amostras de tecido cardíaco foram fixadas em solução de formol a 10% por um período de 48 horas, segundo método já descrito14,15.

Os cortes histológicos foram corados em lâmina com solução Hematoxilina-Eosina (HE) e Masson para aferição do tecido infartado, empregando-se microscópio LEICA DM LS acoplado a câmera de vídeo, que envia imagens digitais a computador dotado de programa de análise de imagens Image Pro-plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA).

O tamanho do infarto foi determinado em cortes entre 5 e 6 mm do ápice, pelo fato de os valores dessa região corresponderem à média dos valores obtidos de cortes de todo coração16,17. Para estimativa do tamanho do infarto por meio de análise histológica, foram utilizadas três técnicas: determinação da área infartada em relação à área total do ventrículo esquerdo (AREA), determinação do perímetro interno da região infartada em relação ao perímetro total da cavidade (PER) e determinação das circunferências epicárdicas e endocárdicas dos segmentos infartados e não-infartados (CIR). O tamanho do infarto determinado pelo ecocardiograma e por histologia é expresso como porcentual das medidas da circunferência ventricular.

Análise estatística - Utilizou-se como referência para a determinação do tamanho do infarto o método CIR, considerado o mais confiável para a estimativa da região infartada6. Assim, para a comparação das técnicas, utilizaram-se, como referência, os valores obtidos pelo método CIR; dessa maneira, compararam-se CIR x AREA, CIR x PER e CIR x ECO. Os procedimentos estatísticos adotados foram análise de variância de medidas repetidas, com comparação entre as medianas, complementada com o teste de comparações múltiplas de Dunn; a significância foi estabelecida em p < 0,05; o teste de correlação de Spearman e o método de concordância de Bland & Altman, que permitiu estabelecer os intervalos de concordância entre os resultados relacionados ao tamanho de infarto, obtidos por duas técnicas diferentes.

O método de Bland & Altman é procedimento estatístico e gráfico para comparação de dois métodos, usados para mensuração de variáveis clínicas. O procedimento é o seguinte: calcula-se a diferença entre as medidas obtidas pelos dois métodos e a média e o desvio padrão dessas diferenças. Se os valores das diferenças têm distribuição normal, é esperado que 95% dos valores da diferença fiquem entre a média ± 2 SD. Esse intervalo é chamado de "limite de concordância". Se a faixa de variação desse intervalo for grande, conclui-se não haver concordância entre os dois métodos. Com o exame visual do gráfico, observa-se a grande dispersão dos dados. Se os dois métodos fossem concordantes, os valores da diferença entre os dois iriam se situar próximos ao valor zero.

Para as equações de correção, utilizamos a análise de regressão linear. Foram dados valores de "0" ao tamanho do infarto categorizado como pequeno, quando o valor da % de infarto encontrada era menor do que 40% nos diferentes métodos e dado o valor "1" e considerado como infarto de tamanho grande, quando o valor da % do infarto era maior ou igual a 40%. Dessa maneira, foram calculados os valores de sensibilidade e especificidade dos métodos AREA, PER e ECO em relação ao método CIR.

Resultados

Analisamos os dados de 122 animais. Em relação ao tamanho do infarto obtido pelas diferentes técnicas, os dados estão apresentados em mediana e intervalos interquartis. Houve diferença estatisticamente significativa entre CIR e os outros três métodos (fig. 1). Assim, em relação ao grau de diferença entre os métodos, a medida por área resultou em subestimação de 15% do tamanho do infarto. Por sua vez, as medidas por ecocardiograma e pelo perímetro interno por meio de histologia resultaram em superestimação do tamanho do infarto de 4% e 5%, respectivamente.

A comparação entre métodos também mostrou diferenças entre AREA e os outros dois métodos (p < 0,001). Em relação ao ECO e PER, não foram encontradas diferenças. Desse modo, a próxima etapa foi analisar o intervalo de concordância dos dois métodos. Apesar de a diferença entre os métodos ser de apenas 1,27%, o intervalo de concordância variou de 24,11% a –26,65%, sugerindo baixa concordância entre eles (fig. 2).

Em relação às associações entre os métodos, houve correlações estatisticamente significativas entre: CIR e PER, com coeficiente de correlação de 0,88 e p < 0,0001; CIR e AREA, com coeficiente de correlação de 0,87 e p < 0,0001; e CIR e ECO, com coeficiente de correlação de 0,42 e p < 0,0001 (fig. 3). Além disso, avaliamos a influência do tamanho do infarto nas correlações CIR versus a razão dos outros métodos/CIR. Na comparação entre CIR e ECO/CIR, houve forte correlação negativa (r = 0,66) entre os métodos e o tamanho do infarto. Assim, a análise mostrou maiores porcentagens de variação, ou maiores discrepâncias, entre os métodos nos infartos pequenos (<30%), sugerindo que o tamanho do infarto possa interferir na comparação entre os diferentes métodos (fig. 4). Para os outros métodos, os valores dos coeficientes de correlação foram: PER/CIR (r = 0,28) e AREA/CIR (r = 0,44).

A análise de regressão linear possibilitou a elaboração de equações, cujo objetivo foi corrigir os valores obtidos na determinação do tamanho do infarto pelos diferentes métodos em função do método CIR. Para o tamanho do infarto estimado pelo perímetro interno, obtivemos a equação: CIR = 10,69 + (0,662 x PER), com coeficiente de determinação de 82%. Para o tamanho do infarto estimado pelo ecocardiograma, obtivemos a equação: CIR = 21,81 + (0,437 x ECO), com coeficiente de determinação de 17%; e para o tamanho do infarto estimado pela área, obtivemos a equação: 16,80 + (0,929 x AREA), com coeficiente de determinação de 78%.

Na análise de sensibilidade e especificidade em comparação com CIR, os valores encontrados foram, respectivamente: ECO (87%, 46%), PER (96%, 65%) e AREA (14%, 100%).

Discussão

O nosso trabalho teve por objetivo comparar diferentes métodos para determinação do tamanho do infarto na fase crônica, no modelo experimental do rato. Nossos resultados sugerem que, a despeito de boa correlação, não existe concordância entre os diferentes métodos.

Um dos métodos utilizados para a determinação do tamanho do infarto no modelo do rato foi a análise da área infartada, em relação à área total do ventrículo esquerdo. Devemos considerar, entretanto, que após o infarto ocorrem alterações dinâmicas tanto no segmento infartado como na região não-infartada. Na região infartada, o tecido necrótico é substituído por tecido fibroso de cicatrização. Nesse processo, que no rato dura 21 dias, ocorre reabsorção do tecido necrótico e deposição de colágeno. Nas fases mais tardias da cicatrização, ocorre contração da área fibrótica18. Na área não-infartada do ventrículo esquerdo, ocorrem diferentes graus de hipertrofia cardíaca, como adaptação à perda dos miócitos. Por causa dessas alterações, prevalece o conceito de que a determinação do tamanho do infarto por volume ou área pode resultar em erro. De fato, a reabsorção e retração da área infartada, somadas à hipertrofia da área não-infartada, poderiam resultar em subestimação do tamanho do infarto em relação à área infartada original6. Nossos dados estão em consonância com esse conceito, já que, por área, houve diferença, para menos, de 15% em relação ao tamanho do infarto avaliado pelas circunferências endocárdicas e epicárdicas.

Outro método utilizado para a determinação do tamanho do infarto foi a medida do perímetro interno do segmento infartado, em relação ao perímetro total da cavidade ventricular. Essa análise pode ser feita por dois métodos: ecocardiograma e histologia. No entanto, a exemplo da estimativa por área, esses métodos podem apresentar importantes limitações. Simultaneamente à necrose das miofibrilas, há desintegração do colágeno interfibrilar. Esse fato ocasiona perda do tecido de sustentação, o que torna a região mais distensível e, conseqüentemente, mais suscetível a deformações. Assim, pode ocorrer deslizamento de áreas musculares necróticas, com realinhamento dos miócitos na parede infartada. Como resultado, há afilamento da região e dilatação do segmento infartado. Essa dilatação aguda, caracterizada por adelgaçamento e distensão da região infartada, é denominada expansão do infarto19. Um aspecto a ser considerado é que, secundário à expansão, a determinação do tamanho do infarto pelos perímetros internos pode superestimar o tamanho do infarto6. Outro achado interessante de nosso estudo foi que, para o ecocardiograma, tamanhos pequenos de infarto apresentaram maiores discrepâncias nos valores do tamanho do infarto, quando comparados ao método CIR. Além disso, em relação ao ecocardiograma, o procedimento cirúrgico pode resultar em alguns artefatos, principalmente aderências, o que causaria a identificação de segmentos com hipocinesia, mas não relacionados ao infarto.

Em concordância com esse conceito, nossos resultados mostraram que houve superestimação do tamanho do infarto tanto pelo ecocardiograma como pela histologia. Um dado interessante foi que a superestimação do tamanho do infarto pelos perímetros (ecocardiograma 4% e histologia 5%) foi menos pronunciada que a subestimação do tamanho do infarto pela área (15%).

Outro aspecto a ser considerado refere-se ao fato de que, na comparação de métodos, a presença de correlações estatisticamente significativas e com alto grau de coeficientes de correlação não assegura concordância entre os métodos. Como exemplo, poderíamos citar as comparações entre CIR e AREA. Nosso trabalho encontrou alto grau de coeficientes de correlação entre os métodos (r = 0,87), com alto grau de significância (p < 0,0001). Poderíamos interpretar que essas técnicas apresentaram o mesmo comportamento, no entanto não podemos inferir que os métodos são similares, já que não houve concordância entre os valores obtidos pelos diferentes métodos.

Finalmente, devemos considerar que, nesse modelo, o tamanho do infarto pode variar de 5% a 60%, dificultando a interpretação das repercussões do infarto. Utilizando o método das circunferências, Pfeffer e cols.6 relacionaram o tamanho do infarto com a presença de remodelação cardíaca e disfunção ventricular. Para infartos menores que 20%, os animais não apresentaram remodelação ou evidências de disfunção ventricular. Os animais com infartos moderados, entre 20% e 40%, apresentaram graus diversos de remodelação e disfunção ventricular, mas sem presença de sinais clínicos de insuficiência cardíaca. Os animais com grandes infartos apresentaram importante remodelação e disfunção ventricular, com sinais clínicos de insuficiência cardíaca. Por essa razão, autores, quando estudam esse modelo, usualmente separam os ratos em grupos com infartos pequenos (<40%) ou grandes (>40%). Em nosso estudo, o método que apresentou melhor capacidade de distinguir infartos menores ou maiores que 40%, quando comparado ao método tradicional, foi o PER, que apresentou sensibilidade de 96% e especificidade de 65%.

Outros estudos compararam a estimativa do tamanho do infarto avaliado por dois métodos (ecocardiograma e por métodos histológicos). Em trabalho pioneiro, Litwin e cols.20 não encontraram diferenças no tamanho do infarto avaliado por ecocardiograma e por histologia. No modelo de camundongos, a exemplo do nosso estudo, foi encontrada alta correlação entre os tamanhos de infarto avaliados por histologia e ecocardiograma21. Recentemente, Nozawa e cols.22, no modelo do rato, encontraram alta correlação entre os métodos ecocardiográfico e histológico para a estimativa do tamanho do infarto (r = 0,88). Entretanto, a exemplo de nosso estudo, a análise de Bland-Altman mostrou baixa concordância entre os dois métodos, com intervalo de concordância variando de - 51,4% a +42,9%22. Portanto, as evidências até o momento sugerem que, apesar de "altas" correlações, não foi identificada concordância entre os dois métodos. Outro aspecto a ser considerado é que não encontramos estudos anteriores que fizessem a comparação entre os quatro diferentes métodos avaliados no presente trabalho.

Os nossos resultados devem ser interpretados considerando-se potenciais limitações. A primeira particularidade refere-se às possíveis diferenças entre medidas realizadas post-mortem e in vivo. As medidas no animal intacto sofrem influência da pressão de distensão ventricular resultante de pressão diastólica e pressão de perfusão coronariana. Outra particularidade é o potencial efeito da fixação nos métodos morfométricos, já que a retração da cicatriz pode ser distinta do músculo normal e distorcer a área avaliada. Esses problemas poderiam ser superados com algum grau de estiramento miocárdico antes da fixação do coração, entretanto isso não foi feito no presente estudo. Além disso, não dispomos de dados sobre a variabilidade intra e interobservada ao ecocardiograma.

Pelo exposto, os valores do tamanho do infarto apresentam pouca concordância entre os diferentes métodos. Esse fato deve ser considerado na interpretação de estudos que façam associações entre as alterações morfológicas e funcionais após a lesão isquêmica e o tamanho infarto.

Em suma, na determinação do tamanho do infarto no modelo experimental do rato, apesar da alta correlação, encontramos baixa concordância entre os métodos.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflitos de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação Acadêmica

Não há vinculação desse estudo a programas de pós-graduação.

Correspondência:

Leonardo A. M. Zornoff

Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - UNESP

18618-000 - Botucatu, SP - Brasil

E-mail:

lzornoff@cardiol.br

Artigo recebido em 05/12/06; revisado recebido em 16/02/07; aceito em 26/06/07.

1. Litwin SE. The rat model of postinfarction heart failure. Heart Fail. 1995; 11: 82-95. The rat model of postinfarction heart failure Heart Fail 1995 82 95 11 Litwin SE 2. Pfeffer MA, Frohlich ED. Improvements in clinical outcomes with the use of angiotensin-converting enzyme inhibitors: cross-fertilization between clinical and basic investigation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2006; 291: H2021-5. Improvements in clinical outcomes with the use of angiotensin-converting enzyme inhibitors: cross-fertilization between clinical and basic investigation Am J Physiol Heart Circ Physiol 2006 H2021 5 291 Pfeffer MA Frohlich ED 3. Litwin SE, Raya TE, Anderson PG, Litwin CM, Goldman S. Induction of myocardial hypertrophy after ligation in rats decreases ventricular dilatation and improves systolic function. Circulation. 1991; 84: 1819-27. Induction of myocardial hypertrophy after ligation in rats decreases ventricular dilatation and improves systolic function Circulation 1991 1819 27 84 Litwin SE Raya TE Anderson PG Litwin CM Goldman S 4. Fletcher PJ, Pfeffer JM, Pfeffer MA, Braunwald E. Left ventricular diastolic pressure-volume relations in rats with healed myocardial infarction: effects on systolic function. Circ Res. 1981; 49: 618-26. Left ventricular diastolic pressure-volume relations in rats with healed myocardial infarction: effects on systolic function Circ Res 1981 618 26 49 Fletcher PJ Pfeffer JM Pfeffer MA Braunwald E 5. Raya TE, Gay RG, Lancaster L, Aguirre M, Moffett C, Goldman S. Serial changes in left ventricular relaxation and chamber stiffness after large myocardial infarction in rats. Circulation. 1988; 77: 1424-31. Serial changes in left ventricular relaxation and chamber stiffness after large myocardial infarction in rats Circulation 1988 1424 31 77 Raya TE Gay RG Lancaster L Aguirre M Moffett C Goldman S 6. Pfeffer MA, Pfeffer JM, Fishbein MC, Fletcher PJ, Spadaro J, Kloner RA, et al. Myocardial infarct size and ventricular function in rats. Circ Res. 1979; 503-12. Myocardial infarct size and ventricular function in rats Circ Res 1979 503 12 Pfeffer MA Pfeffer JM Fishbein MC Fletcher PJ Spadaro J Kloner RA 7. Pfeffer MA, Braunwald E. Ventricular remodeling after myocardial infarction: experimental observations and clinical implications. Circulation. 1990; 81: 1161-72. Ventricular remodeling after myocardial infarction: experimental observations and clinical implications Circulation 1990 1161 72 81 Pfeffer MA Braunwald E 8. Pfeffer JM, Pfeffer MA, Braunwald E. Influence of chronic captopril therapy on the infarcted left ventricle of the rat. Circ Res. 1985; 57: 84-95. Influence of chronic captopril therapy on the infarcted left ventricle of the rat Circ Res 1985 84 95 57 Pfeffer JM Pfeffer MA Braunwald E 9. Cohn JN, Ferrari R, Sharpe N. Cardiac remodeling concepts and clinical implications: a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J Am Coll Cardiol. 2000; 35: 569-82. Cardiac remodeling - concepts and clinical implications: a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling J Am Coll Cardiol 2000 569 82 35 Cohn JN Ferrari R Sharpe N 10. Zornoff LAM, Matsubara BB, Matsubara LS, Paiva SAR, Spadaro J. Early rather than delayed administration of lisinopril protects the heart after myocardial infarction in rats. Basic Res Cardiol. 2000; 95: 208-14. Early rather than delayed administration of lisinopril protects the heart after myocardial infarction in rats Basic Res Cardiol 2000 208 14 95 Zornoff LAM Matsubara BB Matsubara LS Paiva SAR Spadaro J 11. Zornoff LAM, Matsubara BB, Matsubara LS, Minicucci MF, Azevedo PS, Campana, AO, et al. A exposição à fumaça do cigarro intensifica a remodelação ventricular após o infarto agudo do miocárdio. Arq Bras Cardiol. 2006; 86: 276-82. A exposição à fumaça do cigarro intensifica a remodelação ventricular após o infarto agudo do miocárdio Arq Bras Cardiol 2006 276 82 86 Zornoff LAM Matsubara BB Matsubara LS Minicucci MF Azevedo PS Campana AO 12. Sahn DJ, DeMaria A, Kisslo J, Weyman AE. The Committee on M-mode standardization of the American Society of Echocardiography. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 1978; 58: 1072-83. The Committee on M-mode standardization of the American Society of Echocardiography: Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements Circulation 1978 1072 83 58 Sahn DJ DeMaria A Kisslo J Weyman AE 13. Solomon SD, Greaves SC, Ryan M, Finn P, Pfeffer MA, Pfeffer JM. Temporal dissociation of left ventricular function and remodeling following experimental myocardial infarction in rats. J Card Fail. 1999; 5: 213-23. Temporal dissociation of left ventricular function and remodeling following experimental myocardial infarction in rats J Card Fail 1999 213 23 5 Solomon SD Greaves SC Ryan M Finn P Pfeffer MA Pfeffer JM 14. Zornoff LAM, Paiva SAR, Matsubara BB, Matsubara LS, Spadaro J. Combination therapy with angiotensin converting enzyme inhibition and AT1 receptor inhibitor on ventricular remodeling after myocardial infarction in rats. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2000; 5: 203-9. Combination therapy with angiotensin converting enzyme inhibition and AT1 receptor inhibitor on ventricular remodeling after myocardial infarction in rats J Cardiovasc Pharmacol Ther 2000 203 9 5 Zornoff LAM Paiva SAR Matsubara BB Matsubara LS Spadaro J 15. Matsubara LS, Matsubara BB, Okoshi MP, Cicogna AC, Janicki JS. Alterations in myocardial collagen content affect rat papillary muscle function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2000; 279: H1534-9. Alterations in myocardial collagen content affect rat papillary muscle function Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000 H1534 9 279 Matsubara LS Matsubara BB Okoshi MP Cicogna AC Janicki 16. Spadaro J, Fishbein MC, Hare C, Pfeffer MA, Maroko PR. Characterization of myocardial infarcts in the rat. Arch Pathol Lab Med. 1980; 104: 179-83. Characterization of myocardial infarcts in the rat Arch Pathol Lab Med 1980 179 83 104 Spadaro J Fishbein MC Hare C Pfeffer MA Maroko PR 17. Oh B-H, Ono S, Rockman HR, Ross Junior J. Myocardial hypertrophy in the ischemic zone induced by exercise in rats after coronary reperfusion. Circulation. 1993; 87: 598-607. Myocardial hypertrophy in the ischemic zone induced by exercise in rats after coronary reperfusion Circulation 1993 598 607 87 Oh B-H Ono S Rockman HR Ross Junior J 18. Fishbein MC, Maclean MB, Maroko PR. Experimental myocardial infarction in the rat. Am J Pathol. 1978; 90: 55-70. Experimental myocardial infarction in the rat Am J Pathol 1978 55 70 90 Fishbein MC Maclean MB Maroko PR 19. Matsubara BB, Zornoff LAM. Matriz colágena intersticial e sua relação com a expansão miocárdica no infarto agudo. Arq Bras Cardiol. 1995; 64: 559-63. Matriz colágena intersticial e sua relação com a expansão miocárdica no infarto agudo Arq Bras Cardiol 1995 559 63 64 Matsubara BB Zornoff LAM 20. Litwin SE, Katz SE, Morgan PG, Douglas OS. Serial echocardiographic assessment of the ventricular geometry and function after large myocardial infarction in the rat. Circulation. 1994; 89: 345-54. Serial echocardiographic assessment of the ventricular geometry and function after large myocardial infarction in the rat Circulation 1994 345 54 89 Litwin SE Katz SE Morgan PG Douglas OS 21. Kanno S, Lerner DL, Schuessler RB, Betsuyaku T, Yamada KA, Saffitz JE, et al. Echocardographic evaluation of ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. J Am Soc Echocardiogr. 2002; 15: 601-9. Echocardographic evaluation of ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction J Am Soc Echocardiogr 2002 601 9 15 Kanno S Lerner DL Schuessler RB Betsuyaku T Yamada KA Saffitz JE 22. Nozawa E, Kanashiro RM, Murad N, Carvalho AC, Cravo SL, Campos O, et al. Performance of two-dimentional Doppler echocardiography for the assessment of infarct size and left ventricular function in rats. Braz J Med Biol Res. 2006; 39: 687-95. Performance of two-dimentional Doppler echocardiography for the assessment of infarct size and left ventricular function in rats Braz J Med Biol Res 2006 687 95 39 Nozawa E Kanashiro RM Murad N Carvalho AC Cravo SL Campos O Original Articles Comparison of different methods to measure experimental chronic infarction size in the rat model

OBJECTIVE: To evaluate the differences between three methods for the measurement of experimental infarction in rats in comparison to the traditional method. METHODS: Histological analysis of the infarction area (AREA), histological analysis of the internal cavity perimeter (PER) and echocardiogram analysis of the internal perimeter (ECHO) were compared to the traditional method (histological analysis of the epicardial and endocardial circumferences of the infarction region - CIR). Repeated ANOVA measurements were used in conjunction with the Dunn multiple comparison test, the Bland and Altman concordance method and the Spearman correlation test. Significance was established as p < 0.05. RESULTS: The data of 122 animals were analyzed, 3 to 6 months after the infarction. Infarction size assessments revealed differences between CIR and the other three methods (p < 0.001): CIR = 42.4% (35.9-48.8), PER = 50.3% (39.1-57.0), AREA = 27.3% (20.2-34.3), ECHO = 46.1% (39.9-52.6). Therefore, measurement by area underestimated the infarct size by 15%, whereas the echocardiogram and histological internal perimeter measurements overestimated the infarct size by 4% and 5%, respectively. In relation to ECHO and PER, even though the difference between the methods was only 1.27%, the concordance interval ranged from 24.1% to -26.7%, suggesting a low level of concordance between the methods. In relation to associations, statistically significant correlations were found between: CIR and PER (r = 0.88 and p < 0.0001); CIR and AREA (r = 0.87 and p < 0.0001) and CIR and ECHO (r = 0.42 and p < 0.0001). CONCLUSION: Despite the high level of correlation, there was a low level of concordance between the methods to define infarct size.

 Myocardial infarction rats

ORIGINAL ARTICLE

Comparison of different methods to measure experimental chronic infarction size in the rat model

Marcos F. Minicucci; Paula S. Azevedo; Daniella R. Duarte; Beatriz B. Matsubara; Luiz S. Matsubara; Álvaro O. Campana; Sergio A. R. Paiva; Leonardo A. M. Zornoff

Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP - Botucatu, SP - Brazil

Mailing address

SUMMARY

OBJECTIVE: To evaluate the differences between three methods for the measurement of experimental infarction in rats in comparison to the traditional method.

METHODS: Histological analysis of the infarction area (AREA), histological analysis of the internal cavity perimeter (PER) and echocardiogram analysis of the internal perimeter (ECHO) were compared to the traditional method (histological analysis of the epicardial and endocardial circumferences of the infarction region - CIR). Repeated ANOVA measurements were used in conjunction with the Dunn multiple comparison test, the Bland and Altman concordance method and the Spearman correlation test. Significance was established as p < 0.05.

RESULTS: The data of 122 animals were analyzed, 3 to 6 months after the infarction. Infarction size assessments revealed differences between CIR and the other three methods (p < 0.001): CIR = 42.4% (35.9-48.8), PER = 50.3% (39.1-57.0), AREA = 27.3% (20.2-34.3), ECHO = 46.1% (39.9-52.6). Therefore, measurement by area underestimated the infarct size by 15%, whereas the echocardiogram and histological internal perimeter measurements overestimated the infarct size by 4% and 5%, respectively. In relation to ECHO and PER, even though the difference between the methods was only 1.27%, the concordance interval ranged from 24.1% to –26.7%, suggesting a low level of concordance between the methods. In relation to associations, statistically significant correlations were found between: CIR and PER (r = 0.88 and p < 0.0001); CIR and AREA (r = 0.87 and p < 0.0001) and CIR and ECHO (r = 0.42 and p < 0.0001).

CONCLUSION: Despite the high level of correlation, there was a low level of concordance between the methods to define infarct size.

Key words: Myocardial infarction/physiopatology; rats.

Introduction

The experimental acute myocardial infarction model has been widely used for some years now to study physiopathological alterations that occur during and after ischemic attacks.

Among the various models in existence, the experimental infarction in rat models is the most prominent. This is largely due to the fact that it is practical, owing to its relatively low cost in comparison to other animal models, but is mainly due to the reproducibility of results in comparison to subsequent clinical studies1,2.

One of the most relevant aspects of this model is the infarction size. It is accepted that the acute hemodynamic consequences of a coronary occlusion are closely related to infarction size3-6. Chronically, alterations in the composition, mass, volume and cardiac geometry can occur that are collectively called cardiac remodeling7-9. The degree of ventricular remodeling is directly associated with a worse diagnosis due to a greater incidence in the formation of aneurisms, ventricular rupture, arrhythmias and the association with progressive ventricular dysfunction. Similar to the acute alterations, the infarct size is the main determining factor for the presence and intensity of ventricular remodeling after acute myocardial infarction (AMI)7-9. Therefore, defining the infarction size is a critical point in the study of morphological and functional repercussions after infarction.

In experimental studies, infarction size has been preferentially evaluated by four different methods: 1) definition of the infarction area in relation to the left ventricle area using histology or planimetry (with planimetry, the infarction area and total myocardial area are evaluated using transillumination); 2) histological analysis to define the internal perimeter of the infarcted region in relation to the total cavity perimeter; 3) histological analysis to define the epicardial and endocardial circumferences of the infarcted and noninfarcted segments and 4) echocardiogram to define the internal perimeter of the infarcted region in relation to the total cavity perimeter. The potential limitation of these four different techniques is that the infarction size can vary depending on the method used. However, the exact degree of variability for each technique has not yet been determined. Therefore, the objective of this study was to analyze the differences in infarction size estimates using the four different methods.

Methods

The experimental protocol for the present study was approved by our institution’s Ethics Commission for Animal Experiments, in accordance with the Ethical Principles for Animal Experiments adopted by the Brazilian College of Animal Experiments.

Experimental infarction - Male Wistar rats weighing between 200 and 250 grams were used for the experiment. The acute infarction was produced in accordance with the previously described method10,11. In short, the rats were anesthetized with ether and undewent left lateral thoracotomies. After exteriorization of the heart, the left atrium was separated and the left coronary artery was ligated with #5.00 mononylon thread between the exit point of the pulmonary artery and left atrium. Next, the heart was returned to the chest, the lungs were inflated with positive pressure and the thorax was closed with #10 cotton sutures.

The animals were kept in cages during recovery, received standard commercial feed and were allowed free access to water in a room with controlled humidity and temperature, approximately 25ºC, and a 12 hour light - dark cycle.

Echocardiograph Study - After an observation period of 3 to 6 months, the surviving animals (n = 122) were anesthetized with cetamine chloride (50 mg/kg) and xylidine chloride (1 mg/kg) that was injected in the muscle for the echocardiograph study11. After trichotomy of the anterior chest region, the animals were placed in the supine position in a specially designed channel that enabled slight lateral left rotation for the test that was conducted using Philips equipment (model TDI 5500) with an electronic transducer with a multi-frequency range of up to 12 MHz. Measurements of the cardiac structures were taken from the M-mode images, using the two dimensional image to direct the ultrasound beam in the parasternal short axis position. All measurements were taken in accordance with the recommendations of the American Society of Echocardiography12 and previously validated in the infarcted rats model13. Infarction size was estimated by defining the internal perimeter of the infarcted region (hypokinetic/akinetic segment) in relation to the total cavity perimeter (ECHO). These values were measured in the two dimensional mode using planimetry in two parasternal views: long and short axis, evaluated in the medial plane.

Morphometric study - After the echocardiography study, the animals were sacrificed, their hearts were removed and dissected, and the right and left ventricles, including the interventricular septum, were separated. Cardiac tissue samples were fixed in a 10% formaldehyde solution for 48 hours using a previously described method14,15.

The histological sections were stained on a slad with Hematoxylin-Eosin (HE) and Masson agents to assess the infarction tissue, using a LEICA DM LS microscope attached to a video camera that sent digital images to a computer equipped with the image analysis program, Image Pro-plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA).

The infarction size was determined in sections 5 to 6 mm from the apex, since the values in this region correspond to the mean of the values obtained from sections of the entire heart16,17. Three histological analysis techniques were used to estimate the infarction size: definition of the infarction area in relation to the total area of the left ventricle (AREA), definition of the internal perimeter of the infarction region in relation to the total cavity perimeter (PER) and definition of the epicardial and endocardial circumferences of the infarcted and noninfarcted segments (CIR). The echocardiogram and histological infarction sizes are expressed as a percentile of the ventricular circumference measurements.

Statistical analysis - The CIR method was used as a reference to determine infarction size, since it is regarded as the most reliable method to estimate the infarction region6. Therefore, the CIR measurements were used as a reference to compare the following values: CIR vs AREA, CIR vs PER and CIR vs ECHO. The statistical procedures adopted were: variance analysis for repeated measurements, to compare the median values, as well as the Dunn multiple comparison test. Significance was established as p < 0.05. The Spearman correlation test and Bland & Altman concordance method were used to establish the concordance intervals between the results for the infarction sizes obtained by the two different techniques.

The Bland & Altman method is a statistical and graphical procedure to compare two methods used to measure the clinical variables. The procedure is as follows: the difference between the measurements obtained from the two methods as well as the mean and standard deviation of these differences are calculated. If the values of the differences have a normal distribution, it is expected that 95% of these values will be between the mean ± 2 SD. This interval is called the "concordance limit". If this interval presents a significant range of variation, it is presumed that there is no concordance between the two methods. Visual examination of the graph reveals significant data dispersion. If there was concordance between the two methods, the difference values would be located close to the zero mark.

Linear regression analysis was used for the correction equations. Values of "0" were given to the infarctions classified as small, when the % value of the infarction was less than 40% for the different methods and values of "1" were given to the infarctions classified as large, when the % value of the infarction was greater than or equal to 40%. Therefore, the sensitivity and specificity values for the methods AREA, PER and ECHO were calculated in relation to the CIR method.

Results

We analyzed the data of 122 animals. The data in regard to the infarction sizes obtained using the different techniques are presented as medians and interquartile intervals. Significant statistical differences were found between CIR and the other three methods (fig.1). As a result, the degree of difference between the area measurement methods, underestimated the infarction size by 15%. In turn, the echocardiogram and histological internal perimeter measurements, overestimated the infarction size by 4% and 5%, respectively.

Comparisons between methods also revealed differences between the AREA methods and the other two techniques (p < 0.001). In relation to ECHO and PER no differences were found. Therefore, the next step was to analyze the concordance interval of the two methods. Even though the difference between the methods was only 1.27%, the concordance interval ranged from 24.11% to -26.65%, suggesting a low level of concordance (fig. 2).

In relation to associations between the methods, statistically significant correlations were found between: CIR and PER, with a correlation coefficient of 0.88 and p < 0.0001; CIR and AREA with a correlation coefficient of 0.87 and p < 0.0001; and CIR and ECHO with a correlation coefficient of 0.42 and p < 0.0001 (fig. 3). In addition, we evaluated the influence of the infarction size in the correlations CIR versus the ratio of the other methods/CIR. In the comparison between CIR and ECHO/CIR, a strong negative correlation (r = 0.66) was found between the methods and infarction size. Therefore, the analysis demonstrated greater variation percentages, or greater discrepancies between the methods for small infarctions (<30%) suggesting that the infarction size can interfere in the comparison between the different methods (fig. 4). For the other methods, the correlation coefficient values were: PER/CIR (r = 0.28) and AREA/CIR (r = 0.44).

The linear regression analysis made it possible to prepare equations in order to correct the values obtained in defining the infarction size, using different methods in relation to the CIR method. For the estimated infarction size using the internal perimeter, we obtained the equation: CIR = 10.69 + (0.662 x PER), with a determination coefficient of 82%. For the infarction size estimated by the echocardiogram, we obtained the equation: CIR = 21.81 + (0.437 x ECHO), with a determination coefficient of 17%; for the infarction size estimated by area, we obtained the equation: 16.80 + (0.929 x AREA), with a determination coefficient of 78%.

In the sensitivity and specificity analysis in comparison with CIR, the values found were, respectively: ECHO (87%, 46%), PER (96%, 65%) and AREA (14%, 100%).

Discussion

The objective of this study was to compare the different methods to determine infarction size during the chronic phase in the experimental rat model. Our results suggest that, despite the good correlation, there is no concordance between the different methods.

One of the methods used to define the infarction size in the rat model was the analysis of the infarction area in relation to the total area of the left ventricle. Nevertheless, we should consider that after the infarction, dynamic alterations occur in both the infarcted and noninfarcted segments. In the infarcted region, the necrotic tissue is substituted by a fibrous scar tissue. In this process, that lasts 21 days in the rats, the necrotic tissue is reabsorbed and collagen is deposited. In the later stages of healing, the fibrotic area contracts18. In the noninfarcted area of the left ventricle, varying degrees of cardiac hypertrophy occur, to compensate for the loss of myocytes. Due to these alterations, the prevailing concept is that definition of infarction size using volume or area can result in errors. In fact the reabsorption and retraction of the infarcted area, added to the hypertrophy in the noninfarcted area, could result in underestimation of the infarction size when compared to the original infarction area6. Our data agree with this concept, since, by area, there was a difference of 15% less in relation to the infarction size evaluated using the endocardiac and epicardiac circumferences.

Another method used to determine the infarction size, was the measuring of the internal perimeter of the infarcted segment in relation to the total perimeter of the ventricular cavity. This analysis can be made using two methods: echocardiogram and histology. Nevertheless, in the case of estimations by area, these methods can present significant limitations. In conjunction with the myofibrilla necrosis, the interfibrillar collagen disintegrates. This fact causes loss of connective tissue, making the region more susceptible to distensions and consequent deformations. Therefore, the necrotic muscle areas could shift, realigning the myocytes on the infarcted wall. As a result, the region becomes thinner and the infarcted region dilates. This acute dilatation, marked by the thinning and distension of the infarcted zone, is called infarct expansion19. One aspect to be considered is that, secondary to the expansion, the definition of the infarction size using the internal perimeters can overestimate the infarct size6. Another interesting finding in our study was that, when compared to the CIR method, the echocardiogram presented greater discrepancies for small infarctions. Additionally, in relation to the echocardiogram, the surgical procedure can cause some artifacts, mainly adherences, that could identify hypokinetic segments that are not related to the infarction.

In agreement with this concept, our results demonstrate that the infarction size was overestimated with both the echocardiogram and histology. An interesting point is that the overestimation of the infarct size using the perimeters (echocardiogram 4% and histology 5%) was less pronounced than the underestimation with the area method (15%).

Another aspect to be considered, is the fact that when comparing the methods, statistically significant correlations with a high degree of correlation coefficients do not ensure concordance between the methods. As an example, we can cite the comparisons between CIR and AREA. Our study found a high degree of correlation coefficients between the methods (r=0.87) and a high significance level (p < 0.0001). We can construe that these techniques presented the same behavior; however we cannot infer that the methods are similar since there was no concordance between the values obtained using the different methods.

Finally, we should consider that in this model, the infarction size can range from 5% to 60%, making it difficult to interpret the repercussions of the infarction. Using the circumference method, Pfeffer and associates6 related the infarction size to the presence of cardiac remodeling and ventricular dysfunction. For infarctions less than 20%, the animals did not present remodeling or evidence of ventricular dysfunction. The animals with moderate infarctions, between 20% and 40%, presented various degrees of remodeling and ventricular dysfunction, but did not present clinical signs of heart failure. The animals with large infarctions presented significant remodeling and ventricular dysfunction with clinical signs of heart failure. For this reason, when studying this model, the authors usually separate the rats into groups with small (<40%) or large (>40%) infarctions. In our study, the method that presented the best capacity to distinguish between infarctions less than or greater than 40%, in comparison to the traditional method, was PER that presented sensitivity of 96% and specificity of 65%.

Other studies have compared the estimated infarction size using two methods (echocardiogram and histological methods). In a groundbreaking study, Litwin and associates20 did not find any differences in the infarction sizes evaluated by echocardiogram and histology. In the mice model, as in the case of our study, a high correlation was found between the infarction sizes evaluated by histology and echocardiograms21. Recently, Nozawa and associates22 using the rat model, found a high correlation between the echocardiograph and histology methods to estimate infarction size (r = 0.88). Nevertheless, as in the case of our study, the Bland-Altman analysis demonstrated low concordance between the two methods, with a concordance interval ranging from –51.4% to +42.9%22. Therefore, to date the evidence suggests that despite the "high" correlations, concordance between the two methods has not been identified. Another aspect to be considered is that we did not find any previous studies that compared the four different methods evaluated in the present study.

Our results should be interpreted considering potential limitations. The first distinction is the possible difference between the post-mortem and in vivo measurements. Measurements of the intact animal are influenced by the pressure of ventricular distension caused by diastolic and coronary perfusion pressures. Another distinction is the potential effect of the fixation in the morphometric methods, since the scar retraction could be different from the normal muscle and distort the area evaluated. These problems could be overcome with some degree of myocardial stretching before fixing the heart, however this was not done in the present study. Additionally, we did not prepare echocardiogram data for intra and interobserver variability.

As shown, the infarction size values present a low level of concordance between the different methods. This fact should be considered when interpreting studies that associate morphological and functional alterations after the ischemic lesion and the infarction size.

In closing, despite the high correlation in the definition of infarction size using the experimental rat model, we found a low level of concordance between the methods.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This study is not associated with any graduation program.

References

Mailing address:

Leonardo A. M. Zornoff

Faculdade de Medicina de Botucatu

Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - UNESP

18618-000 - Botucatu, SP - Brazil

E-mail:

lzornoff@cardiol.br

Manuscript received December 5, 2006; revised manuscript received February 16, 2007; accepted June 26, 2007.