abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil 6LPLf49xwzvNK6wWvHpctrp 00014 S0066-782X2007000400014 S0066-782X(07)08800414 10.1590/S0066-782X2007000400014 Artigos Originais Análise combinada de fatores genéticos e ambientais na hipertensão essencial em um município da região Amazônica Freitas Silvia Regina Sampaio Cabello Pedro Hernan Moura-Neto Rodrigo Soares Dolinsky Luciana Cresta Bóia Marcio Neves Rio de Janeiro Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Biologia Brazil Rio de Janeiro RJ UNIGRANRIO Instituto de Biociências FIOCRUZ Instituto Oswaldo Cruz 04 2007 88 4 447 451 08 05 2006 19 06 2006 03 07 2006 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

OBJETIVO: Este estudo avaliou a contribuição de seis polimorfismos genéticos presentes em genes do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) e fatores de risco clínicos para o desenvolvimento da hipertensão arterial essencial em um município da região Amazônica. MÉTODOS: Oitenta e dois indivíduos hipertensos e setenta e oito indivíduos normotensos foram genotipados quanto à presença de polimorfismos REN-G1051A (renina), AGT-M235T (angiotensinogênio), ECA-Alu I/D (enzima conversora de angiotensina I), AGTR1-A1166C (receptor tipo 1 da angiotensina II) e CYP11B2-C344T (aldosterona sintetase) pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), com análise de restrição quando necessário. A influência de polimorfismos genéticos e fatores de risco clínicos na variação da pressão arterial foi avaliada por meio de regressão linear stepwise. RESULTADOS: Relatamos a co-ocorrência de fatores de risco clínicos e polimorfismo do gene da enzima conversora de angiotensina (ECA) na população de um município da região amazônica. Nossos resultados mostram que a elevação da pressão arterial sistólica é favorecida pelo alelo D do polimorfismo de inserção/deleção do gene da ECA e pelo aumento da idade, enquanto consumo de bebida alcoólica e envelhecimento estão associados ao aumento da pressão arterial diastólica (PAD). CONCLUSÃO: Esses achados indicam que os moradores de Santa Isabel do Rio Negro que possuem o alelo D da ECA ou têm o hábito de beber apresentam valores mais elevados de PAS e PAD, respectivamente, com o passar dos anos.

 Polimorfismo hipertensão essencial riscos ambientais genética 24 05 2007

ARTIGO ORIGINAL

Análise combinada de fatores genéticos e ambientais na hipertensão essencial em um município da região Amazônica

Silvia Regina Sampaio Freitas; Pedro Hernan Cabello; Rodrigo Soares Moura-Neto; Luciana Cresta Dolinsky; Marcio Neves Bóia

Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Instituto de Biologia – UFRJ, Instituto de Biociências – UNIGRANRIO - Rio de Janeiro, RJ

Correspondência

RESUMO

OBJETIVO: Este estudo avaliou a contribuição de seis polimorfismos genéticos presentes em genes do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) e fatores de risco clínicos para o desenvolvimento da hipertensão arterial essencial em um município da região Amazônica.

MÉTODOS: Oitenta e dois indivíduos hipertensos e setenta e oito indivíduos normotensos foram genotipados quanto à presença de polimorfismos REN-G1051A (renina), AGT-M235T (angiotensinogênio), ECA-Alu I/D (enzima conversora de angiotensina I), AGTR1-A1166C (receptor tipo 1 da angiotensina II) e CYP11B2-C344T (aldosterona sintetase) pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), com análise de restrição quando necessário. A influência de polimorfismos genéticos e fatores de risco clínicos na variação da pressão arterial foi avaliada por meio de regressão linear stepwise.

RESULTADOS: Relatamos a co-ocorrência de fatores de risco clínicos e polimorfismo do gene da enzima conversora de angiotensina (ECA) na população de um município da região amazônica. Nossos resultados mostram que a elevação da pressão arterial sistólica é favorecida pelo alelo D do polimorfismo de inserção/deleção do gene da ECA e pelo aumento da idade, enquanto consumo de bebida alcoólica e envelhecimento estão associados ao aumento da pressão arterial diastólica (PAD).

CONCLUSÃO: Esses achados indicam que os moradores de Santa Isabel do Rio Negro que possuem o alelo D da ECA ou têm o hábito de beber apresentam valores mais elevados de PAS e PAD, respectivamente, com o passar dos anos.

Palavras-chave: Polimorfismo, hipertensão essencial, riscos ambientais, genética.

Introdução

Hipertensão essencial (HE) é uma doença multifatorial desencadeada pela associação de diversos fatores genéticos e ambientais. Estudos epidemiológicos indicaram que variantes genéticas, inclusive variantes dos genes do angiotensinogênio (AGT)1, da renina (REN)2, da enzima conversora de angiotensina (ACE)3, do receptor tipo 1 da angiotensina II (AGTR1)4,5 e da aldosterona sintetase (CYP11B2)6, aumentam o risco de hipertensão essencial. Entretanto, a influência de formas polimórficas desses genes apresentou resultados conflitantes em diferentes populações7,8. Talvez esse cenário seja um reflexo do impacto variável da herança genética das populações e da interação de fatores ambientais, que podem estar modulando esses antecedentes moleculares. Dados recentes publicados na literatura mostraram que a presença isolada do genótipo/alelo desfavorável pode indicar uma associação pequena ou não-significante com HE. Contudo, a co-ocorrência de diferentes genótipos desfavoráveis e fatores de risco clínicos podem aumentar o risco de hipertensão. Os dados indicam que os fatores de risco ambientais mais importantes são idade avançada, ingestão de álcool, tabagismo e massa corporal. A associação desses fatores com um genótipo desfavorável, como ECA-DD e metilenotetraidrofolato redutase (MTHFR) 677-TT, pode aumentar substancialmente o risco de HE, comparado com pacientes que não apresentam riscos clínicos9.

O objetivo deste estudo foi investigar a associação de marcadores genéticos AGT-M235T, REN-G1051A, ACE-I/D, AGTR1-A1166C e CYP11B2-C344T e fatores antropométricos comuns com hipertensão essencial em uma comunidade isolada da região amazônica.

Métodos

Santa Isabel do Rio Negro está situada no nordeste do Estado do Amazonas (0º 28' sul e 65º 32' oeste), na região do Alto Rio Negro. O município ocupa uma área de 62.846 Km2 (IBGE, 2003), 90% coberta dela pela Floresta Amazônica. A maior parte dos 10.561 habitantes de Santa Isabel do Rio Negro é descendente de índios. Destes, 4.220 moram na cidade e 6.341 estão distribuídos em comunidades ribeirinhas do município, inclusive na reserva indígena Yanomami10.

Os indivíduos foram selecionados para este estudo por meio da Técnica da Amostragem sistemática por Conglomerados, em que a cada residência foi considerada uma unidade amostral. Cento e quinze residências foram visitadas, e de cada uma delas foi selecionado um adulto. Ao todo, 82 indivíduos foram classificados como hipertensos de acordo com os seguintes critérios: 1) pressão arterial (PA) > 140/90 mmHg (obtida a partir de leituras repetidas realizadas segundo diretrizes internacionais)11; 2) ausência de tratamento anti-hipertensivo e 3) exclusão de formas secundárias de hipertensão. Os controles normotensos consistiram de 78 indivíduos, caracterizados por ausência de história familiar de HE ou outro transtorno cardiovascular e PA < 140/90 mmHg.

Todos os participantes foram submetidos a exame físico completo e análises laboratoriais de rotina e assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido.

Os participantes foram classificados como caucasianos, negróides, indígenas descendentes ou mistos (mestiços), de acordo com um conjunto de características fenotípicas12. Indivíduos que fumavam mais de cinco cigarros por dia há pelo menos um ano foram classificados como fumantes, e os que bebiam de 30 a 40 ml de álcool ou mais por dia foram considerados bebedores.

A genotipagem de polimorfismo I/D da ECA3, AGT M235T13, REN G1051A2, AGTR1 A1166C4 e C344T6 foi realizada pela técnica de PCR associada à análise de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (PCR-RFLP). O controle de qualidade para esses testes foi avaliado por meio da seleção aleatória de amostras de grupos de indivíduos hipertensos e normotensos para nova genotipagem.

Os dados clínicos e antropométricos foram comparados pelo teste t de Student para dados quantitativos e teste qui-quadrado (c2) para dados qualitativos. As freqüências genotípicas foram calculadas com o programa estatístico SPSS (versão 10.1), e as freqüências alélicas foram calculadas por meio da contagem direta de genes. O equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) para a distribuição dos genótipos foi testado pelo teste c2, com o auxílio do programa GENIOC14. Realizamos também uma regressão linear stepwise (programa SPSS, versão 12.0) para explorar os efeitos dos genótipos e fatores antropométricos sobre a hipertensão. Nessa análise, as variáveis dependentes foram pressão arterial sistólica (PAS) e pressão arterial diastólica (PAD), e as variáveis independentes foram idade, índice de massa corporal (IMC), sexo (0 = feminino, 1 = masculino), tabagismo (0 = não-fumante, 1 = fumante), consumo de álcool (0 = abstêmio, 1 = bebedor), diabetes melito (0 para glicemia < 100 mg/dl, 1 para outros níveis), etnia (etnia_1 [negros], etnia_2 [caucasianos], etnia_3 [indígenas descendentes]; etnia_4 [mestiços]). Foram atribuídos valores de 0 e 1 para presença ou ausência de etnia, respectivamente.

Resultados

Consumo de álcool, idade avançada e tabagismo foram mais freqüentes em hipertensos do que em normotensos (Tab.1). Esses resultados são corroborados por estudos anteriores, que demonstraram que o consumo de álcool contribui para o desenvolvimento de HE ao estimular o sistema nervoso simpático e aumentar a produção de hormônios adrenocorticóides15, enquanto idade avançada e tabagismo atuam como co-fatores que, em associação com sensibilidade ao sal, consumo de álcool ou obesidade, colaboram para o surgimento dessa doença16. Diabete melito e obesidade também são importantes fatores de risco clínicos para hipertensão, mas suas freqüências não diferiram significantemente entre os grupos, mesmo em pacientes com IMC ligeiramente elevado. Além disso, o perfil de etnia observado na população amazônica (onde um grande número de indivíduos de ambos os grupos são índios ou mestiços e poucos são negróides ou caucasóides) foi bastante semelhante entre normotensos e hipertensos.

A distribuição genotípica de cada polimorfismo ficou dentro das expectativas do EHW (p > 0,05) nos dois grupos. As freqüências alélicas de todos os polimorfismos não diferiram entre normotensos e hipertensos (Tab.2). Mas a distribuição genotípica do polimorfismo I/D do gene da ECA diferiu entre os grupos: 9,76% de hipertensos contra 5,1% de normotensos tinham genótipo ECA-DD; e 57,32% de hipertensos contra 78,2% de normotensos tinham genótipo ECA-II. Observou-se que o genótipo da ECA (DD) considerado o "pior' era ligeiramente mais freqüente em hipertensos do que em normotensos. Esses alelos/genótipos desfavoráveis estão associados com alterações fisiológicas que podem levar ao desenvolvimento de hipertensão. No entanto, os resultados de estudos realizados em todo o mundo são controversos e, conseqüentemente, as freqüências de genótipos da ECA variam amplamente7,17,18. As freqüências genotípicas de M235T, G1051A, A1166C e C344T não apresentaram nenhuma diferença em ambos os grupos (p > 0,05).

Para investigar quais são os polimorfismos genéticos e/ou variantes clínicas que estão associados com a alteração da PA, analisamos simultaneamente o perfil genético e clínico de indivíduos normotensos e hipertensos. A análise de regressão linear stepwise revelou que polimorfismo I/D da ECA (alelo D) e idade avançada contribuíram para a variação da PAS (F = 12,958, p = 0,000). O alelo D está associado a um aumento de 7,8 mmHg na PAS (b = 7,829, p = 0,006), enquanto idade avançada contribui para um aumento de 0,471 mmHg na PAS por ano de idade (b = 0,471, p = 0,000). Esse polimorfismo é responsável por metade da variação nos níveis plasmáticos de ECA, produzindo uma grande variabilidade entre os indivíduos19. Observou-se que homozigotos para o alelo D exibem quase o dobro dos níveis séricos de ECA dos homozigotos para o alelo I. Mas haplótipos específicos constituídos por polimorfismos de I/D e polimorfismos nucleotídicos simples dentro do gene da ECA foram mais exatos para a determinação dos níveis plasmáticos de ECA. Segundo Keavney e cols.19, o uso de análise de haplótipos da ECA foi capaz de determinar 36% da variação fenotípica dos níveis de ECA. A despeito do comprometimento fisiológico causado pelo polimorfismo I/D da ECA, estudos recentes demonstraram que fatores de risco clínicos podem aumentar a suscetibilidade do gene da ECA. Diversos estudos demonstraram que idade avançada, alcoolismo, tabagismo e massa corporal são importantes fatores de risco para HE, sobretudo quando ocorrem simultaneamente com genótipo ECA-DD7. Em conformidade com os relatos publicados na literatura, nossos achados também indicam que o polimorfismo I/D do gene da ECA constitui um fator de risco clínico específico para o desenvolvimento de HE. A analise de regressão linear stepwise revelou que indivíduos que têm o alelo D apresentam um aumento de 7,8 mmHg na PAS, em comparação com os indivíduos que têm apenas o alelo I. Além do polimorfismo I/D, o envelhecimento também contribui para os efeitos desfavoráveis do alelo D, acarretando um aumento progressivo da PAS. Em vista dos nossos achados, acreditamos que essa grande variação da PAS pode ser, em parte, determinada por predisposição genética (alelo ECA-D) e idade avançada. Portanto, um genótipo desfavorável associado a um fator de risco clínico pode levar ao desenvolvimento de hipertensão. Observamos também que a variação na PAD está associada ao consumo de álcool e à idade avançada F = 4,305, p = 0,016). A análise estatística indicou que o consumo de álcool (mais de três drinques por dia) pode contribuir para um aumento de 4,781 mmHg na PAD. Idade avançada também está associada a um aumento de 0,140 mmHg da PAD por ano. Nossa observação corrobora relatos publicados anteriormente de que bebedores inveterados têm menor absorção de cálcio, o que poderia levar ao desenvolvimento de HE19. Além disso, a presença de álcool no organismo perturba o funcionamento do sistema renina-angiotensina, estimula o sistema nervoso simpático (possivelmente devido à flutuação dos níveis alcoólicos na corrente sanguínea) e aumenta a produção de hormônios adrenocorticóides20. Segundo relatos publicados na literatura, o consumo de cerca de 40 ml de álcool por dia aumenta a PA e, conseqüentemente, dobra a hipertensão (PAS > 160 mmHg ou DBP > 95mmHg)19. Na população amazônica, o consumo contínuo de álcool através dos anos contribui para o aumento da PAD, elevando o número de casos de hipertensão.

Conclusões

A análise multifatorial de polimorfismos genéticos e fatores clínico-antropométricos indicou que as combinações de alelo D da ECA com idade avançada e consumo de álcool com envelhecimento podem contribuir para a elevação da PAS e PAD, respectivamente, na população de Santa Isabel do Rio Negro.

Financiamento: FIOCRUZ e CNPq.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflitos de interesses pertinentes

Silvia Regina Sampaio Freitas

Avenida Adhemar Bebiano, 4800 Bl 07 apto 508

20766-721 – Rio de Janeiro, RJ

E-mail:

sroig@ioc.fiocruz.br

Artigo recebido em 08/05/06; revisado recebido em 19/06/06; aceito em 03/07/06.

1. Jeunemaitre X, Soubrier F, Kotelevtsev YV, Lifton RP, Willians CS, Charru A, et al. Molecular basis of human hypertension: role of angiotensinogen. Cell. 1992; 71 (1): 169-80. Molecular basis of human hypertension: role of angiotensinogen Cell 1992 169 80 1 71 Jeunemaitre X Soubrier F Kotelevtsev YV Lifton RP Willians CS Charru A 2. Hasimu B, Nakayama T, Mizutani Y, Izumi Y, Asai S, Soma M, et al. Haplotype analysis of the human renin gene and essential hypertension. Hypertension. 2003; 41(2): 308-12. Haplotype analysis of the human renin gene and essential hypertension Hypertension 2003 308 12 2 41 Hasimu B Nakayama T Mizutani Y Izumi Y Asai S Soma M 3. Bonnardeaux A, Davies E, Jeunemaitre X, Fery I, Charru A, Clauser E, et al. Angiotensin II type 1 receptor gene polymorphisms in human essential hypertension. Hypertension. 1994; 24: 63-9. Angiotensin II type 1 receptor gene polymorphisms in human essential hypertension Hypertension 1994 63 9 24 Bonnardeaux A Davies E Jeunemaitre X Fery I Charru A Clauser E 4. Nalogowska-Glosnicka K, Lacka BI, Zychma MJ, Grzeszczak W, Zukwaska-Szczechowska E, Poreba R, et al. Angiotensin II type 1 receptor gene A1166C polymorphism is associated with the increased risk of pregnancy-induced hypertension. Med Sci Monit. 2000; 6 (3): 523-9. Angiotensin II type 1 receptor gene A1166C polymorphism is associated with the increased risk of pregnancy-induced hypertension Med Sci Monit 2000 523 9 3 6 Nalogowska-Glosnicka K Lacka BI Zychma MJ Grzeszczak W Zukwaska-Szczechowska E Poreba R 5. Araújo MA, Menezes BS, Lourenço C, Cordeiro ER, Gatti RR, Goulart LR. O polimorfismo A1166C do receptor tipo 1 da angiotensina II no infarto agudo do miocárdio. Arq Bras Cardiol. 2004; 83 (5): 404-8. O polimorfismo A1166C do receptor tipo 1 da angiotensina II no infarto agudo do miocárdio Arq Bras Cardiol 2004 404 8 83 Araújo MA Menezes BS Lourenço C Cordeiro ER Gatti RR Goulart LR 6. Davies E, Holloway CD, Ingram MC, Inglis GC, Friel EC, Morrison C, et al. Aldosterone excretion rate and blood pressure in essential hypertension are related to polymorphic differences in the aldosterone synthase gene CYP11B2. Hypertension. 1999; 33 (2): 703-7. Aldosterone excretion rate and blood pressure in essential hypertension are related to polymorphic differences in the aldosterone synthase gene CYP11B2 Hypertension 1999 703 7 2 33 Davies E Holloway CD Ingram MC Inglis GC Friel EC Morrison C 7. Mettimano M, Lanni A, Migneco A, Specchia ML, Romano-Spica V, Savi L. Angiotensin-related genes involved in essential hypertension:allelic distribution in an Italian population sample. Ital Heart J. 2001; 2(8): 589-93. Angiotensin-related genes involved in essential hypertension: allelic distribution in an Italian population sample Ital Heart J 2001 589 93 8 2 Mettimano M Lanni A Migneco A Specchia ML Romano-Spica V Savi L 8. Agachan B, Isbir T, Yilmaz H, Akoglu E. Angiotensin converting enzyme I/D, angiotensinogen T174M-M235T and angiotensin II type 1 receptor A1166C gene polymorphisms in Turkish hypertensive patients. Exp Mol Med. 2003; 35 (6): 545-9. Angiotensin converting enzyme I/D, angiotensinogen T174M-M235T and angiotensin II type 1 receptor A1166C gene polymorphisms in Turkish hypertensive patients Exp Mol Med 2003 545 9 6 35 Agachan B Isbir T Yilmaz H Akoglu E 9. Arias-Vásquez A, Sayed-Tabatabaei FA, Schut AFC, Bertolli-Avella AM, Vergeer JM, Aulchenko JCM, et al. Angiotensin converting enzyme gene, smoking and mortality in a population-based study. Eur J Clin Invest. 2005; 35: 444-9. Angiotensin converting enzyme gene, smoking and mortality in a population-based study Eur J Clin Invest 2005 444 9 35 Arias-Vásquez A Sayed-Tabatabaei FA Schut AFC Bertolli-Avella AM Vergeer JM Aulchenko JCM 10. IBGE [homepage]. Sinopse preliminar do censo demográfico de 2000 – Malha municipal digital do Brasil, 1997 [citado em 2003 maio 05]. Disponível em: url:http://www.ibge.gov.br/cidadesat/default.php2000. Sinopse preliminar do censo demográfico de 2000: Malha municipal digital do Brasil, 1997 11. WHO Guidelines Subcommittee. World Health Organization- International Society of Hypertension guidelines for the management of hypertension. J Hipertens. 1999; 17: 151-83. World Health Organization- International Society of Hypertension guidelines for the management of hypertension J Hipertens 1999 151 83 17 12. Ethnicity, race and culture: guidelines for research, audit and publication. BMJ. 1996; 312 (7038): 1094. Ethnicity, race and culture: guidelines for research, audit and publication BMJ 1996 1094 7038 312 13. Russ AP, Maerz W, Ruzicka V, Stein U, Gross W. Rapid detection of the hypertension-associated Met235>Thr allele of the human angiotensinogen gene. Hum Mol Genet. 1993; 2(5): 609-10. Rapid detection of the hypertension-associated Met235->Thr allele of the human angiotensinogen gene Hum Mol Genet 1993 609 10 5 2 Russ AP Maerz W Ruzicka V Stein U Gross W 14. Cabello PH, Krieger H. GENIOC: Sistema para analises de dados de genética. Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz FIOCRUZ; 1977. GENIOC: Sistema para analises de dados de genética 1977 Cabello PH Krieger H 15. Perry IJ, Whincup PH, Sharper AG. Environmental factors in the development of essential hypertension. Br Med Bull. 1994; 50 (2): 246-59. Environmental factors in the development of essential hypertension Br Med Bull 1994 246 59 2 50 Perry IJ Whincup PH Sharper AG 16. Kornitzer M, Dramaix M. Epidemiology of risk factors for hypertension. Implications for prevention and therapy. Drugs. 1999; 57 (5): 695-712. Epidemiology of risk factors for hypertension: Implications for prevention and therapy Drugs 1999 695 712 5 57 Kornitzer M Dramaix M 17. Agachan B, Isbir T, Yilmaz H, Akoglu E. Angiotensin converting enzyme I/D, angiotensinogen T174M-M235T and angiotensin II type 1 receptor A1166C gene polymorphisms in Turkish hypertensive patients. Exp Mol Med. 2003; 35(6): 545-9. Angiotensin converting enzyme I/D, angiotensinogen T174M-M235T and angiotensin II type 1 receptor A1166C gene polymorphisms in Turkish hypertensive patients Exp Mol Med 2003 545 9 6 35 Agachan B Isbir T Yilmaz H Akoglu E 18. Henderson SO, Haiman CA, Wendy M. Multiple polymorphisms in the Renin- Angiotensin-Aldosterone system (ACE, CYP11B2, AGTR1) and their contribution to hypertension in African Americans and Latinos in the multiethnic cohort. Am J Med Sci. 2004; 328 (5): 266-73. Multiple polymorphisms in the Renin- Angiotensin-Aldosterone system (ACE, CYP11B2, AGTR1) and their contribution to hypertension in African Americans and Latinos in the multiethnic cohort Am J Med Sci 2004 266 73 5 328 Henderson SO Haiman CA Wendy M 19. Keavney B, McKenzie CA, Connell JM, Julier C, Ratcliffe PJ, Sobel E, et al. Measured haplotype analysis of the angiotensin-I converting enzyme gene. Hum Mol Genet. 1998; 7: 1745-51. Measured haplotype analysis of the angiotensin-I converting enzyme gene Hum Mol Genet 1998 1745 51 7 Keavney B McKenzie CA Connell JM Julier C Ratcliffe PJ Sobel E 20. Clark LT. Alcohol use and hypertension: clinical considerations and implications. Postgrad Med. 1984; 75 (8): 273-6. Alcohol use and hypertension: clinical considerations and implications Postgrad Med 1984 273 6 8 75 Clark LT Original Articles Combined analysis of genetic and environmental factors on essential hypertension in a brazilian rural population in the Amazon region

OBJECTIVE: In the present study, we evaluated the contribution of six genetic polymorphisms of the Renin-Angiotensis-Aldosterone system (RAAS) and clinical risk factors in the development of essential hypertension in a Brazilian rural population in the Amazon region. METHODS: Eighty-two hypertensive patients and seventy-eight normotensive individuals were evaluated. Genotyping for renin (REN G1051A), angiotensinogen (AGT) M235T, insertion/deletion of angiotensin-converting enzyme (ACE I/D), angiotensin II type 1 receptor (AGTR1) A1166C and aldosterone synthase (CYP11B2) C344T polymorphisms were performed using polymerase chain reaction, with further restriction analysis when required. The influence of genetic polymorphisms and clinical risk factors on blood pressure variation was assessed by stepwise linear regression. RESULTS: We report the co-occurrence of clinical risk factors and angiotensin-converting enzyme (ACE) gene polymorphism in a Brazilian rural population in the Amazon region. Our results indicate that increase of systolic blood pressure (SBP) is favored by ACE I/D- D allele and advanced age, while alcohol consumption and aging are associated with high diastolic blood pressure (DBP). CONCLUSION: These findings suggest that in the Santa Isabel do Rio Negro population, the residents that carry ACE-D allele or have an alcohol consumption habit present higher values of SBP and DBP, respectively, with the passing of years.

 Polymorphisms essential hypertension environmental risks genetic

ORIGINAL ARTICLE

Combined analysis of genetic and environmental factors on essential hypertension in a Brazilian rural population in the Amazon region

Silvia Regina Sampaio Freitas; Pedro Hernan Cabello; Rodrigo Soares Moura-Neto; Luciana Cresta Dolinsky; Marcio Neves Bóia

Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Instituto de Biologia – UFRJ, Instituto de Biociências – UNIGRANRIO - Rio de Janeiro, RJ, Brazil

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SUMMARY

OBJECTIVE: In the present study, we evaluated the contribution of six genetic polymorphisms of the Renin-Angiotensis-Aldosterone system (RAAS) and clinical risk factors in the development of essential hypertension in a Brazilian rural population in the Amazon region.

METHODS: Eighty-two hypertensive patients and seventy-eight normotensive individuals were evaluated. Genotyping for renin (REN G1051A), angiotensinogen (AGT) M235T, insertion/deletion of angiotensin-converting enzyme (ACE I/D), angiotensin II type 1 receptor (AGTR1) A1166C and aldosterone synthase (CYP11B2) C344T polymorphisms were performed using polymerase chain reaction, with further restriction analysis when required. The influence of genetic polymorphisms and clinical risk factors on blood pressure variation was assessed by stepwise linear regression.

RESULTS: We report the co-occurrence of clinical risk factors and angiotensin-converting enzyme (ACE) gene polymorphism in a Brazilian rural population in the Amazon region. Our results indicate that increase of systolic blood pressure (SBP) is favored by ACE I/D- D allele and advanced age, while alcohol consumption and aging are associated with high diastolic blood pressure (DBP).

CONCLUSION: These findings suggest that in the Santa Isabel do Rio Negro population, the residents that carry ACE-D allele or have an alcohol consumption habit present higher values of SBP and DBP, respectively, with the passing of years.

Key words: Polymorphisms, essential hypertension, environmental risks, genetic.

Introduction

Essential hypertension (EH) is a multifactorial disease triggered by several genetic and multiple environmental factors in conjunct. Epidemiological studies have suggested that genetic variants, including those of the genes for angiotensinogen (AGT)1, renin (REN)2, angiotensin-converting enzyme (ACE)3, angiotensin II receptor type 1 (AGTR1)4,5, and aldosterone synthase (CYP11B2)6 increase the risk for EH. However, the influence of polymorphic forms of these genes has shown conflicting results in different populations7,8. This scenario might be reflecting the variable impact of the genetic background of populations and the interaction of environmental factors, which, in turn, might be modulating this molecular background. Recent literature data have shown that unfavorable genotype/allele alone might indicate a minor or nonsignificant association with EH. However, the co-occurrence of different unfavorable genotypes and clinical risk factors can increase the risk of hypertension. Data indicate that the most important environmental risk factors are advanced age, alcohol intake, smoking and body size. The relationship of those factors with unfavorable genotype such as ACE-DD and Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) 677-TT can greatly increase the EH risk, when compared with patients who do not present the clinical risks9.

In this work, we aimed at investigating the association among AGT-M235T, REN-G1051A, ACE-I/D, AGTR1-A1166C, CYP11B2-C344T genetic markers and common anthropometrical factors with essential hypertension, in an isolated community in the Amazon region in Brazil.

Methods

The municipality of Santa Isabel do Rio Negro lies in the northwest of Amazonas State (0º 28' S and 65º 32' W), in the region of the Alto Rio Negro. Santa Isabel do Rio Negro occupies an area of 62, 846 Km2 (IBGE, 2003), 90% of which is covered by the Amazonian Rain Forest. The majority of the population of 10, 561 inhabitants is of indigenous ancestry; 4220 of them reside in the municipality's seat and 6341 in riverine communities in the municipality's territory, including the Yanomami Indigenous Territory10.

Subjects chosen for this study were obtained using the Conglomerate Systematic Sampling Technique, in which each residence was considered a unit sample. One hundred and fifteen residences were visited, and one adult from each residence was chosen. A total of eighty-two individuals were classified as hypertensive according to the following criteria: 1) blood pressure (BP) > 140/90 mmHg (derived from repeated measurements performed in accordance with international guidelines)11; 2) absence of antihypertensive, and 3) exclusion of secondary forms of hypertension. The normotensive controls consisted of 78 individuals, characterized by no family history of EH or other cardiovascular disorder and BP < 140/90 mmHg.

All participants were submitted to a complete physical and routine biochemical analyses and provided written informed consent.

Participants were classified as Caucasian, Negroid, Indigenous or racially mixed (Mestizo) according to a set of phenotypic characteristics12. Individuals who had ever smoked more than five cigarettes per day for at least a year were classified as smokers and the ones who drank 30-40 ml of alcohol or more per day were considered drinkers.

Genotyping ACE I/D3, AGT M235T13, REN G1051A2, AGTR1 A1166C4, and C344T6 were assessed by the PCR-restriction fragment length polymorphisms method. Quality control for these assays was assessed by randomly selecting samples from hypertensive and normotensive groups to be genotyped again.

Anthropometrical and clinical data were compared by the t-Student for quantitative data, and by c2 test for qualitative data. The genotypic frequencies were computed using the SPSS statistical program (version 10.0), and allelic frequencies were calculated by direct gene counting. The Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) for distribution of the genotypes was tested by c2 test, using the GENIOC program14. We also performed a stepwise linear regression (SPSS program, version 12.0) to explore the effects of genotypes and anthropometrical factors on hypertension. In this analysis, the dependent variables were systolic blood pressure (SBP) and diastolic blood pressure (DBP), while independent variables included age, body mass index (BMI), gender (0 = female, 1 = male), smoking status (0 = non-smoker, 1 = smoker), alcohol consumption (0 = non- drinker, 1 = drinker), Diabetes mellitus (0 if glucose <100mg/dl, 1 to else), ethnicity (ethny_1 [African descendant], ethny_2 [Caucasian], ethny_3 [Indigenous]; ethny_4 [Mestizo]). Values 0 and 1 were attributed if ethnicity was absent or present, respectively.

Results

Age, alcohol consumption, and smoking weighed more frequently among hypertensives than in normotensives (Tab.1). These results are supported by previous studies that demonstrated that alcohol consumption contributes to EH development by stimulation of the sympathetic nervous system and increased production of adrenocorticoid hormones15, while age and smoking act as co-factors that, in association with salt sensitivity, alcohol consumption or obesity, collaborate to the development of this disease16. Diabetes mellitus and obesity are also important clinical risk factors for hypertension, but their frequencies were not significantly different between the groups, even among patients that exhibit a slightly high BMI. Moreover, the ethnicity profile observed in this Amazon population (where a great number of individuals from both groups are Indigenous descendents or Mestizo, and a lesser number are Negroid or Caucasoid) was quite similar between normotensives and hypertensives.

Genotypic distribution of each polymorphism was in agreement with HWE expectations (p >0.05) in both groups. Allelic frequencies of all polymorphisms did not show any difference between normotensives and hypertensives (Tab.2). However, the genotypic distributions of ACE I/D differed between the groups: 9.76% hypertensives versus 5.1% normotensives had ACE-DD genotype; and 57.32% hypertensive versus 78.2% normotensives had ACE-II genotypes. It was observed that postulated "worse" ACE (DD) genotype was slightly more frequent in hypertensives than in normotensives. These unfavorable alleles/genotypes are associated with physiological changes that can lead to hypertension development. Yet, worldwide results have been controversial and, consequently, the frequencies of ACE genotypes vary widely7,17,18. Genotypic frequencies of M235T, G1051A, A1166C and C344T failed to show any difference in either group (p > 0.05).

To investigate which genetic polymorphism and/or clinical variant is associated with high BP variation, we analyzed the genetic and clinical profile of normotensives and hypertensives simultaneously. Stepwise linear regression showed that ACE I/D polymorphism (D allele) and age contributed to SBP variation (F = 12.958, p = 0.000). The D allele supports an increase of 7.8 mmHg in SBP (b = 7.829, p = 0.006), while advanced age contributes to a 0.471 mmHg increase in SBP, with each additional year (b = 0.471, p = 0.000). This polymorphism is responsible for half the variance in plasma ACE levels, which results in a large / in wide inter-individual variability19. It was observed that homozygotes for the D allele display serum ACE levels were almost twice as high as I allele homozygotes. However, specific haplotypes constituted by I/D and single nucleotide polymorphisms within the ACE gene were more accurate in determining ACE plasma levels. According to Keavney et al19, the use of ACE haplotype analysis was able to determine 36% of the phenotype variance of ACE levels. Despite the physiological damage caused by ACE I/D polymorphism, recent studies have demonstrated that clinical risk factors can raise ACE gene susceptibility. Several studies have shown that advanced age, drinking, smoking and body size are important clinical risk factors for EH, especially when they occur simultaneously with the ACE-DD genotype7. In accordance with literature reports, our findings also suggest that ACE I/D polymorphism and a specific clinical risk factor collaborate to EH. Stepwise linear regression indicated that individuals who carry D allele have an increase of 7.8 mmHg in SBP when compared with those who have only I allele. In addition to I/D polymorphism, aging also contributes to the unfavorable effects of D allele, causing a progressive increase of SBP. In light of our findings, we believe that high variation of SBP may be, in part, determined by a genetic (ACE-D allele) predisposition and advanced age. Therefore, an unfavorable genotype associated with a clinical risk factor might be acting in hypertension development. We also observed that DBP variation is dependent on alcohol consumption and advanced age (F = 4.305, p = 0.016). Statistical analysis suggested that consumption of alcohol (more than 3 drinks per day) could contribute to an increase of 4781 mmHg in DBP. Advanced age also supports DBP increase by 0.140 mmHg per year. Our observation corroborates previous reports whose authors showed that heavy drinkers have a reduction in calcium absorption that could lead to the development of EH19. Moreover, presence of alcohol in an organism disturbs the renin-angiotensin system function, stimulates the sympathetic nervous system (possibly due to fluctuating blood alcohol levels), and increases production of adrenocorticoid hormones20. Literature reports also relate that consumption of about 40 ml of alcohol, per day, results in BP increase and, consequently, in a doubling of hypertension (SBP > 160mm Hg or DBP > 95mmHg)19. In this Amazon population, continuous alcohol consumption down the years contributed to the increase of DBP and, consequently, raised the number of hypertension cases.

Conclusions

Multifactorial analysis of genetic polymorphisms and clinical-antropometrical factors suggested that combinations of ACE D allele with advanced age and alcohol consumption, along with aging contributes to SBP and DBP high variation, respectively, in the Santa Isabel do Rio Negro population.

Supported by: FIOCRUZ and CNPq.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

References

Silvia Regina Sampaio Freitas

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Manuscript received May 8, 2006; revised manuscript received June 19, 2006; accepted on July 3, 2006.