OBJETIVOS: Determinar os valores plasmáticos de homocisteína e fator von Willebrand, como marcador de disfunção endotelial, em ratos com diabete melito induzido por estreptozotocina. MÉTODOS: Trinta e cinco ratos (rattus norvegicus albinus), machos, adultos (180-200 g), randomizados em três grupos: controle (n=10) não receberam agente ou veículo; sham (n=10) receberam solução veículo da estreptozotocina; e diabético (n=15) receberam estreptozotocina. Após oito semanas de indução do diabete melito, os animais foram pesados, anestesiados e tiveram sangue colhido da aorta abdominal para determinação dos valores de homocisteína plasmática total, fator von Willebrand e glicemia. RESULTADOS: O modelo experimental foi reprodutível em 100% dos animais. A média das concentrações plasmáticas de homocisteína foi: 7,9 µmol/l (controle); 8,6 µmol/l (sham) e 6,1 µmol/l (diabético), com diferença entre os grupos (p<0,01). Pelo método de comparações múltiplas entre os grupos, observou-se que os valores no grupo diabético foram menores que no sham (p<0,01). A média dos valores do fator von Willebrand foi 0,15 U/l (controle), 0,16 U/l (sham) e 0,18 U/l (diabético), com diferença entre os grupos (p=0,03). A média dos seus valores no grupo diabético foi maior que no grupo controle (p<0,05). No grupo diabético não houve correlação entre homocisteína e fator von Willebrand. CONCLUSÃO: No diabete melito induzido por estreptozotocina constataram-se valores reduzidos de homocisteína e elevados de fator von Willebrand, sem, contudo, haver correlações entre si e com níveis de glicemia final.
Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP-EPM - São Paulo, SP
O diabete melito (DM), doença caracterizada fundamentalmente por distúrbio no metabolismo dos hidratos de carbono, cursa habitualmente com macro e microangiopatia, neuropatia periférica, de nervos cranianos e autossômica, que acarretam isoladamente ou associados, importantes complicações clínicas, com elevado índice de mortalidade.
No que diz respeito à vasculopatia, o endotélio é o principal responsável e vários elementos têm sido incriminados pela sua disfunção.
O objetivo deste trabalho é estudar as possíveis alterações dos níveis plasmáticos da homocisteína (He) e do fator von Willebrand (fvW), sabidamente relacionados à patogênese da disfunção endotelial, em ratos portadores de DM induzida por estreptozotocina (STZ).
Trata-se de um estudo experimental. Foram utilizados ratos da linhagem
Para indução do DM utilizou-se STZ (dose única de 60 mg/kg de peso), intraperitoneal, diluída em 0,3 ml de solução tampão citrato 0,1M1-3. Nas primeiras 48 horas, aos ratos diabéticos foram oferecidas soluções de glicose (2,5% e 5%) substituindo a água, para evitar hipoglicemia por hiperinsulinemia resultante da destruição das células beta do pâncreas. Durante as primeiras 72 horas após administração de STZ, a glicemia foi determinada diariamente, sempre no mesmo horário, para comprovar a reprodutibilidade do método, utilizando-se aparelho Advantage (Roche®) com sangue obtido por punção da veia da cauda dos animais. Foram considerados diabéticos os ratos cujos valores de glicemia foram iguais ou superiores a 250 mg/dl1-5.
Após oito semanas de indução do DM, os animais foram pesados, tiveram suas glicemias aferidas e foram submetidos a anestesia com tionembutal (Sigma®) intraperitoneal (50 mg/kg de peso) para posterior coleta de sangue e sacrifício.
A coleta de sangue foi realizada através de punção de artéria aorta abdominal e 3 ml de sangue foram colocados em tubos contendo EDTA como anticoagulante, centrifugado a 3.000 rpm e o plasma aliquotado em "vails" de 1 ml e acondicionados em congelador a -20ºC até a determinação dos níveis de He total plasmática. O sangue restante foi colocado em tubo seco, centrifugado, e o soro foi aliquotado em "vails" de 1,5 ml, congelados a -20°C, para a determinação do fvWe glicemia.
A determinação da He total plasmática foi realizada por meio de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), por detecção fluorimétrica, seguindo protocolo padronizado e baseado na metodologia descrita por Pfeiffer e cols.6 e utilizado por Cruz e cols.7. O plasma passou por três etapas de preparação: redução, precipitação de proteínas e derivatização. O sistema utilizado foi da Shimadzu®, constando de auto-injetor modelo SIL-10 Advp, bombas e detector de fluorescência modelo RF – 10AXL. A separação foi com uma coluna Prodigy ODS2, 150 x 3,2 mm com micropartículas de 5 µm (Phenomenex®) e por uma pré-coluna de Adsorbosphere® C18 de 7,5 x 4,6 mm com micro-partículas de 5 µm (Alltech®). A detecção foi feita com o detector ajustado para excitação a 385 µm e emissão a 515 µm.
Para dosar a glicemia de jejum inicial (Glic inicial) e ao término do experimento (Glic final) utilizou-se o método enzimático-colorimétrico, glicose oxidase/peroxidase (GOD PAP-Celm), e considerando-se valores de referência entre 75-99 mg/dl. O fvW foi determinado pela técnica de Elisa, utilizando-se kit von Willebrand factor (DAKO®).
O trabalho foi avaliado e devidamente aprovado pelo CEP 1341/05. Durante a análise estatística, para avaliar se as médias das variáveis em estudo eram as mesmas nos três grupos, utilizou-se à análise de variância (ANOVA) com o fator fixo (grupo) e três níveis (controle,
O modelo experimental de DM foi reprodutível em 100% dos animais. A tabela 1 mostra valores da média, desvio padrão, mediana, mínimo e máximo para as variáveis em estudo em cada grupo. As
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Segundo o procedimento de comparações múltiplas de Tukey, a He média foi menor no grupo de animais diabéticos do que nos grupos controle e
A
O DM, doença responsável por inúmeras complicações cardíacas e vasculares, apresenta como elemento importante na sua fisiopatologia a disfunção endotelial, e várias alterações bioquímicas plasmáticas são tidas como responsáveis.
A He, relacionada pela primeira vez em 1969 como causa de aterosclerose8, vem alcançando importância como fator de risco para doença arterial coronária9-15,sendo intrigante sua possível participação na patogênese da disfunção endotelial. Aminoácido formado exclusivamente a partir da desmetilação da metionina da dieta ou do catabolismo, contém um grupamento tiol (SH-) e não participa da formação de proteínas16. Apenas 2% a 5% da He plasmática livre são encontradas em sua forma reduzida, e 70% a 80% circulam ligadas a proteínas plasmáticas, principalmente albumina.
A prevalência da hiper-homocisteinemia (HHe) é de 5% a 7% na população geral e níveis intermediários são encontrados em 13% a 47% dos indivíduos com doença vascular aterosclerótica sintomática17-19. Várias publicações correlacionam HHe com doença arterial coronária, cerebral e periférica, assim como trombose venosa, e tem se mostrado importante fator de risco cardiovascular independente dos demais20.
Metanálise com mais de 4.000 pacientes envolvendo 27 estudos mostrou que a partir de valores de He acima de 10 µmol/l, o acréscimo de 5 µmol/l de He circulante associa-se a maior risco para doença cardiovascular. Aumento de 5 µmol/l de He corresponde a aumento de 20 mg/dl de colesterol total plasmático com maior probabilidade de infarto agudo do miocárdio21.Graham e cols.22 concluíram que HHe em jejum ou pós-sobrecarga de metionina corresponde a risco cardiovascular semelhante ao da hiperlipemia e do tabagismo, embora inferior ao da hipertensão arterial sistêmica.
Em 1998, Folsom e cols.23, em importante pesquisa, colocam em dúvida a participação da HHe na fisiopatologia da doença arterial coronária. Contudo, seus resultados não encontram sustentação frente às pesquisas mais recentes24.
A patogenia da lesão vascular determinada pela HHe inclui lesão da célula endotelial, crescimento da musculatura lisa vascular, maior adesividade plaquetária, aumento da oxidação do LDL-colesterol com deposição na parede vascular e ativação direta da cascata da coagulação20. No entanto, ainda não está bem claro por qual mecanismo fisiopatológico a He pode promover aterotrombose25.
O endotélio, principal órgão endócrino do organismo, é de grande importância em inúmeras doenças degenerativas e inflamatórias. Dentre os vários métodos para aquilatar sua disfunção, o fvW tem se mostrado muito eficiente e com ótima sensibilidade. Células endoteliais e megacariócitos sintetizam, armazenam e secretam o fvW. Essa secreção aumenta quando as células endoteliais são estimuladas ou lesadas e seus valores podem aumentar de duas a 10 vezes em indivíduos doentes. O fvW liga-se ao colágeno e a outros componentes da parede vascular e, portanto, serve de mediador da adesão das plaquetas ao subendotélio dos vasos lesados26.
A lesão vascular expõe a matriz de colágeno subendotelial, à qual se liga ao fvW circulante no plasma, que por sua vez se liga à porção extracelular de glicoproteínas da membrana da plaqueta (GPIb), cuja porção intracelular está ligada à filamina do citoesqueleto plaquetário. Tal interação, conhecida por adesão plaquetária, é suficiente para deflagrar dois fenômenos nas plaquetas: a contração celular e a alteração conformacional27-29.
No DM, em decorrência de fatores genéticos e bioquímicos plasmáticos, a disfunção endotelial é precoce e determina o início e progressão da doença vascular, levando à micro e macroangiopatia diabética. Em estudo recente, Becker e cols.25 objetivaram determinar o quanto a He estava associada com a disfunção endotelial em ratos diabéticos e não-diabéticos e se essa disfunção poderia ser estimada pelos níveis plasmáticos de fvW, e concluíram que a relação entre He e a aterotrombose não pode ser explicada pela associação da homocisteína com fvW. Na busca de um elemento que possa ser um marcador desse comprometimento, o fvW passa a ter importante interesse clínico, podendo ser considerado um marcador sérico de disfunção endotelial no DM.
Para indução do DM, nesse experimento foi utilizada a STZ por ser o modelo que representa melhor reprodutibilidade dos resultados obtidos em relação aos da literatura30-35. Os resultados deste trabalho demonstram que no DM, em decorrência das alterações metabólicas, dentre as quais a hiperglicemia é a mais importante, há modificações nos níveis plasmáticos de He e do fvW.
À semelhança dos resultados do presente estudo (
A He, por lesar diretamente o endotélio, estimula a proliferação celular e a produção de colágeno, perpetua o processo inflamatório crônico vascular, altera o relaxamento arterial endotélio-dependente por meio do óxido nítrico, aumenta o estresse oxidativo, ativa fatores de coagulação e inibe a atividade da proteína C. Logo, seria de esperar no diabete, pela extensa lesão endotelial, valores elevados de He. Contudo, na presença de hiperglicemia, há aumento da filtração glomerular37-38, e as alterações metabólicas na via de formação da He36 resultam em valores mais baixos dessa, o que corrobora para a assertiva de que a He seja fator de risco para disfunção endotelial e não marcador específico de lesão do endotélio no DM. Pode-se inferir que valores normais ou elevados de He no DM estejam relacionados com lesão endotelial.
O fvW vem sendo otimizado como marcador de disfunção endotelial. No presente trabalho, os seus valores (
Não foi observada correlação entre He e fvW (
Os valores de He foram mais baixos nos ratos diabéticos, podendo iniciar e perpetuar a lesão endotelial, não sendo, portanto, marcador de sua disfunção. Os níveis elevados de fvW, por esse ser marcador de disfunção endotelial, permitem inferir a presença de lesão vascular no DM. Não houve correlação entre glicemia final, He e fvW nos ratos diabéticos.
Declaro não haver conflitos de interesses pertinentes.
Renato Delascio Lopes Rua Pedro de Toledo, 980, 11º andar, conj. 116 - Vila Clementino 04039-002 – São Paulo, SP E-mail:
Artigo recebido em 02/05/06, revisado recebido em 12/06/06; aceito em 12/06/06.
OBJECTIVES: To determine the plasma homocysteine and von Willebrand factor levels as markers of endothelial dysfunction in rats with diabetes mellitus induced by streptozotocin. METHODS: Thirty-five adult male rats (Rattus norvegicus albinus) (weight between 180-200g) were randomized into three groups: control group (n=10), which received no drugs or vehicles; sham group (n=10), which received streptozotocin solution; and diabetic group (n=15), which received streptozotocin. Eight weeks after diabetes mellitus induction, the animals were weighed and anesthesized; blood samples were collected from abdominal aorta for plasma total homocysteine, von Willebrand factor and glucose levels. RESULTS: The experimental model was reproducible in 100% of animals. The mean plasma homocysteine levels were: 7.9 µmol/l (control), 8.6µmol/l (sham) and 6.1µmol/l (diabetic), with difference among the groups (p<0.01). Multiple comparison analysis among the groups showed that values in the diabetic group were lower than in the sham group (p<0.01). The mean von Willebrand factor values were 0.15 U/l (control), 0.16U/l (sham) and 0.18 U/l (diabetic), with difference among the groups (p=0.03). The mean value was higher in the diabetic group than in the control group (p<0.05). Correlation between homocysteine and von Willebrand factor was not observed in the diabetic group. CONCLUSION: Reduced homocysteine levels and increased von Willebrand factor levels were observed in diabetes mellitus induced by streptozotocin; nevertheless, there were no correlations between them and with final glucose levels.
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Diabetes mellitus (DM), a disease characterized fundamentally by a disorder in the metabolism of carbohydrates, is usually accompanied by macroangiopathy and microangiopathy, peripheral, cranial nerve and autosomal neuropathy, which cause isolated or associated major clinical complications with a high mortality rate.
In terms of vasculopathy, the endothelium is primarily affected and several elements have been related to its dysfunction.
The purpose of this article is to study the possible changes in plasma levels of homocysteine (He) and von Willebrand factor (vWF), which are known to be related with the pathogenesis of endothelial dysfunction, in rats with streptozotocin-induced (STZ) diabetes mellitus.
This is an experimental study involving adult male rats (
DM was induced with intraperitoneal administration of STZ (single dose of 60 mg/kg body weight) diluted in 0.3 mL of 0.1 M citrate buffer solution1-3. During the first 48 hours, diabetic rats were offered glucose solutions (2.5% and 5%) which replaced water in order to prevent hypoglycemia due to hyperinsulinemia resulting from the destruction of pancreatic beta cells. During the first 72 hours after administration of STZ, blood glucose was measured every day at the same time to prove the method reproducibility; measurements were made with Advantage (Roche®) meter by using blood collected from a vein puncture in the animal tail. Rats with glucose levels
Eight weeks after DM induction, the animals were weighed, their blood glucose levels were checked and the animals underwent general anesthesia with intraperitoneal administration of thionembutal (Sigma®) (50 mg/kg body weight) for further blood collection and killing.
Blood collection was performed by means of puncture of the abdominal aorta and 3 mL of blood were distributed into tubes containing EDTA as an anticoagulant agent, followed by centrifugation at 3000 rpm. Plasma was aliquotted into 1-mL vials and stored in a freezer at –20ºC until determination of plasma total He levels. The remaining blood was placed in a dry tube, centrifuged and the serum was aliquotted into 1.5-mL vials, and frozen at –20 °C for determination of vWF and glucose levels.
Determination of plasma total He was carried out with high performance liquid chromatography (HPLC) by fluorimetric detection, following a standardized protocol based on the methodology described by Pfeiffer et al6 and used by Cruz et al7. Plasma underwent 3 stages of preparation: reduction, protein precipitation and derivatization. We used the system from Shimadzu®, composed of an autoinjector model SIL-10 Advp, pumps and fluorescence detector model RF – 10AXL. Separation was performed with a Prodigy ODS2 column, measuring 150 x 3.2 mm and containing 5µm microparticles (Phenomenex®) and a pre-column of Adsorbosphere® C18 measuring 7.5 x 4.6 mm and containing 5µm microparticles (Alltech®). Dectection was performed with the detector adjusted for excitation at 385 µm and emission at 515 µm.
Measurement of the initial fasting blood glucose (initial BG) and at the end of the experiment (final BG) we used the enzymatic-colorimetric method, glucose oxidase/peroxidase (GOD PAP-Celm). The reference values were considered in the range of 75-99 mg/dL. The von Willebrand factor was determined by Elisa technique using a von Willebrand factor kit (DAKO®).
The study was evaluated and duly approved by Research Ethics Committee under record No.1341/05. In the statistical analysis, in order to assess if the mean variables studied were the same in the three groups, we used an analysis of variance (ANOVA) with a fixed factor (group) and three levels (control, sham and diabetes). For the final blood glucose variable, we used reverse transformation to stabilize variance. When ANOVA showed that the means in the groups were not identical, we used Tukey's procedure for multiple comparisons to identify which groups were responsible for such differences. Dispersion diagrams were built and the Pearson correlation coefficients were calculated to assess the presence of linear association between the variables. The significance level was established at 5% in all analyses.
The DM experimental model was reproducible in 100% of animals.
According to Tukey's procedure for multiple comparisons, the mean He was lower in the group of diabetic animals than in the control and sham groups; there was no difference between the means of control and sham groups (p<0.05). As to vWF, the mean was higher in the diabetes group than in the control group; no other difference was detected among the groups (p<0.05). For final glucose level, the mean was higher in the diabetes group than in the control and sham groups, and there was no difference between the means of control and sham groups (p<0.05).
DM is a disease responsible for numerous cardiac and vascular complications. Endothelial dysfunction is an important element in its pathophysiology and several biochemical abnormalities are involved in this condition.
Homocysteine (He) was first reported as a cause of atherosclerosis in 19698, and has been gaining more importance as a risk factor for coronary artery disease9-15 with its intriguing possible participation in the pathogenesis of endothelial dysfunction. An amino acid formed exclusively by demethylation of dietary methionine or by catabolism, it contains a thiole group (SH-) and does not participate in protein synthesis16. Only 2-5% of free plasma He is found in its reduced form and 70-80% is found in the bloodstream bound to plasma proteins, especially albumin.
The prevalence of hyperhomocysteinemia (HHe) is 5-7% in the overall population and intermediate levels are found in 13-47% of individuals with symptomatic atherosclerotic vascular disease17-19. Several publications correlate HHe with coronary, cerebral and peripheral artery disease, as well as venous thrombosis, and it has shown to be an important cardiovascular risk factor, independent from the others20.
A meta-analysis involving 27 studies with more than 4000 patients showed that, for He values higher than 10 µmol/L, an increase by 5 µmol/L of circulating He is associated with a higher risk of cardiovascular disease. A He increase of 5 µmmol/L corresponds to an increase by 20 mg/dL in plasma total cholesterol, with a higher likelihood of acute myocardial infarction21. Graham et al22 concluded that fasting HHe or after methionine overload corresponds to a cardiovascular risk that is similar to that of hyperlipidemia or smoking, although lower than that of systemic hypertension.
In 1998, Folsom et al23 questioned the participation of HHe in the pathophysiology of coronary artery disease in an important study. However, their results are not corroborated by more recent studies24.
The pathogenesis of the vascular injury caused by HHe includes damage to the endothelial cell, growth of vascular smooth muscle, higher platelet adhesion, increased oxidation of LDL-cholesterol with deposits in the vessel wall and direct activation of the coagulation cascade20. However, it is still not clear by which pathophysiological mechanism He promotes the development of atherothrombosis25.
The endothelium, the main endocrine organ in the body, is of great importance in numerous degenerative and inflammatory diseases. Among several methods to appraise its dysfunction, vWF has been very efficient and presents excellent sensitivity. Endothelial cells and megacariocytes synthesize, store and secrete vWF. Such secretion increases when the endothelial cells are stimulated or damaged, and the values can increase by two- to ten-fold in affected individuals. The von Willebrand factor binds to collagen and to other components of the vascular wall and, therefore, it serves as a mediator of platelet adhesion to the subendothelium of damaged vessels26.
Vascular injury exposes the subendothelial collagen matrix, which binds to the circulating vWF in the plasma; this, in turn, binds to the extracellular platelet membrane glycoproteins (GPIb), whose intracellular portion is bound to the filamin of the platelet cytoskeleton. This interaction, known as platelet adhesion, is enough to trigger two phenomena in the platelets: cell contraction and conformational abnormality27-29.
In DM, because of genetic and plasma biochemical factors, endothelial dysfunction is early and determines the beginning and progression of vascular disease, thus causing diabetic microangiopathy and macroangiopathy. In a recent study, Becker et al25 aimed to determine to which extent He was associated with endothelial dysfunction in diabetic and non diabetic rats, and whether such a dysfunction could be estimated by plasma vWF levels. They concluded that the relation between He and atherothrombosis can not be explained by the association of homocysteine and vWF. In the search for an element that can be a marker of this damage, vWF starts to have an important clinical interest and it can be considered a serum marker of endothelial dysfunction in DM.
For induction of DM, we used STZ in this experiment for being the model that represents better reproducibility of results as compared with those found in the literature30-35. The results of this study show that there are changes in the plasma He and vWF levels in DM, due to metabolic abnormalities, among which hyperglycemia is the most important.
Similar to the results of the current study (
Since homocysteine causes direct damage to the endothelium, it also stimulates cell proliferation and collagen production, maintains a chronic vascular inflammatory process, changes the endothelium-dependent arterial relaxation by means of nitric oxide, increases oxidative stress, activates coagulation factors and inhibits protein C activity. Therefore, we would expect to find increased levels of He in diabetes due to the extensive endothelial damage. However, in the presence of hyperglycemia, there is an increase in glomerular filtration37-38; the metabolic changes in He pathway36 result in lower levels, which corroborates the assertion that He is a risk factor for endothelial dysfunction and not a specific marker of endothelial damage in DM. We can infer that normal or increased values of He in DM are related with endothelial injury.
The von Willebrand factor has been optimized as a marker of endothelial dysfunction. In the current study, its values (
No correlation between He and vWF (
Hemocysteine values were lower in diabetic rats, and could trigger or maintain endothelial damage; therefore, it is not a marker of its dysfunction. Since vWF is a marker of endothelial dysfunction, its increased levels allow inferring the presence of vascular damage in DM. There was no correlation between final blood glucose, He and vWF in diabetic rats.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
Renato Delascio Lopes Rua Pedro de Toledo, 980, 11º andar, conj. 116 - Vila Clementino 04039-002 – São Paulo, SP - Brazil E-mail:
Manuscript received May 2, 2006; revised manuscript received June 12, 2006; accepted June 12, 2006.