abcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCSão Paulo, SP, BrazilRnmv63WnXPT7CCkSbKkHgwz00015S0066-782X2007000300015S0066-782X(07)0880031510.1590/S0066-782X2007000300015Artigos OriginaisInfluências de dietas ricas em ácidos graxos saturados e insaturados sobre o miocárdio de ratosPinottiMatheus FécchioSilvaMaeli Dal-PaiSugizakiMário MateusNovelliYeda Santana DinizSant'anaLea SílviaAragonFlávio FerrariPadovaniCarlos RobertoNovelliEthel Lourenzi BarbosaCicognaAntonio CarlosBotucatuSão PauloUniversidade Estadual PaulistaFaculdade de Medicina de Botucatu Faculdade MédicaBrazil032007883346353220620060905200609052006This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.
OBJETIVOS: O estudo avaliou a influência de dietas ricas em ácidos graxos saturados (AGS) e ácidos graxos insaturados (AGI) sobre a função mecânica, a morfologia e o estresse oxidativo do miocárdio de ratos. MÉTODOS: Ratos Wistar com 60 dias de idade foram alimentados com dieta padrão (n = 8) ou dietas ricas em AGS (n = 8) ou AGI (n = 8) durante 60 dias. A função mecânica foi avaliada em músculo papilar isolado do ventrículo esquerdo (VE) por meio de contrações isométrica e isotônica, em condição basal (1,25 mM de cálcio), após elevação da concentração extracelular de cálcio para 5,2 mM e estimulação beta-adrenérgica com isoproterenol 1,0 µM. Fragmentos do VE foram usados para estudo de estresse oxidativo e microscopias óptica e eletrônica. RESULTADOS: As dietas suplementadas com AGS e AGI não alteraram a função mecânica do músculo cardíaco. Entretanto, ambas provocaram estresse oxidativo, com aumento do hidroperóxido de lipídio e redução da concentração de superóxido dismutase. A dieta AGI diminuiu a expressão da catalase e a AGS reduziu a quantidade de glutationa peroxidase miocárdica. Ambas as dietas promoveram discretas alterações morfológicas visualizadas ultra-estruturalmente, como depósitos lipídicos e lesões das membranas celulares. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem que dietas enriquecidas com AGS e AGI não acarretam alteração da função mecânica do músculo cardíaco isolado, mas causam discretas lesões estruturais e estresse oxidativo no miocárdio.
Influências de dietas ricas em ácidos graxos saturados e insaturados sobre o miocárdio de ratos
Matheus Fécchio Pinotti; Maeli Dal-Pai Silva; Mário Mateus Sugizaki; Yeda Santana Diniz Novelli; Lea Sílvia Sant'ana; Flávio Ferrari Aragon; Carlos Roberto Padovani; Ethel Lourenzi Barbosa Novelli; Antonio Carlos Cicogna
Faculdade Médica da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP – Botucatu, SP
Correspondência
RESUMO
OBJETIVOS: O estudo avaliou a influência de dietas ricas em ácidos graxos saturados (AGS) e ácidos graxos insaturados (AGI) sobre a função mecânica, a morfologia e o estresse oxidativo do miocárdio de ratos.
MÉTODOS: Ratos Wistar com 60 dias de idade foram alimentados com dieta padrão (n = 8) ou dietas ricas em AGS (n = 8) ou AGI (n = 8) durante 60 dias. A função mecânica foi avaliada em músculo papilar isolado do ventrículo esquerdo (VE) por meio de contrações isométrica e isotônica, em condição basal (1,25 mM de cálcio), após elevação da concentração extracelular de cálcio para 5,2 mM e estimulação b-adrenérgica com isoproterenol 1,0 µM. Fragmentos do VE foram usados para estudo de estresse oxidativo e microscopias óptica e eletrônica.
RESULTADOS: As dietas suplementadas com AGS e AGI não alteraram a função mecânica do músculo cardíaco. Entretanto, ambas provocaram estresse oxidativo, com aumento do hidroperóxido de lipídio e redução da concentração de superóxido dismutase. A dieta AGI diminuiu a expressão da catalase e a AGS reduziu a quantidade de glutationa peroxidase miocárdica. Ambas as dietas promoveram discretas alterações morfológicas visualizadas ultra-estruturalmente, como depósitos lipídicos e lesões das membranas celulares.
CONCLUSÃO: Os resultados sugerem que dietas enriquecidas com AGS e AGI não acarretam alteração da função mecânica do músculo cardíaco isolado, mas causam discretas lesões estruturais e estresse oxidativo no miocárdio.
Estudos recentes relatam as influências benéficas da mudança do estilo de vida e das alterações dietéticas, como menor consumo de ácidos graxos saturados (AGS) e ácidos graxos trans e aumento da ingestão de óleo de peixe, rico em ácidos graxos insaturados (AGI), sobre a morbidade e a mortalidade de portadores de doença arterial coronariana1,2. Enquanto alimentos ricos em AGS são aterogênicos e diminuem a reserva coronariana1,3,4, os AGI apresentam efeito antiaterogênico1,5 e protegem o coração contra os efeitos adversos da fase aguda do infarto do miocárdio5,6.
Embora os estudos relacionados aos AGI tenham demonstrado resultados benéficos no aparelho cardiovascular1,5,6, trabalhos experimentais evidenciaram que dietas ricas em AGI e AGS promovem danos estruturais e metabólicos no miocárdio6-10. Enquanto ambas as dietas acarretaram desorganizações do sarcolema, depósitos de lipídios9,10 e estresse oxidativo miocárdico6,10, a dieta rica em AGI também promove necrose7 e estriação muscular anormal8.
Apesar de a literatura demonstrar que a dieta rica em AGI acarretou alterações morfometabólicas6-10, há informações contraditórias referentes a seus efeitos sobre a função mecânica do miocárdio7,9,11-15. Enquanto estudos prévios demonstraram que a dieta acarretou depressão da função cardíaca em músculo papilar isolado de coelhos12 e ratos13, dados recentes de nosso laboratório15 demonstraram, em concordância com outros autores7,9,11,14, que a dieta AGI não altera o desempenho funcional do músculo cardíaco. Por outro lado, há escassos registros sobre a relação entre dieta rica em AGS e função cardíaca. Pepe e McLennan4 demonstraram que os AGS de origem animal causaram disfunção ventricular em coração isolado de ratos, que só foi evidenciada após importante aumento da pré-carga e do processo de isquemia-reperfusão miocárdica. Os autores demonstraram que essa alteração funcional é conseqüência da incapacidade de o coração aumentar o fluxo coronariano e utilizar adequadamente o oxigênio necessário para a produção de energia4.
Este trabalho teve como objetivo avaliar as influências de dietas suplementadas com AGS e AGI sobre a função mecânica do músculo papilar isolado, e foi complementado pelas análises do estresse tanto oxidativo como morfológico do miocárdio de ratos.
Métodos
Grupos animais e protocolo experimental - Foram utilizados ratos Wistar, machos, com 60 dias de idade, provenientes do Biotério do Laboratório Experimental do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB-UNESP) e alimentados com ração comercial (C, n = 8) e dietas ricas em AGI (LI, n = 8) e AGS (LS, n = 8) e água ad libitum. A ração comercial Labina® (Purina – Paulínia, Brasil) continha 2,30% de gordura (58,52% de AGI e 41,38% de AGS). A dieta rica em AGI continha 19,39% de gordura (73,57% de AGI e 26,43% de AGS). Por outro lado, a dieta rica em AGS apresentava 20,02% de gordura (37,45% de AGI e 62,55% de AGS). A preparação das dietas está descrita a seguir.
Os animais, submetidos ao protocolo durante 60 dias e sacrificados posteriormente, foram mantidos em gaiolas individuais, em ambiente com temperatura controlada (24ºC + 2ºC), ciclo claro-escuro (12:12 horas), e pesados semanalmente. O peso corpóreo tanto inicial (PCI) como final (PCF), o peso do ventrículo esquerdo (VE) e do ventrículo direito (VD), e as relações VE/PCF e VD/PCF foram medidos nos ratos submetidos a estudo funcional. A ingestão alimentar foi medida pelo consumo de cada semana. Todos os procedimentos estão de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publicado pelo US National Institute of Health e aprovados pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal da FMB-UNESP.
Preparo das dietas - As dietas ricas em AGI e AGS foram preparadas a partir do farelo da ração comercial e proporcionaram quantidades suficientes de vitaminas, minerais, aminoácidos essenciais e lipídios. A fonte de AGI foi o óleo de milho e a fonte de AGS foi o óleo de coco. Para a dieta rica em AGI foi utilizada uma proporção de 220 ml de óleo de milho com 30 ml de óleo de coco para 1.000 g de ração comercial. A dieta rica em AGS foi preparada utilizando-se uma mistura de 110 ml de óleo de milho e 140 ml de óleo de coco para 1.000 g de ração comercial. Depois de processadas, as misturas passaram por máquina específica para formação de pellets, os quais foram secos em estufa com ar circulante durante 24 horas, em temperatura inferior a 70ºC. Depois da secagem, foram mantidos em ar ambiente para resfriamento e armazenados em câmara fria a 6ºC. A validade da ração preparada é de três meses.
A composição nutricional das rações foi estabelecida no Laboratório de Tecnologia dos Produtos Agropecuários da Faculdade de Ciências Agronômicas (FCA-UNESP). Para análise do teor de gordura foi utilizada a extração em éter em aparelho de Soxhlet16. A análise dos ácidos graxos foi realizada por extração segundo o método de Folch e cols.17: a esterificação foi realizada com ácido sulfúrico metanol em frasco de transesterificação e a separação dos ácidos graxos foi realizada em cromatógrafo CG 17 A, utilizando uma coluna DB-Wax com aproximadamente 35 m de comprimento e programação de temperatura.
Estudo funcional - O desempenho mecânico dos músculos papilares isolados foi avaliado de acordo com a técnica utilizada no laboratório em que foi realizado este estudo. Ao término do período experimental, os animais foram anestesiados com pentobarbitol sódico, na razão de 1 ml da droga por 1.000 g de peso do animal, e, posteriormente, decapitados. Depois de aberto o tórax, o coração foi removido rapidamente e colocado em solução de Krebs-Henseleit previamente oxigenada (10 minutos) com 95% de oxigênio (O2) e 5% de dióxido de carbono (CO2). Após remover o coração da solução, o ventrículo direito foi dissecado com a finalidade de se expor o septo interventricular. Este foi dividido ao meio, permitindo a exposição adequada dos dois músculos papilares do ventrículo esquerdo, anterior e posterior. O ventrículo esquerdo foi separado em duas partes, cada uma contendo seu músculo papilar. A seguir, um dos músculos foi cuidadosamente dissecado numa câmara contendo solução de Krebs-Henseleit, adequadamente oxigenada e aquecida a 28ºC. Durante a dissecção, foram mantidos segmentos da parede livre e do septo interventricular nas extremidades dos músculos, em que foram presos anéis de aço inoxidável, evitando lesões das extremidades do músculo papilar. Depois disso, o músculo foi rapidamente transferido para uma câmara de acrílico contendo 100 ml de solução de Krebs-Henseleit, constantemente oxigenada e mantida à temperatura de 28ºC com uso de banho circulante. O músculo papilar foi suspenso verticalmente na câmara, e a extremidade tendinosa superior foi conectada, por meio de anel e fio de aço inoxidável de 0,038 cm de diâmetro, à extremidade do braço de um motor DC de baixa inércia (G100-PD, General Scaning, Watertown, MA, Estados Unidos). A extremidade inferior do músculo foi fixada a um gancho preso ao fundo da câmara por meio de anel de aço.
Para controlar a força e/ou o comprimento da preparação muscular foi utilizado um sistema servoeletrônico. O motor DC contendo transdutores de força e comprimento foi conectado a um microcomputador com interface digital-analógica, o que permitiu controlar a tensão e o comprimento da preparação. As variações de tensão e comprimento foram registradas à velocidade de 1 kHz e armazenadas em disquete para análise posterior.
Os músculos foram estimulados por um estimulador Grass (DS9J, W. Warwick, RI, Estados Unidos) 12 vezes por minuto por meio de eletrodos de platina, com pulsos elétricos regulares de 5 ms de duração. A voltagem utilizada foi 10% maior que o valor mínimo necessário para provocar resposta mecânica máxima do músculo. A seguir está apresentada a composição da solução de Krebs-Henseleit, expressa em milimol por litro: 118,5 NaCl; 4,69 KCl; 1,25 CaCl2; 1,16 MgSO4; 1,18 KH2PO4; 5,5 glicose; e 25,88 NaHCO3.
Após período de 30 minutos, os músculos foram isotonicamente contraídos contra leve carga (0,4 g) e, a seguir, colocados em contração isométrica e medidos. Nessa situação, foram estirados gradualmente até a tensão desenvolvida atingir seu valor máximo. O comprimento diastólico da fibra muscular associado à tensão máxima desenvolvida denomina-se Lmáx. Após atingir Lmáx, o músculo foi colocado em contração isotônica fisiológica contra pós-carga (pré-carga igual a 50% da pré-carga em Lmáx e pós-carga equivalente a 25% da tensão máxima desenvolvida) durante 15 minutos. A seguir, três novas determinações de Lmáx foram realizadas. Após verificação da estabilização de Lmáx, os músculos permaneceram em contração isométrica, sendo analisados os seguintes parâmetros: tensão máxima desenvolvida (TD, g/mm2), tensão de repouso (TR, g/mm2), tempo para atingir o pico da tensão desenvolvida (TPT, ms), velocidade máxima de variação temporal da TD (+dT/dt, g/mm2/s), velocidade máxima de variação do decréscimo da TD (-dT/dt, g/mm2/s), e tempo para TD decrescer 50% de seu valor máximo (TR50, ms).
Após o término do registro isométrico, o músculo foi colocado em contração isotônica, contraindo contra uma pequena carga capaz de manter o músculo com comprimento de repouso igual a Lmáx. Os seguintes parâmetros isotônicos foram medidos: velocidade máxima de encurtamento (-dl/dT, Ml/s) e velocidade máxima de relaxamento (+dl/dT, Ml/s). A constante de rigidez do músculo foi calculada pela relação log(Sm) = B + KmEm, em que Sm é o estresse calculado a partir da TR observada nos diferentes comprimentos do músculo normalizada para as respectivas áreas de secção transversa, e Em é a deformação (strain) natural do músculo (Em = 1 n[Lm/L0,1], em que Lm é o comprimento instantâneo do músculo e L0,1 é o comprimento no estresse igual a 0,1 g/mm2). Essas análises foram realizadas em situação basal ([Ca2+] = 1,25 mM), com aumento da concentração extracelular de Ca2+ para 5,2 mM e estímulo beta-adrenérgico (1 µM de isoproterenol).
Os parâmetros usados para caracterizar os músculos papilares foram: comprimento (mm) e área seccional (AS, mm2). O comprimento in vitro, em Lmáx, foi obtido com catetômetro Gartner (Chicago, IL, Estados Unidos). A porção do músculo entre os anéis de aço foi cortada, submetida a secagem em papel filtro e pesada. A AS foi calculada dividindo-se o peso do músculo pelo seu comprimento, considerando-se que o músculo papilar tem forma cilíndrica, uniforme, e peso específico aproximadamente unitário.
A fim de poder comparar o desempenho de músculos de tamanhos diferentes, os parâmetros isométricos e isotônicos foram normalizados, respectivamente, pela AS e pelo Lmáx.
Estudo bioquímico - Cinco animais de cada grupo foram utilizados para o estudo do estresse oxidativo. Os corações foram removidos e o tecido adiposo cardíaco foi desprezado. Fragmentos de VE pesando 200 mg foram homogeneizados em 5 ml de fosfato de sódio tampão a 0,1 M, pH de 7,4, contendo 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). O tecido homogeneizado foi preparado em um homogeneizador Teflon Glass Potter Elvehjem (Piracicaba, SP, Brasil) por 1 minuto a 100 rpm, imerso em água gelada. O produto foi centrifugado a 10.000 rpm por 15 minutos e o sobrenadante foi usado para determinar: proteína total (PS), hidroperóxido de lipídio (HL), antioxidantes totais (TAS), glutationa-peroxidase (GSH-Px), superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT).
O HL foi medido pela oxidação do hidroperóxido pelo Fe2+ em meio ácido. Amostras foram adicionadas a misturas contendo 100 µM de alaranjado de xilenol, 250 µM de FeSO4, 25 µM de H2SO4, e 4 mM de butilato de hidroxitolueno em metanol 90%. As misturas foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente para leitura a 560 nM.
GSH-Px foi quantificada usando 0,15 M de tampão de fosfato de sódio, pH de 7,0 contendo 5 mM de EDTA, 0,1 ml de NADPH a 0,0084 M e 0,005 ml de GSSG-redutase (Sigma, St. Louis, MO, Estados Unidos), 0,01 ml de NaN3 a 1,125 M e 0,1 ml de GSH a 0,15 M. A atividade da SOD foi determinada pela habilidade da enzima de inibir a redução do nitroazul de tetrazólio (Sigma). A taxa de redução do nitroazul de btetrazólio na ausência de tecido foi usada como referência. Uma unidade de SOD foi definida como a quantidade de proteína necessária para diminuir a taxa de referência para 50%. Todos os dados foram expressos como unidades de SOD por mg de proteína. A atividade da CAT foi determinada a 240 nm, com tampão de fosfato de sódio (pH 7,0).
As atividades enzimáticas foram determinadas com a utilização de leitor de microplacas (Bio-Tech Instruments Inc., Winooski, VT, Estados Unidos), e as determinações espectrofotométricas foram feitas com espectrofotômetro Pharmacia Biotech (974213, Cambridge, Inglaterra).
Estudo morfológico - Após a retirada do coração, um fragmento do músculo papilar de cinco animais de cada grupo foi submetido a tratamento criobiológico. Esses fragmentos foram imersos em N-Hexana a -70ºC, previamente resfriada em nitrogênio líquido a -196ºC. Decorridos dois minutos, o material congelado foi transferido para a câmara de um micrótomo criostato (Leica CM 1800 – Leica Inst., Nussloch, Alemanha), a -20ºC. Estabelecido o equilíbrio térmico, cada fragmento congelado foi fixado aos suportes metálicos do criostato, com adesivo especial Yung Tissue Freezing Medium. Cortes histológicos, com 8-10 µm de espessura obtidos em criostato a -20°C, foram submetidos a coloração HE, para a avaliação da morfologia geral do músculo.
Para o estudo ultra-estrutural, pequenos fragmentos do músculo papilar de VE foram fixados em solução de Karnowsky (0,12 M de fosfato, pH de 7,2), por uma a duas horas, e pós-fixados em tetróxido de ósmio a 1% em tampão de fosfato (0,1 M) por duas horas. Após desidratação em etanol, amostras foram embebidas em resina para realização dos cortes. Secções ultrafinas foram realizadas com uma faca de diamante e coradas com acetato de uranil e citrato de chumbo, as quais foram examinadas em microscópio eletrônico de transmissão (Philips EM 301).
Análise estatística - Dados referentes aos parâmetros morfológicos, aos parâmetros funcionais em situação basal e aos lipídios séricos foram estudados pela análise de variância, complementada com o teste de Tukey. Dados funcionais com aumento das concentrações de cálcio e isoproterenol foram submetidos a análise de variância para o modelo de medidas repetidas em três grupos independentes. O nível de significância foi de 5% (p < 0,05).
Resultados
As características gerais dos animais desse experimento são apresentadas na tabela 1. Os animais submetidos a dieta AGS apresentaram VD maior que os animais controle e os com dieta AGI. A média de ingestão alimentar foi diferente entre os três grupos, sendo maior nos ratos controle e menor nos do grupo LI.
A tabela 2 apresenta os dados referentes ao estudo funcional do músculo papilar isolado em situação basal na concentração extracelular de cálcio de 1,25 mM. Não foram observadas diferenças estatísticas entre os três grupos. Os resultados mecânicos com aumento da concentração extracelular de cálcio estão apresentados na tabela 3. A variação da TR foi menor nos animais com dietas hiperlipídicas que no grupo controle. Os demais parâmetros não foram estatisticamente diferentes entre os grupos. Quando submetidos ao estímulo com isoproterenol, a constante de rigidez do miocárdio do grupo LS apresentou resposta menor que nos demais grupos. Não houve diferença estatística nas outras variáveis analisadas (tab. 4).
A análise bioquímica do miocárdio demonstrou que animais dos grupos LI e LS apresentaram aumento do hidroperóxido de lipídio e diminuição dos antioxidantes totais e da superóxido-dismutase em relação ao controle. As substâncias antioxidantes totais foram menores no grupo LI em relação ao grupo LS. A dieta AGI promoveu diminuição da atividade da catalase e a AGS, diminuição de glutationa peroxidase em relação aos outros dois grupos. A proteína solúvel do miocárdio foi semelhante nos três grupos (tab. 5).
As figuras 1 e 2 demonstram, respectivamente, a análise ultra-estrutural dos músculos papilares de animais submetidos a dietas ricas em AGI e AGS. Em ambos os grupos foram observadas discretas alterações, como pequenos depósitos de gordura entre os miócitos e lesões focais na membrana plasmática e nas cristas mitocondriais. À microscopia óptica não foram encontradas alterações morfológicas.
Discussão
O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos de dietas ricas em AGI e AGS sobre a função mecânica do músculo papilar isolado do ventrículo esquerdo, o estresse oxidativo e a morfologia do miocárdio. Preparações com músculos isolados permitem medir a capacidade do miocárdio de desenvolver tensão e encurtamento, independentemente das alterações da pré-carga, da pós-carga e da freqüência cardíaca, que podem modificar o desempenho miocárdico in vivo. A estimulação inotrópica permite a identificação de alterações nas fases de contração e relaxamento, que podem não ser observadas em condições basais e auxiliam no entendimento de mecanismos envolvidos nas alterações da função cardíaca.
Este trabalho demonstrou que animais alimentados com dietas AGI ou AGS tiveram o mesmo peso corpóreo que os controles. A menor ingestão alimentar dos ratos com dietas hipercalóricas em relação aos controles igualou o aporte calórico entre os três grupos, o que resultou em peso corporal final semelhante. Esses dados estão de acordo com os resultados de experimentos anteriores que usaram dietas ricas em AGI ou AGS8-10,13-15. A análise das relações entre os pesos dos ventrículos e o peso corporal final dos ratos demonstrou que os animais submetidos a dieta AGS apresentaram hipertrofia biventricular em relação ao grupo controle e hipertrofia de ventrículo direito quando comparados aos animais do grupo que recebeu dieta AGI.
No presente estudo, as alterações morfológicas do miocárdio detectadas, como pequenos depósitos de gordura entre os miócitos e lesões focais na membrana plasmática e nas cristas mitocondriais, foram apenas ultra-estruturais. As modificações observadas com dieta AGI são menos relevantes que as relatadas em pesquisas anteriores, que demonstraram necrose7 e desorganização do aparelho contrátil do miócito8. O mecanismo das lesões miocárdicas produzidas pelo aumento da ingestão de ácidos graxos é desconhecido7. Acredita-se que seja conseqüência do estresse oxidativo induzido por esse tipo de dieta10,18,19. Os lipídios ingeridos são incorporados em maior quantidade aos fosfolípides de membrana, tornando-os mais suscetíveis à agressão dos radicais livres. Isso ocorre principalmente em relação aos AGI, que possuem em sua estrutura molecular ligações instáveis e, portanto, mais suscetíveis ao estresse oxidativo10,18,19. Essa hipótese encontra suporte neste experimento, no qual foram observados estresse oxidativo e discretas lesões ultra-estruturais provocados por dietas ricas em AGI e AGS.
Embora trabalhos anteriores tenham associado estresse oxidativo e disfunção cardíaca6,20-22, neste trabalho não foram observadas alterações da função mecânica em situação basal. Os resultados observados, como variações porcentuais isoladas da TR com aumento da concentração extracelular de cálcio e a constante de rigidez do músculo com isoproterenol no grupo LS, permitem concluir que as dietas não provocaram alterações funcionais miocárdicas significantes. Os achados deste estudo estão de acordo com os resultados de estudos que demonstraram que dietas AGI não modificam a função mecânica do miocárdio7,9,11,14,15, embora discordem de outros autores que relataram depressão da função miocárdica com dietas AGI12,13 e AGS4.
Conclusões
Em conclusão, este experimento demonstra que dietas ricas em AGI ou AGS provocam estresse oxidativo e lesões ultra-estruturais miocárdicas discretas, e não acarretam comprometimento da função mecânica do miocárdio.
Agradecimentos
Nossos sinceros agradecimentos a J. C. Georgette, M. Bruno e C. E. Knaggs, pela assistência técnica, e à FAPESP (02/02704-0), por acreditar em nosso trabalho.
Potencial Conflito de Interesses
Declaro não haver conflitos de interesses pertinentes.
Correspondência:
Matheus Fécchio Pinotti
Rua Dr. José Adriano Marrey Jr., 796 – ap. 101
18603-610 – Botucatu, SP
E-mail:
mpinotti@uol.com.br
Artigo recebido em 09/05/06; revisado recebido em 09/05/06; aceito em 22/06/06.
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OBJECTIVES: To study the influence of saturated (SFA) and unsaturated fatty acid (UFA) rich diets on mechanical function, morphology and oxidative stress in rat myocardium. METHODS: Male, 60-day-old Wistar rats were fed a control (n=8), a SFA (n=8), or a UFA-rich diet (n=8) for sixty days. Mechanical function was studied in isolated left ventricle papillary muscle under isometric and isotonic contractions, in basal conditions (1.25mM calcium chloride) and after 5.2mM calcium chloride and beta-adrenergic stimuli with 1.0µM isoproterenol. Left ventricle fragments were used to study oxidative stress and morphology under light and electron microscopy. RESULTS: SFA and UFA-rich diets did not change myocardium mechanical function. Both diets caused oxidative stress, with high lipid hydroperoxide and low superoxide-dismutase concentrations. UFA rich diet decreased catalase expression and SFA rich diet decreased the amount of myocardial glutathione-peroxidase. Both diets promoted light ultrastructural injuries such as lipid deposits and cell membrane injuries. CONCLUSION: Results suggest that SFA and UFA rich diets do not alter isolated muscle mechanical function, but promote light myocardial morphological injuries and oxidative stress.
Dietfatty acidsmyocardiumratsoxidative stress
ORIGINAL ARTICLE
Influences of rich in saturated and unsaturated fatty acids diets in rat myocardium
Matheus Fécchio Pinotti; Maeli Dal-Pai Silva; Mário Mateus Sugizaki; Yeda Santana Diniz Novelli; Lea Sílvia Sant'ana; Flávio Ferrari Aragon; Carlos Roberto Padovani; Ethel Lourenzi Barbosa Novelli; Antonio Carlos Cicogna
Faculdade Médica da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP – Botucatu, SP - Brazil
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SUMMARY
OBJECTIVES: To study the influence of saturated (SFA) and unsaturated fatty acid (UFA) rich diets on mechanical function, morphology and oxidative stress in rat myocardium.
METHODS: Male, 60-day-old Wistar rats were fed a control (n=8), a SFA (n=8), or a UFA-rich diet (n=8) for sixty days. Mechanical function was studied in isolated left ventricle papillary muscle under isometric and isotonic contractions, in basal conditions (1.25mM calcium chloride) and after 5.2mM calcium chloride and beta-adrenergic stimuli with 1.0µM isoproterenol. Left ventricle fragments were used to study oxidative stress and morphology under light and electron microscopy.
RESULTS: SFA and UFA-rich diets did not change myocardium mechanical function. Both diets caused oxidative stress, with high lipid hydroperoxide and low superoxide-dismutase concentrations. UFA rich diet decreased catalase expression and SFA rich diet decreased the amount of myocardial glutathione-peroxidase. Both diets promoted light ultrastructural injuries such as lipid deposits and cell membrane injuries.
CONCLUSION: Results suggest that SFA and UFA rich diets do not alter isolated muscle mechanical function, but promote light myocardial morphological injuries and oxidative stress.
Recent studies have reported the benefical influences of lifestyle and dietary changes, such as consuming less saturated fatty acids (SFA) and trans fatty acids, and increasing consumption of fish oil, rich in unsaturated fatty acids (UFA), on morbidity and mortality of patients with coronary artery disease1,2. While SFA rich foods are atherogenic and reduce coronary reserve1,3,4, UFAs have an anti-atherogenic effect1,5 and protect the heart against the adverse effects of acute phase myocardial infarction5,6.
Studies on UFA have shown beneficial results in the cardiovascular system1,5,6, experiments have shown that diets rich in UFA and SFA cause structural and metabolic damage in the myocardium6-10. While both diets cause disorganized sarcolemma, lipid deposits9,10, and myocardial oxidative stress6,10, the UFA rich diet also promotes necrosis7 and abnormal muscle striation8.
Although literature shows that UFA rich diets cause morphometabolic alterations6-10, information is contradictory with respect to their effects on myocardium mechanical function7,9,11-15. Although previous studies have shown that diet caused depressed cardiac function depression in isolated rabbit12 and rat 13 papillary muscle, recent data from our laboratory15 have shown that, in agreement with other authors7,9,11,14, UFA diet does not alter functional performance. On the other hand, there are few reports on the relationship between SFA rich diets and cardiac function. Pepe and McLennan (2002) showed that animal origin SFA causes ventricular dysfunction in isolated rat heart, seen only after important increase in preload and the myocardial ischemia-reperfusion process. These authors demonstrate that this functional alteration is a consequence of the heart’s incapacity to increase coronary flow and adequately utilize the oxygen needed to produce energy4.
The objective of this work was to evaluate the influence of SFA and UFA supplemented diets on isolated papillary muscle mechanical function, complemented by analysis of oxidative stress and morphology in rat myocardium.
Methods
Animal model and experimental protocol - Sixty-day-old male Wistar rats from the Experimental Laboratory Biotério, Department of Internal Medicine, Botucatu School of Medicine, (FMB-UNESP), were fed a control (C, n=8), an SFA (SF, n=8) or a UFA rich diet (UF, n=8) and water ad libitum. LabinaTM commercial rat chow (Purina, Paulínia, Brasil) contained 2.30% fat (58.52% UFA and 41.38% SFA). The UFA rich diet contained 19.39% fat (73.57% UFA and 26.43% SFA), and the SFA rich diet contained 20.02% fat (37.45% UFA and 62.55% SFA). Diet preparation is described below.
Rats were maintained on this dietary regimen for 60 days and then sacrificed. All animals were housed in individual cages in a room controlled at 23ºC and with a 12h light:dark cycle. All animals were weighed once a week. Initial body weight (IW), final body weight (FW), left ventricle weight (LV), right ventricle weight (RV), and LV/FW and RV/FW ratios were measured in all rats used in the functional study. Animal food consumption was determined once a week. All experiments and procedures were performed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the U.S. National Institute of Health and were approved by the ethics committee of Botucatu School of Medicine, UNESP, São Paulo, Brazil.
Diet preparation - The UFA and SFA rich diets were prepared with commercial rat chow. Thus all diets provided sufficient vitamins, minerals, essential amino acids, and lipids. Corn oil was the source of UFA and coconut oil the source of SFA. The UFA-rich diet was prepared by mixing 220ml of corn oil and 30ml of coconut oil with 1,000g of rat chow; the SFA-rich diet was prepared by mixing 110ml of corn oil and 140ml of coconut oil with 1,000g of rat chow. The mixture was then passed through a pelleting machine. Pellets were dried in a circulating air oven for 24 hours at 70ºC. After drying, both diets were stored at 6ºC for use during the experiment.
Both diets were analyzed in the Agricultural and Livestock Products Technology Laboratory of the School of Agronomy Sciences (FCA-UNESP). Fat was extracted with petroleum ether in a Soxhlet extractor16. Lipids were extracted as per Folch et al17: fatty acid composition was determined after esterification with methanol sulphuric acid and the resulting fatty acid methyl esters [26] were analyzed by a chromatograph CG 17 A, using a 35m DB-Wax column and flame ionization detector.
Functional study - Cardiac intrinsic contractile performance was evaluated by studying isolated LV papillary muscle by the technique used in our lab. Briefly, at the time of study, rats were anesthetized (with sodium pentobarbital, 50mg/kg, IP) and killed; their hearts were quickly removed and placed in oxygenated Krebs-Henseleit solution at 28ºC. The LV anterior or posterior papillary muscles were dissected free, mounted between 2 spring clips, and placed vertically in a chamber containing Krebs-Henseleit solution at 28ºC and oxygenated with a mixture of 95% O2 and 5% CO2 (pH7.38). Muscles were stimulated at 12 contractions/min with a voltage 10% above threshold. The spring clip on the upper end of the muscle was attached to a low inertia DC pen motor (model G100-PD; General Scanning), and the lower clip to a load cell (model DSC-3; Kistler-Morse). A digital computer with an analogue-to-digital interface allowed preparation tension or length to be controlled. Tension and length data were sampled at 1kHz and stored on disk for later analysis.
After mounting, muscles were allowed 30 minutes to stabilize. They were then gradually stretched with tension values plotted against length, to peak active tension (AT, and Lmax was defined as muscle length at peak AT); this was allowed to stabilize for an additional 15 minutes while performing physiologically sequenced contractions. Isometric contraction parameters were determined, including active tension (AT, g/mm2, defined as peak isometric tension minus resting tension), resting tension (RT, g/mm2), time to peak tension (TPT, ms), peak isometric tension development rate (+dT/dt, g/mm2/s), maximum tension decline rate (-dT/dt, g/mm2/s), and time from peak tension to 50% relaxation (RT50, ms).
After isometric contraction, muscles were analyzed in isotonic contraction against a weight sufficient to keep the resting muscle at Lmax. The isotonic parameters were maximum shortening velocity (-dL/dT, ML/s) and maximum relaxation velocity (+dL/dT, ML/s). The stiffness constant (km) was calculated from: log(Sm) = B + kmEm; Sm is the stiffness calculated from resting tension in different muscle lengths normalized to cross-sectional area; Em is the natural muscle strain (Em = 1n[Lm/L0.1] where Lm is the instant muscle length and L0.1 is the length with 0.1g/mm2 stress). Analyses were performed under basal conditions ([Ca2+] = 1.25mM), with [Ca2+] = 5.2mM, and with isoproterenol 10-6 M.
The parameters used to characterize papillary muscle were length (mm), weight (mg), and cross-sectional area (CSA, mm2). Lmaxin vitro was measured with a Gartner cathetometer. The muscle portion between both spring clips was cut and weighed after drying in filter paper. CSA was calculated as the relationship between weight and Lmax, considering that papillary muscle is cylindrical and its specific weight is constant.
To compare the mechanical function between different muscle lengths, isometric and isotonic parameters were normalized to CSA and Lmax.
Biochemical study - Five animals from each group were used for the biochemical study. The heart was removed and cardiac adipose tissue was discarded. LV samples of 200mg were weighed and homogenized in 5ml of cold phosphate buffer (0.1M, pH7.4) containing 1mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Tissue homogenates were prepared in a motor-driven Teflon glass Potter Elvehjem tissue homogenizer (1min. 100rpm) immersed in ice water. The homogenate was centrifuged at 10,000 rpm for 15 min and supernatant was used to determine: Total protein (TP), lipid hydroperoxide (LH), total antioxidant status (TAS), glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD), and catalase (CAT).
LH was measured through hydroperoxide-mediated Fe2+ oxidation under acid conditions. Samples were added to reaction mixtures containing 100µM xylenol orange, 250µM FeSO4, 25µM H2SO4, and 4mM butylated hydroxytoluene (BHT) in 90% (v/v) methanol. The mixtures were incubated for 30 min at room temperature prior to measurement at 560nm.
GSH-Px was assayed using 0.15M, pH7.0 phosphate buffer containing 5mM EDTA, 0.1ml 0.0084M NADPH, 0.005ml GSSG-reductase (Sigma), 0.01ml 1.125M NaN3 (sodium azide), and 0.1ml 0.15M GSH [31]. Superoxide dismutase activity was determined by the ability of the enzyme to inhibit reduction of nitro blue tetrazolium (NBT; Sigma). NBT reduction rate in the absence of tissue was used as a reference. One unit of SOD was defined as the amount of protein needed to decrease the reference rate to 50% maximum inhibition. All data were expressed in SOD units per mg protein. Catalase activity was determined with pH7.0 phosphate buffer at 240nm.
Enzyme activities were determined using a microplate reader (Bio-tech Instruments INC USA). Spectrophotometric determinations were performed in a Pharmacia Biotech spectrophotometer (974213, Cambridge, England). All reagents were from Sigma (Sigma. St. Louis, MO, USA). The extinction coefficient for NADH at 340nm was 6.22µmol-1cm-1 and for DTNB at 412nm was 13.6mmol-1cm-1.
Morphological study - Five animals from each group were used for histological study. After anaesthesia with sodium pentobarbital (50mg/kg, IP), hearts were excised and ventricles separated. The LV free wall was cut into fragments and chilled in n-hexane at –70ºC cooled in liquid nitrogen. Serial transverse 8µm sections were cut in a cryostat at –20ºC and stained with hematoxylin and eosin. For ultrastructural study, small pieces of the LV papillary muscle were fixed in Karnowsky’s fixative (0.12M phosphate, pH7.2) for 1-2h and postfixed in 1% osmium tetroxide in 0.1M phosphate buffer for 2h. After dehydratation in a graded ethanol series, samples were embedded in epoxy resin. Ultrathin sections were cut from selected areas with a diamond knife, double-stained with uranyl acetate and lead citrate, and examined in a Philips EM 301 electron microscope. LV myocyte cross sectional area was measured using a compound microscope attached to a computerized imUFAng analysis system (Image-Pro Plus 3.0, Media Cybernetics, Silver Spring, Md.).
Statistical analysis - Morphological, basal functional, and serum lipid data were evaluated by analysis of variance complemented by the Tukey test. Functional data with increased calcium and isoproterenol concentrations were submitted to analysis of variance for repeated samples in three independent groups. Significance level was 5% (p<0.05).
Results
Table 1 shows the general characteristics of animals used in this experiment. Animals submitted to the SFA diet had higher VD than controls and UFA diet animals. Mean food ingestion was different between groups, higher in controls and lower in UF rats.
Table 2 shows data from the isolated papillary muscle functional study at basal condition in 1.25mM concentration extra-cellular calcium. There were no statistical differences between the three groups. Table 3 shows mechanical results with increased extracellular calcium concentration. The variation in resting tension (RT) was less in animals on supplemented diets than controls. The other parameters were not statistically different between groups. When stimulated with isoproterenol, the stiffness constant was less in SF than the other groups. There were no statistical differences for other analyzed variables (Tab. 4).
Biochemical analysis of the myocardium showed that SF and UF animals had increased lipid hydroperoxide and reduced total antioxidants and superoxide-dismutase than controls. Total antioxidant substances in UF were less than in SF. The UFA diet promoted reduced catalase activity and the SFA diet reduced glutathione peroxidase in relation to the other two groups. Soluble protein from the myocardium was similar in all three groups (Tab. 5).
Figures 1 and 2 show ultrastructural analysis of papillary muscle from animals submitted to UFA and SFA rich diets, respectively. There are discrete alterations in both groups with small fat deposits between myocytes and focal lesions in the plasmatic membrane and mitochondrial crystals. Optical microscopy did not show any morphological alterations.
Discussion
The objective of this study was to evaluate the effects of SFA and UFA rich diets on isolated LV papillary muscle mechanical function, oxidative stress, myocardium morphology. Isolated muscle preparations allow measurement of the myocardium’s capacity to develop tension and shortening, independent of pre and after-load alterations, and changes in cardiac frequency which could modify in vivo cardiac performance. Inotropic stimulation made it possible to see contraction and relaxation phases that could not be seen under basal conditions, and helped in understanding the mechanisms involved in cardiac function changes.
This work showed that animals fed on UFA or SFA diets had the same body weights as controls. The lower food consumption in hypercaloric diet rats than controls equalled out caloric intake between the three groups, which resulted in similar final body weights. These data agree with previous experiments using UFA or SFA rich diets8-10,13-15. Analysis of relationships between ventricle weights and rat final body weights showed that animals submitted to SFA diets had biventricular hypertrophy compared to controls, and RV hypertrophy compared to UF animals.
In this study, myocardial morphological changes, with small fat deposits between myocytes, focal lesions in the plasmatic membrane, and mitochondrial crystals were only found at the ultrastructural level. The changes seen in the UFA diet were less relevant than in previous studies which showed necrosis7 and disorganization myocyte contraction apparatus8. The mechanism which produced myocardial lesions by increasing fatty acid intake is unknown7. It is believed to be from the oxidative stress caused by this type of diet10,18,19. Most ingested lipids are incorporated in membrane phospholipids, making them more susceptible to attack from free radicals. This mainly occurs with UFA which has unstable molecular bonds in its structure and is therefore more susceptible to oxidative stress10,18,19. This hypothesis is supported by our experiment, where oxidative stress and discrete ultrastructural lesions were caused by UFA and SFA rich diets.
Although prior works have associated oxidative stress and cardiac dysfunction6,20-22, this work found no alterations in mechanical function under basal conditions. Results, such as the isolated changes in tension and relaxation with increased extracellular calcium concentration and muscle stiffness constant with isoproterenol in the SF group, allow us to conclude that the diets did not provoke significant myocardial functional changes. These findings are in agreement with studies that show that UFA diets do not modify myocardial mechanical function7,9,11,14,15, and disagree with other authors who report depressed myocardial function with UFA12,13 and SFA diets4.
In conclusion, this work shows that diets rich in saturated or unsaturated fatty acids cause oxidative stress and discrete ultrastructural myocardial lesions, and do not compromise myocardial mechanical function.
Acknowledgments
Our sincere thanks to J.C. Georgette, M. Bruno and C.E. Knaggs for their technical assistance and to FAPESP (02/02704-0) for believing in our work.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
References
Matheus Fécchio Pinotti
Rua Dr. José Adriano Marrey Jr., 796 – ap. 101
18603-610 – Botucatu, SP
E-mail:
mpinotti@uol.com.br
Manuscript received May 09, 2006; revised manuscript received May 09, 2006; accepted June 22, 2006.