OBJETIVO: Determinar os níveis plasmáticos de homocisteína e a incidência do polimorfismo C677T no gene da enzima metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) em um grupo de indivíduos submetidos a angiografia coronariana, buscando estabelecer a possível correlação entre esses parâmetros e a gravidade da doença arterial coronariana (DAC), bem como investigar a correlação entre hiper-homocisteinemia e a presença do polimorfismo. MÉTODOS: Vinte indivíduos com ausência de ateromatose nas coronárias (controles), quatorze indivíduos apresentando ateromatose leve/moderada e vinte e nove indivíduos apresentando ateromatose grave foram avaliados. RESULTADOS: Para o parâmetro homocisteína foram observadas diferenças significativas entre as médias dos grupos controle e ateromatose grave (p < 0,001). Entre os demais grupos não foram observadas diferenças significativas. O grupo ateromatose grave apresentou uma freqüência de 62,0% e 6,9% para o polimorfismo C677T no gene da enzima MTHFR, em heterozigose e homozigose, respectivamente. Entretanto, não foi observada correlação entre a presença da mutação e hiper-homocisteinemia. Foi observada uma correlação positiva da ordem de 41,91% (p < 0,001) entre hiper-homocisteinemia e a presença de DAC. CONCLUSÃO: O achado mais importante deste estudo foi a associação entre hiper-homocisteinemia e a presença de estenose coronariana superior a 70%; entretanto, permanece a dúvida se o aumento da concentração plasmática de homocisteína constitui um fator determinante para o agravamento da lesão aterosclerótica nas coronárias ou se o mesmo é uma conseqüência desta lesão.
Homocistéina e metilenotetrahidrofolato redutase em indivíduos submetidos à angiografia coronariana
Universidade Federal de Minas Gerais, Hospital Socor, Belo Horizonte, Minas Gerais - Belo Horizonte, MG
A homocisteína, um aminoácido proveniente do metabolismo da metionina, atualmente tem sido considerado um fator de risco independente para o desenvolvimento de aterosclerose. Estudos demonstram ainda que níveis elevados de homocisteína possuem ação tóxica ao endotélio vascular1. A elevação da homocisteína no sangue possui causas multifatoriais, entre estas a ingestão elevada de metionina, redução do metabolismo, alterações genéticas ou deficiência de enzimas (cistationina b sintase ou metilenotetrahidrofolato redutase – MTHFR) ou de vitaminas (B12, B6 e ácido fólico) importantes no processo de metabolismo da homocisteína. Esses fatores podem promover o acúmulo da homocisteína e, conseqüentemente, a injúria do endotélio vascular2, desencadeando o processo de instalação das lesões ateroscleróticas. A MTHFR é uma enzima envolvida na via de transmetilação, na qual a homocisteína é convertida em metionina. A mutação C677T no gene da MTHFR gera uma variante termolábil que pode interferir nas atividades enzimáticas das vias metabólicas da homocisteína e predispõe à hiper-homocisteinemia1,3. Indivíduos homozigotos para a mutação C677T do gene da MTHFR podem apresentar níveis plasmáticos de homocisteína duas vezes mais aumentados quando comparados com indivíduos não portadores4.
Alguns estudos5-7 demonstraram associação entre hiper-homocisteinemia e doença vascular periférica, doença cerebrovascular e DAC, constatando que a concentração deste aminoácido era significativamente mais elevada que a encontrada em indivíduos hígidos. Deste modo, a hiper-homocisteinemia passou a ser considerada fator de risco para as condições clínicas citadas. Investigações sobre diferentes fatores, como tabagismo8, perfil lipídico9, idade avançada10, hipertensão arterial10, diabetes mellitus11 e obesidade12, além da homocisteína, revelaram que a sua concentração plasmática pode ser considerada fator de risco independente para a doença aterosclerótica. Deve ser ressaltado que os valores da homocisteinemia parecem ter também grande importância como preditores de mortalidade em pacientes com DAC, além de mostrar relação com a intensidade do processo aterosclerótico13-15.
Diante do contexto exposto acima, o presente estudo teve como objetivo investigar a existência de associação entre hiper-homocisteinemia e a presença do polimorfismo C667T no gene que codifica a enzima MTHFR, bem como estabelecer os níveis plasmáticos de homocisteína em pacientes com diagnóstico de DAC estabelecido por angiografia e comparando-os com indivíduos angiograficamente normais, buscando correlacionar as possíveis alterações com a gravidade da lesão.
Foram avaliados 63 indivíduos, com faixa etária de 46 a 68 anos, de ambos os sexos, selecionados em um período de três meses no Departamento de Hemodinâmica do Hospital Socor de Belo Horizonte, em Minas Gerais, após realização de angiografia coronariana. Os participantes deste estudo foram selecionados buscando uma homogeneidade em relação às variáveis sexo, idade, nível socioeconômico e Índice de Massa Corporal (IMC). Com base nos resultados da angiografia coronariana, os indivíduos foram divididos em três grupos: controle (n = 20), ateromatose leve/moderada (n = 14) e ateromatose grave (n = 29). O protocolo de estudo recebeu parecer favorável sob o ponto de vista ético e formal do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Socor e pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG.
Aos indivíduos selecionados foi feito o esclarecimento dos objetivos da pesquisa, e aqueles que estiveram de acordo assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE. Uma ficha clínica de cada indivíduo com identificação, dados demográficos, história familiar e resultado da angiografia coronariana foi preenchida pelos cardiologistas do Departamento de Hemodinâmica.
Foram excluídos do estudo indivíduos portadores de doenças intercorrentes como distúrbios da coagulação, doenças renais, hepáticas, auto-imunes e câncer.
A presença das variáveis tabagismo, sedentarismo e história familiar para DAC foi constatada com base nas recomendações das III Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias e Prevenção de Aterosclerose16. Foram considerados diabéticos indivíduos com diagnóstico clínico prévio de Diabetes Mellitus, com glicemia de jejum igual ou superior a 126 mg/dL17. Foram classificados como hipertensos indivíduos com pressão sangüínea igual ou superior a 140 mmHg para a pressão arterial sistólica ou 90 mmHg para a pressão arterial diastólica, ou que estivessem fazendo uso de medicação anti-hipertensiva18.
As amostras de sangue venoso foram obtidas com o paciente em jejum de 12 horas. Os mesmos foram orientados a não praticarem atividade física vigorosa e evitar a ingestão de etanol, nas 24 e 72 horas, respectivamente, que antecederam a coleta de sangue, na tentativa de obter amostras biológicas de pacientes em estado metabólico de equilíbrio. Foram coletados 10 ml de sangue venoso (5 ml sem anticoagulante e 5 ml em EDTA), em tubos do Sistema Vacutainer® (Becton-Dickinson). As amostras obtidas sem anticoagulante foram rapidamente centrifugadas a 2500 rpm por 10 minutos para separação do soro, que foi aliquotado e estocado a –70ºC, até o momento da dosagem de homocisteína. Foi extraído o DNA das amostras obtidas com EDTA, que permaneceu armazenado a -20°C até a realização da análise genética.
A determinação quantitativa da homocisteína foi realizada no soro utilizando-se o conjunto diagnóstico Axsym® Homocisteína (Abbott® Laboratories - Alemanha), cujo princípio analítico é o imunoensaio de fluorescência polarizada, seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. O ensaio foi realizado no equipamento Axsym® (Abbott® Laboratories – Alemanha), utilizando-se três soros-controle comerciais para verificar o desempenho do ensaio. A presença da mutação C677T na enzima MTHFR foi investigada por PCR-RFLP usando-se oligonucleotídeos e endonucleases de restrição previamente descritos3. As reações de PCR foram realizadas no termociclador PT100 PCR thermocycler (MJ Research, Waltham, USA), usando-se 1 pMol de cada primer (Invitrogen®, São Paulo, SP), 0,2 mM de dNTPs (GIBCO BRL®, São Paulo, SP), e 1 unidade de Taq polimerase (Phoneutria® – Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil). As reações de PCR foram submetidas a 40 ciclos, consistindo de 1 minuto a 94ºC para desnaturação, 1 minuto a 64ºC (C677T) para anelamento dos primers e 2 minutos a 72ºC para a extensão dos mesmos. Os produtos de PCR foram submetidos à digestão com endonuclease de restrição (Hinf I – Promega, Inc.) por 4 horas a 37°C. Amostras de DNA de indivíduos previamente tipados foram incluídos para controle da atividade enzimática. As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida, seguida de coloração pela prata.
A angiografia coronariana foi realizada por técnica percutânea, via femoral, tendo sido os filmes examinados por três cardiologistas experientes e os laudos apresentados conforme critérios definidos pela redução dos diâmetros intraluminais da luz das artérias: até 30% de estenose foi classificada como ateromatose leve; de 30 a 69% de estenose foi classificada como ateromatose moderada e acima de 70% de estenose foi classificada como ateromatose grave.
Para os valores de homocisteína, a análise estatística foi realizada utilizando-se análise de variância (ANOVA) seguida de teste de Tukey, após transformação logarítmica dos dados. As variáveis categóricas (fatores de risco e mutação C677T) foram analisadas pelo teste exato de Fisher. Foi utilizado o teste de Spearman para analisar a correlação entre a presença da mutação (variável categórica) e os níveis plasmáticos de homocisteína (variável contínua). A correlação entre a presença de DAC (variável categórica) e a homocisteinemia (variável contínua) também foi analisada pelo teste de Spearman. O tamanho mínimo da amostra foi definido usando-se o coeficiente de variação descrito previamente na literatura19, considerando dez por cento de variação em torno da média, chegando a um número mínimo de onze indivíduos em cada grupo para que fossem demonstradas as possíveis diferenças estatísticas com um nível de significância de 5%. Os programas Sigma Stat versão 1.0 e Prism versão 3.0 foram utilizados para realizar as análises e plotar o gráfico, respectivamente.
A
Os resultados da dosagem de homocisteína também são apresentados na
A incidência da mutação C677T na enzima MTHFR nos grupos controle, ateromatose leve/moderada e ateromatose grave é apresentada na
Foi observada correlação positiva entre níveis elevados de homocisteína e a presença de DAC (r = 0,4191, p < 0,001). Entre os demais parâmetros não foram observadas correlações.
Este estudo de coorte transversal avaliou uma população de risco intermediário a elevado, já que todos os indivíduos selecionados foram encaminhados à cateterismo para avaliação de dor torácica e apresentaram perfil demográfico e fatores de risco para DAC conforme mostrado na
Vários estudos importantes foram publicados correlacionando níveis plasmáticos de homocisteína e DAC. Alguns demonstraram uma associação entre hiper-homocisteinemia e a incidência de DAC, enquanto outros relataram ausência de associação entre os dois parâmetros20. Algumas razões podem explicar os resultados controversos das pesquisas envolvendo a concentração de homocisteína e DAC: os fatores que afetam os níveis plasmáticos deste aminoácido são diferentes em cada população. Fatores como hábitos nutricionais, fatores genéticos, estilo de vida e raça podem afetar a concentração da homocisteína circulante6. Na população brasileira, que apresenta uma heterogeneidade de etnias21, os resultados das pesquisas envolvendo níveis plasmáticos de homocisteína e DAC são igualmente controversos. Torna-se oportuno ressaltar que a maioria dos autores considera a hiper-homocisteinemia um fator de risco independente para DAC22. A análise da
Folson e cols.14 sugeriram que níveis elevados de homocisteína poderiam ser uma conseqüência da DAC e não apenas a causa da doença. Esses autores também sugeriram que a hiper-homocisteinemia poderia prever mau prognóstico, refletindo a gravidade da DAC. Entretanto, a hipótese do aumento da concentração plasmática de homocisteína em conseqüência da lesão aterosclerótica não foi aceita por Boston & Selhub23, por não ser a mesma apoiada pela evidência epidemiológica de vários estudos. Os achados do presente estudo sinalizam que a hiper-homocisteinemia, se não apresenta contribuição para a gravidade da DAC nos indivíduos avaliados, no mínimo, está implicada no processo aterosclerótico. Porém, a dúvida persiste, ou seja, se o aumento da homocisteína é fator agravante para a doença ou se manifesta com o desenvolvimento do processo aterosclerótico. Estudos prospectivos com acompanhamento, envolvendo um grande número de indivíduos já apresentando hiper-homocisteinemia, porém ainda sem coronariopatia, são essenciais para esclarecer, com fidedignidade, a relação entre hiper-homocisteinemia e DAC.
O método utilizado no presente trabalho para a dosagem de homocisteína preconiza um valor de referência para esse parâmetro de 2 a 20 µmol/L. Outro ponto de controvérsia entre os autores são os valores de referência da concentração plasmática de homocisteína para a população em geral. Alguns autores consideram a concentração "normal" de homocisteína plasmática entre 5 e 15 µmol/L24-27, enquanto outros admitem que o valor médio na população em geral para a concentração de homocisteína está em torno de 9 a 10 µmol/L28,29. Boushey e cols.4 concluíram, em estudo de metanálise envolvendo 27 trabalhos e mais de quatro mil pacientes, que quando os valores de homocisteína são maiores que 10 µmol/L, cada 5 µmol/L acrescidos aos valores de homocisteína circulante estão associados a 80% de risco para DAC em mulheres e 60% em homens. Atualmente, valores iguais ou maiores que 10 µmol/L são considerados hiper-homocisteinemia e estão relacionados com risco aumentado de DAC30. Neste estudo, 72% dos pacientes com ateromatose grave apresentaram valores plasmáticos de homocisteína na faixa de referência do método utilizado. Observação semelhante foi feita por Gravina-Taddei e cols.31 analisando idosos com e sem doença coronária usando método semelhante ao deste trabalho.
Entre os 63 indivíduos que compuseram os grupos controle, ateromatose leve/moderada e ateromatose grave, a presença da mutação C677T no gene da enzima MTHFR em homozigose foi observada apenas em quatro indivíduos (
A mutação C677T no gene da enzima MTHFR foi mais freqüente em indivíduos com ateromatose grave (62,0%), entretanto, não foi demonstrada diferença significativa entre o grupo ateromatose grave e os demais grupos estudados. Uma possível explicação para este achado seria o fato de que multifatores estão relacionados com o aumento dos níveis de homocisteína e, considerando que o número de participantes avaliados no presente estudo foi insuficiente para qualquer conclusão nesse sentido, seria necessário um estudo epidemiológico e multicêntrico. Pisciotta e cols.33 demonstraram resultados semelhantes avaliando indivíduos com hipercolesterolemia e DAC, com uma maior prevalência da mutação em pacientes com DAC, porém sem diferença significativa em relação aos indivíduos não acometidos pela doença.
A correlação positiva observada entre níveis plasmáticos elevados de homocisteína e a presença de DAC (r = 0,4191, p < 0,001) no presente estudo está de acordo com a literatura34. Entretanto, não foi observada correlação entre a presença da mutação e níveis elevados de homocisteína na população estudada. Apesar de o grupo ateromatose grave ter apresentado a maior incidência da mutação e níveis significativamente mais elevados de homocisteína, este grupo não apresentou diferença significativa em relação aos demais grupos quanto à prevalência da mutação. Resultados semelhantes foram descritos por outros autores35,36. Logo, o aumento da homocisteína nestes casos deve ser explicado por outros mecanismos não explorados no presente trabalho.
Entre os indivíduos com DAC, considerando os participantes dos grupos ateromatose leve/moderada e ateromatose grave (n = 43), 22 apresentaram a mutação em heterozigose (51,1%) e 3 em homozigose (6,9%), não apresentando diferenças significativas em relação ao grupo controle. Por outro lado, Almawi e cols.37 obtiveram uma freqüência maior, de 71,9% da mutação em heterozigose nos pacientes com DAC e de 45,5% no grupo controle, com diferença significativa entre os dois grupos (p < 0,001). Esses autores demonstraram também uma incidência bem maior da mutação em homozigose (31,3%) em pacientes com ateromatose grave, quando comparada com a do presente estudo (6,9%). O pequeno contingente de amostra dos dados ora apresentados pode ter contribuído para a obtenção de dados discordantes com a literatura.
Neste estudo, não foi observada correlação entre a presença da mutação e a presença de ateromatose coronariana, considerando todos os indivíduos dos grupos ateromatose leve/moderada e ateromatose grave (n = 43). Folsom e cols.14 também demonstraram uma ausência de associação entre DAC e a mutação C677T no gene da enzima MTHFR, em estudo prospectivo envolvendo mais de 15.000 participantes. Da mesma forma, Kölling e cols.38 demonstraram ausência de associação entre a mutação e a presença de DAC angiograficamente estabelecida, em estudo caso-controle envolvendo 2.121 pacientes com DAC e 617 indivíduos angiograficamente normais. Os dois estudos citados demonstraram níveis significativamente elevados de homocisteína plasmática nos indivíduos com DAC quando comparados com o grupo controle, dados concordantes com o estudo ora apresentado.
Limitações do estudo - Apesar de o número de indivíduos avaliados ter sido suficiente para demonstrar diferença significativa para os níveis de homocisteína entre os grupos controle e ateromatose grave, os trabalhos da literatura utilizam um contingente amostral bem maior, principalmente para avaliar a associação entre a mutação C677T e DAC. Outro fator limitante foi que o presente estudo não considerou outros fatores importantes do metabolismo da homocisteína, tais como deficiências de outras enzimas também envolvidas neste metabolismo, hábitos nutricionais e as concentrações plasmáticas de vitamina B12 e ácido fólico dos indivíduos participantes, dados que poderiam enriquecer a discussão deste trabalho.
O achado mais importante deste estudo foi a associação entre hiper-homocisteinemia e a presença de estenose coronariana superior a 70%, entretanto permanece a dúvida se o aumento da concentração plasmática de homocisteína constitui um fator determinante para o agravamento da lesão aterosclerótica nas coronárias ou se o mesmo é uma conseqüência dessa lesão.
À Profa. Dra. Ângela Maria Quintão Lana, pelo auxílio na análise estatística. À Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio recebido.
Declaro não haver conflitos de interesses pertinentes.
Marinez Oliveira Sousa UFMG – Faculdade de Farmácia Av. Antônio Carlos, 6627 31270-901 Belo Horizonte, MG E-mail:
Artigo recebido em 23/01/06; revisado recebido em 08/03/06; aceito em 11/05/06.
OBJECTIVE: To determine plasma homocysteine levels and the incidence of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene C677T polymorphism in a group of subjects who underwent coronary angiography, in an attempt to establish a correlation between these parameters and the severity of coronary artery disease (CAD), as well as investigate the correlation between hyperhomocysteinemia and the presence of polymorphism. METHODS: Twenty subjects with no coronary atheromatosis (controls), fourteen subjects with mild/moderate atheromatosis, and twenty-nine subjects with severe atheromatosis were evaluated. RESULTS: Significant differences were observed in mean homocysteine levels between the control and the severe atheromatosis groups (p < 0.001). No significant differences were observed among the other groups. The severe atheromatosis group showed rates of 62.0% and 6.9% for the C677T MTHFR gene polymorphism, in heterozygous and homozygous subjects, respectively. However, there was no correlation between the presence of mutation and hyperhomocysteinemia. A positive correlation of 41.91% (p < 0.001) was found between hyperhomocysteinemia and CAD. CONCLUSION: The most important finding of this study was the association between hyperhomocysteinemia and coronary stenosis > 70%; yet, whether elevated plasma homocysteine worsens atherosclerosis or is a consequence remains to be established.
Homocysteine and methylenetetrahydrofolate reductase in subjects undergoing coronary angiography
Universidade Federal de Minas Gerais, Hospital Socor, Belo Horizonte, Minas Gerais - Belo Horizonte, MG - Brazil
Homocysteine (Hcy), an amino acid derived from methionine metabolism, is considered an independent risk factor for atherosclerosis. Studies demonstrate that increased homocysteine levels have toxic effects on vascular endothelium1. Homocysteine elevation has multifactorial causes, including high methionine intake, decreased metabolism, genetic changes, and enzyme (cystathionine b-synthase or methylenetetrahydrofolate reductase - MTHFR) or vitamin deficiency (B12, B6 and folic acid), all of them required for its metabolism. These factors may lead to homocysteine accumulation and, as a result, vascular endothelial damage2, thereby triggering atherosclerotic lesions. MTHFR is an enzyme involved in the transmethylation pathway by which homocysteine is converted to methionine. The C677T mutation in the MTHFR gene produces a thermolabile variant that may interfere in enzyme activity of homocysteine metabolic pathways, predisposing to hyperhomocysteinemia (HHcy)1,3. Subjects homozygous for MTHFR C677T mutation may show homocysteine plasma levels twice as high as those of heterozygous subjects4.
Some studies5-7 have demonstrated an association between hyperhomocysteinemia and peripheral vascular disease, cerebrovascular disease and CAD, showing that this amino acid concentration was significantly higher than that found in healthy subjects. Hyperhomocysteinemia, therefore, is considered a risk factor for the aforementioned clinical conditions. Investigations on different factors, such as smoking8, lipid profile9, advanced age10, arterial hypertension10, diabetes mellitus11, and obesity12, in addition to homocysteine, have shown that their plasma concentration may be regarded as independent risk factors for atherosclerotic disease. It should be noted that homocysteine values seem to be paramount also as predictors of mortality in CAD patients, besides showing a relationship with the degree of atherosclerosis13-15.
Considering all the above, this study sought to investigate whether there is an association between hyperhomocysteinemia and C667T polymorphism in the gene encoding the MTHFR enzyme, as well as measure homocysteine plasma levels in angiographically diagnosed CAD patients and compare them with normal subjects, in an attempt to correlate possible changes with the severity of the lesion.
Sixty-three subjects of both genders, ages ranging from 46 to 68, were evaluated. These subjects were selected during three months at the Hemodynamics Department of the Hospital Socor in Belo Horizonte, Minas Gerais, after undergoing coronary angiography. Patient selection emphasized homogeneity in terms of gender, age, socioeconomic status, and body mass index (BMI). Subjects were divided into three groups based on coronary angiography results: control (n = 20), mild/moderate atheromatosis (n = 14), and severe atheromatosis (n = 29). The study protocol was approved by the Research Ethics Committees of Hospital Socor and the Federal University of Minas Gerais.
All selected subjects were informed about the study’s objectives, and those who agreed to participate signed an informed consent. Cardiologists at the Hemodynamics Department filled out a case report form on each subject containing identification, demographic data, family history, and coronary angiography results.
Patients with intercurrent diseases, such as coagulation disorders, renal, liver and autoimmune diseases, and cancer, were excluded from the study.
The presence of smoking, sedentariness, and family history of CAD was established according to the recommendations of the III Brazilian Guidelines for Dyslipidemias and Atherosclerosis Prevention16. Subjects previously diagnosed with diabetes mellitus and fasting glucose
Venous blood samples were collected after a twelve-hour fast. These patients were instructed to refrain from vigorous physical activity and avoid drinking alcohol 24 and 72 hours, respectively, preceding blood collection, in an attempt to obtain biological samples of patients in metabolic steady state. Ten mL venous blood samples (5 mL without anticoagulant and 5 mL in EDTA) were collected into Vacutainer® tubes (Becton Dickinson). Blood samples without anticoagulant were immediately centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes; the separated serum was aliquoted and stored at – 70 °C until homocysteine measurement. The DNA was extracted from the blood samples containing EDTA, which remained stored at – 20 °C until genetic analysis was performed.
Serum homocysteine was measured using the Axsym® Homocysteine assay (Abbott® Laboratories – Germany) based on polarized immunofluorescence technology, according to the manufacturer’s instructions. The assay was performed in the Axsym® (Abbott® Laboratories – Germany) analyzer using three commercial control sera in order to check its performance. Presence of C677T mutation in the MTHFR enzyme was investigated by PCR-RFLP using oligonucleotides and restriction endonucleases described previously3. PCR reactions were performed in a PT100 PCR thermal cycler (MJ Research, Waltham, USA) using 1 pMol from each primer (Invitrogen®, São Paulo, S.P), 0.2 mM dNTPs (GIBCO BRL®, São Paulo, SP), and 1 unit of Taq polymerase (Phoneutria®- Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil). PCR reactions were run for 40 cycles, each consisting of one minute at 94 °C for denaturation, one minute at 64 °C (C677T) for primer annealing, and two minutes at 72 °C for primer extension. The PCR products were digested with restriction endonuclease (Hinf I - Promega, Inc.) during four hours at 37 ºC. DNA samples from previously typed subjects were included for enzyme activity control. These samples were then analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis followed by silver staining.
Coronary angiography was performed percutaneously via femoral approach. The angiographic films were interpreted by three experienced cardiologists, and reports were presented according to criteria defined by reduced luminal diameter: up to 30% stenosis was classified as mild atheromatosis; 30% to 69% stenosis was classified as moderate atheromatosis, and greater than 70% stenosis was classified as severe atheromatosis.
For homocysteine values, statistical analysis was performed using analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s test, after logarithmic data transformation. Categorical variables (risk factors and C677T mutation) were analyzed using Fisher’s exact test. Spearman’s test was used for correlation between mutation status (categorical variable) and plasma homocysteine (continuous variable) and between CAD (categorical variable) and homocysteinemia (continuous variable). Minimum sample size was defined by the variation coefficient previously described in the literature19, considering ten percent variation for the mean and reaching a minimum of eleven subjects in each group, so that potential statistical differences with 5% significance level would be demonstrated. Sigma Stat 1.0 and Prism 3.0 software were used to carry out the analysis and plot the graph, respectively.
Homocysteine measurements are also presented in
The incidence of MTHFR C677T mutation in the control, mild/moderate, and severe atheromatosis groups is shown in
Positive correlation was found between high homocysteine levels and CAD (r = 0.4191, p < 0.001). No correlation was found among the other parameters.
This cross-sectional cohort study assessed an intermediate-to-high risk population, since all selected subjects were referred for catheterization due to chest pain and presented demographic profile and risk factors for CAD, as shown in
A number of landmark studies were published that correlate plasma homocysteine levels and CAD. Some have demonstrated an association between hyperhomocysteinemia and CAD incidence, while others reported lack of association between the two parameters20. These controversial results involving homocysteine concentration and CAD may be explained by the fact that some factors that affect this amino acid’s plasma levels differ in each population. Homocysteine circulating levels may be affected by dietary habits, genetic factors, lifestyle, and race6. In the Brazilian population, characterized by ethnic heterogeneity21, the results of studies involving plasma homocysteine levels and CAD are equally controversial. It is well to point out that most authors consider hyperhomocysteine as an independent risk factor for CAD22.
Folson et al14 suggested that elevated homocysteine levels may be a consequence, not only a cause, of CAD. These authors also suggested that hyperhomocysteinemia may predict a poor prognosis, reflecting CAD severity. However, the hypothesis of increased homocysteine plasma levels as a result of atherosclerotic lesion was refuted by Bostom & Selhub23, because it is not supported by the epidemiological evidence of several studies. This study’s findings indicate that if hyperhomocysteinemia did not contribute to worsen CAD in the assessed subjects, at least it was implicated in the atherosclerotic process. Questions remain, however, as to whether increased homocysteine is an aggravating factor for the disease or manifests itself with the development of the atherosclerotic process. Prospective studies with follow-up involving a large number of subjects with known hyperhomocysteinemia but no coronary disease are essential to authoritatively elucidate the relationship between hyperhomocysteinemia and CAD.
In the present study, the method used for homocysteine measurement advocates a reference value for this parameter ranging from 2 to 20 µmol/L. Also controversial among authors are the reference values for plasma homocysteine in the general population.
Some authors regard plasma homocysteine between 5 and 15 µmol/L24-27 as "normal", while others believe that the mean value in the general population is around 9 to 10 µmol/L28,29. Boushey et al4, in a meta-analysis involving 27 studies and more than four thousand patients, concluded that when homocysteine values are greater than 10 µmol/L, each 5µmol/L increment in circulating homocysteine concentration is associated with an 80% CAD risk in women and 60% in men. Currently, values equal to or greater than 10µmol/L are considered hyperhomocysteinemia and linked to increased risk for CAD30. In this study, 72% of the patients with severe atheromatosis had plasma homocysteine within the reference range of the method used. Similar observation was made by Gravina-Taddei et al31, who analyzed elderly people with and without coronary disease using a method similar to that of this study.
Among the 63 subjects that comprised the control, mild/moderate atheromatosis and severe atheromatosis groups, the presence of homozygous C677T MTHFR mutation was found in only four subjects (
The C677T mutation in the MTHFR gene was more frequent in subjects with severe atheromatosis (62.0%); yet, there was no significant difference between the severe atheromatosis group and the others. A possible explanation for this finding is that several factors are related to plasma homocysteine elevation, and since the number of participants evaluated in this study was insufficient to draw any conclusion in this respect, a multicenter, epidemiological study is needed. Pisciotta et al33 obtained similar results when evaluating subjects with hypercholesterolemia and CAD, with greater prevalence of mutation in patients with CAD, although with no significant difference relative to those without CAD.
The positive correlation observed between increased plasma homocysteine and CAD (r = 0.4191, p < 0.001) in the present study is in keeping with literature34. However, there was no correlation between the presence of C677T mutation and high levels of homocysteine in the population studied. Although the severe atheromatosis group was found to have higher mutation incidence and significantly higher plasma homocysteine levels, no significant difference was observed when compared with the other groups. Other authors reported similar results35,36. Therefore, homocysteine elevation in these cases should be explained by other mechanisms that were not examined in this study.
Among the CAD subjects, mild/moderate atheromatosis and severe atheromatosis groups considered, (n = 43); 22 had heterozygous mutation (51.1%) and three had homozygous mutation (6.9%), with no significant differences when compared with the control group. On the other hand, Almawi et al37 found higher frequency (71.9%) of heterogygous mutation in patients with CAD and 45.5% in the control group, with a significant difference between both groups (p < 0.001). These authors also demonstrated a significant higher incidence of homozygous mutation (31.3%) in patients with severe atheromatosis, compared to the present study (6.9%). The small sample size herein presented may have contributed to our data being discordant with that reported in the literature.
In this study, no correlation was found between mutation and coronary atheromatosis, all subjects from the mild/moderate atheromatosis and severe atheromatosis groups considered (n = 43). Folsom et al14, in a prospective study involving more than 15.000 participants, also demonstrated the lack of association between CAD and MTHFR C677T mutation. Likewise, Kölling et al38, in a case-control study involving 2121 CAD patients and 617 non-CAD patients, demonstrated a lack of association between mutation and angiographically documented CAD.
Both studies mentioned above have demonstrated significantly elevated plasma homocysteine levels in CAD subjects, as compared with the control group, and these data are consistent with those of the present study.
The most important finding of this study was the association between hyperhomocysteinemia and coronary stenosis > 70%; yet, whether elevated plasma homocysteine worsens atherosclerosis or is a consequence remains to be established.
To Professor Ângela Maria Quintão Lana, PhD, for the statistical analysis. To Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG), RECOPE (FAPEMIG/FIEMG/IEL-number 32082), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), and the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) for their support.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
Marinez Oliveira Sousa UFMG – Faculdade de Farmácia Av. Antônio Carlos, 6627 31270-901 – Belo Horizonte, MG - Brazil E-mail:
Manuscript received January 23, 2006; revised manuscript received March 8, 2006; accepted May 11, 2006.