OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi avaliar a reparação óssea em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e compará-la com a de ratos normotensos, avaliando machos e fêmeas. MÉTODOS: Um defeito ósseo foi criado no fêmur esquerdo de 24 SHR (12 machos e 12 fêmeas) e 24 ratos normotensos (12 machos e 12 fêmeas). Os animais foram divididos em dois grupos com diferentes períodos de sacrifício: sete e 21 dias após o procedimento cirúrgico. Após processamento laboratorial de rotina, as análises histológica e histométrica foram realizadas e os dados submetidos à análise de variância (ANOVA) e ao teste de Tukey (5%). RESULTADOS: Machos e fêmeas do mesmo grupo apresentaram características histológicas similares. Após sete dias, todos os animais apresentaram trabéculas ósseas irregulares, entretanto, os osteoblastos periosteais eram achatados nos SHR, enquanto nos normotensos, essas células apresentavam formato cúbico. Após 21 dias, todos os espécimes mostraram fechamento linear em toda a extensão superficial do defeito ósseo e os SHR apresentaram osteoblastos achatados, enquanto os normotensos apresentaram células cúbicas circundando as trabéculas ósseas. A análise estatística dos dados histométricos indicou médias similares entre machos e fêmeas, exceto para ratos normotensos, aos sete dias. Além disso, aos 21 dias, foi observada maior neoformação óssea nos ratos hipertensos quando comparados aos normotensos, tanto machos quanto fêmeas. CONCLUSÃO: Concluiu-se que os animais SHR apresentaram maior neoformação e maturidade óssea nos defeitos que animais normotensos, no período de 21 dias após a cirurgia.
Reparação de defeitos ósseos em fêmures de ratos machos e fêmeas espontaneamente hipertensos. Estudo histológico e histométrico
Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho – UNESP - São José dos Campos, SP
A hipertensão arterial sistêmica é um dos maiores problemas mundiais de saúde. Determinadas patologias ósseas podem ser agravadas em hipertensos devido ao seu padrão de regulação do cálcio, o qual induz à perda óssea, tanto em humanos hipertensos1-3, quanto em ratos espontaneamente hipertensos (SHR)4-6. Desse modo, a densidade mineral óssea (BMD), encontra-se reduzida em humanos hipertensos1-3 e nos SHR4-6 quando comparados aos controles normotensos.
Apesar da possibilidade desta patologia atingir ambos os sexos, a maioria dos estudos experimentais foi realizada em ratos machos. Liang e cols.7 afirmaram que são necessárias investigações mais detalhadas do comportamento ósseo em fêmeas de ratos, devido ao fato de que, em humanos, a osteoporose é mais prevalente em mulheres do que em homens.
É evidente a relação entre a hipertensão e o metabolismo ósseo, entretanto, o processo de reparo ósseo em hipertensos é pouco conhecido. Desse modo, o objetivo deste estudo foi avaliar, histológica e histometricamente, o processo de reparação óssea em ratos espontaneamente hipertensos, de ambos os sexos, comparando-o com animais normotensos.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética desta Faculdade (Protocolo n° 051/2002 PA/CEP).
Um defeito ósseo monocortical (2 mm) foi criado no local de maior diâmetro da região proximal da diáfise do fêmur esquerdo de 48 ratos (24 hipertensos e 24 normotensos). Sete dias após a cirurgia, 12 animais normotensos e 12 SHR (seis machos e seis fêmeas) foram sacrificados. Os animais remanescentes foram sacrificados 21 dias após a cirurgia de confecção do defeito.
Após o sacrifício, os fêmures foram removidos, fixados em solução de formaldeído a 10% e descalcificados na solução de Plank-Rychlo. Após o processamento histológico, foram obtidos cortes de aproximadamente 5 µm de espessura, os quais foram corados com hematoxilina e eosina (HE).
As lâminas coradas com HE foram então examinadas sob microscopia de luz e os aspectos histológicos do osso neoformado foram avaliados, baseando-se na remodelação das trabéculas ósseas imaturas, na morfologia dos osteoblastos e dos osteócitos e nas características do periósteo.
Para a análise histométrica, cinco cortes por animal foram selecionados e fotografados na sua área central. As mensurações foram realizadas usando um retículo confeccionado por meio de um programa de análise de imagens (Image-J 1.32 for Windows; National Institutes of Health, Bethesda, USA), contendo 100 pontos de intersecção eqüidistantes (área total: 3.000 (µm2). O retículo era então posicionado sobre a imagem e eram contados os pontos que se sobrepunham às trabéculas ósseas neoformadas (
No período de sete dias, todos os animais apresentaram a área do defeito preenchida por trabéculas ósseas delicadas e entrelaçadas (
Os animais normotensos apresentaram, na sua maioria, hemácias formando um coágulo na superfície de tecido conjuntivo fibroso (
Após 21 dias da cirurgia, todos os espécimes foram caracterizados por uma camada de osso neoformado unindo as bordas do defeito, como uma ponte (
Ainda aos 21 dias, as trabéculas ósseas dos animais normotensos apresentavam-se recobertas por osteoblastos cúbicos enquanto células achatadas recobriam as trabéculas ósseas dos SHR (
Os dados foram submetidos à ANOVA (3 fatores) para avaliar a relação entre a presença da hipertensão, o sexo e o período de sacrifício. O efeito interação entre todas as variáveis não foi significante (p = 0,33).
O teste de Tukey (5%) foi realizado e a formação dos grupos homogêneos foi representada na
A análise estatística mostrou que as médias da porcentagem de osso neoformado foram similares entre machos e fêmeas, exceto para os ratos normotensos avaliados aos sete dias. É possível ainda afirmar que a condição em que ocorreu uma maior porcentagem de neoformação óssea foi nos animais hipertensos aos 21 dias, tanto machos quanto fêmeas.
No presente trabalho, comparou-se a reparação de defeitos ósseos no fêmur de ratos normotensos e hipertensos, de ambos os sexos, aos sete e 21 dias. No período mais curto, houve semelhança na neoformação óssea entre normotensos e hipertensos, sendo o defeito de todos os espécimes preenchido por trabéculas ósseas imaturas. Aos 21 dias, houve o fechamento linear de ambos os grupos, porém, a quantidade de osso neoformado na região do defeito foi maior nos hipertensos. Em adição, não foram notadas diferenças entre animais machos e fêmeas dentro de um mesmo grupo.
Os SHR apresentam uma alteração no processo de
Devido às alterações metabólicas ósseas, como o baixo teor de cálcio e aumento das taxas de reabsorção, animais SHR poderiam ser caracterizados como animais osteopênicos5,8 ou osteoporóticos9. Nos animais normotensos osteoporóticos, o reparo ósseo é considerado deficiente quando comparado ao de animais normai10-13.
Apesar desse fato, no presente estudo observamos que, 21 dias após a confecção do defeito, a reparação óssea nos SHR foi mais expressiva, histológica e histometricamente, que a observada nos animais normotensos.
Aos 21 dias após a confecção do defeito ósseo, os SHR apresentaram maior porcentagem de osso neoformado que os normotensos, tanto machos quanto fêmeas, e histologicamente exibiram osteoblastos achatados na periferia das trabéculas ósseas, caracterizando um aspecto quiescente dos mesmos14,15. Esse fato leva-nos a supor que nos SHR os osteoblastos reduziram ou até mesmo cessaram a produção de matriz óssea, nesse período, enquanto que, nos animais normotensos, os osteoblastos volumosos ainda estavam ativos e poderiam produzir matriz por um período maior. Conseqüentemente, podemos supor que, num período experimental mais longo, a reparação óssea nos SHR poderia ser menor que a observada em animais normotensos.
No período de sete dias, quando comparamos os normotensos com os SHR, constatamos que não houve diferença na quantidade de osso neoformado. Entretanto, algumas características histológicas distintas foram notadas entre os grupos. Na maioria dos SHR não foram observados focos de hemorragia na região superficial do defeito, sugerindo uma aceleração na substituição do coágulo por tecido de granulação. Além disso, a presença de osteoblastos achatados no periósteo dos animais hipertensos, também sugere um processo mais adiantado de reparação nesses animais, quando comparados aos normotensos.
Fatores ligados a neoformação, degradação ou inflamação tecidual, podem exercer papel importante durante a reparação tecidual. Artigos recentes têm investigado o papel da angiotensina II (Ang II) nos processos de inflamação e reparação tecidual16-18. Desse modo, a maior formação óssea nos animais hipertensos, aos 21 dias após a confecção do defeito, poderia ter ocorrido devido a outros fatores metabólicos, que não os ósseos.
Humanos hipertensos apresentam níveis aumentados de Ang II, a qual está relacionada com etapas iniciais do processo da inflamação, pelo recrutamento de células inflamatórias19,20, e também com a reparação e remodelação tecidual, pelo crescimento celular e síntese de matriz21. Estudos recentes,
Já em cultura de células semelhantes a osteoblastos, a Ang II estimula a proliferação celular, pela síntese de DNA23,24, e aumenta a formação de colágeno pelas células osteogênicas24.
Desse modo, pode-se supor que os níveis aumentados de Ang II (presentes na hipertensão) poderiam estimular a formação da matriz óssea nos SHR. Entretanto, é questionável o grau de mineralização do tecido neoformado, visto que Hagiwara e cols.25 demonstraram que a Ang II reduz o processo de mineralização da matriz formada por osteoblastos
As diferenças entre as características ósseas de machos e fêmeas SHR são pouco relatadas na literatura. DeMoss e Wright26 avaliaram o peso seco e o conteúdo de cálcio no esqueleto de machos e fêmeas, normotensos e SHR, e verificaram que a massa esqueletal seca apresentou maiores valores nos animais fêmeas em relação aos machos; entretanto, o conteúdo de cálcio por unidade esqueletal foi semelhante entre os vários grupos. Já Wright e DeMoss29 observaram um aumento na reabsorção óssea nos SHR fêmeas. No entanto, nossos achados mostraram médias de neoformação óssea similares entre os sexos, além de características histológicas semelhantes.
Desse modo, conclui-se que: a presença da hipertensão interfere no processo de reparação óssea em ratos, visto que, após 21 dias do procedimento cirúrgico, a porcentagem de formação óssea em animais hipertensos é maior do que a observada em animais normotensos, apesar de não existir diferença entre o processo de reparo de defeitos ósseos entre machos e fêmeas da mesma linhagem.
Andresa Costa Pereira Av. Engenheiro Francisco José Longo, 777 12245-000 – São José dos Campos, SP E-mail:
Artigo recebido em 27/10/05; revisado recebido em 19/04/06; aceito em 01/06/06.
OBJECTIVE: The aim of this study was to evaluate the bone healing in spontaneously hypertensive rats (SHR) and compare the results with normotensive rats, evaluating male and female animals. METHODS: A bone drill defect was created in the left femur of 24 SHR (12 males and 12 females) and 24 normotensive rats (12 males and 12 females). The animals were divided into two groups and sacrificed 7 and 21 days after the surgical procedure. After the routine laboratory processing, histological and histometric analysis were carried out and data were submitted to ANOVA and Tukey’s test (5%). RESULTS: Males and females from the same group had similar histological characteristics. After seven days, all animals presented irregular bone trabeculae. The periosteal osteoblasts were flattened in SHR, and presented a cuboid shape in normotensive animals. After 21 days, the bone defects of all specimens showed a linear closure in all the superficial extension. In addition, SHR presented flattened osteoblasts surrounding the bone trabeculae, while normotensive ones showed cuboidal cells. Statistical analysis of the histometric data indicated similar means between the male and female groups, except for normotensive rats on day 7. In addition, a larger amount of new bone formation was observed in hypertensive when compared to normotensive rats on day 21, in males as well as females. CONCLUSION: We conclude that bone healing in SHR was more significant than in normotensive ones, as shown by the histological and histometric evaluation 21 days after surgery.
Bone healing in drill hole defects in spontaneously hypertensive male and female rats' femurs. A histological and histometric study
Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho – UNESP - São José dos Campos, SP, Brazil
Systemic arterial hypertension is one of the most important world’s health problems. Some bone pathologies may be aggravated in hypertensive individuals due to their pattern of calcium regulation, which induces bone loss in hypertensive human individuals1-3 as well as in spontaneously hypertensive rats (SHR)4-6. Thus, bone mineral density (BMD) is reduced in hypertensive humans1-3 and in SHR4-6, when compared to normal normotensive controls.
Despite the possibility that this pathology can affect both sexes, most experimental studies were carried out in male rats. Liang et al7 stated that more detailed investigations of bone behavior in female rats were necessary, due to the fact that, in humans, osteoporosis is more prevalent in women than in men.
The connection between hypertension and bone metabolism is evident; however, the process of bone repair in hypertensive individuals is little known. Hence, the aim of this study was to evaluate, histological and histometrically, the process of bone repair in SHR of both sexes, comparing the results to those obtained from normotensive animals.
This study was approved by the Ethics Committee of the Institution (Protocol # 051/2002 PA/CEP).
A monocortical bone defect (2mm) was created in the local of largest diameter in the proximal region of the left femur diaphysis of 48 rats (24 hypertensive and 24 normotensive rats). Seven days after the surgery, 12 normotensive rats and 12 SHR (six males and six females from each group) were sacrificed. The remaining animals were sacrificed 21 days after the surgery that created the bone defect.
After the sacrifice, the femurs were removed, fixed in a 10% formaldehyde solution and decalcified in a Plank-Rychlo’s solution. After histological processing, 5 µm thick slices were obtained, which were hematoxylin-eosin (HE) stained.
The HE-stained slides were then examined under light microscopy and the histological aspects of the neoformed bone were evaluated, based on the remodeling of the immature bone trabeculae, the morphology of the osteoblasts and osteocytes and the periosteum characteristics.
For the histometric analysis, five slices per animal were selected and photographed in their central area. The measurements were performed using a reticulum created by an image analysis program (Image-J 1.32 for Windows; National Institutes of Health, Bethesda, USA), containing 100 equidistant intersection points (total area: 3,000µm2). The reticulum was then placed on the image and the points that overlapped the neoformed bone trabeculae were counted (
On the 7th day post-surgery, all animals presented the defect area filled by delicate and intertwined bone trabeculae (
The normotensive animals presented, in their majority, red blood cells forming a clot on the surface of the fibrous conjunctive tissue (
Twenty-one days after the surgery, all specimens were characterized by a layer of neoformed bone joining the borders of the defect, as a bridge (
Still on day 21, the bone trabeculae of the normotensive animals showed to be recovered by cuboid osteoblasts while flattened cells recovered the bone trabeculae of SHR (
The data were submitted to ANOVA (3 factors) to evaluate the association between the presence of hypertension, gender and the sacrifice period. The interaction effect among all variables was not significant (p=0.33).
Tukey’s test (5%) was performed and the formation of homogeneous groups is represented in
The statistical analysis showed that the means of neoformed bone percentage were similar for males and females, except for the normotensive rats on day 7. It is possible to state that the condition in which there was a higher percentage of bone formation was that disclosed by hypertensive animals on day 21, in males as well as in females.
The present study compared the healing of bone defects in the femurs of normotensive and hypertensive rats of both sexes, on days 7 and 21, post-surgically. At the shortest period, bone neoformation was similar between normotensive and hypertensive animals, with the defect being filled by immature bone trabeculae in all specimens. On day 21, there was a linear closure of both groups; however, the amount of neoformed bone in the defect region was higher for the hypertensive animals. Additionally, there were no differences between males and females from a same group.
The SHR presented an alteration in the process of bone turnover, when compared to the normotensive ones5,8,9. Despite the knowledge of these data, we did not find studies in literature that compared the process of bone healing between SHR and normotensive ones.
Due to the bone metabolic alterations, such as low calcium content and increased resorption rates, SHR could be characterized as osteopenic5,8,9 or osteoporotic9 animals. In osteoporotic normotensive animals, bone healing is considered deficient when compared to that of normal animals10-13.
Nevertheless, in the present study we observed that, 21 days after the bone defect was created, bone healing in the SHR was more significant, histological and histometrically, than that observed in normotensive animals.
Twenty-one days after the bone defect was created, male and female SHR presented a higher percentage of neoformed bone than the normotensive animals of both sexes, and histologically, the first presented flattened osteoblasts in the periphery of the bone trabeculae, characterizing their quiescent aspect14-15. This fact led us to suppose that in SHR, the osteoblasts reduced or even ceased the production of bone matrix during this period, whereas in the normotensive animals, the large osteoblasts were still active and could reproduce the matrix for a longer period. Consequently, we can suppose that, over a longer experimental period, bone healing in SHR might be inferior to the one observed in normotensive animals.
At the end of the 7-day period, no difference was observed regarding the amount of neoformed bone when the normotensive animals were compared to the SHR. However, some distinct histological characteristics were observed between the groups. Most of the SHR did not show hemorrhagic sources in the superficial area of the defect, suggesting an accelerated substitution of blood clots by granulation tissue. In addition, the presence of flattened osteoblasts in the periosteum of hypertensive animals also suggests a more advanced healing process in these animals, when compared to the normotensive ones.
Factors related to tissue neoformation, degradation or inflammation can exert a major role during tissue repair. Recent studies have investigated the role of angiotensin II (Ang II) in the inflammation and tissue repair processes16-18. Thus, the higher amount of bone formation in hypertensive animals on day 21 after the creation of the defect might have occurred due to other metabolic factors, apart from the bone-related ones.
Hypertensive humans present increased levels of Ang II, which is related with the initial phases of the inflammation process through the recruiting of inflammatory cells19,20, and also with tissue repair and remodeling through cell growth and matrix synthesi21. Recent
In cultures of cells that are similar to osteoblasts, Ang II stimulates cell proliferation by DNA synthesis23,24 and increases the formation of collagen by the osteogenic cells24.
Therefore, one can hypothesize that the increased levels of Ang II (present in hypertension) could stimulate the formation of bone matrix in SHR. However, the degree of mineralization of the neoformed tissue is questionable, as Hagiwara et al25 demonstrated that Ang II reduces the process of mineralization of the matrix formed by osteoblasts
The differences between the bone characteristics of male and female SHR are scarcely reported in literature. DeMoss et al26 evaluated the dry weight and calcium content in the skeleton of male and female normotensive and SHR rats, and observed that the dry skeletal mass presented higher values in females when compared to males; however, the calcium content per skeletal unit was similar among the different groups. On the other hand, Wright et al9 observed an increase in bone resorption in female SHR, while our findings showed similar bone neoformation means between the genders, as well as similar histological characteristics.
Therefore, we conclude that the presence of hypertension interferes in the process of bone healing in rats, considering that 21 days after the surgical procedure, the percentage of bone formation in hypertensive rats was higher than that observed in normotensive animals, although there was no difference between the healing process of bone defects between males and females from the same lineage.
Andresa Costa Pereira Faculdade de Odontologia de São José dos Campos Av. Engenheiro Francisco José Longo, 777 12245-000 – São José dos Campos, SP, Brazil E-mail:
Manuscript received October 27, 2005; revised manuscript received April 19, 2006; accepted June 1, 2006.