ARTIGO ORIGINAL

Controle microbiológico em valvas cardíacas humanas

Angela Maria Peruzzo; Francisco Diniz Affonso da Costa; Wanda Moscalewski Abrahão

Cardioprótese - Ind. e Com. de Produtos para Saúde, Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Universidade Federal do Paraná – Passo Fundo, RS

Correspondência

RESUMO

OBJETIVO: Avaliar, sob o aspecto microbiológico, valvas processadas pelo Banco de Valvas Cardíacas Humanas da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de Curitiba, para serem utilizadas em cirurgias cardiovasculares.

MÉTODOS: Foi avaliado o processamento de 1.671 valvas, no período de junho de 1999 a junho de 2004. Das valvas e soluções envolvidas no processo foram coletadas amostras e semeadas nos meios de cultura: meio líquido tioglicolato, caldo soja tripticaseína e caldo Sabouraud, com quatorze dias de incubação, utilizando a metodologia modificada baseada na Farmacopéia Brasileira 1998 e USP 1990 (United States Pharmacopeia). Nas amostras que apresentaram crescimento foram realizadas as identificações microbianas.

RESULTADOS: Em um total de 1.671 amostras analisadas, 92% foram consideradas próprias para utilização, sob o aspecto microbiológico, uma vez que não apresentaram contaminação microbiana. Somente 8% não foram liberadas para uso clínico por motivo de contaminação em alguma etapa do processamento da valva.

CONCLUSÃO: Analisando os resultados, observou-se a importância do controle microbiológico em enxertos humanos, evitando a utilização de valvas com contaminação microbiológica em pacientes submetidos à cirurgia cardiovascular.

Palavras-chave: Valvas cardíacas, homoenxertos, aloenxertos

A preocupação com a qualidade de maneira em geral tem sido uma constante para o ser humano. Quando essa qualidade está relacionada a produtos para saúde, envolve cuidados e conhecimentos ainda maiores, principalmente em se tratando de materiais invasivos como os aloenxertos.

O primeiro relato da utilização de aloenxerto data de 1948, quando tecido humano obtido de cadáver foi implantado por Gross et al., que utilizaram segmentos arteriais^1,2.

A primeira implantação de valva humana na posição aórtica ocorreu em 24 de julho de 1962, realizada pelo Dr. Donald Ross, em Londres, no Hospital Guys³.

Com a finalidade de garantir a qualidade dos tecidos processados e o controle de sua distribuição foi fundada, em 1976, a Associação Americana dos Bancos de Tecidos⁴.

No Brasil, a Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de Curitiba – Hospital de Caridade dispõe de um o Banco de Valvas Cardíacas Humanas que recebe os tecidos das Centrais de Transplantes, as quais detêm o controle da captação e utilização das valvas em todo o território nacional. Esse Banco está cadastrado no Ministério da Saúde de acordo as determinações da Portaria n.333/GM, de 24 de março de 2000⁵.

Visando oferecer aos pacientes um substituto valvar com qualidade, o Banco de Valvas processa e estoca valvas humanas obtidas de doadores saudáveis, seguindo a metodologia preconizada pelo Manual de Qualidade do Banco de Valvas Cardíacas Humanas da Santa Casa de Misericórdia de Curitiba.

O controle microbiológico foi realizado em todas as etapas do processamento para quantificar e qualificar os microrganismos encontrados durante o manuseio das valvas, selecionando aquelas que se apresentam isentas de contaminação.

O objetivo do trabalho foi relatar os resultados microbiológicos encontrados na solução transporte até a criopreservação de cada valva, no período de julho de 1999 a julho de 2004.

Métodos

O controle microbiológico foi realizado durante o processamento de 1.671 valvas removidas de corações de doadores sadios.

Após a coleta (feita por equipe médica, de acordo com procedimentos pré-estabelecidos), cada coração foi submerso em solução fisiológica (solução transporte = ST) e enviado ao Banco de Valvas Cardíacas Humanas da Santa Casa (BHSC) entre 2 e 8ºC.

O processamento das valvas seguiu instruções do protocolo do Banco de Valvas Cardíacas Humanas da Santa Casa de Misericórdia de Curitiba e foi realizado em fluxo laminar classe 100. Para inoculação das amostras foram preparados três diferentes meios de cultura (utilizando a metodologia modificada baseada na Farmacopéia Brasileira 1988 e da United States Pharmacopeia 1990^6,7): meio líquido de Tioglicolato visando ao crescimento de bactérias aeróbias e anaeróbias; caldo Soja Tripticaseína (TSB), para o crescimento de bactérias aeróbias; e caldo Sabouraud, para o crescimento de fungos^6-9.

As amostras foram coletadas nas seguintes etapas:

Etapa 1 – Preparo da solução para esterilização (SE): constituída de 400 ml de RPMI (Gibco) e antibióticos (cefoxitina: 240 µg/ml, lincomicina: 120 µg/ml, polimixina B: 100 µg/ml e vancomicina: 50 µg/ml). Após o preparo da solução foram retirados 3 ml da solução e foi semeado 1 ml em cada 5 ml dos diferentes meios de cultura. Depois de preparada a solução foi deixada em geladeira até o momento o uso. RPMI: Roswell Park Memorial Institute¹⁰.

Etapa 2 – Inoculação da solução transporte: antes da dissecção, foram retirados assepticamente 3 ml da solução transporte e foi semeado 1 ml em cada um dos meios de cultura. Em seguida foi feita a dissecção da valva. Após a dissecção, foram retirados três fragmentos (amostras) do músculo e da parede de cada valva, com aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm cada. Em seguida, cada valva e seus respectivos fragmentos foram colocados separadamente em recipientes contendo 200 ml da SE (previamente preparada na Etapa 1), permanecendo entre 2 e 8ºC durante 24 horas.

Etapa 3 – Transcorridas as 24 horas as valvas foram congeladas, mas, antes, foi preparada a solução para congelamento (SC), constituída de 200 ml de RPMI + 25 ml de DMSO (dimetilsulfóxido - MercK) e 25 ml de SFB (soro Fetal Bovino - Gibco). Foram retirados assepticamente 3 ml da SC e foi semeado 1 ml em cada um dos meios de cultura.

Etapa 4 – Inoculação das amostras sólidas (Etapa chamada de esterilização: E): as valvas e os fragmentos foram retirados da SE e lavados com solução fisiológica. Os fragmentos foram semeados nos diferentes meios de cultura (um pedaço do músculo e um pedaço da parede de cada valva para cada meio utilizado).

Etapa 5 – Inoculação da etapa do congelamento (C): em seguida, cada valva foi introduzida em uma bolsa, contendo 100 ml da SC (previamente preparada na Etapa 3). Após cada valva entrar em contato com a solução, antes de selar a bolsa foram retirados 3 ml da solução e foi semeado 1 ml em cada um dos meios de cultura. Os meios de cultura foram incubados por um período de quatorze dias, e os meios líquidos de Tioglicolato e TSB permaneceram a uma temperatura de 35°C e o caldo Sabouraud em temperatura de 22°C^6-9. Nas amostras positivas para os meios líquidos Tioglicolato e TSB foram realizados isolamentos em meios Mac Conkey⁹ (Gram-negativos) e Ágar Sangue⁹ de carneiro (Gram-positivos e negativos), as identificações foram através de automação no microScan Walk Away 40 – Dade Behring. Para amostras positivas em caldo Sabouraud os isolamentos foram feitos em Ágar Sabouraud⁹ e as identificações manuais, através de tubos germinativos e microscopia.

Resultados

Em um total de 1.671 amostras analisadas, 1.535 (92%) foram consideradas adequadas e 136 (8%) inadequadas sob o aspecto microbiológico (fig.1).

Foram consideradas amostras adequadas aquelas que não apresentaram crescimento microbiano nas diferentes etapas, bem como ausência de crescimento após a etapa de esterilização para amostras com ST positivo.

As amostras consideradas inadequadas, portanto, foram aquelas que apresentaram crescimento microbiano em uma ou mais etapas após a etapa de esterilização.

Nas 1.535 amostras adequadas, 1.266 apresentaram resultado negativo em todas as etapas e 269 tiveram apenas a solução transporte positiva, apresentando um resultado negativo após a esterilização (fig.1).

Nas 136 amostras inadequadas, as etapas com resultados positivos foram (fig.1): solução transporte (ST): 87; solução para esterilização (SE): 4; solução para congelamento (SC): 17; etapa da esterilização (E): 78; etapa do congelamento (C): 79.

Os microrganismos mais freqüentes encontrados em cada etapa foram:

Somando as 269 amostras positivas da solução transporte nas análises adequadas e as 87 nas análises inadequadas, obteve-se um total de 356 ST positivas, e os microorganismos mais freqüentes foram: Staphylococcus aureus (50) Staphylococcus epidermidis (45), Estafilococo com coagulase negativa (44) (gráfico 2).

Discussão

De acordo com os resultados obtidos, pode-se considerar eficaz a metodologia utilizada no processamento das valvas, na qual 1.266 amostras foram negativas em todas as etapas (da captação do órgão até o congelamento da valva), indicando assepsia e boas práticas no procedimento¹¹.

Entre as 356 amostras de ST positivas, apenas 269 foram consideradas aptas para uso clínico sob o aspecto microbiológico, pois apresentaram resultados negativos nas etapas subseqüentes após a etapa de esterilização, mostrando a eficiência da solução esterilizante.

A solução transporte positiva pode indicar a contaminação do órgão propriamente dito, contaminação na sua retirada, na manipulação durante o procedimento ou na coleta da amostra. Entretanto, não se pode afirmar onde realmente ocorreu a contaminação.

Se a ST for positiva para o gênero Bacillus ou Clostridium, a valva é considerada inadequada para uso, mesmo que nas demais etapas apresente resultados negativos após a esterilização, por se tratar de bactérias esporuladas dificultando a ação dos antibióticos.

Segundo o protocolo do Banco de Valvas, qualquer amostra positiva após a esterilização é considerada inadequada para uso clínico do ponto de vista microbiológico, independentemente do microorganismo identificado, pois mostra que não ocorreu a esterilização da valva.

Em alguns casos é esperada a presença de bactérias e fungos após a Etapa de esterilização, em razão da baixa concentração de antibióticos e da não-utilização de antifúngico¹², pela sua toxicidade celular.

Utilizando os mesmos antibióticos uma instituição internacional apresentou resultados semelhantes (Rebeyka IM. Policy and Procedure Manual. Hospital for Sick Children Cryopreservation Laboratory. Toronto; 1992; Ap H), mostrando a eficácia da solução esterilizante em ambos os serviços, com a diminuição da contaminação após a etapa de esterilização e o eventual crescimento de fungos na solução esterilizante e na etapa da esterilização, uma vez que não se utilizou antifúngico em nenhum dos procedimentos, revelando assim a reprodutividade do método (tab.1).

Finalmente, pode-se dizer que o método utilizado para o controle microbiológico no processamento de valvas, até o momento, mostra-se eficaz e reprodutivo, proporcionando a pacientes submetidos a cirurgia cardiovascular um substituto isento de contaminação microbiana.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflitos de interesses pertinentes.

Correspondência:

Angela Maria Peruzzo

Rua Bom Pastor, 485 – Sobrado 25

81720-310 – Curitiba, PR

E-mail:

angelamariaperuzzo@yahoo.com.br

Artigo recebido em 04/08/05; revisado recebido em 14/10/05; aceito em 28/10/05.