OBJETIVO: A neoproliferação intimal e o remodelamento têm sido implicados como os maiores fatores causadores de reestenose. O objetivo deste trabalho é estudar a ação da L-arginina por via oral, nesses dois fatores, após lesão por balão, em artérias ilíacas de coelhos hipercolesterolêmicos. MÉTODOS: Foram utilizados dezenove coelhos, que foram divididos em dois grupos: controle (GC) e arginina (GA), respectivamente com dezenove e dezessete artérias estudadas. Os animais foram submetidos a lesão por balão de angioplastia, em suas artérias ilíacas, quinze dias após início de dieta hipercolesterolêmica a 2%. A seguir, os animais do GA passaram a receber uma solução de L-arginina, por via oral, na dose de 1 g/kg/dia. Após o sacrifício, no 15º dia após a lesão por balão, procedeu-se a cortes histológicos das artérias, as quais foram coradas e fixadas. Utilizou-se como representativa do desenvolvimento da lesão a razão da área da neoíntima (em mm²) pela camada média (em mm²). Por sua vez, a razão da área total do vaso em sua porção medial (de maior contato com o balão) pela área total do vaso no segmento referencial (de menor contato com o balão) foi a definidora do remodelamento. RESULTADOS: A média do espessamento neointimal (NI/M) foi de 0,8151±0,2201 no GC e de 0,3296±0,1133 no GA. Não houve diferença entre os tipos de remodelamento entre os dois grupos estudados. CONCLUSÃO: No modelo experimental utilizado, a L-arginina foi capaz de reduzir o espessamento intimal em coelhos hipercolesterolêmicos e não teve ação sobre o remodelamento arterial.
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O espessamento neointimal do vaso tem sido amplamente valorizado, pois sua presença está ligada a várias complicações de intervenções terapêuticas. Em enxertos venosos implantados na circulação arterial, esse fator está implicado na gênese em reoclusões no pós-operatório1. Na vasculopatia relacionada ao coração transplantado, esse fenômeno tem mostrado papel decisivo2, e a reestenose após angioplastia com
A formação da neoíntima difere da placa aterosclerótica, pois essa é formada fundamentalmente por células musculares lisas (CML) e matriz extracelular. Essas células migram da camada média para a íntima em diferentes momentos desse fenômeno4. Tal fato pode sofrer inibição por mecanismos mediados pelo óxido nítrico (NO)5. O conhecimento dos fatores estimuladores e limitadores de crescimento neointimal precisa ser aprofundado e, nesse contexto, precursores do NO podem ter seu papel na intervenção sobre esse fator.
São alguns os estudos com a L-arginina, precursora do óxido nítrico, que, além de um custo acessível, é bem tolerada e disponível comercialmente6. Há, entretanto, alguma divergência nos trabalhos publicados, havendo benefício bem estabelecido quando se utiliza o agente em forma de aplicação local (intravascular)7,8. É válido ressaltar que pesquisas experimentais concluíram haver maior expressão vascular no óxido nítrico, com alguns tipos de exercícios físicos, ocorrendo, inclusive, benefício na hiperplasia neointimal e na adesão plaquetária em angioplastia com
Antes de sua realização, o experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Animais.
Foram utilizados dezenove coelhos machos albinos (
Para a alimentação dos animais, foi preparada uma dieta hipercolesterolêmica. Para tal, foram utilizados 200 g de colesterol (Sigma-Aldrich®), dissolvidos em 800 ml de clorofórmio (Biotec®), distribuídos em 10 kg de ração Nuvital®, constituindo uma alimentação hipercolesterolêmica a 2%. O colesterol dissolvido foi distribuído com auxílio de pulverizador sobre a ração, a qual era colocada num recipiente plano e raso. Após as 24 horas exigidas para adequada evaporação do clorofórmio, a ração foi distribuída para os animais. A lesão arterial foi induzida no 15º dia após o início da dieta, e a utilização dessa dieta se deu até o sacrifício dos animais.
Os coelhos foram anestesiados com Xilazina (Coopazine®-Coopers) na dose de 5 mg/kg e Ketamina (Vetanarcol® König) na dose de 3,5 mg/kg, por via intramuscular, na coxa. Foi, então, colhida amostra de sangue para dosagem de colesterol total. Após indução anestésica, foram realizadas tricotomias nas regiões inferior do abdome e inguinal, seguidas de limpeza adequada do local, assepsia e antisepsia. Procedeu-se, então, à incisão na pele com 2 a 3 cm de extensão no sentido longitudinal na prega inguinal, para exposição das artérias femoral direita e esquerda, as quais foram reparadas com fio de algodão 3-0. Em seguida, realizou-se pequena arteriotomia transversal, através da qual introduziu-se uma guia metálica número 0, 014, pela qual adentrava o cateter-balão de 3,0 mm de diâmetro por 20 mm de comprimento (raio balão/artéria de 2,5:1), que foi inserido no lúmen da artéria ilíaca direita (AID) e artéria ilíaca esquerda (AIE). Em cada artéria, o cateter-balão foi insuflado pelo tempo de cinco minutos, na pressão de 5 atm, levando a distensão da parede arterial. Após desinsuflação do balão, procedeu-se à ligadura das artérias, para contenção do fluxo, em ponto imediatamente acima do orifício de entrada do sistema cateter- balão, com fio de algodão 3-0. Por fim, a pele foi suturada com fio de Vicryl 3-0. Foram administrados analgésicos e antibióticos para ambos os grupos.
Vinte e quatro horas após a realização da lesão arterial, iniciou-se a administração de L-arginina para o grupo arginina, na dose de 1 g/kg/dia. Esta substância foi administrada na forma de solução, previamente homogeneizada, preparada na concentração de 3g/10 mL de solução. A mesma foi retirada através de seringa graduada, a qual foi inserida na cavidade oral do animal e teve o êmbolo pressionado lentamente para não haver perda da solução. Enquanto este procedimento era realizado, o coelho se encontrava em uma caixa com orifício adequado para sua cabeça, que limitava seus movimentos e facilitava a aceitação da droga.
No 15º dia após a lesão arterial, cada animal foi novamente pesado e anestesiado e, após procedimentos de antisepsia e colocação de campos estéreis, foi realizada uma incisão longitudinal, que se estendia desde a transição toracoabdominal até a região pélvica, a partir da qual era prolongada até as regiões inguinais direita e esquerda. Foram visualizadas e reparadas as artérias femorais, ilíacas e aorta. Após sacrifício com dose letal de barbitúrico, as artérias foram lavadas e fixadas com formaldeído a 10%, tamponado com fosfato (pH = 7,6), pelo período de dez minutos. Realizou-se, a seguir, a remoção do bloco envolvendo parte da aorta e ilíacas. Para identificação, a AID foi armazenada com um ponto na porção distal.
Para análise histológica e morfométrica, os espécimes arteriais, constituídos pelo segmento distal da aorta até as artérias ilíacas, foram fixados em formalina, por 24 horas, e processados para a confecção dos cortes histológicos. As artérias foram submetidas a cortes transversais, com 2 a 3 mm de espessura cada. As amostras foram colocadas em cápsulas histológicas identificadas, separando o segmento medial, de maior contato com o balão, do referencial (distal e proximal ao balão). As amostras foram identificadas com anotação do número do coelho e o lado da artéria ilíaca em uma das extremidades da lâmina, seguidos pelo registro do local dos cortes.
Para efeito de análise morfométrica e de remodelamento, foram consideradas as seguintes variáveis: área neointimal, área da camada média e área total do vaso, expressas em mm2. O espessamento intimal foi avaliado pela relação da área neointimal pela área da camada média, para que fosse levado em conta o tamanho da artéria a ser analisada. Utilizou-se, portanto, como representativa do desenvolvimento da lesão, a área neointimal que foi relativizada de acordo com a dimensão de cada vaso, ou seja, mediu-se o valor porcentual da neoíntima em relação à área da camada média. Por sua vez, a razão da área total do vaso em sua porção medial, pela área total do vaso no segmento referencial, expressa em porcentagem, foi a definidora do remodelamento. Esse era considerado positivo quando a área relativa do segmento medial (de interesse) fosse 10% maior do que a área referencial, e era dito negativo, quando a área do segmento medial fosse 10% menor do que a área referencial.
Os resultados das variáveis NI/M, área do vaso e remodelamento foram expressos por média e desvio-padrão, enquanto os resultados da variável remodelamento foram expressos por freqüências e porcentuais. Para comparar os dois grupos: controle e arginina em relação às médias das variáveis NI/M, área do vaso e remodelamento, foi usado o teste t de Student para amostras independentes, levando-se em consideração a homogeneidade das variâncias. Para a comparação dos locais medial e referencial, dentro de cada grupo, foi usado o teste
A inibição da formação neointimal tem sido objetivada para resolução da reestenose na era
Alguns estudos de L-arginina em seres humanos não demonstraram efeitos favoráveis na taxa de reestenose. Dudek e cols.11,12 aplicaram o agente de maneira intravascular, seguido de administração oral de 6 g/dia, por quatorze dias, após a angioplastia. Apesar de não ter havido diferença na taxa de reoclusão e na neoproliferação intimal, essa dose é bem mais baixa do que a utilizada no presente trabalho. Mesmo não havendo possibilidade de se extrapolar a dose experimental para seres humanos, trabalhos demonstraram segurança com a utilização desse aminoácido em doses de 12 g/dia13. Há pouca literatura, entretanto, sobre o uso da L-arginina por via oral, na espécie humana. Por este trabalho acredita-se haver possibilidade de reconsiderar a questão.
A relação do NO com o remodelamento pode ter seu fundo fisiopatogênico na inibição do espessamento intimal, na produção de metaloproteinases e na apoptose das células musculares lisas5. A ativação da matriz de metaloproteinases é necessária para que o remodelamento adaptativo arterial ocorra, e um dos fatores capazes de levar a essa produção é o NO, pois ele é capaz de regular a expressão dessas, bem como de mediar fatores inibitórios das metaloproteinases. Em estudo feito
Apesar da grande redução da espessura neointimal obtida neste estudo, não houve diferença no remodelamento. Tal fato pode ser explicado, pois o modelo experimental utilizado apresenta limitações para o estudo desse fenômeno. A utilização de artérias sem fixação com pressão sistêmica tem sido apontada como uma metodologia que superestima os valores reais desse fator15. Além disso, a retração do tecido, após o sacrifício, pode levar a falhas no dimensionamento do remodelamento.
Em um dos poucos trabalhos sobre o tema, Le Tourneau e cols.10 notaram ausência de remodelamento favorável (alargamento do vaso) no grupo de animais tratados com L-arginina, fato que não ocorreu no grupo controle. Esses autores sugerem, portanto, que esse agente teria efeito inibitório no remodelamento favorável. Nesse estudo, o sacrifício dos animais ocorreu em quatro semanas. Isso pode significar que a ação do óxido nítrico no remodelamento ocorre entre duas e quatro semanas após a angioplastia. É importante ressaltar algumas diferenças, entretanto, entre o trabalho desses autores e o presente estudo. Naquele trabalho, a L-arginina foi acrescentada na água dos animais, fato que se considera pouco eficiente, pois não há controle sobre a adequada ingesta do aminoácido e a dose real desse. Além disso, no trabalho de Le Tourneau e cols.10, a lesão foi desenvolvida numa fase inicial, através de um cateter de Fogarty e a angioplastia foi realizada seis semanas após esse procedimento16. Portanto, o modelo experimental foi diferente. Finalmente, no presente trabalho, foi considerada para análise histológica a média dos cortes arteriais que tiveram contato com o balão. No estudo desses autores, considerou-se apenas o corte de menor diâmetro luminal, fato que pode aumentar a margem de erro.
Diante do exposto, a possibilidade da L-arginina ter seu papel na prevenção do espessamento neointimal surge em um momento no qual a função endotelial normal está cada vez mais sendo valorizada, sendo a doença do endotélio responsabilizada pela doença coronariana em geral. Independentemente do aspecto terapêutico, os resultados deste trabalho evidenciam a necessidade de melhor conhecimento fisiopatológico da formação neointimal e, mais do que isso, ressaltam o papel do óxido nítrico nesse fenômeno. Portanto, a aplicabilidade da L-arginina pode ser aperfeiçoada, melhorada ou até substituída, desde que se conheçam os mecanismos pelos quais ela inibe o crescimento da neoíntima.
O resultado encontrado neste estudo difere do que havia na literatura até a presente data, pois a L-arginina agiu positivamente na neoproliferação intimal e de forma neutra no remodelamento. Levando-se em conta sua baixa toxicidade, esse agente poderia ser uma opção isolada ou associada a demais estratégias de inibição da formação neointimal, após novos estudos e, ainda, abrir caminhos para novas estratégias terapêuticas.
Por este trabalho é possível concluir que, no modelo experimental utilizado, a L-arginina foi capaz de reduzir a neoproliferação intimal em coelhos hipercolesterolêmicos, e não teve ação sobre o remodelamento arterial17.
Agradecemos ao Prof. Dr. João Carlos Repka por sua fundamental contribuição.
Declaro não haver conflitos de interesses pertinentes.
José Knopfholz Rua Carlos de Carvalho, 2620 80730-201 – Curitiba, PR E-mail:
Recebido em 10/04/05
Aceito em 12/08/05
OBJECTIVE: It has been implied that neointimal proliferation and remodeling are the major causes of restenosis. The objective of this study is to assess the effect of orally administered L-arginine on these two factors in hypercholesterolemic rabbits that had suffered an injury to their iliac arteries caused by a catheter balloon. METHODS: The study included nineteen rabbits that were divided in two groups: control (CG) and arginine (AG). There were 19 arteries studied from the control group and 17 in the arginine group. The animals were placed on a 2% hypercholesterolemic diet for 15 days and then submitted to a balloon angioplasty in order to produce a lesion in their iliac arteries. Next, the AG animals were given a 1g/kg/day oral dose of a L-arginine solution. The animals were sacrificed 15 days after the angioplasty procedure and histological artery sections were prepared, stained and fixed. The ratio between the neointimal area (in mm²) and the media layer (in mm²) was used to represent lesion development. In order to determine remodeling, the ratio between the total area of the medial portion of the vessel (greater balloon contact) and the total area of the reference segment of the vessel (less balloon contact) was used. RESULTS: Mean neointimal thickness (NI/M) was 0.8151±0.2201 in CG and 0.3296±0.1133 in AG. Remodeling patterns for the two groups studied were similar. CONCLUSION: In the experimental model used, L-arginine was able to reduce intimal tissue thickness in hypercholesterolemic rabbits but did not act on artery remodeling.
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The neointimal thickness of a vessel has been given great importance since it is linked to various therapeutic intervention complications. For vein grafts inserted into arterial circulation this factor is implicated as the genesis for postoperative recurrent occlusions1. In vasculopathies related to heart transplants, it has been proven that this phenomenon plays a decisive role2. Restenosis after an angioplasty and stent implantation procedures is almost exclusively explained by neointimal hyperplasia3.
Neointimal formation is different from atherosclerotic plaque which is basically formed by smooth muscle cells and an extracellular matrix. These cells migrate from the media layer to the intimal layer during different stages of this phenomenom4. This process could be inhibited by mechanisms mediated by nitric oxide (NO)5. More profound knowledge regarding the stimulating and limiting factors of neointimal growth is needed and, in this context, the nitric oxide precursors could have a role in the intervention of this process.
A few studies have been conducted with L-arginine, the precursor of nitric oxide, that in addition to an accessible cost is well tolerated and commercially available6. There is however some divergence in the studies published, but the benefits have been well established when the drug is injected locally (intravenously)7,8. It is worth noting that experimental research has concluded that physical exercise increases nitric oxide vascular expression and reduces neointimal hyperplasia and platelet adhesion after angioplasty and stenting procedures in rats9.
Before the experiment was conducted it was approved by the Animal Research Ethics Committee.
The study included nineteen male New Zealand albino rabbits (
The animals were fed a hypercholesterolemic diet. The 2% hypercholesterolemic diet was prepared by dissolving 200g of cholesterol (Sigma-Aldrich®) in 800 milliliters (ml) of chloroform (Biotec®) and distributing the solution in 10 kilograms (kg) of Nuvital® animal feed. The dissolved cholesterol was distributed using a spray gun over the feed which was placed in a flat and shallow dish. After the 24 hours required for adequate evaporation of the chloroform the feed was distributed to the animals. This diet was fed to the animals for fifteen days before the procedure to induce the arterial lesion and continued up to the day that the animals were sacrificed.
The rabbits were anesthetized with a 5mg/kg dose of Xylazine (Coopazine®-Coopers) and a 3.5mg/kg dose of Ketamine (Vetanarcol® König) injected in the thigh muscle. A blood sample was then drawn to measure total cholesterol. After anesthetic induction, a trichtomy was performed in the lower abdomen and groin followed by an aseptic and antiseptic cleaning of the area. Next, a 2 to 3cm longitudinal incision was made in the groin skinfold to expose the left and right femoral arteries which were repaired with 3-0 cotton thread. Next a small cross-sectional arteriotomy was performed and a 0.014 metal guide wire was inserted through which a 3.0 mm diameter balloon catheter with a length of 20 mm was entered (balloon/artery radius of 2.5:1) and inserted in the lumen of the right iliac artery (RIA) and left iliac artery (LIA). The balloon catheter was inflated for five minutes in each artery at a pressure of 5 atm. causing the artery wall to expand. After the balloon was deflated, the arteries were ligated immediately above the balloon catheter entrance orifice with 3-0 cotton thread to contain blood flow. Lastly, the skin was closed with Vicryl 3-0 sutures. Analgesics and antibiotics were administered to both groups.
Twenty-four hours after inducing the artery injury, the arginine group began receiving a 1g/kg/day dose of L-arginine. This substance was administered in the form of a solution that had been previously homogenized with a concentration of 3g/10 ml of solution. This was drawn using a graduated syringe and administered in the animal's oral cavity by slowly pressing the plunger ensuring that none of the solution was lost. During this procedure the rabbit was confined in a box with an adequate opening for its head that limited its movements and facilitated the acceptance of the drug.
On the 15th day after the artery injury, each animal was weighed and anesthetized once again and after antiseptic procedures and placement of sterile fields, a longitudinal incision was made that extended from the thoracoabdominal transition to the pelvic region and then extended to the right and left groin regions. The femoral, iliac and aorta arteries were exposed and observed. After the animals were sacrificed using a lethal dose of barbiturates, the arteries were cleaned and fixed with 10% phosphate buffered formaldehyde solution (pH=7.6) for 10 minutes. Next the block enveloping part of the aorta and iliac arteries was removed. For identification the RIA was stored with a stitch in the distal portion.
For histological and morphometric analysis the artery specimens, consisting of the distal segment of the aorta up to the iliac arteries, were fixed in formalin for 24 hours and processed for the making of the histological sections. Cross sectional slices of the arteries were cut with a thickness of 2 to 3 mm each. The samples were placed in identified histological containers, separating the medial segment which had greater contact with the balloon from the reference segment (distal and proximal to the balloon). The samples were identified by the number of the rabbit and the side of the iliac artery in one of the extremities of the slide followed by the register of the section location.
The following variables were used for morphometric and remodeling analysis: neointimal area, media layer area and total vessel area expressed in mm2. The intimal thickness was evaluated using the ratio between the neointimal area and the media layer area, so that the size of the artery to be analyzed could be considered. Therefore in order to assess the development of the lesion, the neointimal area was compared to the size of each vessel or in other words the percentage of neointimal tissue in relation to the media layer area was measured. In order to determine remodeling, the ratio between the total area of the medial portion of the vessel and the total area of the reference segment of the vessel expressed as a percentage was used. This was considered positive when the relative medial segment area (of interest) was 10% greater than the reference segment area and negative when the medial segment area was 10% less than the reference segment area.
The results of the variables NI/M, vessel area and remodeling were expressed as averages and standard deviations while the results of the variable remodeling pattern were expressed as frequencies and percentages. To compare the two groups: control and arginine in relation to the averages of the variables NI/M, vessel area and remodeling, the Student's t-test was used for the independent samples, considering the homogeneity of the variations. To compare the medial and reference locations within each group, the Student's t-test was used for paired samples. Normality was verified using the Shapiro-Wilks test. In the cases of non-normality a logarithmic transformation was applied to the data. To compare the groups in relation to remodeling type distribution the chi-square test was used. For all tests statistical significance was considered as p<0.05.
The inhibition of neointimal formation has been targeted as the solution for restenosis in the post stent era. The notable statistical difference detected in this study suggests that L-arginine is able to inhibit neointimal proliferation in the experimental model in question. These results are similar to those found by Le Tourneau et al10, in an experiment with hypercholesterolemic rabbits.
Some studies of L-arginine in humans have not demonstrated favorable effects on restenosis rates. Dudek et al11,12 initially administered the drug intravenously followed by an oral dose of 6 g/day for 14 days after the angioplasty. Despite the fact that re-obstruction rates and neointimal proliferation were similar, this is a much lower dose than that used in this study. Even though it is not possible to extrapolate the experimental dose for humans, studies have demonstrated that this aminoacid can safely be prescribed in doses of 12 g/day13. However, there is limited medical literature on the oral use of L-arginine in humans. Based on this study it is believed that the issue may be reconsidered.
The physiopathogenic basis of the relationship between nitric oxide and remodeling could be the inhibition of intimal thickness, the production of metalloproteinase and the apoptosis of smooth muscle cells5. The activation of the metalloproteinase matrix is required for adaptive artery remodeling to occur and NO is one of the factors that is able to stimulate this production since it is able to regulate their expression as well as mediate the metalloproteinase inhibiting factors. An
Despite the great reduction of neointimal thickness obtained in this study, remodeling patterns were similar. The explanation for this is that the resources of the experimental model used are limited for the study of this phenomenon. The use of arteries without fixing the systemic pressure has been indicated as a method that overestimates the real values of this factor15. Additionally, tissue retraction after the sacrifice could lead to remodeling dimensional errors.
In one of the few studies on the subject, Le Tourneau et al10 noted the absence of favorable remodeling (vessel enlargement) in the group of animals treated with L-arginine, a fact that did not occur in the control group. Therefore, these authors suggested that this drug could have an inhibiting effect on favorable remodeling. In this study, the animals were sacrificed after four weeks. This could signify that the action of nitric oxide on remodeling takes place between 2 and 4 weeks after the angioplasty. Nevertheless it is important to note some differences between this study and the study conducted by Le Tourneau. In the Le Tourneau's study, the L-arginine was added to the animals' water which is considered inefficient since there is no control over the adequate intake of the aminoacid or the actual dosage. Additionally, in the Le Tourneau et al10 study, the lesion was developed during the initial stage using a Fogarty catheter and the angioplasty was performed 6 weeks after this procedure16. Therefore, the experimental model was different. Lastly, in the present study, the average of the artery sections that had contact with the balloon was used for histological analysis. In the Le Tourneau's study, only the section with the smallest luminal diameter was considered, a fact that could increase the margin of error.
Based on the facts presented, the possibility that the role of L-arginine is to prevent neointimal thickening appears at a time when normal endothelial function is gaining importance since endothelial disease, in general, is resposible for heart disease in general. Regardless of the therapeutic aspect, the results of this study emphasize the role of nitric oxide in neointimal formation and prove that a better knowledge of the physiopathology of this phenomenon is required. Therefore the relevance of L-arginine could be perfected, improved or even substituted provided that the mechanisms which inhibit neointimal growth are understood.
The results of this study differ from those published in medical literature to date, since L-arginine had a positive effect on neointimal proliferation and a neutral effect on remodeling. Considering its low toxicity, this drug could be an isolated option or used in combination with other inhibition strategies for neointimal formation. Further studies will be required to determine these possibilities as well as other new therapeutic strategies.
From this study it is possible to conclude that in the experimental model used, L-arginine was able to reduce neointimal proliferation in hypercholesterolemic rabbits but did not affect artery remodelling17.
We would like to thank Prof. Dr. João Carlos Repka for his valuable contribution.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
José Knopfholz Rua Carlos de Carvalho, 2620 80730-201 – Curitiba, PR - Brazil E-mail:
Received on 10/04/05
Accepted on 12/08/05