abcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCSão Paulo, SP, BrazilY6N8M5dMG6g9CHDsdV9M67f00017S0066-782X2006001700017S0066-782X(06)0870041710.1590/S0066-782X2006001700017Artigos OriginaisRadiolesão vascular como efeito deletério da braquiterapia intra-arterial com dose elevada de Samário-153 em coelhos hipercolesterolêmicosPrécomaDalton BertolimNoronhaLúciaMouraÁlvaro VieiraYamadaAirton SeijiKnopfholzJoséDusilekCésar LopesPerussoloRitaBrofmanPaulo Roberto SludOlandoskiMárciaMeneghettiJosé CláudioCuritibaPRCentro de Radioimunoensaio e Medicina Nuclear do ParanáPontifícia Universidade Católica do Paraná São PauloSão PauloUniversidade de São PauloFM Hopital das ClínicasBrazil1020068745125190908200513032005This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.
OBJETIVO: Este estudo tem por objetivo avaliar as alterações vasculares morfológicas e morfométricas induzidas pela braquiterapia com Samário-153 (153 Sm) em coelhos hipercolesterolêmicos, com doses elevadas. MÉTODOS: Foram analisados 43 coelhos hipercolesterolêmicos, brancos, da raça New Zealand, e o total de 86 artérias ilíacas submetidas a lesão por balão de angioplastia. Divididos em três grupos: dois (GI) irradiados com as doses de 15Gy (n=14) e 60Gy (n=36) e um grupo controle (n=36). Foram realizadas avaliação histológica morfométrica e análise histológica qualitativa para análise tecidual. RESULTADOS: Foram observadas uma redução significativa da neoproliferação intimal (NPI) no GI 15 Gy (p<0,0001), uma redução da área de camada média (ACM) (p<0,0001) e % estenose (p<0,0001) comparada com os demais grupos. O GI 60 Gy teve o maior índice de PNI, aumento da ACM, AV e porcentagem de estenose. No GI 60 Gy, observou-se maior número de células xantomatosas (GI 60Gy:86,11% e GI 15Gy:14,29%, p<0,0001), tecido amorfo hialino (GI 60Gy:58,33% e GI 15 Gy:0%, p=0,0001) e proliferação vascular (GI60 Gy:30,56% e GI15 Gy:0%, p=0,0221). Outras análises teciduais não apresentaram diferença estatística entre os grupos. CONCLUSÃO: A dose elevada de 60Gy ocasionou intensa proliferação celular considerada radiolesão vascular, ao contrário da dose de 15Gy que apresentou excelente inibição da neo-proliferação intimal.
Lesão arterialbraquiterapiasamário-15321112006
ARTIGO ORIGINAL
Radiolesão vascular como efeito deletério da braquiterapia intra-arterial com dose elevada de Samário-153 em coelhos hipercolesterolêmicos
Dalton Bertolim Précoma; Lúcia Noronha; Álvaro Vieira Moura; Airton Seiji Yamada; José Knopfholz; César Lopes Dusilek; Rita Perussolo; Paulo Roberto Slud Brofman; Márcia Olandoski; José Cláudio Meneghetti
Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Centro de Radioimunoensaio e Medicina Nuclear do Paraná, Instituto do Coração do Hopital das Clínicas - FMUSP - Curitiba, PR - São Paulo, SP
Correspondência
RESUMO
OBJETIVO: Este estudo tem por objetivo avaliar as alterações vasculares morfológicas e morfométricas induzidas pela braquiterapia com Samário-153 (153 Sm) em coelhos hipercolesterolêmicos, com doses elevadas.
MÉTODOS: Foram analisados 43 coelhos hipercolesterolêmicos, brancos, da raça New Zealand, e o total de 86 artérias ilíacas submetidas a lesão por balão de angioplastia. Divididos em três grupos: dois (GI) irradiados com as doses de 15Gy (n=14) e 60Gy (n=36) e um grupo controle (n=36). Foram realizadas avaliação histológica morfométrica e análise histológica qualitativa para análise tecidual.
RESULTADOS: Foram observadas uma redução significativa da neoproliferação intimal (NPI) no GI 15 Gy (p<0,0001), uma redução da área de camada média (ACM) (p<0,0001) e % estenose (p<0,0001) comparada com os demais grupos. O GI 60 Gy teve o maior índice de PNI, aumento da ACM, AV e porcentagem de estenose. No GI 60 Gy, observou-se maior número de células xantomatosas (GI 60Gy:86,11% e GI 15Gy:14,29%, p<0,0001), tecido amorfo hialino (GI 60Gy:58,33% e GI 15 Gy:0%, p=0,0001) e proliferação vascular (GI60 Gy:30,56% e GI15 Gy:0%, p=0,0221). Outras análises teciduais não apresentaram diferença estatística entre os grupos.
CONCLUSÃO: A dose elevada de 60Gy ocasionou intensa proliferação celular considerada radiolesão vascular, ao contrário da dose de 15Gy que apresentou excelente inibição da neo-proliferação intimal.
A reestenose permanece um grande desafio na intervenção coronariana desde o advento da angioplastia, sendo motivo de vários estudos sobre as múltiplas opções terapêuticas. Constitui-se numa tentativa de reparo tecidual frente à lesão da parede arterial, cuja resposta se caracteriza pela neoproliferação intimal (NPI) e o remodelamento. Neste mecanismo fisiopatogênico, destacam-se a migração e a proliferação de células musculares lisas (CML) e o depósito de matriz extracelular, associados a fenômenos inflamatórios e proliferativos1,2,3.
A braquiterapia intra-arterial começou a ser estudada em trabalhos experimentais em 19944, e em humanos desde 1997.5 Desde então a sua importância tem sido demonstrada em aproximadamente 5.000 pacientes, que participam de estudos clínicos randomizados. Nos EUA, são realizados mais de 40.000 procedimentos por ano em 400 centros6,7. A irradiação provoca modificações fenotípicas que impedem a reprodução celular pelo ácido desoxiribonucleico (DNA), inibem a proliferação e a migração das células musculares lisas (CML) e diminuem o grau da hiperplasia neo-intimal, pela emissão de radiação localizada8. O nosso grupo demonstrou a eficácia na inibição da neoproliferação intimal utilizando pela primeira vez o Samário-153, com a dose de 15 Gy9. Vários estudos demonstraram a melhora dos resultados na inibição da NPI comparando-se doses mais elevadas. Entretanto as doses maiores podem causar efeitos deletérios no vaso, como descritos com a utilização de irradiação torácica que afeta os vasos internos10. Na literatura, há poucas publicações sobre os efeitos da braquiterapia intra-arterial com o uso de doses maiores.
Recentemente, com a demonstração da eficácia dos stents recobertos com substâncias antiproliferativas, houve grande expectativa na redução da reestenose11. Estudos comparativos demonstraram maior eficácia e segurança em relação à braquiterapia, porém a reestenose é um campo aberto para a pesquisa, pois os métodos disponíveis até o momento não conseguiram solucionar esse problema7,12.
Este estudo tem por objetivo analisar as alterações vasculares morfológicas e morfométricas induzidas pela braquiterapia utilizando-se uma dose elevada de Samário-153 (153Sm) em coelhos hipercolesterolêmicos, comparada com uma dose considerada ideal.
Métodos
Experimentação animal - Para a realização deste estudo, o protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal do hospital. Foram utilizados 43 coelhos brancos da raça New Zealand (Oryctolagus cunicullus), com a média de 4 meses de idade, com o peso de 2,6±0,5Kg, tratados previamente com ração de colesterol a 2%, 14 dias antes do procedimento e mantida até o dia do sacrifício.
Os animais foram anestesiados com xilazina (dose de 5mg.Kg-1) associada a ketamina (dose de 3,5mg.Kg-1), por via intramuscular na região da coxa. Após o período de dois a quatro minutos, foi realizada tricotomia nas regiões inferior do abdome e inguinal e uma incisão na pele de 2 a 3cm de extensão no sentido longitudinal na prega inguinal. Foram expostas as artérias femoral direita e esquerda e, por meio de pequena arteriotomia transversal, foi introduzida uma guia metálica número 0,014 por onde se deslizou o cateter-balão de 3,0mm de diâmetro por 20mm de comprimento (raio balão/artéria de 2,5:1), que foi inserido no lúmen da artéria ilíaca direita (AID) e artéria ilíaca esquerda (AIE).
Nesse local o balão foi insuflado com solução salina isotônica com a pressão de 5atm pelo período de 5 minutos, em 18 coelhos (36 artérias) que constituíram o grupo-controle (GC). O mesmo procedimento foi repetido em 7 coelhos (14 artérias), e, nestes, o balão foi insuflado com solução 153 Sm-EDTMP para expor a dose de 15Gy a 1 mm da superfície do vaso (GI15Gy), por 13min e 38s. . No terceiro grupo, com 18 coelhos (36 artérias), o balão foi insuflado com a dose calculada para atingir 60 Gy a 1mm da superfície do vaso (GI 60Gy) por 6min e 22s no primeiro dia. Nesta fase foi colhido sangue para a dosagem de colesterol.
Após 30±1 dias, os animais foram sacrificados com dose letal de barbitúricos. Imediatamente após foi realizada uma laparotomia com acesso até a aorta e artérias ilíacas as quais foram lavadas com formaldeído a 10% durante 10 minutos. Foi retirado o bloco composto de aorta terminal e artérias ilíacas, fixadas em formalina e encaminhadas para análise histológica (vide Figura 1).
Preparo das amostras - Após fixação por 24 horas, foram retiradas 3 a 6 amostras de cada artéria ilíaca em cortes transversais, com 2 a 3mm de espessura cada, que representam os segmentos proximais, mediais e distais em ambas artérias, em todos os animais. Os segmentos mediais representavam a área central de maior contato com o balão de angioplatia. Os segmentos proximais e distais da artéria ilíaca de cada lado, denominados de referenciais, correspondiam às extremidades em relação à área central de maior contato com o balão de angioplastia. Também foram obtidas amostras aleatórias de segmentos de aorta. O material foi processado conforme técnica convencional, sendo obtidas 110 lâminas coradas com hematoxilina-eosina (HE) e elástica de Hardt (orceína) e 521 cortes transversais das artérias ilíacas (fig. 2)
Análise histológica qualitativa - Todas as lâminas foram analisadas de maneira cega, em microscópio de 5 cabeças Olympus® BX 40, sendo observadas as seguintes variáveis em todos os cortes realizados: a) graus de lesão vascular; b) graus de lesão da lâmina elástica interna (LEI) e lâmina elástica externa (LEE); c) padrão lesional da adventícia; d) alterações tissulares gerais: d1) proliferação vascular, d2) recanalização vascular, d3) material amorfo hialino, d4) teleangiectasia, d5) características do endotélio, d6) tecido de granulação e fibrose, d7) atipias celulares, d8) células xantomatosas, d9 ) trombose vascular e d10) necrose fibrinóide.
Essas variáveis foram classificadas conforme o escore exposto na Tabela 1. (Classificação modificada de Schwartz 13)
Análise histológica morfométrica (quantitativa) - A leitura morfométrica foi realizada a fim de se determinar o lúmen arterial, a LEI, a LEE, área da neo-íntima (ANI), área da camada média (ACM) e área do vaso. A leitura das lâminas foi realizada por meio do programa Pro Image-plus® v.4,5 para Windows®, acoplado a microscópio Olympus® BX50 e câmara de vídeo Sony®, utilizando-se o aplicativo chamado morfometria de "área", calibrado previamente em µm com a objetiva de quatro vezes. As medidas foram transferidas para o programa Excel Windows®. As medidas morfométricas foram realizadas em todas as secções transversais da lâmina, no sentido proximal do corte próximo da identificação da lâmina para o distal. Foram desprezados os segmentos com artefatos que impossibilitavam as medidas.
Para avaliar a área luminal (AL), ANI, a ACM e a área do vaso, foram utilizados os seguintes critérios (fig. 3):
a) AL: determinada por uma linha traçada junto ao perímetro da borda luminal;
b) ANI: determinada por uma linha traçada sob a borda luminal e a linha do perímetro da LEI, isto é, AL- LEI;
c) ACM: determinada pelo perímetro da LEI e da LEE, isto é, LEE-LEI;
d) Área do vaso: compreendendo a área da LEE mais a ANI (LEE + ANI).
Graus de lesões do vaso - Adotou-se a classificação anatomopatológica para alterações histológicas dos graus de lesões do vaso, baseada em escores (tab. 1). Em cada vaso, foi comparado o segmento medial com os segmentos referenciais (proximal e distal).
Análise estatística - A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa Statistica/w. Para a comparação entre os grupos em relação às variáveis contínuas, adotou-se a análise de variância (ANOVA) e o teste LSD para comparar os grupos dois a dois. Para investigar o grau de associação entre a ANI e a ACM, estimou-se o coeficiente de correlação de Pearson e testou-se a existência ou não de correlação entre as variáveis.
As variáveis correspondentes às características celulares e ao grau de lesão vascular foram analisadas por meio do teste Exato de Fisher, comparando-se os grupos dois a dois.
Em relação ao grau de lesão avaliado pela classificação de Schwartz, para a comparação dos grupos dois a dois, adotou-se o teste não-paramétrico de Mann-Whitney.
As variáveis contínuas foram expressas em média ± desvio-padrão e as variáveis categóricas em freqüências e percentuais. As comparações foram feitas considerando-se o nível de significância corrigido de Bonferroni (p<0,0167 para grau de lesão e p<0,0125 para alterações tissulares e variáveis morfométricas). Nos demais testes estatísticos, valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
Resultados
A média do colesterol total foi de 1362,28 ± 273,00 mg/dl.
1. Análise histológica morfométrica (mensurações quantitativas de área) - Esta análise foi feita considerando-se as variáveis: ANI, ACM, área do vaso e a razão entre a ANI/ACM. Na Tabela 2, são apresentados os resultados de médias e desvios-padrões dessas variáveis para cada um dos grupos e os valores de p obtidos nas comparações de médias entre os grupos.
1.1 Área neo-intimal (ANI) - Houve significativa redução da área da neo-íntima no GI 15 Gy quando comparada aos outros grupos. Houve diferença estatística entre os grupos com p<0,0001, pela análise de variância (ANOVA). Na comparação dos grupos dois a dois, constatou-se diferença estatisticamente significante entre os GC e GI 15Gy (p=0,0007), entre os GC e GI 60Gy (p=0,0121) e entre os GI 15Gy e GI 60Gy (p<0,0001), pelo teste LSD. Em média, a ANI do GI 15Gy é 2,5 vezes menor do que a ANI do GC e 3,6 vezes menor do que a ANI do GI 60Gy. O GC é 1,4 vezes menor do que o GI 60Gy .
1.2 Área da camada média (ACM) - O GI 60Gy teve a maior ACM. Na comparação entre os grupos em relação à ACM, foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os GC e GI 60Gy (p<0,0001) e entre os GI 15Gy e GI 60Gy (p<0,0001). Não houve diferença significativa na comparação dos GC e GI 15Gy (p=0,0516). Em média, a ACM do GI 15Gy é 1,3 vez menor do que o GC e 1,9 vez menor do que o GI 60Gy. No GC a ACM é 1,5 menor do que o GI 60Gy.
1.3 Relação entre a ANI e ACM - A razão entre ANI/ACM foi menor no GI 15Gy, com diferença estatística entre os grupos (p=0,0018). A razão entre ANI/ACM apresentou diferença estatisticamente significante entre os GC e o GI 15Gy (p=0,0016), e entre os GI 15Gy e GI 60Gy (p=0,0010), o mesmo não ocorreu quando se compararam os GC e GI 60Gy. Em média, a razão ANI/ACM é 1,8 vez menor no GI 15Gy em relação ao GC e 1,9 vez ao GI 60 Gy. A relação média entre o GC e o GI 60Gy foi de apenas 1,02 vez.
1.4 Área do vaso - A maior área do vaso foi encontrada no GI 60Gy, com 2,49 ± 0,73mm2, que apresentou uma proporção 38% maior do que o GI 15Gy e 22% do GC. A análise de variância (ANOVA) mostrou significância estatística, com p<0,0001 (tab. 2). Considerando-se a análise grupo a grupo, houve diferença estatística entre os grupos irradiados e entre o GI 60Gy e o controle, com valores de p=0,0001 e p=0,0014, respectivamente, pela análise LSD.
2. Graus de lesões vasculares - O grau de lesão vascular analisada pela classificação de Schwartz e cols.13 (tab. 1) foi mais freqüente no GI 60Gy, principalmente no segmento medial, com diferença estatística entre o CG (p=0,0046) e o GI 15Gy (p=0,0391) (tab. 3).
Utilizando-se a classificação para as lesões da LEI (tab. 1), obteve-se maior grau de lesão nos segmentos mediais dos três grupos, porém na análise de grupo versus grupo não houve diferença estatística. (tab. 4)
Para análise do grau de lesão da LEE, foi empregada a classificação semelhante à LEI (tab. 1). Comparando-se grupo versus grupo, foi observado maior grau de lesão da LEE para o segmento medial no GI 60Gy, com diferença estatística entre o GC (p=0,0086) e o GI 15Gy (<0,0001). Não houve diferença entre o GC e o GI 15Gy. (tab. 5)
3. Análise histológica qualitativa - As variáveis qualitativas observadas foram as células xantomatosas, tecido hialino e amorfo, proliferação vascular e tecido de granulação e fibrose.
A presença de células xantomatosas de grau moderado/acentuado foi observada principalmente no GI 60Gy em 86,11% das artérias, e em 33,33% no GC; houve uma diferença estatisticamente significativa entre esses grupos, com p<0,0001. Quando comparados os grupos de artérias irradiadas, o GI 60Gy apresentou predominância sobre o GI 15Gy, com 86,11% e 14,29%, respectivamente, com diferença estatisticamente significativa, com p<0,0001, pelo teste de Fisher. Não houve diferença entre o GC e o GI 15Gy. Os valores estão especificados na Tabela 6, e os cortes histológicos na Figuras 4 e 5.
O tecido de granulação e fibrose esteve presente em 27,78% no GC; 71,43% no GI 15Gy e 63,89% no GI 60Gy. Na comparação entre os grupos observou-se significância estatística entre GC e GI 15 Gy (p=0,0089) e entre GC e GI 60Gy (p=0,0042), pela análise do teste de Fisher. As freqüências e os percentuais são demonstrados na Tabela 6 e os cortes histológicos, na Figura 6.
O material amorfo e hialino foi observado no GC em 13,89% dos casos e em 58,33% no GI 60Gy. Não ocorreu alteração no GI 15Gy. Houve significância estatística quando comparados os GC e GI 60Gy (p=0,0002), e os grupos GI 15Gy e GI 60Gy (p=0,0001), analisados pelo teste Exato de Fisher. Entre os grupos GC e GI15 Gy não houve significância. As freqüências e os percentuais são demonstrados na Tabela 6.
A proliferação vascular foi predominante no GI 60Gy, presente em 30,56% dos casos. No GC ocorreu em 11,11%. Houve diferença estatisticamente significativa, quando comparados os GI 15Gy e o GI 60Gy, com p=0,0221. A comparação dos demais grupos não apresentou diferença estatística. Os valores estão especificados na Tabela 6.
Discussão
Utilizando-se a classificação de lesão vascular modificada de Schwartz RS et al13, observamos maiores graus de lesão vascular na LEE, no grupo da dose elevada de Samário-153 (GI 60 Gy). Os maiores graus de lesão da LEE podem indicar maior comunicação entre a camada média e a adventícia. Essas alterações sugerem que o efeito não deve ser dado somente pelo trauma do balão, uma vez que os outros grupos (GC e GI 15 Gy) também foram submetidos à mesma pressão, mas também pela elevada dose de irradiação, que favoreceu as modificações estruturais na LEE.
Não houve diferença estatística entre os grupos para os graus de lesão na LEI, apesar de esta estar mais predisposta ao comprometimento pelo barotrauma do balão de angioplastia. A LEI tem a função de manter a estrutura do vaso, servindo como barreira entre a íntima e a camada média, impedindo a migração de células e macromoléculas. A sua estrutura é composta de fibras elásticas delgadas com fenestrações que variam conforme as espécies13,14. A presença de células xantomatosas freqüentes no espaço intimal é citada como característica típica de radiolesão quando se associa à hipercolesterolemia. Kwon et al15, estudando as mudanças estruturais da LEI em suínos hipercolesterolêmicos, notaram que há aumento da comunicação entre a íntima e a camada média. Achados semelhantes foram observados neste estudo. Embora não tenha sido demonstrada lesão significativa da LEI entre os grupos, as modificações estruturais da LEI associam-se com significativa comunicação entre a íntima e a camada média, sendo evidenciadas pelo aumento da presença de células xantomatosas. As artérias irradiadas com 60Gy apresentaram o predomínio dessas células no grau moderado e acentuado, sendo observadas em 86,11% dos segmentos arteriais analisados, e somente em 33,33% no grupo-controle e 14,29% no grupo irradiado com 15Gy, com significância estatística entre os grupos (p<0,0001). O aumento da área da camada média reflete tais alterações estruturais.
Estudos têm demonstrado a utilidade da irradiação com emissores beta na prevenção da reestenose16. Waksman et al17 testaram diferentes doses absorvidas, utilizando 7, 14, 28 e 56Gy de 90Sr/Y, calculadas para atingirem 2,0mm da parede do vaso e resultaram em adequada inibição da proliferação intimal, conforme a progressão das doses, não sendo observada necrose das camadas da artéria. Em nosso estudo, as doses foram calculadas para atingir 1 mm da parede do vaso, com as doses de 15 Gy e 60 Gy, na hipótese de a dose mais exposta obter melhor resultado na inibição tecidual. Contudo, com dose absorvida maior, de 60Gy, foram observados 63,89% de fibrose, em comparação com 27,78% no GC e 71,435% com a dose de 15Gy. Esses achados sugerem a presença de lesão ocasionada pela irradiação, com a provável penetração exacerbada com a dose absorvida elevada do 153Sm de 60Gy. Tal observação é ressaltada ao se analisar o grau de lesão da LEE, que foi 48,5% maior no GI 60Gy do que o GI 15Gy e 31% maior do que o GC. Este fato reforça a hipótese de radiolesão e não lesão pelo trauma do balão de angioplastia. Tal achado corrobora a literatura, sugerindo que essa fibrose seja atribuída à radiação, peculiar aos radioisótopos. Entretanto, com a artéria exposta à dose de 15Gy, não foram observadas as anormalidades celulares e histológicas encontradas com a dose de 60Gy, o que pode sugerir que esses fenômenos são dose-resposta. Esses achados são discutidos por Denham e Hauer-Jensen18. Eles descrevem a diferença entre a lesão arterial pelo trauma e a lesão pela radiação; esta última envolve uma produção excessiva de citocinas, o acúmulo exagerado de matriz extracelular e a conseqüente fibrose. Trott e Kamprad10 estudaram os efeitos antiinflamatórios e pró-inflamatórios da radiação, e assinalam a forte correlação com a dose aplicada. Isso pode explicar a diferença encontrada entre os dois grupos de artérias irradiadas neste experimento; com a dose de 15Gy observou-se fibrose semelhante à dose de 60Gy, porém sem a presença de células xantomatosas, material amorfo hialino nem alterações nas áreas intimal e da camada média observadas na dose de 60Gy.
A principal característica do dano vascular após balão de angioplastia é a hiperplasia neo-intimal, um tipo de lesão fibrocelular, que confere limitação ao fluxo sangüíneo. As características principais são a migrações das células da camada média, as alterações fenotípica e secreção de matriz celular19. Essas características conferem uma das principais causas da reestenose em humanos submetidos a angioplastia por balão, além do recolhimento elástico da parede arterial. A braquiterapia intra-arterial nos últimos anos tem sido utilizada como uma das principais terapêuticas da reestenose, por meio de doses específicas e atua como um supressor do crescimento celular. 20,21 Semelhantes observações foram evidenciadas neste estudo, no qual se encontraram resultados significativos na inibição neo-intimal com a utilização da dose de 15Gy, ao contrário das artérias expostas à dose de 60 Gy, que determinaram os efeitos deletérios da radiolesão, com esta técnica de irradiação intra-arterial.
Conclusão
A irradiação intra-arterial com a dose absorvida de 153-Sm de 15 Gy foi adequada para reduzir a área neo-intimal, a área da camada média e a área do vaso. Na dose absorvida de 60 Gy, foi observado aumento significativo das variáveis morfométricas, além da presença significativa de padrões celulares anormais, tais como: células xantomatosas e material amorfo hialino, dados estes compatíveis com efeitos de radiolesão arterial.
Agradecimentos
Doutoras Karine Dall'Oglio Tolazzi, Priscila Oliveira Silva e Flávia Ferreira; doutorandos Ruy Fernando Kuenzer Caetano da Silva e Manuela Oliveira, pelo grandioso auxílio na fase experimental.
Potencial Conflito de Interesses
Declaro não haver conflitos de interesses pertinentes.
Dalton Bertolim Précoma
R. Dias da Rocha Filho, 1347
80040-050 – Curitiba, PR
E-mail:
precoma@cardiol.br ou
daltonprecoma@onda.com.br
Recebido em 13/03/05
Aceito em 09/08/05
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OBJECTIVE: This study was designed to evaluate vascular morphological and morphometric changes induced by brachytherapy with samarium-153 (Sm-153) at high doses in hypercholesterolemic rabbits. METHODS: Forty-three New Zealand White hypercholesterolemic rabbits were analyzed, and the total of 86 iliac arteries underwent balloon angioplasty injury. The rabbits were divided into three different groups: two irradiation groups (IG) assigned to 15 Gy (n=14) and 60 Gy (n=36) irradiation doses, respectively, and a control group (n = 36). Histomorphometric and qualitative histological analyses were performed for tissue evaluation. RESULTS: Significant reductions were found in neointimal proliferation (NIP) (p< 0.0001), media area (MA) (p<0.0001) and percent stenosis (p<0.0001) in the 15-Gy IG, compared to the other groups. The 60-Gy IG had the higher rate of NIP, increase in media and vessel areas (VA) and percent stenosis. The 60-Gy IG also showed the greatest number of xanthomatous cells (60-Gy IG: 86.11% and 15-Gy IG: 14.29%, p<0.0001) and the highest amount of hyaline amorphous tissue (60-Gy IG:58.33% and 15-Gy IG:0%, p=0.0001) and vascular proliferation (60-Gy IG:30.56% and 15-Gy IG:0%, p=0.0221). No statistically significant differences were found among groups concerning other tissue analyses. CONCLUSION: The high-dose irradiation of 60 Gy resulted in intense cell proliferation considered vascular radiolesion, unlike the 15-Gy dose, which was associated with an excellent inhibition of neointimal proliferation.
Artery injurybrachytherapysamarium-153
ORIGINAL ARTICLE
Vascular radiolesion as a deleterious effect of high-dose-rate intraarterial brachytherapy with samarium-153 in hypercholesterolemic rabbits
Dalton Bertolim Précoma; Lúcia Noronha; Álvaro Vieira Moura; Airton Seiji Yamada; José Knopfholz; César Lopes Dusilek; Rita Perussolo; Paulo Roberto Slud Brofman; Márcia Olandoski; José Cláudio Meneghetti
Pontifical Catholic University of Paraná, Radioimmunoassay and Nuclear Medicine Center of Paraná, Hospital das Clínicas Heart Institute – University of São Paulo School of Medicine (FMUSP) - Curitiba, PR - São Paulo, SP - Brazil
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ABSTRACT
OBJECTIVE: This study was designed to evaluate vascular morphological and morphometric changes induced by brachytherapy with samarium-153 (Sm-153) at high doses in hypercholesterolemic rabbits.
METHODS: Forty-three New Zealand White hypercholesterolemic rabbits were analyzed, and the total of 86 iliac arteries underwent balloon angioplasty injury. The rabbits were divided into three different groups: two irradiation groups (IG) assigned to 15 Gy (n=14) and 60 Gy (n=36) irradiation doses, respectively, and a control group (n = 36). Histomorphometric and qualitative histological analyses were performed for tissue evaluation.
RESULTS: Significant reductions were found in neointimal proliferation (NIP) (p< 0.0001), media area (MA) (p<0.0001) and percent stenosis (p<0.0001) in the 15-Gy IG, compared to the other groups. The 60-Gy IG had the higher rate of NIP, increase in media and vessel areas (VA) and percent stenosis. The 60-Gy IG also showed the greatest number of xanthomatous cells (60-Gy IG: 86.11% and 15-Gy IG: 14.29%, p<0.0001) and the highest amount of hyaline amorphous tissue (60-Gy IG:58.33% and 15-Gy IG:0%, p=0.0001) and vascular proliferation (60-Gy IG:30.56% and 15-Gy IG:0%, p=0.0221). No statistically significant differences were found among groups concerning other tissue analyses.
CONCLUSION: The high-dose irradiation of 60 Gy resulted in intense cell proliferation considered vascular radiolesion, unlike the 15-Gy dose, which was associated with an excellent inhibition of neointimal proliferation.
Since the advent of angioplasty, restenosis has been a great challenge in coronary intervention, and several studies have focused on examining the multiple therapeutic options. It is an attempt at tissue repair following arterial wall injury through neointimal proliferation (NIP) and remodeling. Smooth muscle cell (SMC) migration and proliferation plus extracellular matrix (ECM) deposition, associated with inflammatory and proliferative phenomena, play key roles role in this pathophysiological mechanism1-3.
Intraarterial brachyterapy was first studied in experimental models in 19944, and in 1997 study of it began in humans5. Since then, its importance has been demonstrated in roughly 5,000 patients participating in randomized clinical trials. In the United States, more than 40,000 procedures are performed each year in 400 centers6,7. Delivery of local radiation causes phenotypic changes that prevent cell reproduction by deoxyribonucleic acid (DNA), inhibiting smooth muscle cell (SMC) proliferation and migration and thus decreasing the degree of neointimal hyperplasia8. Our group showed that brachytherapy with samarium-153, used for the first time, at a dose of 15 Gy effectively inhibits neointimal proliferation9. Several studies, comparing higher doses, have demonstrated better results in NIP inhibition. However, higher doses may have deleterious effects on the vessel wall, affecting internal vessels, as described with thoracic irradiation10. Little has been published on the effects of intraarterial brachytherapy using higher doses.
Recently, as the effectiveness of antiproliferative drug-eluting stents was demonstrated, expectations were high for restenosis reduction11. The safety and efficacy of brachytherapy have been established in comparative studies; however, restenosis is open field for research, because no method has thus far been able to solve this problem7,12.
This study is directed towards analyzing morphological and morphometric vascular changes induced by high dose samarium-153 (Sm-153) brachytherapy in hypercholesterolemic rabbits, compared with an optimal dose.
Methods
Animal experiment - The study protocol was approved by the hospital's Animal Research Ethics Committee. Forty-three New Zealand White rabbits (Oryctolagus cunicullus), mean age four months and body weight 2.6±0.5Kg, were used. They were fed a 2% cholesterol diet from 14 days before the procedure up to the day of sacrifice.
The animals were anesthetized intramuscularly with a mixture of xylazine (5 mg.kg-1) and Ketamine (3.5 mg.kg-1) in the thigh region. After 2 to 4 minutes, trichotomy of the lower abdominal and inguinal regions was performed, followed by a 2-3-cm longitudinal skin incision along the inguinal crease. Both the right and left femoral arteries were exposed and, through a small transverse arteriotomy, a balloon catheter 3.00 mm in diameter and 20 mm in length (balloon/artery ratio 2.5:1) was advanced over a nº 0.014 guide-wire up to the right iliac artery (RIA) and left iliac artery (LIA) lumina.
At this site, the balloon was inflated with isotonic saline solution at 5 atm for 5 minutes in the 18 rabbits (36 arteries) that comprised the control group (CG). The same procedure was performed in 7 rabbits (14 arteries), but this time the balloons were inflated with Sm-153-EDTMP solution, to deliver a dose of 15 Gy (15-Gy IG) at 1 mm from vessel surface for 13 minutes and 38 seconds. In the third group, consisting of 18 rabbits (36 arteries), the balloon was inflated with a dose calculated to reach 60 Gy at 1 mm from the vessel surface (60-Gy IG) for 6 minutes and 22 seconds, on the first day. During this phase, blood samples were collected for serum cholesterol measurements.
After 30 ± 1 days, the animals were sacrificed with a lethal dose of barbiturates, followed immediately by laparotomy to obtain access to the aorta and iliac arteries, which were flushed with a 10% formaldehyde solution for 10 minutes. The terminal aorta and iliac arteries were removed en bloc, fixed in formalin and sent to histological analysis (Fig. 1).
Sample preparation – After a 24-hour fixation, 3 to 6 samples were taken from each iliac artery, in 2- to 3-mm thick cross-sections, thus representing the proximal, medial and distal segments of both arteries, in all the animals. Medial segments represented the central area in most contact with the angioplasty balloon. Proximal and distal segments of the iliac artery of each side, named reference segments, corresponded to the ends relative to the central area in greatest contact with the angioplasty balloon. Randomly selected samples were also taken from aorta segments. All the material was processed according to standard technique, and 110 microscope slides stained with hematoxyline-eosine (HE) and Hardt's elastica (orcein) were obtained, as well as 521 iliac artery cross-sections (Fig. 2).
Qualitative histological analysis - All slides were blindly analyzed using a 5-head microscope Olympus® BX 40. The following variables were observed in every section: a) degree of vascular injury; b) degree of internal elastic lamina (IEL) and external elastic lamina (EEL) injury; c) lesional pattern of the adventitia; d) general tissue changes: d1) vascular proliferation, d2) vascular recanalization, d3) hyaline amorphous material, d4) telangiectasia, d5) endothelial characteristics, d6) granulation/fibrous tissue, d7) cellular atypism, d8) xanthomatous cells, d9) vascular thrombosis, and d10) fibrinoid necrosis.
These variables were classified according to the scoring system shown in Table 1. (Schwartz' modified classification 13).
Quantitative histomorphometric analysis – Morphometric measurements were performed to determine arterial lumen, IEL, EEL, neointimal area (NIA), media layer area (MA), and vessel area (VA). Slides were examined by means of Image-Pro Plus 4.5 software for Windows® coupled to an Olympus® BX50 microscope and Sony® video camera, using the so-called "area" morphometry application previously calibrated in µm with a 4x objective. Measurements were transferred to Excel Windows®. Morphometric measurements were performed in all cross-sections of the microscope slide, from proximal, near slide identification, to distal. Segments with artifacts that made it impossible to obtain measurements were disregarded.
In order to assess the lumen area (LA) and the media layer and vessel areas, the following criteria were followed (Fig. 3): a) LA: determined by drawing a line along the luminal border perimeter; NIA: determined by drawing a line under the luminal border and the IEL perimeter line; MA: determined by IEL and EEL perimeters, i. e., EEL-IEL; d) vessel area: comprising EEL area plus NIA (EEL + NIA).
Degrees of vessel lesion – The pathologic classification of histological changes based on scores was adopted to assess the degree of vessel lesion (Table1). In every vessel, the medial segment was compared with reference segments (proximal and distal).
Statistical analysis was performed using Statistica/w software. Analysis of variance (ANOVA) was used to compare groups on categorical variables, and Fisher's LSD test was used for pairwise comparison between groups. To investigate the degree of association between NIA and MA, Pearson's correlation coefficient was estimated and the correlation between these variables tested.
Variables corresponding to cell characteristics and degree of vascular lesion were analyzed by Fisher's exact test, comparing two groups at a time.
In regard to the degree of lesion evaluated by Schwartz's classification, by which two groups were compared at a time, the Mann-Whitney nonparametric test was used.
Continuous variables were expressed as mean ± standard deviation, and categorical variables were expressed as frequencies and percentages. Comparisons were drawn taking into account the Bonferroni-corrected significance level (p<0.0167 for the degree of lesion and p<0.0125 for tissue changes and morphometric variables. For the other statistical tests, p-values < 0.05 were considered statistically significant.
Results
Mean total cholesterol was 1362.28 ± 273.00 mg/dL.
Histomorphometric analysis (quantitative measurements of the area) – This analysis was performed taking into account the following variables: NIA, MA, vessel area and neointima/media ratio (NI/M). Table 2 shows mean and standard deviation results of these variables for each group and the p values obtained from comparison of means between groups.
Neointimal area (NIA) – Reduction in neointimal area was significant in the 15-Gy IG compared with the other groups. Analysis of variance (ANOVA) showed statistically significant difference among groups (p<0.0001). When comparing two groups at a time, LDS testing pointed to statistically significant difference between the CG and 15-Gy IG (p = 0.0007), the CG and 60-Gy IG (p = 0.0121) and the 15–Gy IG and 60-Gy IG (p<0.0001). On average, the neointimal area of the 15-Gy IG was 2.5 times smaller than that of the CG and 3.6 times smaller than that of the 60-Gy IG. The CG neointimal area, in turn, was 1.4 smaller than that of the 60-Gy IG.
Media layer area (MA) – The largest MA was observed in the 60-Gy IG. When the groups were compared for MA, statistically significant differences were found between the CG and 60-Gy IG (p < 0.0001) and the 15-Gy IG and 60-Gy IG (p < 0.0001). No statistically significant difference was found between the CG and 15-Gy IG (p = 0.0516). On average, the media area of the 15-Gy IG was 1.3 times smaller than that of the CG and 1.9 times smaller than that of the 60-Gy IG. This media area was 1.5 smaller in the CG than in the 60-Gy IG.
NI/M ratio – The lowest neointima/media ratio was detected in the 15-Gy IG, with statistically significant difference among groups (p = 0.0018). A statistically significant difference was found between the CG and 15-Gy IG (p=0.0016), and the 15-Gy IG and 60-Gy IG (p=0.0010), but not between the CG and 60-Gy IG. On average, neointima/media ratio was 1.8 times lower in the 15-Gy IG compared to that of the CG and 1.9 times lower than that of the 60-Gy IG. Mean ratio between the CG and 60-Gy IG was only 1.02 fold.
Vessel area – The largest vessel area was found in the 60-Gy IG (2.49 ± 0.73mm2), the proportion of which was 38% greater than in the 15-Gy IG and 22% greater than in the CG. Analysis of variance (ANOVA) showed statistical significance, with p < 0.0001 (Tab. 2). Considering the group-to-group analysis, a statistically significant difference was found between the irradiated groups and between the 60-Gy IG and control group, with p values 0.0001 and 0.0014, respectively, using LSD analysis.
Degree of vascular lesions – The degree of vascular lesion analyzed according to Schwartz et al classification (Table1) was more frequent in the 60-Gy IG, especially in the medial segment, with a statistically significant difference between the CG (p = 0.0046) and 15-Gy IG (p = 0.0391) (Tab. 3).
Using the classification for IEL lesions (Tab.1), the greatest degree of lesion was observed in the medial segments of the three groups; however, in the group versus group analysis, no statistically significant difference was found (Tab. 4).
To analyze degree of lesion in the EEL, a classification similar to that of the IEL was used (Tab. 1). Comparing group versus group, the greatest degree of EEL lesion was found in the 60-Gy IG medial segment, with a statistically significant difference between the CG (p=0.0086) and 15-Gy IG (p < 0.0001). There was no difference between the CG and 15-Gy IG (Tab. 5).
Qualitative histological analysis – Qualitative variables observed were xanthomatous cells, hyaline amorphous tissue, vascular proliferation, and granulation/fibrous tissue.
The presence of xanthomatous cells in moderate/marked degree was observed in 86.11% of the arteries in the 60-Gy IG and 33.33% of the arteries in the CG, with a statistically significant difference between these groups (p < 0.0001). When the irradiated groups were compared, the 60-Gy IG had higher rates of xanthomatous cells than the 15-Gy IG, 86.11% and 14.29%, respectively, showing a statistically significant difference (p < 0.0001), measured by Fisher's test. No difference was found between the CG and 15-Gy IG. Values are shown in Table 6, and histological sections are shown in Figures 4 and 5.
Granulation/fibrous tissue was present in 27.78% in the CG; 71.43% in the 15-Gy IG, and 63.89% in the 60-Gy IG. When the groups were compared, using Fisher's test, a statistically significant difference was found between the CG and 15-Gy IG (p = 0.0089) and the CG and 60-Gy IG (p = 0.0042). Frequencies and percentages are shown in Table 6, and histological sections are shown in Figure 6.
The presence of hyaline amorphous material was seen in 13.89% of the CG and 58.33% of the 60-Gy IG. No change was found in the 15-Gy IG. There was a statistically significant difference when the CG and 60-Gy IG (p = 0.0002) and the 15-Gy IG and 60-Gy IG were compared (p = 0.0001) by Fisher's exact test. No statistically significant difference was found between the CG and 15-Gy IG. Frequencies and percentages are shown in Table 6.
Vascular proliferation was predominant in the 60-Gy IG, as it occurred in 30.56% of the cases. In the CG, it was detected in 11.11%. A statistically significant difference was found when the 15-Gy IG and 60-Gy IG were compared (p = 0.0221). Comparison of the other groups showed no statistically significant difference. All values are specified in Table 6.
Discussion
Using Schwartz et al's modified classification for vascular lesion13 the greatest degrees of lesion in the EEL were observed in the group assigned to the highest dose of samarium-153 (60-Gy IG). The higher degrees of EEL lesion may indicate increased communication between the media and adventitia layers. These changes suggest that the effect may not be due only to the balloon trauma, since the other groups (CG and 15-Gy IG) also underwent the same pressure, but rather to the high dose of irradiation, which triggered structural modifications in the EEL.
No statistically significant difference was found among groups regarding the degree of lesion in the IEL, although this lamina was more predisposed to being compromised by the barotrauma caused by the angioplasty balloon. The role of the internal elastic lamina is to maintain vessel structure, serving as a barrier for cells and macromolecules migration between the intima and the media layers. Its thin elastic fibers have fenestrations that vary according to the species13,14. The presence of frequent xanthomatous cells in the intimal space is typical of radiolesion associated with hypercholesterolemia. Studying IEL structural changes in hypercholesterolemic pigs, Kwon et al15 observed increased communication between the intima and media layers. Similar findings were observed in this study. Although no significant lesion was manifest in the IEL among groups, structural changes in the IEL are associated with a considerable communication between the intima and media layers, shown by the increased number of xanthomatous cells. Arteries irradiated with 60 Gy showed the highest number of these cells in moderate and marked degree, being observed in 86.11% of the arterial segments analyzed compared with only 33.33% in the control group and 14.29% in the 15-Gy irradiated group, with statistical significance among groups (p < 0.0001). The increase in media area reflects these structural changes.
Studies have demonstrated the usefulness of irradiation with beta-emitters to prevent restenosis16. Waksman et al17tested different doses absorbed, using 7, 14, 28 and 56 Gy of 90Sr/Y, calculated to reach 2.0 mm from the vessel wall, and achieved adequate inhibition of intimal proliferation, according to dose progression. No necrosis was observed in artery layers. In our study, doses were calculated to reach 1 mm from the vessel wall, with 15 Gy and 60 Gy, hypothesizing that the higher dose would yield better results in tissue inhibition. With the higher absorbed dose of 60 Gy, however, 63.89% of fibrosis was observed, compared with 27.78% in the CG and 71.435% in the 15-Gy IG. These findings suggest the presence of irradiation-induced lesion, probably due to an exacerbated penetration with the absorbed dose of 60 Gy of Sm-153. This is emphasized by the degree of lesion in the EEL, which was 48.5% higher in the 60-Gy IG than in the 15-Gy IG and 31% higher than in the CG. The hypothesis of radiolesion rather than lesion caused by the angioplasty balloon is thus reinforced. This finding corroborates literature data, suggesting that this fibrosis may be attributed to radiation typical of radioisotopes. Nevertheless the artery exposed to the 15 Gy dose did not show the cellular and histological abnormalities found with the 60 Gy dose, suggesting that these may be dose-response phenomena. Denham and Hauer-Jensen discussed these findings18. They described the difference between arterial lesion caused by trauma and by radiation, the latter involving excessive production of cytokines, excessive deposition of extracellular matrix and the resulting fibrosis. Trott and Kamprad10 studied the anti-inflammatory and proinflammatory effects of radiation and point to a strong correlation with the delivered dose. This may explain the difference found between both groups of irradiated arteries in this trial, with similar fibrosis observed with the 15 Gy dose and 60 Gy dose, but without the xanthomatous cells, hyaline amorphous material, and changes in intimal and media layers observed in the 60-Gy IG.
The primary characteristic of vascular damage following balloon angioplasty is neointimal hyperplasia, a kind of fibrocellular lesion that limits blood flow. The major characteristics are migration of media layer cells, phenotypic changes, and cellular matrix secretion19. These are some of the main causes of restenosis in human beings undergoing balloon angioplasty, besides the elastic recoil of the arterial wall. Over recent years, intraarterial brachytherapy has been one of the main techniques for treating restenosis, through specific doses, acting as a cell growth suppressor20,21. Similar observations were made in this study, which yield significant results in neointimal inhibition with the 15 Gy dose, unlike the arteries exposed to a 60 Gy dose, determining the deleterious effects of radiolesion using the intraarterial radiation technique.
Conclusion
Intraarterial radiation with the absorbed dose of 15 Gy (Sm-153) was adequate to reduce neointimal, media layer and vessel areas. In the absorbed dose of 60 Gy, a significant increase was found in the morphometric variables, in addition to significant abnormal cell patterns, such as xanthomatous cells and hyaline amorphous material. These data are consistent with the effects of arterial radiolesion.
Acknowledgement
Thanks to drs. Karine Dall'Oglio Tolazzi, Priscila Oliveira Silva, and Flávia Ferreira; and also to the postgraduate students Ruy Fernando Kuenzer Caetano da Silva and Manuela Oliveira, for their great help in the experimental phase.
Potencial Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.