abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil Y5hbmbDfSPDVL4rc4rQnkjn 00014 S0066-782X2006001500014 S0066-782X(06)08700214 10.1590/S0066-782X2006001500014 Artigos Originais Resultados iniciais do transplante de células de medula óssea para o miocárdio de pacientes com insuficiência cardíaca de etiologia chagásica Vilas-Boas Fábio Feitos Gilson S. Soares Milena B.P. Mota Augusto Pinho-Filho Joel Alves Almeida Augusto José Gonçalves Andrade Marcus Vinicius Carvalho Heitor G. Dourado-Oliveira Adriano Ribeiro-dos-Santos Ricardo Hospital Santa Izabel Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz Fundação Oswaldo Cruz Brazil 08 2006 87 2 159 166 05 06 2006 28 05 2006 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

OBJETIVO: Avaliar efeitos precoces do transplante de células de medula óssea para o miocárdio de pacientes com insuficiência cardíaca (IC) de etiologia chagásica. MÉTODOS: A amostra consistiu de 28 pacientes, idade média 52,2±9,9 anos, 24 masculinos, 25 em classe NYHA III e 3 em NYHA IV, apesar de tratamento otimizado. O procedimento consistiu na aspiração de 50ml de medula óssea, separação da fração mononuclear e injeção intracoronariana. Foram avaliados os efeitos sobre a fração de ejeção ventricular esquerda (FEVE), distância no teste de 6 minutos, qualidade de vida, classe NYHA, efeitos arritmogênicos e bioquímicos. RESULTADOS: Não houve complicações relacionadas diretamente ao procedimento. A fração de ejeção ventricular esquerda em repouso antes do transplante era 20,1±6,8% e, após 60 dias, aumentou para 23,0±9,0%, p = 0,02. Houve melhora da classe NYHA (3,1±0,3 para 1,8±0,5; p<0.0001); qualidade de vida (50,9±11,7 para 21,8±13,4; p<0.0001); distância caminhada (355±136 m para 443±110 m; p = 0,003). O número de extrassístoles ventriculares em 24h apresentou tendência à elevação (5.322±4.977 para 7.441±7.955; p = 0,062), porém sem incremento dos episódios de taquicardia ventricular (61±127 para 54±127; p = 0,27). CONCLUSÃO: Nossos dados demonstram que a injeção intracoronariana de células mononucleares da medula óssea é exeqüível e sugere ser potencialmente segura e eficaz em pacientes com IC de etiologia chagásica.

 Células-tronco insuficiência cardíaca doença de Chagas terapia celular miocardiopatia dilatada 28 09 2006

ARTIGO ORIGINAL

Resultados iniciais do transplante de células de medula óssea para o miocárdio de pacientes com insuficiência cardíaca de etiologia chagásica

Fábio Vilas-BoasI; Gilson S. FeitosaI; Milena B.P. SoaresII; Augusto MotaI; Joel Alves Pinho-FilhoI; Augusto José Gonçalves AlmeidaI; Marcus Vinicius AndradeI; Heitor G. CarvalhoI; Adriano Dourado-OliveiraI; Ricardo Ribeiro-dos-SantosII

IHospital Santa Izabel, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz

IIFundação Oswaldo Cruz - Salvador, BA

Correspondência

RESUMO

OBJETIVO: Avaliar efeitos precoces do transplante de células de medula óssea para o miocárdio de pacientes com insuficiência cardíaca (IC) de etiologia chagásica.

MÉTODOS: A amostra consistiu de 28 pacientes, idade média 52,2±9,9 anos, 24 masculinos, 25 em classe NYHA III e 3 em NYHA IV, apesar de tratamento otimizado. O procedimento consistiu na aspiração de 50ml de medula óssea, separação da fração mononuclear e injeção intracoronariana. Foram avaliados os efeitos sobre a fração de ejeção ventricular esquerda (FEVE), distância no teste de 6 minutos, qualidade de vida, classe NYHA, efeitos arritmogênicos e bioquímicos.

RESULTADOS: Não houve complicações relacionadas diretamente ao procedimento. A fração de ejeção ventricular esquerda em repouso antes do transplante era 20,1±6,8% e, após 60 dias, aumentou para 23,0±9,0%, p = 0,02. Houve melhora da classe NYHA (3,1±0,3 para 1,8±0,5; p<0.0001); qualidade de vida (50,9±11,7 para 21,8±13,4; p<0.0001); distância caminhada (355±136 m para 443±110 m; p = 0,003). O número de extrassístoles ventriculares em 24h apresentou tendência à elevação (5.322±4.977 para 7.441±7.955; p = 0,062), porém sem incremento dos episódios de taquicardia ventricular (61±127 para 54±127; p = 0,27).

CONCLUSÃO: Nossos dados demonstram que a injeção intracoro­nariana de células mononucleares da medula óssea é exeqüível e sugere ser potencialmente segura e eficaz em pacientes com IC de etiologia chagásica.

Palavras-chave: Células-tronco, insuficiência cardíaca, doença de Chagas, terapia celular, miocardiopatia dilatada.

A capacidade das células-tronco de medula óssea de se diferenciarem em cardiomiócitos tem sido demonstrada principalmente em modelos experimentais de infarto do miocárdio1-3. Embora algum grau de controvérsia exista quanto à plasticidade dessas células, tais observações levaram investigadores a examinarem, em humanos, o papel dessas células no tratamento do infarto do miocárdio e da insuficiência cardíaca (IC) de etiologia isquêmica, com resultados iniciais promissores4-6.

No Brasil, a doença de Chagas é um dos principais contribuintes do quadro nosológico da insuficiência cardíaca. Estimativas sorológicas mostram que, no Brasil, oito a nove milhões de pessoas são infectadas pelo Trypanosoma cruzi e que 30 a 40% delas podem ter algum grau de comprometimento cardíaco7. Os pacientes portadores de insuficiência cardíaca devida à cardiopatia chagásica crônica evoluem com grave disfunção sistólica devida à miocardite crônica e conseqüente fibrose8.

Os mecanismos etiopatogênicos e fisiopatológicos que promovem a doença de Chagas tornam a terapia com células-tronco atraente. A presença de miocardite persistente e a demonstração da produção aumentada de citocinas pelo miocárdio de pacientes com IC de etiologia chagásica sugerem a existência de um ambiente atrativo para o "homing" e para a fixação das células-tronco9. Portanto, ao contrário do tratamento de outras cardiopatias onde pouca inflamação é encontrada, na cardiopatia chagásica pode-se supor que células-tronco circulantes migrem para o miocárdio, recrutadas pelos sinais inflamatórios difundidos por todo o órgão.

Estudos sobre o uso de células-tronco de medula óssea no tratamento da cardiomiopatia chagásica crônica experimental demonstraram que camundongos chagásicos crônicos apresentaram uma significativa diminuição da inflamação e regressão da fibrose após dois meses de tratamento com células de medula óssea adultas, em comparação com animais controle10.

O relato do primeiro caso de transplante de células-tronco de medula óssea para o miocárdio de paciente com insuficiência cardíaca de etiologia chagásica foi feito por nosso grupo e revelou melhora da função ventricular, qualidade de vida e capacidade funcional11.

O objetivo do presente estudo é avaliar a exeqüibi­lidade e segurança do transplante autólogo de células mononucleares da medula óssea em pacientes portado-res de insuficiência cardíaca de etiologia chagásica, bem como identificar evidências iniciais de eficácia do procedimento.

MÉTODOS

Foi delineado um ensaio clínico de fase 1, aberto, não-controlado, de casos selecionados de IC crônica de etiologia chagásica, realizado em centro único, no Hospital Santa Izabel da Santa Casa de Misericórdia da Bahia, no Brasil.

Foram incluídos, consecutivamente, pacientes com IC crônica, de etiologia chagásica, com fração de ejeção de ventrículo esquerdo (VE) menor que 40% ao ecocardiograma, de ambos os sexos, idades entre 20 e 70 anos e em classes funcionais III e IV (NYHA), em uso de terapia crônica otimizada para ICC (digoxina, diuréticos, inibidores da enzima conversora de angiotensina, com ou sem betabloqueador ou antagonistas dos receptores de angiotensina II), e que se mantivessem estáveis nessa condição no mês que antecedeu ao experimento.

Foram excluídos pacientes com presença de outras afecções patológicas sistêmicas associadas; tais como infecções ou neoplasias; doenças auto-imunes; doenças neurodegenerativas; insuficiência cardíaca aguda ou descompensada agudamente; doenças hematológicas prévias; coagulopatias; insuficiência hepática; insuficiência renal moderada (creatinina acima de 2 mg/dl); história prévia de doença pulmonar obstrutiva crônica; implante de marca-passo ressincronizador interventricular há menos de 90 dias; mulheres com potencial de engravidar e pacientes com doença arterial coronariana detectada previamente ou após realização de coronariografia.

O presente protocolo foi aprovado pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (Registro CONEP nº 4108; Processo nº 25000.054219/2002/20). Os pacientes foram detalhadamente informados sobre todos os procedimentos de investigação e, após leitura completa e aceitação por escrito do termo de consentimento livre e esclarecido, foram incluídos no estudo.

Todos os pacientes foram submetidos à avaliação clínica inicial, com registro basal de dados clínicos e das seguintes variáveis: a) Classe funcional (NYHA), b) Escore de qualidade de vida do "Minnesota Living With Heart Failure Questionnaire"; c) Avaliação hematológica e bioquímica; d) Eletrocardiograma de 12 derivações; e) Ecocardiograma transtorácico; f) Ventriculografia radioisotópica; g) Teste de caminhada de 6 minutos; h) Holter 24h. Após o procedimento os pacientes eram encaminhados para a Unidade de Terapia Intensiva, onde permaneciam monitorizados por, pelo menos 24h. Não havendo intercorrências, eram transferidos para a enfermaria, onde permaneciam até completar o mínimo de 05 dias de acompanhamento hospitalar. Toda a avaliação clínica, laboratorial e por exames complementares foi repetida após 30 e 60 dias.

Para avaliar a ocorrência de possível dano miocárdico pela injeção de células de medula óssea no coração, foram realizados, seriadamente (a cada 6h durante as primeiras 24h), dosagens de marcadores de necrose miocárdica (CK-MB e troponina I), assim como eletrocardiogramas. Para investigar o potencial desencadeamento de arritmias cardíacas como complicação da injeção de células, os pacientes foram submetidos a avaliações com eletrocardiografia ambulatorial (sistema Holter) 24h antes do procedimento e periodicamente desde então (após 24 h, 30 d e 60 d).

Transplante de células-tronco -Na manhã do procedimento os pacientes eram encaminhados ao centro de hemodinâmica, em jejum. De cada paciente eram aspirados 50 ml de conteúdo da medula óssea através de cinco punções da crista ilíaca posterior direita e cinco da crista ilíaca posterior esquerda, cada uma com retirada de cinco ml, sob anestesia local com lidocaína 2% e sedação venosa com midazolan. O aspirado de medula era submetido a processo de filtragem de resíduos de gordura e fragmentos ósseos (filtro de aço inoxidável, Universidade de Washington), seguido de centrifugação por gradiente de Ficoll Hystopaque (Amersham Pharmacia, produto licenciado para uso humano). A fração de células mononucleares isolada era então diluída em solução salina estéril e centrifugada novamente. Uma amostra era submetida à contagem e ao teste de viabilidade celular. Ao término do processo, a amostra era diluída em 20 ml de salina. Imediatamente antes da injeção intracoronária, os pacientes eram submetidos a cateterismo cardíaco esquerdo por punção femoral, seguido de coronariografia. Havendo evidências de doença coronariana hemodinamicamente significativa (estenoses > 50%) o paciente era excluído do estudo. A solução contendo as células era injetada lentamente, durante 10 minutos, no sistema coronariano direito e esquerdo. Dez ml da solução eram injetados na artéria coronária descendente anterior, 5 ml na artéria coronária direita e 5 ml na artéria circunflexa esquerda.

Após 25 dias do procedimento, os pacientes recebiam injeções diárias por via SC durante cinco dias de G-CSF humano (Granulokine®) na dose de 5 mcg/kg/dia para induzir a mobilização de células-tronco da medula óssea para o sangue periférico, com o objetivo de promover reforço de oferta de células-tronco para o reparo das lesões. Em estudos realizados utilizando um modelo experimental de miocardite chagásica, a combinação da terapia celular com o tratamento com G-CSF causou uma redução significativamente maior do número de células inflamatórias do que somente a terapia celular (dados não publicados).

O teste de caminhada de 6 minutos foi realizado conforme protocolo utilizado por Bitner e cols. no estudo SOLVD12. Após 15 minutos de descanso, um novo teste era realizado e a média das distâncias caminhadas nos dois testes era empregada como resultado. Para a avaliação da qualidade de vida, foi utilizado o questionário da Universidade de Minnesota "Living with Heart Failure Questionnaire"13, validado em nosso país por Carrara e cols14. As avaliações ecocardiográficas foram realizadas pelo mesmo observador, que não tinha acesso aos exames anteriores, em equipamento da marca Hewllet Packard, modelo Sonos 5500 (Seattle, WA, EUA), sendo utilizado o método de Simpson modificado, para obtenção da fração de ejeção do ventrículo esquerdo15,16. As gravações do Holter foram feitas em equipamento digital da marca Dynamis modelo 3000 ECO e analisadas em equipamento Burdick, com software AltairPC Holter System.

Análise estatística - A análise estatística foi realizada, utilizando-se o programa SPSS (Statistical Package for Social Sciences) for Windows versão 9.0. As variáveis contínuas foram expressas em médias ± desvios-padrão. Para testar a normalidade da distribuição das variáveis, foi aplicado o teste de Kolmogorov-Smirnov. Como as variáveis apresentavam distribuição não normal, foram utilizados testes não-paramétricos. Todas as comparações foram bicaudais. Foram considerados estatisticamente significantes os valores de p < 0,05.

Fontes de financiamento do estudo - Esse estudo contou com o financiamento das seguintes instituições: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB); Financiadora de Estudos e Projetos do CNPq (FINEP) e Instituto do Milênio de Bioengenharia Tecidual. Os autores declaram não ter nenhum tipo de conflito de interesses.

RESULTADOS

Foram selecionados 30 pacientes, sendo dois excluídos após a coleta de medula óssea: um paciente por doença coronariana após cateterismo e outro paciente por problemas técnicos com o equipamento. As principais características dos 28 pacientes estudados se encontram descritas na tabela 1. A análise do perfil clínico revela uma população com avançado estágio da doença e vários marcadores de gravidade. Todos os pacientes estavam extremamente limitados, em classes funcionais III e IV, apesar de tratamento clínico otimizado com múltiplos agentes e doses elevadas de diuréticos. Observa-se baixa capacidade funcional, avaliada pela pequena distância percorrida em 6 minutos, e a qualidade de vida se encontrava gravemente comprometida, evidenciada pelo elevado escore no questionário de Minnesota. A função ventricular se encontrava gravemente deprimida, com fração de ejeção muito baixa e elevado diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo demonstrados pelo exame ecocardiográfico. A presença de marcante hiponatremia e disfunção renal caracteriza a gravidade dessa população.

Não houve nenhuma complicação relacionada diretamente ao procedimento de coleta ou injeção das células. Os testes de viabilidade indicaram que 96 ± 6,5 % das células eram viáveis. Os marcadores de necrose miocárdica não se alteraram significativamente em 24h, assim como não ocorreram alterações eletrocardiográficas que sugerissem isquemia ou infarto.

Para testar se o implante miocárdico de células-tronco estaria associado à indução de arritmias, o perfil arritmogênico foi avaliado pelo total de extrassístoles ventriculares em 24h, bem como do seu padrão de agrupamento e recorrência. Não foi observada mudança significativa no perfil arritmogênico, embora houvesse tendência não-significativa ao aumento do número de extrassístoles ventriculares em 24h (figura 1), sem mudança no número de episódios de taquicardia ventricular (figura 2).

Ocorreram três óbitos no seguimento de 2 meses de acompanhamento, todos durante o segundo mês (paciente #04, masculino, 37 anos, hemorragia pulmonar e insuficiência respiratória; paciente #16, feminino, 34 anos, morte súbita; paciente #27, 69 anos, masculino, insuficiência cardíaca terminal). Embora esse não seja um estudo de avaliação de eficácia e o parâmetro mortalidade não possa ser avaliado como desfecho de segurança, exceto pela associação causal de temporariedade imediata, não identificamos associação causal direta entre o desfecho morte e o procedimento de transplante. Não ocorreram neoplasias, doenças hematológicas, coagulopatias ou qualquer outro tipo de doença que pudesse ser atribuída à injeção das células ou ao seu implante.

A função ventricular apresentou melhora significativa logo após um mês do procedimento, melhora essa que se manteve aos dois meses (figura 3).

A avaliação da qualidade de vida através do ques­tionário de Minnesota revelou melhora significativa do escore global, também com 1 mês, mantida ao longo do período observado (figura 4).

A capacidade funcional avaliada pela distância caminhada no teste de seis minutos em corredor apresentou melhora significativa, mantida por dois meses (figura 5).

Quando analisamos a classe funcional como variável ordinal, observamos redução do valor médio de classe funcional da NYHA, já com 1 mês de acompanhamento, que foi mantida ao longo do período observado (figura 6).

A avaliação bioquímica revelou correção do nível sérico de sódio, entre 72h e três semanas do tratamento, correção esta que se manteve durante os dois meses de observação inicial do estudo (figura 7).

DISCUSSÃO

Esse é o primeiro estudo a relatar a aplicação de células mononucleares da medula óssea em pacientes com insuficiência cardíaca de etiologia chagásica e o primeiro estudo de terapia celular utilizando modelo não-isquêmico. O nosso modelo envolveu a administração intracoronariana de células, associada ao estímulo medular com filgrastina subcutânea após 30 dias.

A gravidade dos pacientes do presente estudo é maior que a observada em outros estudos de células-tronco devida a cardiopatia isquêmica, que, via de regra, apresentavam disfunção ventricular, disfunção renal e hiponatremia de menor magnitude. O número de células injetadas no presente estudo também foi maior que em outros previamente publicados. Não está claro se há uma relação entre o número de células injetadas e o grau de resposta clínica da terapia celular, mas essa é uma hipótese que precisa ser mais bem explorada.

A observação da não ocorrência de eventos adversos relacionados diretamente ao procedimento indica que o procedimento é exeqüível, desde que seguidos os protocolos implementados no presente estudo, visando a proteção e segurança do paciente.

Um dos aspectos de segurança mais importantes analisados foi a possibilidade de a injeção de células de medula óssea no sistema coronariano causar infarto agudo do miocárdio. Para tanto, foram feitas dosagens de troponina I, CK-MB e análises seriadas de ECG, que não evidenciaram lesão miocárdica, sugerindo que esse procedimento é seguro em relação à indução de isquemia.

Outro importante parâmetro analisado foi o potencial de indução de arritmias. Estudos prévios com o emprego de células-tronco de músculo esquelético (satélites) apresentaram resultados promissores com restauração parcial da função cardíaca, porém tem havido preocupações quanto ao aparecimento de arritmias em pacientes que receberam o tratamento com este tipo celular17,18. Em nosso estudo, detectamos aumento não-significativo do número de extrassístoles ventriculares isoladas, sem incremento do número de episódios de taquicardia ventricular sustentada ou não.

Em relação aos parâmetros de eficácia, a magnitude dos incrementos na fração de ejeção que observamos foi maior que os descritos previamente em outros estudos. No estudo BOOST19, a FEVE média era 52% e os autores detectaram um aumento médio de 5%, que corresponde a cerca de 10% de aumento relativo. No presente estudo, nós detectamos um aumento médio semelhante, que corresponde no entanto, a aumento relativo de aproximadamente 20%, já que a FEVE dos nossos pacientes era significativamente menor.

Um achado que chama a atenção é a melhora de qualidade de vida e capacidade funcional. Os pacientes desse estudo estavam em tratamento otimizado, em uso de múltiplos fármacos, em doses otimizadas e persistiam com severa limitação de capacidade funcional e de qualidade de vida. De forma consistente, os pacientes apresentaram melhora da qualidade de vida avaliada pelo questionário de Minnesota, que reflete não apenas parâmetros de dispnéia, mas também aspectos emocionais, psicológicos, econômicos e profissionais. Observação semelhante foi evidenciada em relação a variáveis mais objetivas, como a distância caminhada em 6 min, que é uma medida de exercício em níveis submáximos. Consistente com as variações acima, verificou-se melhora significativa na capacidade funcional avaliada pela classificação da NYHA. Embora aspectos motivacionais possam estar relacionados com essas variáveis subjetivas, a consistência na modificação sugere que é provável haver, realmente, um efeito clínico subjacente. Todos esses achados ocorreram com apenas um mês do tratamento, o que seria precoce demais para considerar devido aos efeitos de transdiferenciação ou fusão celular. Nesse sentido, evidências recentes indicam que o mecanismo de ação que ocorre com o implante de células-tronco envolveria três fenômenos distintos: transdiferenciação, fusão celular e efeitos parácrinos. Essa hipótese se baseia na observação de que efeitos mensuráveis podem ser demonstrados tão cedo quanto apenas 72h20.

Variáveis mais objetivas, independentes da influência de motivação ou sugestão do paciente, bem como de interferência do pesquisador, nos indicam que a terapia empregada exerceu efeitos biológicos positivos. Hiponatremia, por exemplo, é um dos mais importantes marcadores prognósticos na ICC avançada, e o seu mecanismo fisiopatológico está relacionado à ativação neuro-humoral da síndrome21. A identificação da correção da hiponatremia em duas semanas, no presente estudo, revela um achado difícil de ser observado na prática clínica, onde mesmo após intervenções terapêuticas otimizadas, dificilmente se observa correção de hiponatremia em pacientes graves.

Os resultados descritos acima, de um modo geral, abrem novas perspectivas para o tratamento de doenças cardíacas através da utilização do potencial regene­rador das células-tronco. Nossos dados sugerem que o transplante de células-tronco de medula óssea para o miocárdio de pacientes com insuficiência cardíaca de etiologia chagásica é exeqüível, potencialmente seguro e eficaz, trazendo alívio sintomático e melhora de qualidade de vida a uma significativa parcela da população brasileira afetada pelo Mal de Chagas. No entanto, é bastante clara a necessidade de se desenvolver novos estudos no sentido de se esclarecer os mecanismos que levam à melhora pós-terapia, assim como estabelecer protocolos mais eficazes e determinar possíveis riscos e limitações das metodologias empregadas. Embora a identificação precisa das subpopulações envolvidas no processo de reparo seja uma questão importante a ser investigada, deve-se avaliar cautelosamente se processos de purificação destas populações, certamente mais onerosos do que a simples purificação da fração mononuclear que já vem sendo empregada em estudos clínicos, trará maior benefício para os pacientes.

A confirmação desses nossos achados em seguimento mais duradouro, assim como em estudos randomizados e controlados, poderá criar uma nova linha terapêutica que será disponível universalmente, a baixíssimo custo, sem rejeição, sem medicação especifica, mais fisiológica, menos agressiva e com possibilidades múltiplas de repetição.

Agradecimentos

Os autores desejam expressar seus agradecimentos às enfermeiras Cristiane Carvalho e Aline Bernardes, do Núcleo de Pesquisas em Cardiologia do Hospital Santa Izabel, pela assistência aos pacientes durante todo o estudo. A contribuição de Daniele Brustolim, do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz – Fundação Oswaldo Cruz – Bahia nos procedimentos de separação celular é reconhecido com destaque.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflitos de interesses pertinentes.

Fábio Vilas-Boas

Praça Almeida Couto, 500

Nazaré - 40050-410, Salvador - BA

E-mail:

fabiovboas@cardiol.br

Recebido em 28/05/06

Aceito em 05/06/06

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OBJECTIVE: To evaluate early effects of bone marrow cell transplantation to the myocardium of patients with heart failure (CHF) due to Chagas disease. METHODS: We studied 28 patients (mean age 52.2 ± 9.9), of whom 24 were male. Despite optimized treatment, 25 patients were in NYHA class III and three patients, in NYHA class IV. The procedure consisted of aspiration of 50 mL of bone marrow, separation of the mononuclear fraction, and intracoronary injection. Effects on left ventricle ejection fraction (LVEF), distance walked in the six-minute walking test, quality-of-life, NYHA class, arrhythmogenic and biochemical parameters, were all evaluated. RESULTS: There were no complications directly related to the procedure. Baseline left ventricular ejection fraction was 20.1 ± 6.8%, and 60 days after transplantation it increased to 23.0 ± 9.0%, p = 0.02. Significant improvements were observed in the NYHA class (3.1 ± 0.3 to 1.8 ± 0.5; p < 0.0001); quality-of-life (50.9 ± 11.7 to 21.8 ± 13.4; p < 0.0001); and distance walked in six minutes (355 ± 136 m to 443 ± 110 m; p = 0,003). The number of ventricular premature beats in 24 hours tended to increase (5,322 ± 4,977 to 7,441 ± 7,955; p = 0,062), but without increase in ventricular tachycardia episodes (61 ± 127 to 54 ± 127; p = 0.27). CONCLUSION: Our data demonstrate for the first time that intracoronary injection of bone marrow mononuclear cells is feasible and suggest that it may be potentially safe and effective in patients with CHF due to Chagas disease.

 Stem cell heart failure Chagas disease cell therapy dilated cardiomyopathy

ORIGINAL ARTICLE

Early results of bone marrow cell transplantation to the myocardium of patients with heart failure due to chagas disease

Fábio Vilas-BoasI; Gilson S. FeitosaI; Milena B.P. SoaresII; Augusto MotaI; Joel Alves Pinho-FilhoI; Augusto José Gonçalves AlmeidaI; Marcus Vinicius AndradeI; Heitor G. CarvalhoI; Adriano Dourado-OliveiraI; Ricardo Ribeiro-dos-SantosII

IHospital Santa Izabel - Salvador, BA - Brazil

IICentro de Pesquisas Gonçalo Moniz – Fundação Oswaldo Cruz - Salvador, BA - Brazil

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ABSTRACT

OBJECTIVE: To evaluate early effects of bone marrow cell transplantation to the myocardium of patients with heart failure (CHF) due to Chagas disease.

METHODS: We studied 28 patients (mean age 52.2 ± 9.9), of whom 24 were male. Despite optimized treatment, 25 patients were in NYHA class III and three patients, in NYHA class IV. The procedure consisted of aspiration of 50 mL of bone marrow, separation of the mononuclear fraction, and intracoronary injection. Effects on left ventricle ejection fraction (LVEF), distance walked in the six-minute walking test, quality-of-life, NYHA class, arrhythmogenic and biochemical parameters, were all evaluated.

RESULTS: There were no complications directly related to the procedure. Baseline left ventricular ejection fraction was 20.1 ± 6.8%, and 60 days after transplantation it increased to 23.0 ± 9.0%, p = 0.02. Significant improvements were observed in the NYHA class (3.1 ± 0.3 to 1.8 ± 0.5; p < 0.0001); quality-of-life (50.9 ± 11.7 to 21.8 ± 13.4; p < 0.0001); and distance walked in six minutes (355 ± 136 m to 443 ± 110 m; p = 0,003). The number of ventricular premature beats in 24 hours tended to increase (5,322 ± 4,977 to 7,441 ± 7,955; p = 0,062), but without increase in ventricular tachycardia episodes (61 ± 127 to 54 ± 127; p = 0.27).

CONCLUSION: Our data demonstrate for the first time that intraco­ronary injection of bone marrow mononuclear cells is feasible and suggest that it may be potentially safe and effective in patients with CHF due to Chagas disease.

Key words: Stem cell, heart failure, Chagas disease, cell therapy, dilated cardiomyopathy.

The ability of bone marrow stem cells to differentiate into cardiomyocytes has been demonstrated especially in experimental models of myocardial infarction1-3. Although some degree of controversy regarding stem cell plasticity exists, such observations have led investigators to examine, in humans, their role in the management of myocardial infarction and heart failure of ischemic etiology, and the first results are promising4-6.

In Brazil, Chagas disease is one of the main contributors to the nosological description of heart failure. Serological estimates show that eight or nine million Brazilians are infected by Trypanosoma cruzi, and that 30 to 40% of them may have some degree of cardiac involvement7. Patients with heart failure secondary to chronic Chagas heart disease progress to severe systolic dysfunction due to the chronic myocarditis and consequent fibrosis8.

The etiopathogenic and pathophysiological mechanisms involved in Chagas disease make stem cell therapy attractive. Both the presence of persistent myocarditis and increased production of cytokines by the myocardium in patients with CHF due to Chagas disease suggest the existence of an attractive environment for stem cell homing and adhesion9. Therefore, unlike the management of other heart diseases in which little inflammation is found, in Chagas heart disease it may be assumed that circulating stem cells migrate to the myocardium, recruited by the inflammatory signals spread throughout the organ.

Experimental studies using stem cells derived from bone marrow to treat chronic Chagas cardiomyopathy demonstrate that, two month after treatment with adult bone marrow cells, chronic chagasic mice showed a significant reduction in inflammation and fibrosis, compared with control animals10.

The first case of bone marrow stem cell transplantation to the myocardium of a patient with heart failure secondary to Chagas disease was reported by our group, leading to improvement in ventricular function, quality of life, and functional capacity11.

This study was designed to assess the safety and feasibility of autologous bone marrow mononuclear cell (BM-MNC) transplantation in patients with heart failure due to Chagas disease, as well as identify early evidence supporting the effectiveness of the procedure.

METHODS

The study was an open-label, uncontrolled, single-center, phase-1 clinical trial carried out at the Santa Izabel Hospital of the Santa Casa de Misericórdia da Bahia, Brazil, involving selected patients with CHF secondary to Chagas disease.

Patients who met the following inclusion criteria were consecutively included in the study: subjects of both genders, ranging from 20 to 70 years, with CHF due to Chagas disease, left ventricle (LV) ejection fraction less than 40% on echocardiogram, functional class III and IV (NYHA), receiving optimal chronic treatment to CHF (digoxin, diuretics, angiotensin-converting enzyme inhibitors, with or without beta-blockers or angiotensin-II receptor antagonists), and who remained stable in this condition in the month prior to the experiment.

We excluded patients with associated systemic conditions, such as infections or neoplasias, autoimmune diseases, and neurodegenerative diseases; acute or acutely decompensated heart failure; previous hematologic diseases; coagulopathies; liver failure; moderate renal failure (creatinine above 2 mg/dL); previous history of chronic obstructive pulmonary disease (COPD); implantation of biventricular resynchronization pacemaker in the previous 90 days; women of childbearing potential, and patients with coronary artery disease detected previously or after coronary angiography.

This protocol was approved by CONEP (Brazilian National Committee for Ethics in Research) under No. 4108; Case No. 25000.054219/2002/20). Patients were fully informed about study procedures and, after reading and signing the informed consent, they were included in the study.

All patients underwent a baseline clinical evaluation, and the following clinical data and variables were recorded: a) functional class (NYHA), b) quality-of-life score of the "Minnesota Living With Heart Failure Questionnaire"; c) hematological and biochemical assessment; d) twelve-lead electrocardiogram; e) transthoracic echocardiogram; f) radionuclide ventriculography; g) six-minute walk test; g) 24-hour Holter. After the procedure, patients were referred to the Intensive Care Unit, where they were monitored for at least 24 hours. If everything went uneventfully, they were transferred to the regular ward where remained for a minimum of five days for in-hospital follow-up. All clinical evaluation, laboratory tests and complementary exams were repeated after 30 and 60 days.

To check for any possible myocardial damage caused by bone marrow cell injection, serial measurements (every six hours during the first 24 hours) of markers of myocardial damage (CK-MB and troponin I), as well as electrocardiograms, were performed. To investigate the development of cardiac arrhythmias as a complication of cell injection, patients underwent ambulatory electrocardiography (Holter) 24 hours before the procedure and periodically thereafter (after 24 hours, 30 days and 60 days).

Stem cell transplantation - In the morning before the procedure, patients were referred to the cath lab after overnight fasting. Fifty ml of bone marrow content were aspirated from every patient through five punctures in the right posterior iliac crest and five in the left posterior iliac crest, 5 ml per puncture, under local anesthesia with 2% lidocaine and intravenous sedation using midazolam. The harvested aspirate was filtered to remove bone marrow debris, such as fat and bone fragments (stainless steel mesh, Washington University), and centrifuged by Ficoll Hystopaque gradient (Amersham Pharmacia, a product licensed for clinical use in humans). The isolated mononuclear cell fraction was then diluted in sterile saline solution and centrifuged again. One sample was used for cell count and viability test. At the end of the process, samples were diluted in 20 ml of saline solution. Immediately before intracoronary injection, patients underwent left heart catheterization by the femoral approach followed by coronary angiography. Patients with evidence of hemodynamically significant coronary disease (stenosis > 50%) were excluded from the study. The cell solution was slowly injected, during 10 minutes, into the right and left coronary system. Ten ml of the solution was injected in the anterior descending artery, 5 ml in the right coronary artery, and 5 ml in the left circumflex artery.

Twenty-five days later, patients received daily subcutaneous injections of human G-CSF (Granulokine®) for five days, at a dose of 5 mcg/kg/day, to induce mobilization of bone marrow stem cells to peripheral blood, so that a greater number of stem cells would be available for injury repair. In studies using an experimental model of chagasic myocarditis, combined cell therapy and G-CSF treatment led to a significantly greater decrease in the number of inflammatory cells than cell therapy alone (unpublished data).

The six-minute walk test was performed according to the protocol used by Bitner et al. in the SOLVD study12. After a fifteen-minute rest, a new test was carried out, and the average of the distances walked in the two tests was used as the result. Quality of life was assessed by the "Living with Heart Failure Questionnaire" developed by the University of Minnesota13 and validated by Carrara et al. in Brazil14. Echocardiographic studies were conducted by the same observer, blind to previous examinations, on a Hewlett-Packard Sonos 5500 System (Seattle, WA, EUA). Left ventricular ejection fraction was calculated according to the modified Simpson’s rule15,16.Holter monitoring was performed with a Dynamis 3000 ECO recorder and analyzed in a Burdick machine using AltairPC Holter System software.

Statistical analysis - Statistical analysis was performed using SPSS (Statistical Package for Social Sciences) for Windows version 9.0. Continuous variables were presented as mean ± standard deviation. Variable distribution was assessed by the Kolmogorov-Smirnov test. Since variables were not normally distributed, non-parametric tests were used. All comparisons were two-tailed. P values < 0.05 were considered statistically significant.

Funding sources - This study was financially supported by the following institutions: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB); Financiadora de Estudos e Projetos do CNPq (FINEP), and Instituto do Milênio de Bioengenharia Tecidual. The authors declare that they have no conflict of interest.

RESULTS

Thirty patients were selected, but two were excluded after bone marrow collection: one patient due to coronary disease detected by catheterization and the other due to technical problems with the equipment. The primary characteristics of the 28 patients studied are described in Table 1.

An analysis of the clinical profile reveals a population with advanced stage of the disease and various markers of severity. All patients were extremely limited, in functional class III and IV, despite optimal treatment with a multi-drug regimen and high doses of diuretics. Functional capacity was found to be low, based on the short distance covered during the six-minute walking test, and quality-of-life was severely impaired, as indicated by high scores on the Minnesota questionnaire. Ventricular function was severely depressed, with very low ejection fraction and high left ventricular diastolic diameter on the echocardiogram. The presence of marked hyponatremia and renal dysfunction characterizes the severe condition of this population.

There were no complications directly related to either bone marrow aspiration or cell injection. Viability tests showed that 96 ± 6.5 % of the cells were viable. Neither significant changes in myocardial necrosis markers in 24 hours nor electrocardiographic changes suggestive of ischemia or infarction occurred.

In order to check if the myocardial implantation of stem cells was associated with arrhythmias, the arrhythmogenic profile was evaluated through the total number of ventricular extrasystoles in 24 hours, as well as their clustering and recurrence pattern. No significant change was found in the arrhythmogenic profile, despite a non-significant trend for increase in the number of ventricular premature beats in 24 hours (Figure 1), with no change in the number of ventricular tachycardia episodes (Figure 2).

There were three deaths during the two-month follow-up, all during the second month (patient 04, male, age 37, pulmonary hemorrhage and respiratory failure; patient 16, female, age 34, sudden death; patient 27, age 69, male, end-stage heart failure). Although this study was not designed to assess efficacy, and that mortality cannot be evaluated as a safety endpoint, except by the causal association of immediate temporariness, no direct causal association was found between death and cell transplantation. There were no neoplasias, hematological diseases, coagulopathies or any other kind of disease that could be attributed to cell injections or their implantation.

Ventricular function, evaluated by left ventricular ejection fraction showed significant improvement one month after the procedure, which was maintained at two months (Figure 3).

Quality of life assessment by the Minnesota Living with Heart Failure questionnaire revealed significant improvement in the global score, also at one month and was maintained throughout the follow-up period (Figure 4).

Functional capacity, as measured by the distance walked during the six-minute corridor walk test, showed significant improvement, which was maintained for two months (Figure 5).

When functional class was analyzed as an ordinal variable, a decrease in mean NYHA functional class was noted after one month and maintained over the follow-up period (Figure 6).

Biochemical analysis showed correction of serum sodium concentration between 72 hours and three weeks of treatment, which was maintained over the first two-months of study follow-up (figure 7).

DISCUSSION

This is the first study to report the implantation of bone marrow mononuclear cells in patients with heart failure due to Chagas disease and the first cell therapy study using a non-ischemic model. Our model involved intracoronary administration of stem cells, followed by bone marrow stimulation with subcutaneous filgrastim after 30 days.

Patients in this study are more severe than those previously reported in other stem-cell studies of ischemic etiology. In the other studies, patients had milder degrees of ventricular dysfunction, renal dysfunction and hyponatremia. The number of injected cells in the present study was greater than that of previously published studies. Whether there is a relationship between the number of cells injected and the degree of clinical response to cell therapy remains unclear, but this hypothesis warrants further investigation.

The absence of adverse events directly related to the procedure indicates that this is feasible, provided that the protocols implemented in this study are followed, as they aim at the patient’s protection and safety.

One of the most relevant aspects analyzed regarding safety was whether bone marrow cell injection into the coronary system could trigger acute myocardial infatction. To ascertain this, troponin I and CK-MB measurements were performed, as well as serial electrocardiograms, which showed no evidence of myocardial injury, thus suggesting that this procedure is safe regarding ischemia inducement.

Another important parameter analyzed was the potential to induce arrhythmias. Previous studies using skeletal muscle stem cells (satellite cells) have shown promising results, with partial recovery of cardiac function; yet, there has been concern regarding the development of arrhythmias in patients that underwent this kind of cell therapy17,18. In our study, the number of isolated ventricular extrasystoles increased significantly, but the number of sustained or nonsustained ventricular tachycardia episodes remained unchanged.

As far as parameters related to efficacy are concerned, LVEF increments were similar to those described in previous studies. In the BOOST study19, mean LVEF was 52%, and the authors detected an increase of 5%, on average, corresponding to around 10% of relative increase. In the present study, mean LVEF increase was similar; yet, it corresponds to approximately 20% of relative increase, since LVEF of our patients was significantly lower.

One finding that calls attention is the improvement in quality of life and functional capacity. Despite being on optimal treatment and multi-drug regimen in optimal doses, patients’ functional capacity and quality of life remained severely impaired. However, their quality of life improved consistently, as evaluated by the Minnesota questionnaire, which reflects not only dyspnea parameters, but also emotional, psychological, economic, and professional aspects. The same was true with respect to more objective variables, as distance covered during the six-minute walk test, which measures exercise capacity at submaximal levels. Consistent with the variations mentioned above, there was a significant improvement in functional capacity, as assessed by the NYHA classification. While motivational aspects may be related to these subjective variables, the consistent modification suggests that an underlying clinical effect is likely to exist. All these findings were observed only one month after treatment, too early to be considered an effect of transdifferentiation or cell fusion. In that regard, recent evidence indicates that the mechanism of action associated with stem cell transplantation may involve three different phenomena: transdifferentiation, cell fusion, and paracrine effects. This hypothesis is based on the observation that measurable effects may be demonstrated as early as 72 hours20.

More objective variables, irrespective of motivation or self-suggestion by the patient, as well as investigator interference, indicate that the therapy used produced positive biological effects. Hyponatremia, for example, is one of the most important prognostic markers in advanced CHF, and its pathophysiological mechanism is related to the neurohumoral activation of the syndrome21. The hyponatremia correction achieved within two weeks in this study is uncommon in clinical practice, where it is hardly ever observed in severely ill patients, even after optimal therapeutic interventions.

Overall, the above-mentioned results open new perspectives for the treatment of heart diseases through the regenerating capacity of stem cells. Our data suggest that transplantation of bone marrow mononuclear cells to the myocardium of patients with heart failure due to Chagas disease is feasible, potentially safe, and effective, bringing symptomatic relief to and improving the quality of life of a significant portion of the Brazilian population affected by Chagas disease. On the other hand, further studies focused on elucidating the mechanisms leading to improvement after therapy are clearly needed, as well as establishing more effective protocols and determining potential risks and limitations associated with the methodologies used. While the accurate identification of subpopulations involved in the repair process is an important issue that warrants investigation, it is essential to evaluate cautiously whether other methods for purifying these subpopulations, indeed more expensive than the simple purification of the mononuclear fraction used today in clinical trials, will bring more benefit to patients.

The corroboration of our findings in a longer-term follow-up, as well as in randomized controlled clinical trials, may provide a new therapeutic line available worldwide at a very low cost and with no rejection, requiring no specific medication and that is more physiological, less aggressive and allows multiple repetitions.

Acknowledgement

The authors would like to express their appreciation to Cristiane Carvalho and Aline Bernardes, nurses of the Núcleo de Pesquisas em Cardiologia of the Hospital Santa Izabel, for the patients assistance throughout the study. The contribution of Daniele Brustolim, of the Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz – Fundação Oswaldo Cruz – Bahia, is particularly acknowledged.

Potencial Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

REFERENCES

Fábio Vilas-Boas

Praça Almeida Couto, 500, Nazaré

40050-410, Salvador - BA - Brazil

E-mail:

fabiovboas@cardiol.br

Received on 05/28/06

Accepted on 06/05/06