abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil x6sk7J84m9zsYR5kQYvk8Yy 00005 S0066-782X2006000600005 S0066-782X(06)08600605 10.1590/S0066-782X2006000600005 Artigos Originais Critérios ecocardiográficos para definição de graus de disfunção ventricular em ratos portadores de estenose aórtica Moreira Vanessa Oliveira Castro Ana Valéria Barros de Yaegaschi Marcelle Yumi Cicogna Antonio Carlos Okoshi Marina Politi Pereira Camila Alves Aragon Flávio Ferrari Bruno Mário Batista Padovani Carlos Roberto Okoshi Katashi Botucatu São Paulo Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina de Botucatu Instituto de Biociências de Botucatu Brazil 06 2006 86 6 432 438 11 11 2005 05 08 2005 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi identificar variáveis ecocardiográficas que definam graus de disfunção cardíaca em ratos com estenose aórtica (EAo). MÉTODOS: Ratos Wistar (n = 23), machos (90-100 g), foram submetidos a cirurgia para indução de EAo. As variáveis ecocardiográficas analisadas foram: diâmetros diastólico do ventrículo esquerdo (DDVE) e sistólico do átrio esquerdo em valores absolutos e normalizados para o peso corporal; diâmetro sistólico do VE (DSVE); três índices de encurtamento do VE (% de encurtamento endocárdico, %Enc.Endo; % de encurtamento miocárdico, %Enc.Mio; e velocidade de encurtamento da parede posterior do VE, VEPP); e índice de massa do VE (IMVE). Essas variáveis foram utilizadas para a análise de agrupamento ("cluster analysis"). RESULTADOS: A análise de agrupamento possibilitou separar os ratos com EAo em dois grupos: disfunção leve (n = 13) e disfunção severa (n = 9). Os intervalos de confiança das seguintes variáveis não apresentaram superposição dos seus valores: DDVE, DSVE, %Enc.Endo, %Enc.Mio, IMVE e VEPP. CONCLUSÃO: A utilização conjunta dos intervalos de confiança dessas variáveis permite identificar dois grupos de ratos com estenose aórtica e diferentes graus de comprometimento cardíaco, possibilitando a realização de estudos longitudinais com grupos homogêneos de animais.

 Ecocardiograma estenose aórtica disfunção ventricular ratos análise de agrupamento 26 06 2006

ARTIGOS ORIGINAIS

ECOCARDIOGRAFIA

Critérios ecocardiográficos para definição de graus de disfunção ventricular em ratos portadores de estenose aórtica

Vanessa Oliveira Moreira; Ana Valéria Barros de Castro; Marcelle Yumi Yaegaschi; Antonio Carlos Cicogna; Marina Politi Okoshi; Camila Alves Pereira; Flávio Ferrari Aragon; Mário Batista Bruno; Carlos Roberto Padovani; Katashi Okoshi

Faculdade de Medicina de Botucatu e Instituto de Biociências de Botucatu – Unesp - Botucatu, SP

Correspondência

RESUMO

OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi identificar variáveis ecocardiográficas que definam graus de disfunção cardíaca em ratos com estenose aórtica (EAo).

MÉTODOS: Ratos Wistar (n = 23), machos (90-100 g), foram submetidos a cirurgia para indução de EAo. As variáveis ecocardiográficas analisadas foram: diâmetros diastólico do ventrículo esquerdo (DDVE) e sistólico do átrio esquerdo em valores absolutos e normalizados para o peso corporal; diâmetro sistólico do VE (DSVE); três índices de encurtamento do VE (% de encurtamento endocárdico, %Enc.Endo; % de encurtamento miocárdico, %Enc.Mio; e velocidade de encurtamento da parede posterior do VE, VEPP); e índice de massa do VE (IMVE). Essas variáveis foram utilizadas para a análise de agrupamento ("cluster analysis").

RESULTADOS: A análise de agrupamento possibilitou separar os ratos com EAo em dois grupos: disfunção leve (n = 13) e disfunção severa (n = 9). Os intervalos de confiança das seguintes variáveis não apresentaram superposição dos seus valores: DDVE, DSVE, %Enc.Endo, %Enc.Mio, IMVE e VEPP.

CONCLUSÃO: A utilização conjunta dos intervalos de confiança dessas variáveis permite identificar dois grupos de ratos com estenose aórtica e diferentes graus de comprometimento cardíaco, possibilitando a realização de estudos longitudinais com grupos homogêneos de animais.

Palavras-chave: Ecocardiograma, estenose aórtica, disfunção ventricular, ratos, análise de agrupamento.

Em modelos experimentais de agressão cardíaca, a dificuldade de estabelecer uma classificação in vivo do grau de disfunção ventricular tem restringido a realização de estudos longitudinais com o intuito de verificar o efeito de intervenções terapêuticas. A obtenção de grupos homogêneos de animais quanto ao grau de disfunção do coração é de fundamental importância, uma vez que efeitos benéficos ou maléficos de um tratamento podem ser observados de acordo com o comprometimento prévio da função ventricular.

Tradicionalmente, o diagnóstico de disfunção cardíaca em animais é baseado na medida da pressão diastólica do ventrículo esquerdo (VE), que requer cateterização ventricular incorrendo no risco de lesões de valvas cardíacas e conseqüente alteração do desempenho cardíaco1. Outros critérios para o diagnóstico de insuficiência cardíaca (IC) baseiam-se na presença de alterações clínicas e anatômicas, tais como taquipnéia, derrame pleural, ascite, trombo no átrio esquerdo e hipertrofia ventricular direita, sendo a maioria delas identificadas após o sacrifício do animal2-5.

O ecocardiograma é um importante exame auxiliar no diagnóstico clínico de IC, que permite avaliar: 1) morfologia e função do coração; 2) evolução da disfunção cardíaca causada por diferentes tipos de agressão6-8; 3) efeitos cardíacos de intervenções farmacológicas4 .

Em pequenos animais, o ecocardiograma transtorácico é um dos métodos mais freqüentemente utilizados para avaliar a dimensão das estruturas cardíacas e o desempenho contrátil do VE4-10. Habitualmente, a identificação de disfunção ventricular é realizada comparando-se os índices de encurtamento muscular com aqueles obtidos no grupo controle.

Recentemente, Sjaastad e cols.1 identificaram as variáveis mais importantes para o diagnóstico ecocardiográfico de IC em ratos infartados, utilizando o método estatístico de análise de agrupamento. Esse método foi utilizado também para determinar a evolução funcional cardíaca durante a remodelação induzida pela ligadura da artéria coronária2. Entretanto, não há relatos na literatura de estudos ecocardiográficos em modelos experimentais de estenose aórtica (EAo) que tenham enfocado os graus de disfunção ventricular. O modelo de EAo em ratos é largamente utilizado por induzir hipertrofia ventricular gradual evoluindo para disfunção ventricular. Nesse modelo, um clipe é colocado na aorta ascendente e a estenose se desenvolve de maneira proporcional ao crescimento corporal do animal.

Postulamos a hipótese de que a análise de agrupamento também permitirá identificar critérios que possam distinguir os diferentes graus de disfunção cardíaca a partir do momento de aparecimento de taquipnéia, em um modelo de sobrecarga pressórica induzida por clampeamento da raiz da aorta que, habitualmente, evolui com hipertrofia do VE e IC progressiva11,12.

O objetivo deste estudo foi, portanto, identificar as variáveis ecocardiográficas que definam os graus de disfunção ventricular na fase de hipertrofia compensada à descompensação, em ratos portadores de EAo. A identificação dessas variáveis permitirá estabelecer os estágios da remodelação cardíaca induzida pela sobrecarga pressórica e avaliar os efeitos cardíacos de intervenções farmacológicas em diferentes momentos do processo progressivo da disfunção cardíaca.

MÉTODOS

Animais e protocolo experimental - Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu, Unesp.

Neste estudo, foram utilizados ratos Wistar, machos, com peso corporal de 90 a 100 g, provenientes do Biotério Central – Unesp, Botucatu. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais, à temperatura de 23ºC e com ciclos de luminosidade de doze horas. Os animais foram alimentados durante todo o período experimental com ração Labina® e água ad libitum. Foram utilizados 35 animais, sendo doze controles e 23 com EAo.

Indução de insuficiência cardíaca pela estenose aórtica - A estenose aórtica foi induzida de acordo com o método previamente descrito em nosso laboratório5,13,14. Em resumo, os animais foram submetidos a tricotomia e toracotomia mediana, após anestesia com cloridrato de cetamina (50 mg/kg intraperitoneal) e cloridrato de xilidino (10 mg/kg intraperitoneal). A seguir, a aorta ascendente foi dissecada e um clipe de prata, com 0,6 mm de diâmetro interno, foi colocado a aproximadamente 3 mm de sua raiz. Durante a cirurgia, os ratos receberam ventilação manual com pressão positiva e 1 ml de soro fisiológico aquecido, intraperitonealmente. Os animais controle foram submetidos à mesma cirurgia, porém sem a colocação do clipe.

Após dezenove semanas da indução de EAo, os animais foram observados diariamente para a detecção de taquipnéia, que é um sinal de disfunção cardíaca.

Estudo ecocardiográfico - O ecocardiograma foi realizado após a detecção de taquipnéia, que é observada geralmente após 28 semanas de EAo.

Os ratos foram anestesiados com cloridrato de cetamina (50 mg/kg) e cloridrato de xilidino (1 mg/kg), administrados por via intraperitoneal. Após tricotomia da região anterior do tórax, os animais foram posicionados em decúbito lateral esquerdo e o exame foi realizado com o equipamento modelo Sonos 2000 da Hewlett-Packard Co., equipado com transdutor eletrônico de 7,5 MHz. Para medir as estruturas do coração foram obtidas imagens em modo monodimensional (modo-M), orientado pelas imagens em modo bidimensional, estando o transdutor em posição paraesternal eixo menor.

A avaliação do VE foi realizada posicionando o cursor do modo-M logo abaixo do plano da valva mitral no nível dos músculos papilares15-17. A imagem do átrio esquerdo foi obtida posicionando o cursor do modo-M no nível do plano da valva aórtica. As imagens obtidas em modo-M foram registradas em impressora modelo UP-890 da Sony Co.

Posteriormente, as estruturas cardíacas foram medidas, manualmente, com o auxílio de um paquímetro de precisão. As seguintes estruturas cardíacas foram medidas: diâmetros diastólico e sistólico do VE (DDVE e DSVE, respectivamente), diâmetro do átrio esquerdo (AE) e espessura diastólica do septo interventricular (EDSIV) e da parede posterior do VE (EDPP).

Os valores de DDVE e AE foram normalizados para o peso corporal. A função sistólica do VE foi avaliada pela porcentagem de encurtamento endocárdico, %Enc.Endo [(DDVE – DSVE) / DDVE X 100], porcentagem de encurtamento miocárdico, %Enc.Mio, que é a variação entre os valores diastólico e sistólico da fórmula [(diâmetro VE + ½ espessura do septo interventricular + ½ espessura da parede posterior) x 100] e a velocidade de encurtamento da parede posterior do VE, VEPP (tangente máxima do movimento sistólico da parede posterior).

A massa do VE (MVE) foi calculada segundo a fórmula 7,15: [(DDVE + EDSIV + EDPP)3 – DDVE3] x 1,04; no qual o valor 1,04 indica a densidade específica do miocárdio. O índice de MVE (IMVE) foi calculado normalizando a MVE para o peso corporal.

Análise de agrupamento em estágios de disfunção cardíaca - Considerando isoladamente as variáveis ecocar-diográficas de 23 animais portadores de EAo, utilizou-se a técnica de análise de agrupamento ("cluster analysis") para se estabelecer grupos de similaridade quanto à gravidade da doença. Utilizamos as variáveis ecocardiográficas cujos valores aumentam progressivamente com o avançar da doença (DDVE, AE e IMVE), além de parâmetros indicativos de função sistólica (%Enc.Endo, %Enc.Mio e VEPP) e o DSVE, que também está relacionado com a função sistólica do VE. O procedimento empregado na análise dos conglomerados considerou para a formação dos grupos a estratégia SAHN (envolve agrupamentos seqüenciais, aglomerativos, hierárquicos e não-superpostos), tendo como método de agrupamento a técnica do vizinho mais próximo (SLM: "single linkage method"), e como coeficiente de similaridade a distância euclideana média18. A representação final do agrupamento é descrita pelo dendograma (fig.1).

RESULTADOS

A análise de agrupamento permitiu separar os ratos com EAo em grupos similares, de acordo com a gravidade da disfunção ventricular. Esses grupos foram denominados disfunção leve (n = 13) e disfunção severa (n = 9). Na análise estatística, não foi possível realizar o agrupamento de apenas um animal com EAo nos grupos já mencionados (fig.1). Esse animal apresentou os menores valores dos índices de função sistólica do VE e os maiores valores dos diâmetros do VE e átrio esquerdo dos animais com EAo. Esses valores se posicionaram fora dos limites de intervalos de confiança do grupo de disfunção severa. Portanto, no nosso grupo de ratos com EAo um animal apresentou disfunção ventricular mais grave que o grupo denominado disfunção severa.

A tabela 1 mostra os valores médios ± desvio padrão e os respectivos limites dos intervalos de 95% de confiança para as variáveis ecocardiográficas analisadas considerando os grupos controle e EAo. Os limites dos intervalos de 95% de confiança estão ilustrados nas figuras 2 e 3. As variáveis ecocardiográficas que indicam as dimensões do VE e átrio esquerdo e massa do VE, normalizados para o peso corporal, apresentaram valores mais elevados no grupo EAo-severa em comparação ao grupo EAo-leve. As variáveis indicativas de encurtamento ventricular esquerdo (%Enc.Endo e %Enc.Mio) apresentaram valores menores no grupo EAo-severa em relação ao grupo EAo-leve. As variáveis DDVE, DSVE, %Enc.Endo, %Enc.Mio, IMVE e VEPP não apresentaram superposição dos seus valores de intervalos de confiança entre os dois grupos.

As seguintes variáveis obtidas de ratos sem EAo (controle) mostraram superposição com o grupo EAo-leve: DDVE, DDVE/PC e VEPP. Houve superposição entre os grupos controle e EAo-severa nas variáveis DSVE, %Enc.Endo e %Enc.Mio. O grupo controle não apresentou superposição dos intervalos de confiança com outros grupos nos valores de AE/PC e IMVE.

DISCUSSÃO

O surgimento e o desenvolvimento do ecocardiograma representou um grande avanço na avaliação in vivo do coração. Em pequenos animais utilizados em laboratórios experimentais, esse método tornou possível o acompanhamento do efeito de agressões e/ou tratamentos sobre o coração, de maneira ilimitada quanto ao número de repetições do exame. Em ratos com EAo, os sinais clínicos para identificar a gravidade da IC in vivo são limitados. Além disso, o tempo de surgimento dos primeiros sinais de IC é variável; em nosso laboratório é habitualmente observado intervalo de 29 a 37 semanas entre a indução de EAo e o aparecimento de taquipnéia.

No presente estudo, o ecocardiograma mostrou que os ratos estavam em diferentes graus de comprometimento cardíaco no momento em que foi identificada a taquipnéia. Tradicionalmente, nos estudos experimentais, os fármacos são introduzidos em momento pré-determinado após a indução de EAo11,19. Portanto, é possível que os animais não apresentassem uniformidade quanto ao comprometimento do coração no momento da introdução do tratamento. Esta heterogeneidade é um fator importante que pode levar à obtenção de resultados discrepantes. Diante dessa consideração, é de fundamental importância a procura de critérios ecocardiográficos para classificar os animais quanto à gravidade da disfunção ventricular, permitindo, dessa forma, a utilização de animais que apresentem comprometimento estrutural e funcional do coração o mais homogêneo possível.

A análise de agrupamento é uma técnica freqüentemente utilizada para agrupar o objeto do estudo de acordo com a semelhança de suas características1,20,21. Sjaastad e cols.1 estabeleceram critérios ecocardiográficos para a detecção de IC em ratos, após infarto do miocárdio, utilizando a técnica da análise de agrupamento. Em nosso estudo, com o auxílio dessa análise estatística procuramos classificar o comprometimento cardíaco dos animais com EAo e que apresentavam taquipnéia. Com o número de ratos utilizados no presente estudo, a análise de agrupamento permitiu separar os ratos com EAo em dois grupos de animais que compartilharam características ecocardiográficas semelhantes (EAo-leve e EAo-severa).

As variáveis DDVE, DSVE, % Enc.Endo, % Enc.Mio, IMVE e VEPP não apresentaram superposição dos valores dos intervalos de confiança entre os dois grupos. As variáveis DDVE/PC, AE e AE/PC apresentaram superposição entre os grupos EAo-leve e EAo-severa. Como os diâmetros do VE e AE sofrem influência da variação do peso corporal (PC), torna-se necessária a normalização de seus valores para o PC. Entretanto, esse procedimento também pode causar erros na interpretação dos resultados porque os diâmetros do VE e AE não são exatamente proporcionais ao PC. Portanto, a utilização conjunta das variáveis que não apresentaram superposição, à exceção de DDVE e DSVE, permitirá separar ratos com estenose aórtica em dois graus distintos de disfunção ventricular com extrema segurança. Os valores absolutos de DDVE e DSVE devem ser utilizados com cautela porque esses parâmetros habitualmente necessitam ser normalizados para o peso corporal dos animais.

Como já descrito nos resultados, algumas variáveis apresentaram superposição entre os grupos controle e EAo. Essa superposição é compreensível, levando em consideração a remodelação ventricular que se segue à colocação de clipe na aorta12. Nesse modelo de sobrecarga de pressão, à medida que o animal cresce ocorre, progressivamente, a instalação de estenose ao fluxo anterógrado do VE com conseqüente desenvolvimento de hipertrofia miocárdica. Esse aumento na espessura miocárdica é acompanhado por aumento progressivo nos valores dos índices de encurtamento ventricular com manutenção dos valores do DDVE (hipertrofia concêntrica) e redução do DSVE.

Mesmo antes de atingir o pico dos valores de encurtamento sistólico, o animal passa a apresentar taquipnéia em razão da disfunção diastólica do VE decorrente do comprometimento do relaxamento e da complacência ventricular. A partir do momento em que o mecanismo de hipertrofia não mais consegue compensar o excesso de carga inicia-se a dilatação ventricular, e os índices de encurtamento ventricular começam a diminuir pela instalação de disfunção sistólica com manifestação mais exuberante de insuficiência cardíaca, embora haja dificuldade de caracterizar a gravidade da EAo baseada na taquipnéia que é o sinal comumente observado nessa fase da EAo. Portanto, mesmo com disfunção sistólica evidente os valores dos índices de encurtamento ventricular estarão elevados em relação aos animais controles. Com a progressão da disfunção sistólica aqueles índices passarão a ser semelhantes aos controles e posteriormente menores. Pelos motivos expostos acima os índices de encurtamento muscular não apresentam superposição de seus valores entre os grupos controle e EAo-leve e apresentam-se superpostos nos grupos controle e EAo-severa.

Na tentativa de minimizar o efeito da hipertrofia miocárdica sobre o aumento na porcentagem de encurtamento entre o endocárdio do septo interventricular e da parede posterior do VE (%Enc.Endo), calculamos também a porcentagem de encurtamento entre os pontos centrais daquelas paredes (%Enc.Mio)9,22. No entanto, as conclusões não diferiram do índice %Enc.Endo, provavelmente pelo intenso grau de hipertrofia ventricular. O índice de massa do VE foi a única variável que não apresentou superposição entre os três grupos. Em nosso estudo, a distinção entre grupos controle e com EAo pôde ser feita também pela medida da espessura da parede do VE (dados não apresentados).

Em conclusão, a análise de agrupamento permite classificar ratos com EAo em grupos com graus distintos de comprometimento cardíaco. A quantificação da disfunção ventricular e, conseqüentemente, a utilização de grupos de animais com comprometimento homogêneo do coração terão papel importante em estudos experimentais sobre fisiopatologia e tratamento da hipertrofia ventricular e insuficiência cardíaca.

Agradecimento

Os autores agradecem à Fundunesp (processo n.00758/04) e a Novo Nordiskâ o apoio financeiro ao desenvolvimento parcial deste estudo. Os autores agradecem também a contribuição de Mirella Oliveira Silva na realização do estudo.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflitos de interesses pertinentes.

Correspondência:

Katashi Okoshi

Travessa Cyro Targa, 115

18610-250 – Botucatu, SP

E-mail:

okoshi@cardiol.br

Recebido em 05/08/05

Aceito em 11/11/05

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OBJECTIVE: The purpose of this study was to identify echocar-diographic parameters that allow distinguishing different levels of cardiac dysfunction in aortic banded rats. METHODS: Wistar male rats (90-100 g) were subjected to aortic banding (n=23) or a sham operation (n=12). The following echocardiographic parameters were evaluated and used to group rats into groups with similar characteristics using cluster analysis: absolute values and after normalization to body weight of left ventricular end-diastolic diameter (LVDD) and left atrial systolic diameter; left ventricular end-systolic diameter (LVSD); LV weight to body weight ratio (LVW/BW); three indexes of left ventricular shortening (endocardial fractional shortening, EFS; midwall FS, MFS; and posterior wall shortening velocity, (PWSV). RESULTS: The cluster analysis could group aortic banded rats into two groups: mild (n=13) and severe (n=9) stage of heart failure. There was no overlapping among the values of the 95% confidence interval of the following parameters between the two groups: LVDD, LVSD, EFS, MFS, LVW/BW, and PWSV. CONCLUSION: It is feasible to distinguish two groups of aortic banded rats according to the level of cardiac dysfunction using those echocardiographic parameters. This allows to perform longitudinal studies in homogeneous groups of rats with aortic banding and cardiac dysfunction.

 Echocardiogram aortic stenosis ventricular dysfunction rats cluster analysis

ORIGINAL ARTICLES

Echocardiographic criteria for the definition of ventricular dysfunction severity in aortic banded rats

Vanessa Oliveira Moreira; Ana Valéria Barros de Castro; Marcelle Yumi Yaegaschi; Antonio Carlos Cicogna; Marina Politi Okoshi; Camila Alves Pereira; Flávio Ferrari Aragon; Mário Batista Bruno; Carlos Roberto Padovani; Katashi Okoshi

Faculdade de Medicina de Botucatu and Instituto de Biociências de Botucatu – Unesp - Botucatu, SP - Brazil

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ABSTRACT

OBJECTIVE: The purpose of this study was to identify echocar-diographic parameters that allow distinguishing different levels of cardiac dysfunction in aortic banded rats.

METHODS: Wistar male rats (90-100 g) were subjected to aortic banding (n=23) or a sham operation (n=12). The following echocardiographic parameters were evaluated and used to group rats into groups with similar characteristics using cluster analysis: absolute values and after normalization to body weight of left ventricular end-diastolic diameter (LVDD) and left atrial systolic diameter; left ventricular end-systolic diameter (LVSD); LV weight to body weight ratio (LVW/BW); three indexes of left ventricular shortening (endocardial fractional shortening, EFS; midwall FS, MFS; and posterior wall shortening velocity, (PWSV).

RESULTS: The cluster analysis could group aortic banded rats into two groups: mild (n=13) and severe (n=9) stage of heart failure. There was no overlapping among the values of the 95% confidence interval of the following parameters between the two groups: LVDD, LVSD, EFS, MFS, LVW/BW, and PWSV.

CONCLUSION: It is feasible to distinguish two groups of aortic banded rats according to the level of cardiac dysfunction using those echocardiographic parameters. This allows to perform longitudinal studies in homogeneous groups of rats with aortic banding and cardiac dysfunction.

Key words: Echocardiogram, aortic stenosis, ventricular dys-function, rats, cluster analysis.

In experimental models of heart injury, the difficulty in establishing an in vivo classification severity of ventricular dysfunction has restricted longitudinal studies aimed at verifying the effect of therapeutic interventions. Obtaining homogeneous groups of animals as regards the degree of heart dysfunction is of fundamental importance, since the beneficial or harmful effects of a treatment can be observed according to the prior impairment of the ventricular function.

The diagnosis of heart dysfunction in animals has traditionally been based on the measurement of left ventricle (LV) diastolic pressure, which requires ventricular catheterization with the risk of lesions to heart valves and the consequent alteration in heart performance1. Other criteria to diagnose heart failure (HF) are based on the presence of clinical and anatomical changes such as tachypnea, pleural effusion, ascitis, thrombus in the left atrium and right ventricle hypertrophy; most of these changes are identified after the animal is sacrificed2-5.

The echocardiogram is an important ancillary exam for the clinical diagnosis of HF. It allows the evaluation of: 1) heart morphology and function; 2) progression of heart dysfunction caused by different types of injuries6-8; 3) effects of pharmacological interventions on the heart 4 .

In small animals, the transthoracic echocardiogram is one of the most frequently used methods to assess the size of heart structures, and the contractile performance of the LV4-10. The identification of ventricular dysfunction is generally carried out by comparing the muscular shortening indexes with those obtained in the control group.

Sjaastad et al1 have recently identified the most important variables for the echocardiographic diagnosis of HF in infarcted rats using the cluster analysis statistical method. This method was also used to determine the progression of heart function during the remodeling induced by the ligation of the coronary artery2. However, there are no reports in the literature about echocardiographic studies on experimental models of aortic stenosis (AS) focusing on degrees of ventricular dysfunction. The AS rat model is widely used because it induces gradual ventricular hypertrophy which progresses towards ventricular dysfunction. In this model, a clip is placed in the ascending aorta and stenosis develops in a proportionate fashion according to the growth of the animal's body.

We hypothesized that cluster analysis will also allow us to identify criteria which can distinguish the different degrees of heart dysfunction as of the occurrence of tachypnea, in a model of pressure overload induced by the clamping of the root of the aorta that usually progresses towards LV hypertrophy and progressive HF11,12.

The objective of this study was therefore to identify the echocardiographic variables that define the degrees of ventricular dysfunction from the compensated hypertrophy phase through the uncompensated phase in rats with AS. The identification of these variables will allow us to establish the stages of heart remodeling induced by pressure overload and to assess the effects of pharmacological interventions on the heart at different times of the progression of heart dysfunction.

METHODS

Animals and experimental protocol - The procedures of the experiment were approved by the Ethics Committee for Research on Animals of the Medical School of Botucatu (Faculdade de Medicina de Botucatu, Unesp).

In this study, we used Wistar male rats, with body weight between 90 and 100 g, grown in the Central Bioterium – Unesp, Botucatu, Brazil. The animals were kept in individual cages at 23ºC room temperature, with 12-hour light/dark cycles. The animals were feed during all the experiment with Labina® chow and water ad libitum. The study included 35 animals. 12 were in the control group and 23 had AS.

Induction of heart failure through aortic stenosis - Aortic stenosis was induced according to the method previously described in our laboratory5,13,14. In summary, the animals were submitted to median thoracotomy and trichotomy after anesthesia with ketamine hydrochloride (50 mg/kg intraperitoneally) and xylazine hydrochloride (10 mg/kg intraperitoneally). Then the ascending aorta was dissected and a silver clip, with an internal diameter of 0.6 mm was placed at approximately 3 mm of the aorta's root. During the surgery, the rats were manually ventilated using positive pressure and given 1 ml of warm saline solution intraperitoneally. The control animals underwent the same surgery, but with no clip placed in the aorta.

Nineteen weeks after the induction of AS, the animals were observed daily to allow the detection of tachypnea, which is a sign of heart dysfunction.

Echocardiographic Study - The echocardiogram was performed after the detection of tachypnea, which is generally observed after 28 weeks of the AS.

The rats were anesthetized with ketamine hydrochloride (50 mg/kg) and xylazine hydrochloride (1 mg/kg), administered intraperitoneally. Following the trichotomy of the anterior part of the thorax, the animals were placed in the left lateral decubitus, and the exam was performed using a Hewlett-Packard Co. Sonos 2000 device, equipped with a 7.5 MHz electronic transducer. In order to measure the heart structures, we obtained monodimensional images (M-mode), guided by the bidimensional mode images, with the transducer in the parasternal short-axis position.

The LV assessment was performed with the M-mode cursor positioned just below the mitral valve plane at the level of the papillary muscles15-17. The image of the left atrium was obtained by positioning the M-mode cursor at the level of the aortic valve plane. The images obtained in M-mode were recorded on a Sony Co. UP-890 printer.

Later heart structures were measured manually using a caliper. The following heart structures were measured: LV diastolic and systolic diameters (LVDD and LVSD respectively), LA diameter (LA) and the diastolic thickness of the interventricular septum (IST) and of the LV posterior wall (PWT).

LVDD and LA values were normalized for body weight (BW). LV systolic function was assessed based on the endocardial fractional shortening, EFS [(LVDD – LVSD) / LVDD X 100]; midwall fractional shortening, MFS, which is the variation between the diastolic and systolic values of the formula [(LV + ½ interventricular septum thickness + ½ posterior wall thickness) x 100]; and LV posterior wall shortening velocity, PWSV (maximum tangent of posterior wall systolic movement).

Left ventricle mass (LVM) was calculated using the following formula 7,15: [(LVDD + IST + PWT)3 – LVDD3] x 1.04 where the value 1.04 indicates the specific density of the myocardium. The LVM index (LVMI) was calculated by normalizing LVM for body weight.

Cluster analysis at stages of heart dysfunction - Considering the echocardiographic variables of 23 animals with As separately, we used the cluster analysis technique to establish similarity groups as to the severity of the disease. We used echocardiographic variables whose values increase progressively with the progression of the disease (LVDD, LA and LVMI), in addition to parameters indicative of the systolic function (EFS, MFS and PWSV) and LVSD, which is also related with the LV systolic function. The procedure employed to analyze the conglomerates considered the SAHN strategy for the formation of groups (SAHN involves sequential, agglomerative, hierarchical and non-overlapping clusters); the method of clustering was the closest neighbor technique (SLM: single linkage method), and the similarity coefficient was the median Euclidean distance18. The final representation of the cluster is described by the dendogram (fig.1).

RESULTS

The cluster analysis allowed us to place rats with AS into similar groups, according to the severity of the ventricular dysfunction. These groups were called mild dysfunction (n = 13) e severe dysfunction (n = 9) groups. In the statistical analysis, it was impossible to include one animal with AS into the groups mentioned above (fig.1). This animal had the lowest values for LV systolic function indexes and the highest values for LV and LA diameters among animals with AS. These values were outside the limits of the confidence intervals of the severe dysfunction group. Therefore, in our group of rats with AS, one animal presented more severe ventricular dysfunction than the group called severe dysfunction.

Table 1 shows the mean values ± standard deviation and the respective limits of the 95% confidence intervals for the echocardiographic variables analyzed considering the control and AS groups. The limits of the 95% confidence intervals are illustrated in figures 2 and 3. The echocardiographic variables which indicate LV and left atrium size and LV mass, normalized for body weight, presented higher values in the severe-AS group as compared with the mild-AS group. The variables indicative of left ventricle shortening (EFS, MFS and %Myoc.Short.) presented lower values in the severe-AS as compared with the mild-AS group. The confidence intervals of the variables LVDD, LVSD, % Endo.Short., % Myoc.Short., LVMI and PWSV did not present overlapping between the two groups.

The following variables obtained for rats without AS (control) showed overlapping with the mild-AS group: LVDD, LVDD/BW and PWSV. There was overlapping between the control groups and the severe-AS group for the variables LVSD, % Endo.Short. and % Myoc.Short. The control group presented no overlapping of confidence intervals with other groups for the values of LA/BW and LVMI.

DISCUSSION

The emergence and development of the echocardiogram was a great advancement for in vivo assessment of the heart. In small animals used in experimental laboratories, this method enabled the follow-up of the effect of injuries and/or treatment on the heart, in an unlimited fashion as regards the number of times the exam is repeated. In rats with AS, the clinical signs that identify HF severity in vivo are limited. Additionally, the time elapsed until the first signs of HF appear is variable. In our laboratory, usually from 29 to 37 weeks elapse between the induction of AS and the appearance of tachypnea.

In the present study, the echocardiogram showed that the rats had different degrees of heart impairment when tachypnea was observed. Traditionally, in experimental studies, drugs are introduced at a predetermined time after the induction of AS11,19. Therefore, it may be that the animals were at different stages of heart impairment when the treatment was started. This heterogeneity is an important factor that may lead to discrepant results. In view of this, it is fundamental to seek echocardiographic criteria to classify the animals as regards the severity of ventricular dysfunction, thus allowing the use of animals with the most homogeneous degree of heart functional and structural impairment.

The cluster analysis technique is frequently used to group the object of study according to the similarity of its characteristics1,20,21. Sjaastad et al1 established echocardiographic criteria for the detection of HF in rats, following myocardial infarction using the cluster analysis technique. In our study, using this statistical analysis, we aimed at classifying the heart impairment of animals with AS and tachypnea. With the number of rats used in this study, the cluster analysis allowed us to separate the rats with AS into two groups of animals which shared similar echocardiographic characteristics (mild-AS and severe-AS).

The variables LVDD, LVSD, % Endo.Short., % Myoc.Short., LVMI and PWSV did not present confidence interval values overlapping for the two groups. The variables LVDD/BW, LA and LA/BW presented overlapping between the mild-AS and severe-AS groups. Because LV and LA diameters are subject to the influence of body weight (BW) variation, their values have to be normalized for BW. However, this procedure can also cause errors in the interpretation of the results since the LV and LA diameters are not exactly proportional to BW. Therefore, the joint use of variables which did not present overlapping, with the exception of LVDD and LVSD, will allow an utmost safe distribution of rats with aortic stenosis into two different degrees of ventricular dysfunction. The absolute values of LVDD and LVSD are to be used with caution because these parameters usually require normalization in accordance to the animals' body weight.

As described in the results section, some variables presented overlapping between the control and AS groups. This overlapping is understandable, if we consider the ventricular remodeling that takes place after the placement of the clip in the aorta12. In this model of pressure overload, as the animal grows, progressive stenosis develops in the LV anterograde flow with the consequent development of myocardial hypertrophy. This increase in myocardial thickness occurs concurrently with a progressive increase in ventricular shortening index values while LVDD values (concentric hypertrophy) remain stable and LVSD decreases.

Even before reaching the peak of systolic shortening values, the animal begins to present tachypnea due to LV diastolic dysfunction resulting from impaired relaxation and ventricular compliance. When the mechanism of hypertrophy becomes unable to compensate the overload, the enlargement of the ventricle begins, and the indexes of ventricular shortening start to decrease as systolic dysfunction develops with a full blown manifestation of heart failure, although it is difficult to characterize AS severity based on tachypnea, which is the sign commonly observed at this stage of AS. Therefore, even with manifest systolic dysfunction, the values of the ventricular shortening indexes will be elevated as compared with the control animals. With the progression of systolic dysfunction, those indexes will converge to the controls and will eventually become lower. Because of the reasons stated above, the values of muscle shortening indexes did not present overlapping between the control and mild-AS groups and presented overlapping between the control and severe-AS groups.

In an attempt to minimize the effect of myocardial hypertrophy on the increase of the percentage of shortening between the endocardium of the interventricular septum and the LV posterior wall (% Endo.Short.), we also calculated the percentage of shortening between the central points of these walls (% Myoc.Short.)9,22. However, the conclusions were not different from the % Endo.Short. index, probably because of the high degree of ventricular hypertrophy. The LV mass index was the only variable which did not present overlapping between the three groups. In our study, the difference between the control and AS groups was also distinguished by using the measure of LV wall thickness (data not presented).

In conclusion, the cluster analysis allows the classi-fication of rats with AS in groups with different degrees of heart impairment. The quantification of ventricular dysfunction and consequently the use of groups of animals with homogeneous heart impairment will play an important role in experimental studies on physiopathology and treatment of ventricular hypertrophy and heart failure.

Acknowledgement

The authors are thankful to Fundunesp (process n.00758/04) and to Novo Nordiskâ for the partial funding of this study. The authors are also thankful to Mirella Oliveira Silva for her support in the carrying out of this study.

Potencial Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

REFERENCES

Katashi Okoshi

Travessa Cyro Targa, 115

18610-250 – Botucatu, SP - Brazil

E-mail:

okoshi@cardiol.br

Received on 08/05/05

Accepted on 11/11/05