abcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCSão Paulo, SP, BrazilvgdckRRqF8DtjXPJLk5DZKR00002S0066-782X2005000600002S0066-782X(05)0840060210.1590/S0066-782X2005000600002Artigos OriginaisChlamydia pneumoniae e Mycoplasma pneumoniae nos nódulos de calcificação da estenose da valva aórticaHiguchi-dos-SantosMarilia HarumiPierriHumbertoHiguchiMaria de LourdesNussbacherAmitPalominoSueliSambiaseNadia VieiraRamiresJosé Antonio FranchiniWajngartenMaurícioSão PauloSão PauloUniversidade de São PauloInstituto do Coração do Hospital das Clínicas Brazil0620058464434480309200303092004This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.
OBJETIVO: Investigar se chlamydia pneumoniae (CP) ou mycoplasma pneumoniae (MP) estão presentes na estenose da valva aórtica (EA). MÉTODOS: Imuno-histoquímica foi utilizada para identificar os antígenos de CP (Ag-CP), a hibridização in situ para identificar o DNA de MP, e microscopia eletrônica para avaliação dos dois agentes, nos grupos: normal - 11 valvas normais de autópsia; aterosclerose - 10 valvas de pacientes com aterosclerose sistêmica de autópsia e sem EA; e EA - 14 espécimes cirúrgicos provenientes de pacientes com EA analisados em 3 sub-regiões: EA-preservada - regiões mais preservadas na periferia da valva; EA-fibrose - tecido fibrótico peri-calcificação; e EA-calcificação - nódulos calcificados. RESULTADOS: As medianas da fração de área positiva para Ag-CP foram 0,09; 0,30; 0,18; 1,33; e 3,3 nos grupos acima descritos, respectivamente. A densidade de CP foi significativamente maior nos grupos aterosclerose e EA-calcificação em relação ao normal (p<0,05). Dentro do grupo EA, a quantidade de CP foi maior nas regiões de fibrose e calcificação (p<0,05). As frações de área positivas para MP-DNA (medianas) foram 0,12; 0,44; 0,07; 0,36; e 1,52 nos grupos acima descritos, respectivamente. A quantidade de MP-DNA foi maior na EA-calcificação em relação ao normal (p<0,05). Dentro do grupo EA, maior quantidade de MP-DNA foi encontrada nas regiões de calcificação e fibrose (p<0,05). CONCLUSÃO: Os nódulos de calcificação da EA tinham maior concentração de CP e MP sugerindo que essas bactérias possam estar associadas ao desenvolvimento de calcificação e inflamação, apontando novas semelhanças entre os processos de EA e aterosclerose, que podem ter mecanismos infecciosos envolvidos.
mycoplasma pneumoniaechlamydia pneumoniaeestenose da valva aórticaateroscleroseidoso28062005
ARTIGO ORIGINAL
Chlamydia pneumoniae e Mycoplasma pneumoniae nos nódulos de calcificação da estenose da valva aórtica
Marilia Harumi Higuchi-dos-Santos; Humberto Pierri; Maria de Lourdes Higuchi; Amit Nussbacher; Sueli Palomino; Nadia Vieira Sambiase; José Antonio Franchini Ramires; Maurício Wajngarten
Instituto do Coração do Hospital das Clínicas - FMUSP - São Paulo, SP
Endereço para correspondência
RESUMO
OBJETIVO: Investigar se chlamydia pneumoniae (CP) ou mycoplasma pneumoniae (MP) estão presentes na estenose da valva aórtica (EA).
MÉTODOS: Imuno-histoquímica foi utilizada para identificar os antígenos de CP (Ag-CP), a hibridização in situ para identificar o DNA de MP, e microscopia eletrônica para avaliação dos dois agentes, nos grupos: normal - 11 valvas normais de autópsia; aterosclerose - 10 valvas de pacientes com aterosclerose sistêmica de autópsia e sem EA; e EA - 14 espécimes cirúrgicos provenientes de pacientes com EA analisados em 3 sub-regiões: EA-preservada - regiões mais preservadas na periferia da valva; EA-fibrose - tecido fibrótico peri-calcificação; e EA-calcificação - nódulos calcificados.
RESULTADOS: As medianas da fração de área positiva para Ag-CP foram 0,09; 0,30; 0,18; 1,33; e 3,3 nos grupos acima descritos, respectivamente. A densidade de CP foi significativamente maior nos grupos aterosclerose e EA-calcificação em relação ao normal (p<0,05). Dentro do grupo EA, a quantidade de CP foi maior nas regiões de fibrose e calcificação (p<0,05). As frações de área positivas para MP-DNA (medianas) foram 0,12; 0,44; 0,07; 0,36; e 1,52 nos grupos acima descritos, respectivamente. A quantidade de MP-DNA foi maior na EA-calcificação em relação ao normal (p<0,05). Dentro do grupo EA, maior quantidade de MP-DNA foi encontrada nas regiões de calcificação e fibrose (p<0,05).
CONCLUSÃO: Os nódulos de calcificação da EA tinham maior concentração de CP e MP sugerindo que essas bactérias possam estar associadas ao desenvolvimento de calcificação e inflamação, apontando novas semelhanças entre os processos de EA e aterosclerose, que podem ter mecanismos infecciosos envolvidos.
Palavras-chave:mycoplasma pneumoniae; chlamydia pneumoniae; estenose da valva aórtica; aterosclerose; idoso
O processo de degeneração aórtica associado com a estenose da valva aórtica (EA) no paciente idoso compartilha várias semelhanças com a aterosclerose das artérias coronárias1. Placas ateromatosas e a calcificação de valvas aórticas sem doença reumática parecem exibir patogênese similar. As valvas com EA freqüentemente exibem alterações inflamatórias com infiltração de macrófagos e linfócitos T ao redor dos nódulos de calcificação, que lembram a resposta inflamatória vista na aterosclerose coronariana2. Além disso, depósitos de colesterol precedem os nódulos de calcificação na EA. Os mesmos fatores de risco clínicos usualmente associados com a doença arterial coronariana estão associados com a estenose aórtica calcificada não reumática2-7 e incluem idade avançada, sexo masculino, níveis aumentados de lipoproteína de baixa densidade (LDL) e lipoproteína Lp(a)8, tabagismo, hipertensão, diabetes, hipercolesterolemia9. Polimorfismos genéticos podem também ser relevantes no desenvolvimento da aterosclerose10 e na doença aórtica valvar11. A oesteopontina, uma glicoproteína fosforilada que pode ser ativamente sintetizada por macrófagos tem sido ligada à calcificação e relacionada à gravidade da doença arterial coronariana12 e a lesões avançadas da estenose aórtica13. Entretanto, a identificação das causas e fatores associados com o desenvolvimento da calcificação na EA permanece um desafio.
Sugere-se que a Chlamydia pneumoniae (CP) possa estar envolvida na patogênese da aterosclerose, relacionada a polimorfismos genéticos14 e inflamação15, porém, isto ainda é assunto controverso16-18. CP também foi associada com os processos inflamatórios das lesões da valva aórtica19. Nosso grupo demonstrou, previamente, que Mycoplasma pneumoniae (MP) está presente em associação com CP em placas de artérias coronárias de síndromes coronarianas instáveis, usualmente associadas à inflamação da parede e freqüentemente apresentando calcificação15,17. Tendo em vista as similaridades entre aterosclerose coronariana e EA, elaboramos a hipótese de que MP e CP poderiam estar presentes também na estenose aórtica calcificada do idoso.
Métodos
Três grupos de valvas aórticas foram analisados: grupo normal, 11 valvas obtidas através da autópsia de pacientes de 52±16 anos (7 mulheres, 4 homens) sem aterosclerose sistêmica ou estenose aórtica; grupo aterosclerose, 10 valvas obtidas de autópsia de pacientes de 69±9 anos (5 mulheres, 5 homens) com aterosclerose sistêmica, porém sem EA; e grupo estenose da valva aórtica (EA), 14 espécimes cirúrgicos de pacientes de 71±8 anos (4 mulheres, 10 homens) submetidos à substituição da valva aórtica por EA. EA severa foi definida como uma valva contendo áreas de calcificação e difuso espessamento por fibrose e evidência clínica de obstrução severa. Critérios de exclusão foram: evidência de doença reumática, endocardite, síndrome de Marfan, ou doença valvar coexistente em outras valvas (exceto calcificação do anel valvar). As válvulas do grupo EA forma analisadas em três sub-regiões: áreas distantes dos nódulos de calcificação (EA-preservada), tecido fibrótico peri-calcificação (EA-fibrose), e focos de calcificação (EA-calcificação).
Uma seção representativa da porção central das válvulas foi fixada em formalina 10%. A descalcificação foi realizada quando necessário em ácido fórmico 25%. Seções de 5-mm de espessura foram submetidas a colorações com hematoxilina e eosina, técnica de imuno-histoquímica (IQ) para detecção de CP e técnica de hibridização in situ (HIS) para detecção de MP. A especificidade da reação de IQ foi confirmada por HIS em três casos positivos para CP.
Análise quantitativa foi realizada com o analisador de imagens Quantimet 500-Leica detectando-se a fração de área ocupada por antígenos de CP (Ag-CP) e DNA de MP.
Fragmentos valvares adjacentes aos obtidos para microscopia ótica de todos os casos foram analisados à microscopia eletrônica.
Técnica de imuno-histoquímica (IQ) - Seções de 5-mm de espessura de cada espécime foram submetidas à recuperação antigênica por calor (microondas) e incubadas com um anticorpo monoclonal anti-CP (clone RR-402, Dako, Carpinteria, CA, USA, contra a membrana externa principal de CP), por 20 h, a 4º C. Esse anticorpo não reage de forma cruzada com os seguintes agentes: adenovírus, vírus respiratório, vírus A e B da gripe, Chlamydia trachomatis, e alguns sorotipos de Chlamydia psittaci. Confirmamos tal especificidade realizando simultaneamente reações em seções histológicas positivas para citomegalovírus e herpes vírus. O anticorpo secundário foi uma imunoglobulina anti-rato produzida em coelho, conjugada com a biotina (Dako, Carpinteria, CA, USA), diluída a 1:2000, por uma hora a 37º C. A reação foi revelada com streptavidina conjugada com peroxidase (Amersham International, England), diluída a 1:1000, por uma hora a 37º C, e 3,3-diaminobenzidina (Sigma Chemical Corporation, St. Louis, MO). As seções foram contra-coradas com hematoxilina de Harri, desidratadas, clareadas, e montadas com Entellan (Merck, Germany).
Técnica de hibridização in situ (HIS) para MP e CP - A permeabilização celular das seções histológicas foi feita com 0,01M de solução de tampão citrato, pH 6,0±0,1, no forno de microondas. A peroxidase endógena foi bloqueada com H202 a 3%. As seções foram incubadas com a mistura de hibridização contendo: a sonda, formamida deionizada, sulfato dextran 50%, 20 X SSC, solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão, tRNA de fungo, poli A e C, e água pura com dietilpirocarbonato. Duplas-fitas de DNA foram denaturizadas a 95±5º C. O sinal foi amplificado utilizando-se o sistema de amplificação de sinais para HIS, Dakogen Point (Dako, Carpinteria, CA, USA). A reação foi revelada com o cromógeno 3,3-diaminobenzidina (Dako, Carpinteria, CA, USA). As seções foram contra-coradas com a hematoxilina de Harri.
Controles: controles negativos para HIS e IQ foram realizados omitindo-se a sonda ou o anticorpo primário. Seções histológicas humanas, previamente diagnosticadas como positivas para MP e CP foram utilizadas como controles para ambas as reações. Além disso, como controle positivo para HIS, utilizamos uma sonda de seqüência Alu repetitiva (alu1/alu2) (Genetic Research, AL, USA) e como controle negativo, um DNA plasmídio, coberto com biotina (Dako, Carpinteria, CA, USA).
Sondas: A sonda marcada de Mycoplasma pneumoniae foi preparada pela técnica de nick translation de um clone altamente específico para M. pneumoniae. O clone foi caracterizado como sendo altamente específico para MP para exclusão de outras espécies de micobactéria e outras espécies de bactérias (Enzo Diagnostics, Farmingdale, NY, USA). A sonda de Chlamydia pneumoniae foi uma seqüência de oligonucleotídeos biotinilados (20 bp) sintetizada pela GIBCO/BRL, Rockville, MD, USA.
Microscopia eletrônica - Os fragmentos de valvas coletados para a microscopia eletrônica foram previamente descalcificados se necessário, como descrito anteriormente, e fixados em glutaraldeído 3%, pós-fixados em tetróxido de ósmio 1% e contrastados com 0,5% de acetato de uranil. Os fragmentos foram emblocados em resina de araldita. Seções ultra-finas (60 a 90 hm) foram obtidas e contrastadas com solução de citrato de chumbo 5%20.
Análise estatística - A variável fração de área foi descrita pelos valores mínimo e máximo, média, mediana e desvio-padrão.
Como não foi encontrada distribuição normal, um teste não paramétrico (distribuição-livre) foi utilizado para comparação dos dados dos três grupos independentes (normal, aterosclerose e EA). O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para testar a hipótese de igualdade entre os três grupos, teste de comparações múltiplas, e o grupo diferente foi determinado pelo teste de Dunn.
Para testarmos a igualdade das médias nas diferentes regiões da mesma valva no grupo de estenose aórtica (EA-preservada, EA-fibrose, e EA-calcificação), o teste não paramétrico de Friedman foi utilizado21.
O nível de significância utilizado foi de 5%.
Resultados
Análise de antígenos de C. pneumoniae em valvas calcificadas e não calcificadas - A imuno-histoquímica demonstrou várias granulações positivas (pontos marron escuro) dentro do foco de calcificação e no tecido fibrótico adjacente (fig. 1B). As valvas normais e não calcificadas de pacientes ateroscleróticos exibiram menor número de antígenos de CP (fig. 1A).
Mediana, média e desvio-padrão (DP) das frações de área positiva para Ag-CP nos diferentes grupos de valvas são mostrados na tabela I.
A análise comparativa da fração de área positiva para Ag-CP revelou número significativamente maior de Ag-CP apenas em EA-calcificação comparado ao grupo normal (p<0,05).
A comparação entre as diferentes regiões valvares do grupo EA mostrou que EA-preservada tinha quantidade significativamente menor de Ag-CP em relação aos grupo EA-Fibrose e EA-calcificação (P<0.05).
Análise do DNA de M. pneumoniae em valvas calcificadas e não calcificadas - A hibridização in situ revelou concentrações de MP-DNA (em marrom) nos focos de calcificação (fig. 1C). Algumas áreas das valvas do grupo Aterosclerose também exibiram várias granulações positivas, porém pouca CP.
Mediana, média e desvio-padrão (DP) das frações de área positiva para MP-DNA nos diferentes grupos são mostrados na tabela II.
A comparação dos grupos: normal, aterosclerose, e EA-preservada revelou que o grupo aterosclerose apresentava valores maiores em relação a EA-preservada (p<0,05). O grupo EA-calcificação (focos de calcificação) tinha uma quantidade significativamente maior de MP-DNA em relação aos grupos normal e aterosclerose (p<0,05). Não houve diferença entre os grupos normal, aterosclerose e EA-fibrose (p=0,16).
A análise das diferentes regiões do grupo EA revelou que as regiões mais preservadas da valva (EA-preservada) apresentavam números menores de MP-DNA em relação aos nódulos de calcificação (EA-calcificação) e a região peri-calcificação (EA-fibrose) (p<0,05).
Densidade de C. pneumoniae e M. Pneumoniae nas valvas - As densidades de Ag-CP e MP-DNA foram similares nas valvas dos grupos: normal e aterosclerose. No grupo com estenose aórtica, as densidades tanto de Ag-CP quanto de MP-DNA na região de calcificação foram maiores que as densidades encontradas na região mais preservada da valva e no grupo Normal. Na região de fibrose, as densidades de Ag-CP e MP-DNA também foram maiores do que na região mais preservada da valva (fig. 2).
Discussão
Várias similaridades entre o processo de aterosclerose e da EA sugerem que agentes causadores comuns possam estar presentes em ambas as doenças. Mohler e cols.22 encontrou que 88% das valvas cardíacas retiradas cirurgicamente de pacientes que tinham sido submetidos à troca de valva continham placas ateroscleróticas, 83% apresentava calcificação distrófica e, mastócitos estavam presentes nas valvas calcificadas e ossificadas, de forma proeminente nas regiões ateromatosas.
Nosso grupo descreveu previamente que CP e MP estão presentes em placas ateroscleróticas15,17,18. Dada a similaridade entre a aterosclerose e a estenose aórtica valvar, fizemos a hipótese de que tais agentes poderiam também estar presentes na EA, podendo ter papel importante na patogênese da doença. No presente estudo, procuramos por CP e MP em valvas aórtica com e sem estenose e em valvas sem estenose de pacientes ateroscleróticos, utilizando diferentes técnicas anatomopatológicas.
A sonda utilizada contra MP é altamente específica, assim como o anticorpo monoclonal contra a membrana externa da CP. Os resultados mostraram que as duas bactérias estão freqüentemente presentes em todas as valvas aórticas, independentemente de calcificação. Entretanto, quantidade significativamente maior de ambas foi encontrada nos focos de calcificação. O tecido fibrótico adjacente também exibiu grandes quantidades de Ag-CP.
MP e CP foram encontrados em 100% das valvas estudadas. As valvas aórticas de pacientes sem EA apresentaram pequena quantidade, independentemente se havia aterosclerose sistêmica ou não. Por outro lado, pacientes com EA apresentavam maiores quantidades dos dois agentes. Esses resultados sugerem que MP e CP possam desempenhar um papel no desenvolvimento da calcificação na EA. A detecção das duas bactérias nos nódulos de calcificação foi obtida por todas as três técnicas - hibridização in situ, imuno-histoquímica, e microscopia eletrônica - reforçando o conceito de que os resultados não são artefatuais. A análise ultra-estrutural demonstrou que nos nódulos de calcificação essas bactérias têm aspecto degenerado, porém pudemos reconhecer em muitas delas a membrana externa dupla e a forma em pêra que caracterizam os corpos elementares da Chlamydia pneumoniae (figs. 3A e 3B).
Diferenças significativas existem quanto à incidência de CP relatada em valvas de pacientes com EA na literatura. Andreasen e cols.9 encontrou 0% utilizando o PCR (reação de polimerase em cadeia ou polymerase chain reaction) e cultura, enquanto Juvonen e cols.16 reportou 53% utilizando a imuno-histoquímica e 18% pelo PCR em espécimes cirúrgicos de pacientes submetidos a troca da valva aórtica por estenose não reumática severa.
O PCR foi o método mais comumente utilizado para detecção de C.pneumoniae em estudos prévios. Este fato talvez explique em parte a ampla variação de positividade entre os resultados. Estudos demonstraram que existe grande variação na habilidade de métodos entre laboratórios clínicos para detectar agentes infecciosos de forma confiável23,24.
Por outro lado, a maior parte dos estudos, não quantificou a concentração dos agentes infecciosos presentes no tecido no sentido de correlacionar com a intensidade e o grau de lesão e inflamação. O PCR é uma técnica que apenas detecta a presença ou não de uma seqüência de DNA procurada.
No presente estudo, preferimos utilizar a técnica de hibridização in situ que fornece informação não apenas quanto à presença, mas também quanto à localização e quantidade das seqüências de DNA. Para certificar-se da confiabilidade dos resultados, procuramos simultaneamente pela presença de antígenos específicos utilizando a técnica de imuno-histoquímica com o anticorpo anti C.pneumoniae mais comumente utilizado. Finalmente, procuramos, pela microscopia eletrônica, pela presença de estruturas compatíveis com as formas de C.pneumoniae e encontramos grande número delas, sobretudo ao redor dos nódulos de calcificação.
A demonstração de que as bactérias CP e MP estão presentes em concentrações significativamente maiores em valvas aórticas de pacientes com estenose aórtica não parece ser um achado coincidente. Do ponto de vista fisiopatológico, essas bactérias têm o potencial de ativamente participar na gênese dos achados patológicos dessa doença. A demonstração desses dois agentes nas valvas aórticas ainda não havia sido realizada e abre um novo caminho na pesquisa acerca da estenose aórtica.
Chlamydia pneumoniae são bactérias gram-negativas que se multiplicam exclusivamente dentro de outras células como os macrófagos. São capazes de induzir a produção de enzimas pela célula hospedeira tais como as metaloproteinases e gelatinase 92-kDA. Essas enzimas podem danificar os componentes da matriz extracelular, resultando em alterações que são similares àquelas observadas em condições inflamatórias crônicas, tais como aterosclerose e estenose aórtica25,26.
Mycoplasma pneumoniae são bactérias pequenas, simples e únicas, capazes de utilizar colesterol para sua reprodução. Estão freqüentemente associadas com infecções respiratórias, mas também podem estar envolvidas em doenças vasculares e são capazes de induzir estados inflamatórios crônicos. Têm a membrana externa rica em fosfolipídios, o que pode induzir à oxidação da membrana celular do hospedeiro. Adicionalmente, podem induzir produção de citocinas nas células do hospedeiro e ampliar a virulência de outras bactérias27.
Dessa forma, é plausível que essas duas bactérias estejam participando ativamente no processo da doença aórtica valvar. O MP pode estimular a virulência da CP levando a um intenso processo inflamatório, resultando em debris de membranas celulares da bactéria e das células hospedeiras, com acúmulo de colesterol-LDL28 e Lp(a)8 oxidados e um processo inflamatório local29. A presença de grande quantidade de fosfolipídios provenientes das membranas degradadas de CP e MP é um substrato adequado para a deposição de cálcio, culminando na calcificação da valva. Em lesões iniciais, calcificação microscópica está presente em áreas com acúmulo de lipoproteínas8,28. Com o progresso da doença, as áreas anormais tornam-se confluentes. O micro-ambiente da valva danificada na presença de agentes infecciosos, deposição de colesterol e inflamação, resulta em condições favoráveis para o desenvolvimento da calcificação e danificação da valva.
Concluindo, CP e MP estão presentes em maiores concentrações na estenose aórtica valvar calcificada. Nossos resultados sugerem que essas bactérias estão associadas ao desenvolvimento da calcificação e inflamação, adicionando novas similaridades entre os processos de estenose da valva aórtica e aterosclerose, ambos podendo ter a infecção envolvida em sua patogênese.
Endereço para correspondência
Marilia Harumi Higuchi dos Santos
Rua Capote Valente, 361/142
05409-001
São Paulo, SP
E-mail:
mhhsantos@yahoo.com
Recebido em 4/07/03
Aceito em 3/09/04
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OBJECTIVE: We investigated whether Chlamydia pneumoniae (CP) and Mycoplasma pneumoniae (MP) are present in aortic valve stenosis (AS). METHODS: Immunohistochemistry was utilized to identify CP antigens, in situ hybridization to identify MP DNA, and electron microscopy was used to evaluate the following three groups: Normal - 11 normal autopsy valves; Atherosclerosis - 10 autopsy valves from patients with systemic atherosclerosis and no AS; and AS - 14 surgical specimens of AS analyzed in 3 sub-regions: AS-Preserved - peripheral, preserved regions; AS-Fibrosis - peri-calcified fibrotic tissue; and AS-Calcification - calcified nodules. RESULTS: The positive area fraction of CP antigen median values were 0.09, 0.30, 0.18, 1.33, and 3.3 in groups Normal, Atherosclerosis, AS-Preserved, AS-Fibrosis, and AS-Calcification, respectively. CP density was significantly greater in Atherosclerosis and AS-Calcification than in Normal (P<0.05). Within the AS group, the amount of CP was greater in the Calcification and Fibrosis regions (P<0.05). MP-DNA positive area fraction (median values) were 0.12, 0.44, 0.07, 0.36, and 1.52 in groups Normal, Atherosclerosis, AS-Preserved, AS-Fibrosis, and AS-Calcification, respectively. The amount of MP-DNA was greater in AS-Calcification than in Normal (P<0.05). Within the AS group, MP-DNA was in larger quantity in the Calcification and Fibrosis regions (P<0.05). CONCLUSION: AS Calcified nodes present higher concentration of CP and MP suggesting that these bacteria may be associated with the development of calcification and inflammation. This adds novel similarities between AS and the atherosclerosis process, which may have infection mechanisms involved.
Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae in calcified nodes of stenosed aortic valves
Marilia Harumi Higuchi-dos-Santos; Humberto Pierri; Maria de Lourdes Higuchi; Amit Nussbacher; Sueli Palomino; Nadia Vieira Sambiase; José Antonio Franchini Ramires; Maurício Wajngarten
Heart Institute (InCor) - FMUSP - São Paulo, SP - Brazil
Correspondence
ABSTRACT
OBJECTIVE: We investigated whether Chlamydia pneumoniae (CP) and Mycoplasma pneumoniae (MP) are present in aortic valve stenosis (AS).
METHODS: Immunohistochemistry was utilized to identify CP antigens, in situ hybridization to identify MP DNA, and electron microscopy was used to evaluate the following three groups: Normal - 11 normal autopsy valves; Atherosclerosis - 10 autopsy valves from patients with systemic atherosclerosis and no AS; and AS - 14 surgical specimens of AS analyzed in 3 sub-regions: AS-Preserved - peripheral, preserved regions; AS-Fibrosis - peri-calcified fibrotic tissue; and AS-Calcification - calcified nodules.
RESULTS: The positive area fraction of CP antigen median values were 0.09, 0.30, 0.18, 1.33, and 3.3 in groups Normal, Atherosclerosis, AS-Preserved, AS-Fibrosis, and AS-Calcification, respectively. CP density was significantly greater in Atherosclerosis and AS-Calcification than in Normal (P<0.05). Within the AS group, the amount of CP was greater in the Calcification and Fibrosis regions (P<0.05). MP-DNA positive area fraction (median values) were 0.12, 0.44, 0.07, 0.36, and 1.52 in groups Normal, Atherosclerosis, AS-Preserved, AS-Fibrosis, and AS-Calcification, respectively. The amount of MP-DNA was greater in AS-Calcification than in Normal (P<0.05). Within the AS group, MP-DNA was in larger quantity in the Calcification and Fibrosis regions (P<0.05).
CONCLUSION: AS Calcified nodes present higher concentration of CP and MP suggesting that these bacteria may be associated with the development of calcification and inflammation. This adds novel similarities between AS and the atherosclerosis process, which may have infection mechanisms involved.
The process of aortic degeneration associated with aortic valve stenosis (AS) in the elderly patient shares many similarities with that of coronary artery atherosclerosis1. Atheromatous plaques and calcification of nonrheumatic aortic valves seem to have a similar pathogenesis2. Valves with AS often exhibit inflammatory changes with infiltration of macrophages and T lymphocytes around calcified nodules, which resemble the inflammatory response seen in coronary atherosclerosis2. Furthermore, cholesterol deposits precede the calcified nodes in AS. The same clinical risk factors usually associated with coronary artery disease are associated with nonrheumatic calcific aortic stenosis2-7. These include older age, male sex, increased serum levels of low-density lipoprotein (LDL) and Lp (a) lipoprotein8, smoking, hypertension, diabetes, hypercholesterolemia9. Gene polymorphism could also be relevant in the development of atherosclerosis10 and in aortic valve disease11. Osteopontin, a phosphorylated glycoprotein that can be actively synthethised by macrophages has been linked to calcification and has been related to the severity of coronary artery disease12 and to advanced lesions of aortic stenosis13. However, identification of the causes and factors associated with the development of calcification in AS is still a challenge.
Chlamydia pneumoniae (CP) has been suggested to be involved in the pathogenesis of atherosclerosis, related with gene polymorphisms14 and inflammation15 but this still is a controversial matter16-18. CP has also been associated with the inflammatory processes of aortic valve lesions19. We have previously demonstrated that Mycoplasma pneumoniae (MP) is present in association with CP in atheromatous plaques of coronary arteries with unstable coronary syndromes, usually associated with wall inflammation and frequently having calcification15,17. Given the similarities between coronary artery atherosclerosis and AS, we hypothesized that MP and CP could be involved in the development of calcific aortic stenosis in the elderly.
Methods
Three groups of aortic valves were analyzed: group Normal, 11 valves obtained from autopsies of patients aged 52±16 years (7 female, 4 male) without systemic atherosclerosis or aortic stenosis; group Atherosclerosis, 10 valves obtained from autopsies of patients aged 69±9 years (5 female, 5 male) with severe systemic atherosclerosis but without aortic stenosis; and group Aortic Valve Stenosis (AS), 14 surgical specimens from patients aged 71±8 years (4 female, 10 male) undergoing aortic valve replacement for AS. Severe AS was defined as the valve containing areas of calcification and diffuse fibrotic thickening and clinical evidence of severe obstruction. Exclusion criteria were evidence of rheumatic disease, endocarditis, Marfan's syndrome or coexisting valvar disease in the other valves (except mitral annular calcification). The valve leaflets of the group AS were analyzed in 3 sub-regions: areas distant from the calcified nodules (AS-Preserved), peri-calcified fibrous tissue (AS-Fibrosis), and calcified foci (AS-Calcification).
A representative section of the central portion of the leaflets was fixed in formalin 10%. Decalcification was performed when necessary in formic acid 25%. Serial 5-µm thick sections were obtained for hematoxylin and eosin staining, the immunohistochemical technique (IHC) for detecting Chlamydia pneumoniae (CP), and the in situ hybridization technique (ISH) for detecting Mycoplasma pneumoniae (MP). The specificity of the CP-IHC reaction was confirmed by in situ hybridization in the 3 most positive cases at IHC.
A quantitative analysis was performed with the image analysis system Quantimet 500-Leica to detect the area fraction occupied by CP antigens (CP-Ags) and MP-DNA.
Adjacent valvular fragments of each case were also collected for electron microscopy analysis.
Immunohistochemistry technique (IHC) - Five-µm thick sections of each specimen were submitted to heat antigen recovery (microwave) and incubation with pure monoclonal anti-CP antibody (clone RR-402, Dako, Carpinteria, CA, USA, antimajor outer external membrane of CP), overnight at 4º C. This antibody does not cross react with the following agents: adenovirus, respiratory virus, A and B flu viruses, Chlamydia trachomatis, and some Chlamydia psittaci serotypes. We confirmed such specificity by simultaneously performing reactions in histological sections positive for cytomegalovirus and herpes virus. The secondary antibody was antimice immunoglobulin produced in rabbits, conjugated with biotin (Dako, Carpinteria, CA, USA) diluted 1:2000, for 1 hour at 37º C. The reaction was detected with streptavidin peroxidase conjugate (Amersham International, England), diluted 1:1000, for 1 hour at 37º C, and 3,3-diaminobenzidine (Sigma Chemical Corporation, St. Louis, MO). Sections were later counterstained with Harri's hematoxylin, dehydrated, cleared, and mounted with Entellan (Merck, Germany).
In situ hybridization technique (ISH) for MP and CP - Cell permeabilization of the histological sections was made using 0.01 M citrate buffered solution, pH 6.0±0.1, in the microwave oven. Endogenous peroxidase was blocked with 3% H202. Hybridization mixture containing the following ingredients was applied: the probe, deionized formamide, 50% dextran sulfate, 20 X SSC, Denhardt solution, salmon sperm DNA, yeast tRNA, poly A and C, and diethylpyrocarbonate pure water. DNA double-strands were denatured at 95±5º C. The signal was amplified using the catalyzed signal amplification system for ISH, Dakogen Point (Dako, Carpinteria, CA, USA). The reaction was visualized with the chromogen 3,3-diaminobenzidine (Dako, Carpinteria, CA, USA). Sections were counterstained with Harri's hematoxylin.
Controls: negative controls for ISH and IHC were carried out omitting the probe or the primary antibody. Human histological sections previously diagnosed as positive for MP and CP were used for control of both reactions. In addition, as positive control for in situ hybridization, we used a repetitive Alu sequence probe (alu1/alu2) (Genetic Research, AL, USA) and for negative control, we used a plasmid DNA, labeled with biotin (Dako, Carpinteria, CA, USA).
Probes: Mycoplasma pneumoniae labeled probe was prepared by nick translation of a highly specific clone for M. pneumoniae. The clone was specifically isolated and characterized to be higly specific for MP to the exclusion of hybridization with other species of Mycobacteria and other bacterial species (Enzo Diagnostics, Farmingdale, NY, USA). Chlamydia pneumoniae probe was the biotinylated oligonucleotide sequence (20 bp) synthesized by GIBCO/BRL, Rockville, MD, USA.
Electron microscopy - The fragments of the valves collected for electron microscopy were previously decalcified as described above when necessary, fixed in 3% glutaraldehyde, and postfixed with 1% osmium tetroxide. The fragments were contrasted with 0.5% uranyl acetate. Fragments were blocked in araldite resin. Ultra-thin sections (60 to 90 nm) were obtained and contrasted with 5% lead citrate solution20.
Statistical analysis - The variable area fraction was described through the observation of the minimum and maximum values, and the calculation of means, medians, and standard deviations.
As the assumption of normality or equality of variance was not met, a nonparametric test (distribution-free) was used to compare the 3 independent groups of sampled data (groups Normal, Atherosclerosis, and AS). The Kruskal-Wallis test was used to test the hypothesis of equality between the 3 groups, with multiple comparisons, and the different group was determined by the Dunn test.
To test the mean equality in different regions of the same valve in the group with aortic stenosis (AS-Preserved, AS-Fibrosis, and AS-Calcification), the Friedman nonparametric test was used21.
The significance level used for all the tests was 5%.
Results
Analysis of C. pneumoniae antigens in calcified and noncalcified valves - The immunohistochemistry demonstrated several positive granules into the calcified foci and in the fibrous tissue surrounding them represented by dark brown points (Figure 1B). The normal and noncalcified valves from atherosclerotic patients exhibited a much lower number of CP antigens (Figure 1A).
Median, mean, and standard deviation (SD) of area fraction positive for CP-Ags in the different valve groups are shown in Table I.
Comparative analysis of median area fraction positive for CP-Ags revealed a significantly greater number of CP-Ags only in AS-Calcification as compared to Normal (p<0.05).
Comparison of the different valvular regions of group AS showed that AS-Preserved had a significantly lower number of CP-Ags than did groups AS-Fibrosis and AS-Calcification (P<0.05).
Analysis of M. pneumoniae-DNA in calcified and noncalcified valves - In situ hybridization revealed concentrations of MP-DNA (in brown) in the calcified foci (Figure 1C). Some areas of valves from the Atherosclerotic group also exhibited many positive granules but little CP.
Median, mean, and standard deviation (SD) of area fraction of Mycoplasma pneumoniae-DNA (MP-DNA) in the different groups are shown in Table II.
Comparison of groups Normal, Atherosclerosis, and AS-Preserved revealed that group Atherosclerosis has significantly higher values than AS-Preserved (P<0.05). The group AS-Calcification (calcified foci) had a statistically significant greater amount of MP-DNA than did groups Normal and Atherosclerosis (P<0.05). No difference existed among groups Normal, Atherosclerosis, and AS-Fibrosis (P=0.16).
Analysis of different regions of group AS revealed that more preserved valvular regions (AS-Preserved) had lower numbers of MP than did the calcified nodules (AS-Calcification) and the peri-calcified fibrotic region (AS-Fibrosis) (P<0.05).
Density of C. pneumoniae and of M. Pneumoniae in the valves - The density of CP-Ags and MP-DNA were similar in valves from Normal and Atherosclerosis groups. In the group with aortic ste-nosis, the density of both CP-Ags and MP-DNA in the calcified region were higher than the density in the Preserved region of the valve and than that in the Normal group. In the fibrotic region, the density of CP-Ags and MP-DNA were also greater than that in the Preserved region (Figure 2).
Discussion
Many similarities between the process of atherosclerosis and that of AS suggest that common causative agents may underlie both diseases. Mohler et al22 found that 88% of surgically excised heart valves from patients who underwent cardiac valve replacement surgery contained atherosclerotic plaques, 83% had dystrophic calcification, and mast cells were present in calcified and ossified valves and most prominently in atheromatous regions.
We have previously reported that Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae are present in atherosclerotic plaques15,17,18. Given the similarity between atherosclerosis and aortic valve stenosis, we hypothesized that such agents may also be present in AS and play an important role in the pathogenesis of the disease. In the present study, we searched for CP and MP in aortic valves with and without stenosis and in nonstenotic aortic valves from atherosclerotic patients, using different anatomopathological techniques.
The probe used against MP is very specific, as is the monoclonal antibody against the external wall of CP. The results showed that both bacteria are frequently present in all aortic valves, independently of calcification. However, a significantly greater amount of both is present in the calcified foci. The surrounding dense fibrotic tissue also exhibits large amounts of CP-Ags.
MP and CP were found in 100% of the studied valves. Aortic valves of patients without AS present scarce amount, regardless of whether they had systemic atherosclerosis or not. On the other hand, patients with AS presented higher amounts of both agents. These results suggest that MP and CP may play a role in the development of calcification in AS. The detection of both bacteria in the calcified nodules was obtained by all 3 techniques - in situ hybridization, immunohistochemistry, and electron microscopy - a demonstration that the results are consistent and reliable. The ultra-structural analysis demonstrated that in the calcified nodules these bacteria seem to be degenerated, but in many of them we recognized the double external membrane and the pearl shape that characterize elementary bodies of Chlamydia pneumoniae (Figure 3A and 3B).
A significant difference exists in the reported incidence of CP in valves of patients with AS in the literature. Andreasen et al 9 found 0% using PCR (polymerase chain reaction) and culture, while Juvonen et al (16) reported 53% using immunohistochemistry and 18% by PCR in surgical specimens of patients undergoing aortic valve replacement due to severe nonrheumatic stenosis.
PCR was the most often used method for detection of C.pneumoniae in previous studies. This may explain in part the wide variation of positivity in the results. Studies have demonstrated that there is a significant variation in the abiity of assays among clinical laboratories to reliably detect infectious agents23,24.
On the other hand, most of the studies, did not quantify the amount of infectious agents present in the tissue in order to correlate with the intensity of the lesion and inflammation. PCR is a technique that is only capable to detecting the presence or not of the DNA sequence searched.
In the present work we prefered to use the in situ hybridization technique that provides information not only about the presence, but also localization and quantity of the searched DNA sequence.
In order to check the reliability of these results, we simultaneously searched for the presence of specific antigens using immunohistochemistry technique with the most commonly used monoclonal antibody against C.pneumoniae. Finally, we searched by electron microscopy for the presence of structures that were compatible with C.pneumoniae forms and found large numbers of them, mainly surrounding the calcified nodules.
The demonstration that Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae bacteria are present in significantly higher concentrations in aortic valves of patients with aortic stenosis does not appear to be a coincidental finding. From a pathophysiological point of view, these bacteria have the potential to actively participate in the genesis of the pathological findings of this disease.
The demonstration of these two agents in aortic valves has never been shown before and opens another approach in the research on aortic valve stenosis.
Chlamydia pneumoniae are gram-negative bacteria that dwell exclusively within other cells such as macrophages. They are capable of inducing the production of enzymes by the host cell such as metalloproteinases and 92-kDA gelatinase. These enzymes can damage components of the extracellular matrix and result in changes that are similar to those observed in chronic inflammatory conditions, such as atherosclerosis and aortic stenosis25,26.
Mycoplasma pneumoniae are small, simple bacteria and the only ones capable of utilizing cholesterol for their reproduction. They are frequently associated with respiratory infections but may also be involved in vascular disease and are capable of inducing chronic inflammatory states. Their external membrane is rich in phospholipids, which can induce the oxidation of the host's cellular membrane. Additionally, they can induce cytokines in the host's cells and can boost the virulence of other bacteria27.
It is therefore plausible that these two bacteria actively participate in the process of aortic valve disease. Mycoplasma pneumoniae may stimulate the virulence of Chlamydia pneumoniae leading to an intense inflammatory process, resulting in debris of cellular membranes of the bacteria and host cells, with accumulation of oxidized LDL-cholesterol28 and Lp(a)8 and a local inflammatory process29. The presence of a large number of phospholipids from degraded membranes of Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae is an adequate substrate for calcium deposition, culminating in calcification of the valve. In early lesions, microscopic calcification is present in areas with lipoprotein accumulation8,28. As the disease progresses, the abnormal areas become confluent. The microenvironment of the damaged valve with the presence of the infectious agents, cholesterol deposition, and inflammation results in favorable conditions for the development of calcification and hardening of the valve.
In conclusion, Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae are present in high concentrations in calcific aortic valve stenosis. Our results suggest that these bacteria are associated with the development of calcification and inflammation, adding novel similarities between aortic valve stenosis and the atherosclerotic processes, both of which may have infection involved in their basic pathogenesis.