OBJETIVO: Comparar os efeitos da atorvastatina, fluvastatina, pravastatina e simvastatina sobre a função endotelial, a aterosclerose aórtica e o teor de malonodialdeído (MDA) nas LDL nativas, oxidadas e na parede arterial de coelhos hipercolesterolêmicos, depois que as doses destas estatinas foram ajustadas para reduzir o colesterol total plasmático a valores similares. MÉTODOS: Coelhos machos, foram separados em grupos de 10 animais (n=10), chamados hipercolesterolêmico (controle), atorvastatina, fluvastatina, pravastatina e normal. A exceção do grupo normal, os animais foram alimentados com ração padrão acrescida de colesterol a 0,5% e óleo de coco a 2% durante 45 dias. As drogas foram administradas a partir do 15º dia do início do experimento e no 30º dia, as doses foram ajustadas, através do controle do colesterol plasmático, para obter valores semelhantes em cada grupo. Ao final do experimento foi dosado o colesterol plasmático e as lipoproteinas e retirado um segmento de aorta torácica para estudo da função endotelial, da peroxidação lipídica e exame histológico para medida da aterosclerose aórtica. RESULTADOS: As estatinas reduziram significantemente o colesterol total plasmático, as LDL-colesterol e a aterosclerose aórtica. O teor de MDA também foi significantemente reduzido nas LDL nativas e oxidadas, assim como na parede arterial. O relaxamento-dependente do endotélio foi significantemente maior no grupo tratado em comparação ao hipercolesterolêmico. CONCLUSÃO: As estatinas, em doses ajustadas, tiveram efeito significante e similar em reduzir a peroxidação lipídica nas LDL e na parede arterial, na regressão da aterosclerose aórtica e na reversão da disfunção endotelial.
Efeitos da atorvastatina, fluvastatina, pravastatina e simvastatina sobre a função endotelial, a peroxidação lipídica e a aterosclerose aórtica em coelhos hipercolesterolêmicos
Campinas, SP
Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp - Campinas
As drogas inibidoras da HMGCoA-redutase reduzem, efetivamente, a mortalidade e os eventos coronarianos1-6, representando poderoso instrumento na prevenção e no controle da aterosclerose. Uma das principais ações destas drogas é reduzir as LDL-colesterol plasmáticas, interferindo na biossíntese do colesterol e aumentando o número de receptores hepáticos para a ApoB1007.
Mais recentemente, efeitos adicionais destas drogas têm sido demonstrados e considerados de importância na estabilização da placa de aterosclerose. Esses efeitos, chamados pleiotrópicos, referem-se à proteção endotelial, à redução da peroxidação lipídica e ao controle da reação inflamatória e da hemostasia8-11.
Alguns efeitos adversos das estatinas têm sido relatados e incluem cefaléia, mialgia, faringite e interação com outros medicamentos metabolizados no citocromo P45012-14.
Embora as estatinas tenham um mecanismo semelhante de ação, diferem na sua potência em reduzir o colesterol plasmático, sua solubilidade e metabolismo15,16.
Em trabalhos anteriores, foi estudado o efeito da simvastatina e da pravastatina sobre a função endotelial, o colesterol tecidual e o número de células espumosas em anéis de aorta de coelhos hipercolesterolêmicos17,18. Nesses estudos, verificamos que a pravastatina foi mais efetiva em reverter a disfunção endotelial ocasionada pela hipercolesterolemia, assim como reduziu mais intensamente o número de células espumosas em cortes histológicos obtidos da aorta torácica. Esses achados foram interpretados com cautela por tratar-se de estudo em animal de experimentação, mas de qualquer forma a diferença de efeitos observados entre essas estatinas insere-se dentro da controvertida discussão sobre o diferencial farmacológico das drogas inibidoras da HMGCoA-redutase.
No presente estudo, propusemo-nos a comparar o efeito de quatro estatinas (atorvastatina, fluvastatina, pravastatina e simvastatina) sobre a função endotelial, a peroxidação lipídica e a aterosclerose da aorta de coelhos hipercolesterolêmicos. As doses das estatinas foram ajustadas para reduzir o colesterol total plasmático a valores similares.
Os experimentos foram conduzidos de acordo com as recomendações do
Foram utilizados 60 coelhos da raça Nova Zelândia, com idade ao redor de 12 semanas, machos, com peso variando de 1,6 a 2,4 Kg, e distribuídos em grupos de 10 (n=10), denominados grupos normal (GN), hipercolesterolêmico (GH), atorvastatina (GA), fluvastatina (GF), pravastatina (GP) e simvastatina (GS). Os animais foram separados em gaiolas individuais e alimentados com ração padrão, da marca Purina, adicionada de colesterol a 0,5% e óleo de coco a 2%, por 45 dias. Foram servidos 100gr de ração/dia e água à vontade. Após 15 dias, foi obtida uma amostra de sangue, por punção cardíaca, para determinação do colesterol plasmático. Em seguida, atorvastatina (10 mg/dia), fluvastatina (20 mg/dia), pravastatina (20mg/dia) e simvastatina (15 mg/dia) foram administradas aos respectivos grupos. As doses basearam-se em estudos anteriores17,18 e as drogas administradas uma vez ao dia através de gavagem. Após 15 dias, foi obtida outra amostra de sangue para determinação do colesterol plasmático e as doses das estatinas ajustadas para se obter valores semelhantes do colesterol plasmático em cada grupo. As doses finais foram 10 mg/dia, 15 mg/dia, 15 mg/dia e 10 mg/dia para atorvastatina, fluvastatina, pravastatina e simvastatina, respectivamente.
Ao final do experimento, outra amostra de sangue foi obtida para determinação do colesterol plasmático e separação das lipoproteínas. Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e realizada toracotomia mediana e remoção da aorta para obtenção dos anéis destinados ao estudo da função endotelial, dosagem do MDA e exame histológico para medida da aterosclerose aórtica. Fragmentos de fígado e músculo foram também obtidos para exame histológico.
A aorta torácica, limpa de tecido conectivo, foi cortada em anéis de aproximadamente 5mm, com especial atenção para não lesar o endotélio. Em um contingente de anéis, o endotélio foi lesado, mecanicamente, através de um pequeno fórceps. Os anéis da aorta foram suspensos em 10ml de solução de Krebs-Henseleit a pH 7.4 (composição em mmol/L: NaCl, 113.; CaCl2, 2.19; NaHCO3, 25.0; MgSO4, 0.44; KH2PO4, 1.18; EDTA, 0.03; glicose, 11.0). A solução foi mantida a 37ºC e, continuadamente aerada, com uma mistura de gás contendo 95% de O2 e 5% de CO2. Os anéis foram montados em dois suportes metálicos ligados a um transdutor de força (
Os anéis de aorta torácica, com e sem endotélio, foram contraídos com noradrenalina (NA, 10-7 M). Quando a contração se manteve estável, acetilcolina (ACH) foi adicionada à solução, de forma cumulativa (10-8-10-5..5M) para obter as curvas de concentração-efeito. Após, a solução foi substituída com Krebs-Henseleit e a tensão estabilizada em valores basais, com freqüente renovação da solução. Após 30min, os anéis de aorta foram contraídos com NA (10-7 M) e outras curvas de concentração-efeito obtidas com nitroprussiato de sódio (SNP, 10- 8 - 10- 5..5 M).
Anéis de aorta, com 5mm de espessura, foram obtidos de forma padronizada de áreas definidas da parte superior da aorta torácica. Também foram retirados fragmentos de fígado e músculo da coxa. Os tecidos foram fixados em formalina a 10% por 24h, processados e embebidos em parafina. Cortes seriados foram montados em lâminas e corados com hematoxilina-eosina.
O colesterol total plasmático foi medido através de kits enzimáticos comerciais em um espectofotômetro
A peroxidação lipídica foi avaliada pela medida do MDA, um dos produtos finais da peroxidação. Amostras de aorta foram homogeneizadas em ácido-tricloroacético (TCA) gelado (1 mg de tecido por ml de TCA a 10%). Após centrifugação, uma porção do sobrenadante foi adicionada a igual volume de ácido tiobarbitúrico (0,6% v/v) e a mistura aquecida a 100ºC por 20min. A concentração de MDA foi calculada através de espectrofotômetro, usando uma absorção de 532 nm e um coeficiente de extinção molar de 1,49x10-5, sendo os resultados expressos em nmol/mg de tecido seco x10-7 19. As lipoproteínas foram separadas por ultracentrifugação sequencial do plasma de acordo com o método de Havel e cols.20. Sumariamente, o plasma foi centrifugado a 40.000 rpm por 18h a 4ºC em um Ti50 rotor (Beckman) e a camada de VLDL (d<1.006 g/ml) removida. O sobrenadante foi ajustado a uma densidade de 1063 g/ml usando brometo de potássio e centrifugado a 40 000 rpm por 20h. A LDL isolada foi dializada em 0,01 M de tampão fosfato (PBS), pH 7,4 a 8ºC por 24h, com freqüente lavagem do tampão. A concentração de proteína das LDL foi determinada pelo método de Lowry e cols.21, usando albumina bovina como padrão. A oxidação das LDL foi feita através da incubação com sulfato de cobre 5 mM (100 µg de proteína/ml, 1 M PBS) por 24 h a 37ºC22. A concentração de lípides peróxidos das LDL nativas e oxidadas foi medida pela reação do ácido tiobarbitúrico (TBARS), como descrito por Buege e Aust23. Os valores das TBARS foram expressos como equivalentes do MDA (nmol/proteína LDL) usando solução padrão de 1,1, 3,3 tetrametoxipropano.
Imagens dos cortes histológicos dos anéis da aorta foram obtidas através de microscópio Leica DMLD e importadas para um computador. Através de um programa Scion24 foram selecionadas manualmente as áreas da parede arterial e dos lipossomos extracelulares. O número de
Cloreto de acetilcolina, bitartarato de noradrenalina, nitroprussiato de sódio, ácido tricloroacético, ácido tiobarbitúrico e indometacina foram obtidos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Os reagentes da solução de Krebs-Henseleit foram obtidos da Merck Chemicals.
As análises descritivas foram feitas através das medidas de posição e dispersão para as variáveis contínuas. Para comparar os grupos de tratamentos através das variáveis coletadas foi utilizada análise de variância simples (ANOVA
Para comparar as curvas dose resposta foi utilizada a ANOVA com medidas repetidas. Para localização das diferenças foram utilizados os testes de comparação múltipla de Tukey e o teste de perfil por contrastes. O nível de significância adotado foi de 5%26,27.
No início do estudo, o peso médio dos coelhos, nos diferentes grupos, foi 1,80±0,2 kg para o GN, 2,0±0,18 kg para GH, 1,75± 0,12 kg para GA, 1,85±0,14 kg para GF, 2,09±0,23 kg para GP e 1,79±0,10 kg para o GS. Todos os animais ganharam peso durante o estudo, mas não houve diferença significante entre os grupos.
A
O teor de malonodialdeído (MDA) (nmol/mg x 10-7M) nas partículas de LDL oxidadas e parede da aorta encontram-se nas
A
O exame histológico mostrou a presença de lipossomos extracelulares na região da íntima da aorta dos coelhos hipercolesterolêmicos, sem a presença de células inflamatórias. A porcentagem de lipossomos extracelulares comparados com a parede do vaso foi de 21,0±0,15, 2,58±1,35, 3,83±0,89, 2,95±0,91 e 3,84±1,08 para os grupos hipercolesterolemia, atorvastatina, fluvastatina, simvastatina e pravastatina, respectivamente. As estatinas reduziram significantemente (p<0,05) a aterosclerose aórtica quando comparada ao grupo hipercolesterolemia, não sendo observada diferença entre os grupos tratados.
A
O estudo histológico de fragmentos do fígado revelou esteatose moderada em todos os grupos estudados, enquanto o tecido muscular aparentou ser normal ao exame microscópico.
Os níveis de TGO e TGP encontravam-se normais em todos os grupos tratados.
As estatinas variam consideravelmente nas suas características farmacológicas, lipofílicas, na vida média, metabolismo e outras propriedades28
O principal objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos pleiotrópicos das diversas estatinas, dentro de seus recursos, considerando os resultados controversos apontados na literatura. Assim, Pentikainem e cols.35 relataram que a pravastatina é um inibidor da HMGCoA redutase com maior afinidade para os tecidos periféricos, confirmado por Germershausen e cols.36, que atribuem esse achado às espécies ativas derivadas da pravastatina ligadas as proteínas em cerca de 50%, enquanto as demais estatinas encontram-se intensamente ligadas às proteínas (>95%) e as drogas menos ligadas às proteínas teriam maior penetração nos tecidos. Os inibidores da HMGCoA redutase hidrofílicos, de outro lado, podem alcançar maior concentração nas células endoteliais, aumentando assim, a atividade da NO sintase. Entretanto, a seletividade tissular dos inibidores da HMG-CoA redutase é controversa14,37. Thiery e cols.38, investigando a extensão da aterogênese em coelhos hipercolesterolêmicos tratados com lovastatina, simvastatina e pravastatina (15 mg/dia) observaram uma menor concentração do colesterol tissular nos animais tratados com lovastatina e simvastatina do que nos que receberam pravastatina. De Vries e cols.39 afirmam que a síntese do colesterol no cristalino é inibida pela pravastatina 100 vezes mais efetivamente que a simvastatina. Tesfamarian e cols.40 observaram efeitos diferentes da pravastatina, simvastatina, e atorvastatina na liberação do Ca2+ citoplasmático e na reatividade vascular, enquanto Joukhadar e cols.41 referiram efeito similar para a atorvastatina, simvastatina e pravastatina em alguns parâmetros relativos à hemostasia e inflamação no plasma de pacientes hipercolesterolêmicos.
Entretanto, as supostas diferenças apontadas entre as estatinas, aparentemente, não teriam maior significado clínico, uma vez que os grandes estudos randomizados têm demonstrado significante redução da mortalidade e eventos coronarianos, para as diferentes estatinas estudadas1,3,4,6.
Nossos resultados mostraram que todas as estatinas foram eficientes em reduzir a peroxidação lipídica, seja nas LDL nativas ou oxidadas e também na parede arterial. Não houve diferença significante na intensidade de efeito entre as diversas drogas. O efeito antioxidante da simvastatina42, da fluvastatina43, da pravastatina44, e da atorvastatina45 tem sido referido na literatura e representa uma providência importante na preservação da função endotelial34.
Quando comparadas ao grupo de animais hipercolesterolêmicos, todas as estatinas foram eficientes em reverter parcialmente a disfunção endotelial. O efeito foi semelhante para as diferentes drogas, a exceção da pravastatina, cujo efeito sobre o relaxamento-dependente do endotélio foi mais significante. A discreta diferença na intensidade do relaxamento- dependente do endotélio verificado com a pravastatina, foi interpretado como devido a sua característica hidrofílica, mas esse achado deve ser reavaliado em outros estudos.
O aumento do relaxamento-dependente do endotélio observado nos anéis de aorta de coelhos tratados com estatinas deve estar relacionado à redução do colesterol tecidual e do estresse oxidativo da parede arterial46, além de ação sobre mediadores de transcrição celular, não estudados neste modelo experimental. Em trabalho anterior18, verificamos que a reversão da disfunção endotelial em coelhos hipercolesterolêmicos, tratados com pravastatina e simvastatina, ocorria rapidamente, lembrando o benefício do tratamento para as síndromes coronarianas agudas.
Outro ponto que merece destaque no presente trabalho, pelas eventuais implicações clínicas, é a regressão do espessamento intimal, representado pelo acúmulo de lipossomos extracelulares. As partículas de LDL adentram à célula endotelial por um mecanismo de pinocitose, formando vesículas de pinocitose que são incorporadas em endossomos e lipossomos no citoplasma celular. Na hipercolesterolemia o material lipídico carreado pelos endossomos acumulam-se em lipossomos extracelulares na íntima da artéria.. Considerando que a presença de lipossomos extracelulares representa a expressão morfológica mais precoce da aterosclerose, sua regressão significa um potencial mecanismo de controle da doença aterosclerótica. A regressão da placa de aterosclerose pelas estatinas tem sido demonstrada em diversos estudos experimentais47-49.
Estudos com ressonância magnética e espectroscopia têm revelado mobilização do conteúdo lipídico em placas de aterosclerose de animais tratados com diversas drogas50-52.
Mais recentemente, o estudo REVERSE53, veio confirmar a interrupção da progressão e mesmo uma pequena regressão da placa de aterosclerose (0,4% de redução mediana), através do ultra-som coronariano, em pacientes com doença coronariana estável. Esses resultados abrem uma excepcional perspectiva na condução da aterosclerose.
No presente trabalho, não se observou diferença significante no efeito sobre a regressão da aterosclerose, entre as diversas estatinas estudadas. Entretanto, merece destaque que as doses das estatinas foram ajustadas para se obter valores selhantes do colesterol plasmático nos diversos grupos, considerando a diferença de potência entre as drogas. A atorvastatina foi a de maior potência, pois utilizou-se uma menor dose para semelhante redução do colesterol plasmático entre os grupos, não se podendo analisar uma eventual diferença de efeito na regressão, levando em conta a intensidade de redução do colesterol e das LDL plasmáticas. Mais recentemente, a verificação de que a redução mais intensa das LDL-plasmáticas em pacientes com síndromes coronárianas agudas levou a um melhor beneficio em relação à redução da mortalidade e outros eventos coronarianos54, abriu a discussão sobre o melhor nível das LDL plasmáticas no controle da aterosclerose, destacando o significado da potência hipolipemiante das estatinas.
A redução mais intensa dos lípides plasmáticos faz sentido, quando se considera que a aterosclerose tem como fator causal principal o afluxo de partículas de LDL e seus epítopes para a região intimal do vaso através da célula endotelial, provocando uma resposta imunológica mediada por diversos fatores relacionados a inflamação, com mobilização de monócitos, neutrófilos e linfócitos, que vão restringir o núcleo lipídico através de uma reação predominantemente proliferativa ou instabilizar a placa por uma maior resposta celular e enzimática55. Provavelmente, a magnitude da redução do colesterol e das LDL plasmáticas, a par de outros fatores já mencionados, teriam ação benéfica na reversão da disfunção endotelial e mobilização do núcleo lipídico da placa de aterosclerose, mormente da sua fase mais precoce, restando estabelecer o limite de segurança para a redução das LDL plasmáticas.
Os autores do estudo REVERSE53 e PROVE-IT54 destacam também, a existência de um diferencial farmacológico entre as estatinas estudadas, atorvastatina e pravastatina. Estudo experimental bem conduzido, utilizando a fluvastatina, também considera a existência de um efeito indireto da droga, independente da redução do colesterol plasmático55 o que reabre a discussão sobre um eventual diferencial farmacológico e possível especificidade tissular entre este grupo de drogas, independente da redução dos lípides.
Neste estudo, as estatinas não alteraram a atividade enzimática hepática. Os exames histológicos mostraram aparência normal do tecido muscular e moderada esteatose hepática, provavelmente conseqüente à elevada concentração do colesterol no plasma. Não foram encontradas áreas de necrose ou reação inflamatória. Esses achados sugerem que as drogas não tiveram efeito tóxico nas doses administradas.
A ausência de reação inflamatória na camada íntima da parede vascular, a despeito da presença de lipossomos extracelulares nos coelhos hipercolesterolêmicos, reforça a idéia de que a resposta inflamatória ocorre mais tardiamente, no propósito de reparar a presença inadequada das LDL e seus epítopes na íntima arterial56, mais uma vez reforçando a impressão de que a mais intensa redução das LDL teciduais terá efeito mais favoravél no controle da doença.
Os resultados deste estudo mostraram que todas as estatinas foram efetivas em reduzir o colesterol total plasmático, o teor do MDA na parede arterial, nas LDL nativas e oxidadas, e reverter a disfunção endotelial em coelhos hipercolesterolêmicos.
Paulo Afonso Ribeiro Jorge Rua Guilherme da Silva, 397 Cep 13025-070 - Campinas, SP E-mail:
Enviado em 04/04/2004 - Aceito em 29/10/2004
OBJECTIVE: To compare the effects of atorvastatin, fluvastatin, pravastatin, and simvastatin on endothelial function, aortic atherosclerosis, and the content of malondialdehyde (MDA) in native and oxidized LDL and in the arterial wall of hypercholesterolemic rabbits after adjusting the dosages of those statins to reduce total serum cholesterol levels to similar values. METHODS: Male rabbits were divided into the following 6 groups of 10 animals (n=10): 1) GH (control) - hypercholesterolemic animals; 2) GA - atorvastatin; 3) GF - fluvastatin; 4) GP - pravastatin; 5) GS - simvastatin; and 6) GN - normal. The animals were fed a standard food preparation enriched with 0.5% cholesterol and 2% coconut oil for 45 days. Fifteen days after beginning the experiment, atorvastatin, fluvastatin, pravastatin and simvastatin were administered for 15 days through gavage, and the dosages were adjusted to obtain similar cholesterol values in each group. At the end of the experiment, a blood sample was withdrawn for determining total cholesterol and separating the lipoproteins, and a segment of the thoracic aorta was removed to be used for studying endothelial function and lipid peroxidation, and for measuring aortic atherosclerosis in histological sections. RESULTS: The statins significantly reduced total serum cholesterol levels, LDL-cholesterol levels, and aortic atherosclerosis. The MDA content was also significantly reduced in native and oxidized LDL, as well as in the arterial wall. Endothelium-dependent relaxation was significantly greater in the treated group compared with that in the hypercholesterolemic group. CONCLUSION: The statins, at dosages adjusted, had a significant and similar effect in reducing lipid peroxidation in native and oxidized LDL-C and in arterial walls, in decreasing aortic atherosclerosis, and in reverting endothelial dysfunction.
Effects of atorvastatin, fluvastatin, pravastatin, and simvastatin on endothelial function, lipid peroxidation, and aortic atherosclerosis in hypercholesterolemic rabbits
Campinas, SP - Brazil
Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp, Campinas, SP
The HMG-CoA reductase inhibitors effectively reduce mortality and coronary events 1-6, representing a powerful instrument in preventing and controlling atherosclerosis. One of the major actions of these drugs is reducing serum LDL-cholesterol, interfering with the biosynthesis of cholesterol and increasing the number of hepatic receptors for ApoB100 7.
More recently, additional effects of these drugs have been demonstrated and considered important for stabilizing the atherosclerotic plaque. Such effects, called pleiotropic, refer to endothelial protection, lipid peroxidation reduction, and control of inflammatory reactions and hemostasia 8-11.
Some adverse effects of the statins have been reported and include cephalea, myalgia, pharyngitis, and interaction with other drugs metabolized in cytochrome P-450 12-14.
Although statins have a similar mechanism of action, they differ in their potency for reducing serum cholesterol, their solubility and metabolism 15,16.
Previous studies 17,18 have assessed the effect of simvastatin and pravastatin on endothelial function, tissue cholesterol, and the number of foam cells in aortic rings of hypercholesterolemic rabbits. Those studies showed that pravastatin was more effective in reversing endothelial dysfunction caused by hypercholesterolemia, in addition to more intensely reducing the number of foam cells in the histological sections obtained from the thoracic aorta. Those findings were carefully interpreted because they derived from an experimental study on animals, and the differences between the effects of those statins encompassed the controversial discussion about the pharmacological difference of the HMG-CoA reductase inhibitors.
The present study aimed at comparing the effects of 4 statins (atorvastatin, fluvastatin, pravastatin, and simvastatin) on endothelial function, lipid peroxidation, and aortic atherosclerosis in hypercholesterolemic rabbits. The dosages of statins were adjusted to reduce total serum cholesterol levels to similar values.
The experiments were conducted according to the recommendations of the US National Institutes of Health for the care and use of laboratory animals (NIH publication N 85-23 revision).
Sixty male rabbits of the New Zealand breed, aged approximately 12 weeks and weighing from 1.6 to 2.4 kg, were divided into the following 6 groups (n=10): 1) normal group (GN); 2) hypercholesterolemic (GH); 3) atorvastatin (GA); 4) fluvastatin (GF); 5) pravastatin (GP); and 6) simvastatin (GS). The animals were separated in individual cages and fed a standard preparation of Purina brand food, enriched with 0.5% cholesterol and 2% coconut oil for 45 days. They received 100 g of food preparation per day and unlimited water. After 15 days, a blood sample was obtained through cardiac puncture for determining serum cholesterol. Then atorvastatin (10 mg/day), fluvastatin (20 mg/day), pravastatin (20 mg/day), and simvastatin (15 mg/day) were administered to the respective groups. The dosages were based on previous studies 17,18 and the drugs administered once a day through gavage. After 15 days, another blood sample was obtained for determining serum cholesterol levels, and the dosages of the statins were adjusted to obtain similar values of serum cholesterol in each group. The final dosages were 10 mg/day, 15 mg/day, 15 mg/day, and 10 mg/day for atorvastatin, fluvastatin, pravastatin, and simvastatin, respectively.
At the end of the experiment, another blood sample was obtained for determining serum cholesterol levels and for separating the lipoproteins. The animals were euthanized by having their necks severed. Median thoracotomy was then performed, and the aorta was removed to obtain the rings for assessing endothelial function and MDA content, and for measuring aortic atherosclerosis on histological sections. Liver and muscle fragments were also obtained for histological examination.
The thoracic aorta, free from connective tissue, was sectioned into rings of approximately 5 mm, with special care not to damage the endothelium. In some rings, however, the endothelium was mechanically damaged by a small forceps. The aortic rings were suspended in 10 mL of the Krebs-Henseleit solution at pH 7.4 (composition in mmol/L: NaCl, 113; CaCl2, 2.19; NaHCO3, 25.0; MgSO4, 0.44; KH2PO4, 1.18; EDTA, 0.03; glucose, 11.0). The solution was maintained at 37ºC and continuously aerated with a gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2. The rings were mounted on 2 metallic supports coupled to a force transducer (Narco Byosystem) and distended at a baseline tension of 1g. The aortic rings were allowed to stabilize for 60 minutes, with Krebs Henseleit solution exchange every 20 minutes. To prevent the synthesis of prostaglandins, the experiments were performed in the presence of 10 µM of indomethacin.
The rings of the thoracic aorta with and without endothelium were contracted with noradrenaline (NA, 10-7 M). When the contraction was kept stable, acetylcholine (ACH) was added to the solution in a cumulative form (10-8-10-5.5 M) to obtain the concentration-effect curves. Then, the solution was replaced for the Krebs-Henseleit solution, and the tension was stabilized at baseline values with frequent renewal of the solution. After 30 minutes, the aortic rings were contracted with NA (10-7 M), and other concentration-effect curves were obtained with sodium nitroprusside (SNP, 10- 8 - 10- 5.5 M).
The 5-mm-thick aortic rings were obtained in a standardized form from defined areas of the superior part of the thoracic aorta. Fragments from the liver and thigh muscle were also obtained. The tissues were fixed in 10% formalin for 24 hours, processed, and embedded in paraffin. Serial sections were mounted on slides and stained with hematoxylin-eosin.
Total serum cholesterol level was measured with commercial enzymatic kits in a spectrophotometer (Genesys 10, Spectronics) and the results were expressed in mg/dL. The GOT and GPT levels were also measured with the commercial enzymatic kit, and the results were expressed in U/L.
Lipid peroxidation was assessed by use of MDA measurement, one of the end-products of peroxidation. The aortic samples were homogenized in cold trichloroacetic acid (TCA) (1 mg of tissue per mL of 10% TCA). After centrifugation, a portion of the supernatant was added to an equal volume of thiobarbituric acid (0.6% v/v), and the mixture was heated at 100ºC for 20 minutes. The MDA concentration was calculated by use of a spectrophotometer, with absorption of 532 nm and a molar extinction coefficient of 1.49x10-5, and the results were expressed in nmol/mg of dry tissue x 10-7 19. The lipoproteins were separated by plasma sequential ultracentrifugation according to the method by Havel et al 20. The plasma was centrifuged at 40000 rpm for 18 hours at 4ºC in a Ti50 rotor (Beckman), and the VLDL layer (d < 1,006 g/mL) was removed. The supernatant was adjusted to a density of 1063 g/mL by using potassium bromide, being then centrifuged at 40,000 rpm for 20 hours. The isolated LDL-C was dialyzed in 0.01 M of phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 at 8ºC for 24 hours, with frequent buffer washing. The LDL protein concentration was determined by use of the method of Lowry et al 21 with bovine albumin as the standard. The LDL oxidation was performed by use of incubation with 5 µM copper sulfate (100 µg of protein/mL, 1 M PBS) for 24 hours at 37ºC 22. The concentration of peroxide lipids of the native and oxidized LDL was measured by the reaction of the thiobarbituric acid (TBARS), as reported by Buege and Aust 23. The TBARS values were expressed as MDA equivalents (nmol/protein LDL) using the standard solution of 1,1,3,3 tetramethoxypropane.
Images of the histological sections of the aortic rings were obtained with a Leica DMLD microscope and imported to a computer. By use of the Scion program 24, areas of the arterial wall and of the extracellular liposomes were manually selected. The number of pixels was determined and used as a measurement. The results were expressed as % of extracellular liposomes in relation to the arterial wall 25.
The acetylcholine chloride, noradrenaline bitartrate, sodium nitroprusside, trichloroacetic acid, thiobarbituric acid, and indomethacin were obtained from Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA). The reagents of the Krebs-Henseleit solution were obtained from Merck Chemicals.
The descriptive analyses were performed by use of the position and dispersion measurements for the continuous variables. For comparing the groups of treatment through the variables collected, the simple analysis of variance (one-way ANOVA) was used, with transformation of the variables according to ranks. For identifying the differences, the Tukey test, a multiple comparisons procedure, was used.
The repeated measures ANOVA was used for comparing the dose-response curves. The multiple comparisons Tukey test and the contrast profile test were used for identifying the differences. The significance level adopted was 5% 26,27.
At the beginning of the study, the mean weights of the rabbits in the different groups were as follows: 1) GN: 1.80±0.2 kg; 2) GH: 2.0±0.18 kg; 3) GA: 1.75± 0.12 kg; 4) GF: 1.85±0.14 kg; 5) GP: 2.09±0.23 kg; and 6) GS: 1.79±0.10 kg. All animals gained weight during the study, but no significant difference was observed between the groups.
The content of malondialdehyde (MDA) (nmol/mg x 10-7M) in the oxidized LDL particles and aortic wall is shown in
The histological examination showed the presence of extracellular liposomes in the intimal layer of the aorta of hypercholesterolemic rabbits and no inflammatory cells. The percentages of extracellular liposomes in the vessel wall in the hypercholesterolemic, atorvastatin, fluvastatin, simvastatin, and pravastatin groups were as follows, respectively: 21.0±0.15, 2.58±1.35, 3.83± 0.89, 2.95±0.91, and 3.84±1.08. When comparing the hypercholesterolemic group with the treated groups, statins significantly (P<0.05) reduced aortic atherosclerosis, and no difference was observed between the treated groups.
The histological study of liver fragments revealed moderate steatosis in all groups studied, while the muscle tissue appeared normal on microscopic examination.
The GOT and GPT levels were within the normal range in all treated groups.
Statins vary considerably in their pharmacological and lipophilic characteristics, their mean life, metabolism, and other properties28. Pravastatin is hydrophilic, while the other statins are lipophilic. Atorvastatin, simvastatin, and fluvastatin circulate in the blood bound to protein in 95 to 98%, while pravastatin circulates bound to protein in 50% 29. Except for pravastatin, the statins are metabolized in cytochrome P-450-3A4 (fluvastatin is metabolized in cytochrome P-450-2C9). Atorvastatin, fluvastatin, and simvastatin, but not pravastatin, decrease the migration and proliferation of smooth muscle cells in the arterial wall 30, probably by blocking RhoA- and Rac1-, which are cell signalers 31. Evident alterations in inflammatory response have been reported with the use of statins, including the inhibition of cytokines, C-reactive protein, expression of the metalloproteinases of the matrix, and decrease in the adhesion of monocytes to the endothelial cell 32. Recent studies about the pleiotropic properties of statins have revealed their capacity to inhibit the synthesis of important intermediates of the isoprenoids, which serve as bindings to a variety of proteins implicated in intracellular signaling 33,34. On the other hand, well-conducted studies have revealed a difference in the potential of statins to reduce cholesterol and serum LDL particles 15,16; differences in their pleiotropic effects and supposed tissular selectivity have been discussed.
The major objective of this study was to assess the pleiotropic effects of different statins, considering the controversial results reported in the literature. Pentikainem et al 35 reported that pravastatin is an HMG-CoA reductase inhibitor with greater affinity to peripheral tissues, which was confirmed by Germershausen et al 36. The latter authors attributed that finding to the active species derived from pravastatin, which bind to proteins in approximately 50%, while the other statins are intensely bound to proteins (>95%); thus, drugs that bind to proteins in smaller amounts have greater penetration in tissues. The hydrophilic HMG-CoA reductase inhibitors, on the other hand, may reach a greater concentration in endothelial cells, therefore increasing the NO synthase activity. However, the tissular selectivity of HMG-CoA reductase inhibitors is controversial 14,37. Thiery et al 38, investigating the extension of atherogenesis in hypercholesterolemic rabbits treated with lovastatin, simvastatin, and pravastatin (15 mg/day), reported a smaller concentration of tissular cholesterol in animals treated with lovastatin and simvastatin than that in animals treated with pravastatin. De Vries et al 39 stated that the synthesis of cholesterol in the lens is 100 times more effectively inhibited by pravastatin than by simvastatin. Tesfamarian et al 40 reported different effects of pravastatin, simvastatin, and atorvastatin in the release of cytoplasmic Ca2+ and in vascular reactivity, while Joukhadar et al 41 reported a similar effect for atorvastatin, simvastatin, and pravastatin in some parameters relating to hemostasia and inflammation in the plasma of hypercholesterolemic patients.
However, the supposed differences between statins apparently do not have a major clinical significance, because the great randomized studies have shown a significant reduction in mortality and coronary events with the use of the different statins studied 1,3,4,6.
Our results showed that all statins were effective in reducing lipid peroxidation in native or oxidized LDL and also in the arterial wall. No significant difference was observed in the intensity of the effect between the different drugs. The antioxidizing effect of simvastatin 42, fluvastatin 43, pravastatin 44, and atorvastatin 45 has been reported in the literature and represents an important step in preserving endothelial function 34.
In the group of hypercholesterolemic animals, all statins were effective in partially reversing endothelial dysfunction. The effect was similar in the different drugs, except for pravastatin, whose effect on endothelium-dependent relaxation was more significant. The mild difference in the intensity of endothelium-dependent relaxation observed with pravastatin was interpreted as due to its hydrophilic characteristic, but this finding should be reassessed in further studies.
The increase in endothelium-dependent relaxation observed in the aortic rings of rabbits treated with statins should be related to the reduction in tissular cholesterol and oxidative stress in the arterial wall 46, in addition to the action on the mediators of cellular transcription, which was not studied in this experimental model. In a previous study 18, we observed that the reversion of endothelial dysfunction in hypercholesterolemic rabbits treated with pravastatin and simvastatin occurred rapidly, which is beneficial to the treatment of acute coronary syndrome.
Another point that deserves to be stressed in the present study due to clinical implications is the regression of intimal thickening, represented by the build up of extracellular liposomes. The LDL particles enter the endothelial cell due to the mechanism of pinocytosis, forming vesicles of pinocytosis, which are incorporated as endosomes and liposomes in the cell cytoplasm. In hypercholesterolemia, the lipid material carried by the endosomes accumulates in extracellular liposomes in the intimal layer of the artery. Considering that the presence of extracellular liposomes are the earliest morphological expression of atherosclerosis, their regression may represent a potential mechanism of control of the atherosclerotic disease. The regression of the atherosclerotic plaque caused by statins has been demonstrated in several experimental studies 47-49.
Studies with magnetic resonance imaging and spectroscopy have reported mobilization of the lipid content in the atherosclerotic plaques of animals treated with different drugs 50-52.
More recently, the REVERSE study 53 has confirmed the interruption of progression, and even a small regression, of the atherosclerotic plaque (0.4% of median reduction) evidenced on coronary ultrasound in patients with stable coronary disease. Those results open an exceptional perspective in the management of atherosclerosis.
The present study showed no significant difference in atherosclerosis regression between the different statins studied. However, it is worth emphasizing that the dosages of statins were adjusted for obtaining similar values of serum cholesterol in the different groups considering the different potencies of the drugs. Atorvastatin was the most potent, because a lower dose of atorvastatin was required for a similar reduction in serum cholesterol in the groups; an eventual difference in the effect of regression could not be assessed considering the intensity of the reduction in serum cholesterol and LDL particles. More recently, a more intense reduction was observed in serum LDL in patients with acute coronary syndromes leading to a greater benefit regarding a reduction in mortality rate and other coronary events 54. This initiated the discussion about the best LDL serum level for controlling atherosclerosis, stressing the significance of the lipid-lowering potency of statins.
The most intense reduction in serum lipids is significant when one considers that the major causal factor in atherosclerosis is the afflux of LDL particles and their epitopes to the intimal region of the vessel through the endothelial cell. This causes an immune response mediated by several factors related to inflammation, with mobilization of monocytes, neutrophils, and lymphocytes. This restricts the lipid core through a predominantly proliferative reaction or makes the plaque unstable due to a greater cellular and enzymatic response 55. Probably the magnitude of the reduction in cholesterol and LDL serum levels, in addition to the other factors already mentioned, has a beneficial effect on reversing endothelial dysfunction and mobilizing the lipid core of the atherosclerotic plaque, mainly in the earliest phase. The safe limit to which serum LDL can be lowered has yet to be established.
The authors of the REVERSE 53 and PROVE-IT 54 study have also emphasized the existence of a pharmacological difference between the statins studied, atorvastatin and pravastatin. A well-conducted experimental study 55 using fluvastatin has also considered the existence of an indirect effect of the drug, independently of the reduction in serum cholesterol. This reinitiates the discussion about a possible pharmacological difference and tissular specificity between these drugs, independently of the reduction in lipids.
In this study, the statins did not alter the enzymatic activity of the liver. The histological examinations showed moderate hepatic steatosis and a normal appearance of the muscle tissue, probably consequent to the elevated serum concentration of cholesterol. Areas neither of necrosis nor of inflammation were observed. These findings suggest that the drugs had no toxic effect at the dosages administered.
The lack of inflammatory reaction in the intimal layer of the vascular wall, despite the presence of extracellular liposomes in hypercholesterolemic rabbits, reinforces the idea that the inflammatory response occurs later to repair the inadequate presence of LDL and its epitopes in the intimal layer of the artery 56. This, once more, reinforces the impression that a more intense reduction in tissue LDL will have a more favorable effect on disease control.
The results of this study showed that all statins were effective in reducing serum total cholesterol, the MDA content in the arterial wall and in native and oxidized LDL, and in reversing the endothelial dysfunction in hypercholesterolemic rabbits.
Paulo Afonso Ribeiro Jorge Rua Guilherme da Silva, 397 Cep 13025-070 - Campinas, SP, Brazil E-mail:
Sent for publication: 04/04/2004
Accepted for publication: 10/29/2004
English version by Stela Maris Costalonga