OBJETIVO: Avaliar o papel do bloqueador dos receptores AT1 e do inibidor da enzima conversora da angiotensina na remodelação cardíaca induzida por estenose aórtica em ratos. MÉTODOS: Ratos Wistar foram divididos em 4 grupos: controle (C, n=13), estenose aórtica (EAo, n=11), EAo com lisinopril, 20 mg/kg/dia (LIS, n=11) e EAo com losartan, 40 mg/kg/dia (LOS, n=9). Os tratamentos foram iniciados 3 dias antes da cirurgia. Após 6 semanas, os animais foram submetidos ao estudo ecocardiográfico, quantificação da concentração de hidroxiprolina e da área seccional (CSA) miocitária do ventrículo esquerdo (VE). RESULTADOS: A EAo induziu aumento da espessura da parede do VE. Os animais LIS e LOS não apresentaram diferença em relação aos animais controles. Os ratos EAo e LIS apresentaram maiores diâmetros do átrio esquerdo que os ratos controles, enquanto nos animais LOS não houve diferença. Os animais com EAo apresentaram maiores valores da porcentagem de encurtamento que os controle. Esse fato não foi modificado com LIS ou LOS. A CSA dos animais do grupo EAo foi maior que a dos controle. Entretanto, o tratamento com LOS e com LIS atenuou o aumento da área induzida pela EAo. A EAo resultou em aumento na concentração de HOP, enquanto o grupo LOS não apresentou diferença em relação ao grupo controle. CONCLUSÃO: O bloqueio do sistema renina-angiotensina, com bloqueador AT1 e com IECA, pode atenuar o desenvolvimento de hipertrofia cardíaca, porém só o bloqueio dos receptores AT1 atenua a fibrose intersticial do VE.
O bloqueio do sistema renina-angiotensina atenua a remodelação cardíaca de ratos submetidos a estenose aórtica
Botucatu, SP
Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP
O processo de remodelação cardíaca se caracteriza por alterações da geometria, volume, massa e constituição do coração em resposta a determinada agressão. A hipertrofia miocárdica é importante componente da remodelação cardíaca e, usualmente, ocorre em resposta à sobrecarga hemodinâmica crônica. Esse mecanismo adaptativo permite ao coração manter suas funções básicas em vigência de aumento das condições de carga. A longo prazo, entretanto, a hipertrofia representa fator de risco independente para morbidade e mortalidade cardíacas1-3. Outro componente importante da remodelação é o tecido conjuntivo. Os miócitos representam apenas 30% do número total de células miocárdicas, sendo entre outras células as musculares lisas dos vasos, as endoteliais e os fibroblastos. Circundando e interligando todas essas estruturas está uma complexa e organizada rede de colágeno. As principais funções dessa rede seriam: regular a apoptose, resistir às deformações patológicas, manter o alinhamento das estruturas e regular a transmissão de força durante o encurtamento da fibra cardíaca. Portanto, o tecido colágeno é importante modulador da arquitetura e da função cardíaca, podendo ocorrer, dependendo do estímulo, acúmulo de colágeno, caracterizando a fibrose miocárdica. Esse fenômeno pode interferir com a manutenção da geometria normal cardíaca e/ou comprometer a função ventricular4,5.
Os estímulos para o desenvolvimento da remodelação cardíaca incluem fatores mecânicos e bioquímicos que têm ações endócrina, parácrina e autócrina. Esses fatores, atuando em receptores, como os de integrina, e canais iônicos presentes na membrana sarcolemal, ativam sinalizadores que promovem alteração na expressão gênica e aumento da síntese protéica6.
Entre os estímulos envolvidos no processo de remodelação destaca-se a angiotensina II (AII). Formada, tanto local como sistemicamente, a partir da angiotensina I por meio da enzima conversora da angiotensina (ECA) e atuando nos receptores AT1, a AII estimula o crescimento celular, bem como promove o acúmulo de colágeno5. No coração, entretanto, a formação da AII pode ocorrer predominantemente pela ação da quimase e não da ECA7,8.
Considerando o papel fisiopatológico do sistema renina-angiotensina no processo de remodelação cardíaca, diversos trabalhos já mostraram que os inibidores da ECA atenuam as alterações morfológicas e funcionais desencadeadas por diversos estímulos9-12. No caso da estenose aórtica, em que há elevação persistente e severa da pressão intraventricular esquerda sem elevação da pressão arterial sistêmica, ocorre somente ativação do sistema renina-angiotensina cardíaco. Assim, nesse modelo, o benefício dos IECA é menos claro. Em adição, o papel dos bloqueadores AT1 na EAo é menos conhecido. Por bloquear a ação da AII, independentemente da atuação da ECA ou quimase, os bloqueadores da AII poderiam ser mais eficazes que os IECA.
O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos do bloqueio do sistema renina-angiotensina, com bloqueador AT1 ou com IECA, no processo de remodelação ventricular (hipertrofia, fibrose e função ventricular) induzido por estenose aórtica, em ratos.
O protocolo experimental deste estudo foi conduzido em conformidade com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal13.
Foram utilizados ratos Wistar machos, com peso corpóreo entre 90 a 100 g. Após anestesia com cloridrato de cetamina (50 mg/kg intramuscular) e cloridrato de xilidino (10 mg/kg intramuscular), os ratos foram submetidos a toracotomia mediana, a aorta ascendente dissecada e um clipe de prata, com 0,6 mm de diâmetro interno, colocado, aproximadamente, 3 mm da raiz da aorta. A parede torácica foi fechada, sendo o esterno, as camadas musculares e a pele reconstruídos com fio de sutura mononylon 4-0. Durante a cirurgia, os animais foram ventilados manualmente com pressão positiva e oxigênio a 100%. Os animais controle foram submetidos à mesma cirurgia, mas sem a colocação do clipe.
Os ratos foram divididos em 4 grupos experimentais: controle (C, n=13), estenose aórtica (EAo, n=11), EAo tratados com lisinopril, 20 mg/kg/dia (LIS, n=11) e EAo tratados com losartan, 40 mg/kg/dia (LOS, n=9). Os tratamentos foram adicionados na água de beber e iniciados 3 dias antes da cirurgia e mantidos por 6 semanas.
Após 6 semanas, os animais foram anestesiados com cloridrato de cetamina (50mg/kg) e cloridrato de xilidino (1mg/kg) por via intramuscular para o estudo ecocardiográfico14. Após tricotomia da região anterior do tórax, os animais foram posicionados em decúbito lateral esquerdo para realização do ecocardiograma com ecocardiógrafo Hewlett-Packard (modelo Sonos 2000) equipado com transdutor eletrônico de 7,5 MHz. A avaliação dos fluxos foi realizada com o mesmo transdutor operando em 5,0 MHz. Para medir as estruturas cardíacas, utilizamos imagens em modo-M com o feixe de ultra-som orientado pela imagem bidimensional com o transdutor na posição para-esternal eixo menor. A imagem da cavidade ventricular esquerda foi obtida posicionando o cursor do modo-M logo abaixo do plano da valva mitral entre os músculos papilares. As imagens da aorta e do átrio esquerdo também foram obtidas na posição para-esternal eixo menor com o cursor do modo-M posicionado ao nível da valva aórtica. O registro da imagem monodimensional (velocidade: 100 mm/s) foi realizado por meio da impressora modelo UP-890MD da Sony Co. Posteriormente, as estruturas cardíacas foram medidas manualmente com o auxílio de um paquímetro, de acordo com as recomendações da American Society of Echocardiography15. As estruturas cardíacas foram medidas em, pelo menos, cinco ciclos cardíacos consecutivos. O diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo (DDVE) e a espessura diastólica da parede posterior do VE (EDVE) foram medidos no momento correspondente ao diâmetro máximo da cavidade. O diâmetro sistólico do VE (DSVE) foi medido no momento de máxima excursão sistólica da parede posterior da cavidade. A função sistólica do VE foi avaliada calculando-se a porcentagem de encurtamento sistólico (DDVE-DSVE)/DDVE x 100. O fluxo diastólico transmitral (ondas E e A) foi obtido com o transdutor na posição apical quatro câmaras. As medidas referentes aos fluxos foram realizadas diretamente no monitor do ecocardiógrafo.
Um a 3 dias após o estudo ecocardiográfico, os animais foram pesados, anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/kg intraperitonial) e submetidos a toracotomia mediana para a remoção do coração. Os ventrículos direito (VD) e esquerdo (VE) foram separados e pesados separadamente. Da parte central do VE, foi cortado um anel com 2 a 3 mm de espessura, compreendendo toda a extensão de sua parede. O material foi imerso em formalina a 10% neutra e tamponada, durante 48 hs, a 4ºC. Após esse período, o tecido foi lavado, desidratado e incluído em parafina. Cortes histológicos com 5 a 7 mm de espessura foram submetidos à coloração por hematoxilina e eosina e analisados em microscopia óptica. A análise morfométrica foi realizada utilizando-se câmara de vídeo acoplada a microscópio Leica conectado a computador equipado com programa analisador de imagem (Image-Pro 3.0, Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). Em secções transversas do VE das regiões subendocárdicas e subepicárdicas, foram medidas as áreas seccionais de, no mínimo, 50 miócitos, nas quais o núcleo era claramente identificado no centro da célula16.
As dosagens de hidroxiprolina foram realizadas segundo técnica de Switzer17. Amostras dos tecidos do VE, após desidratação em álcool, foram secas em forno a vácuo por 24h, à temperatura constante de 60ºC. As amostras, previamente desidratadas, foram hidrolizadas em solução 6 N de àcido clorídrico (10mg de tecido seco/ml de HCl 6 N) durante 16h, a 110ºC. Alíquotas de 50ml de hidrolisado foram secas em forno a vácuo durante 24h e, diluídas em 1,6 ml de água deionizada, em tubo de ensaio 150 x 16mm dotado de tampa com rosca. Esta solução foi alcalinizada com 1ml de tampão borato pH=8,7, em seguida adicionados 0,3ml de cloramina T. Após 20min de repouso, à temperatura ambiente, foi adicionado 1,0ml de tiosulfato de sódio 3,6 M e o tubo vigorosamente agitado. Cerca de 1,5g de KCl foram adicionados para saturação da solução. Os tubos foram fechados e aquecidos em água fervente por 20min. Após o resfriamento da amostra foram adicionados 2,0ml de tolueno e os tubos agitados durante 5min. Após breve período de repouso, 1,0ml do tolueno sobrenadante foi transferido a um tubo de ensaio onde foi acrescentado 0,4ml de reagente de Ehrlich (27,4ml de ácido sulfúrico em 200ml de etanol; o conjunto foi adicionado à solução de 120g de p-dimetilaminobenzaldeído em 200ml de etanol). Após 30min, foi realizada leitura da densidade óptica com espectofotômetro a 565nm, contra um
Os dados apresentaram distribuição normal e foram expressos em média ± desvio padrão. O método utilizado foi a análise de variância (ANOVA - one way) complementada com o teste de comparações múltiplas de Tukey. O nível de significância foi fixado em 5%.
Os resultados do estudo morfométrico estão na
Os resultados morfológicos do estudo ecocardiográfico estão na
Os resultados do estudo funcional estão na
Nosso objetivo foi analisar a influência do bloqueio do sistema renina-angiotensina com bloqueador dos receptores AT1 da AII e com IECA, sobre a remodelação cardíaca, por meio da análise do desenvolvimento de hipertrofia ventricular esquerda, fibrose intersticial miocárdica e função ventricular, em ratos submetidos a EAo supravalvar. Nesse modelo, a administração de IECA ou bloqueadores AT1 não altera significativamente os valores da pressão intraventricular esquerda18. Assim, é possível a dissociação entre os efeitos hemodinâmicos e os efeitos tissulares diretos causados pelo IECA e/ou pelo bloqueador dos receptores AT1 da AII sobre variáveis da remodelação cardíaca. Como, nesse modelo, existe ativação do sistema renina-angiotensina cardíaco, aventou-se a possibilidade de que o bloqueio com IECA ou bloqueadores AT1 poderia atenuar a remodelação cardíaca.
Nosso estudo revelou que a EAo promoveu hipertrofia ventricular esquerda. A administração de LIS ou LOS atuou nesse processo, desde que os 2 tratamentos resultaram em área seccional miocitária semelhante em comparação aos animais do grupo controle. Na avaliação ecocardiográfica, nossos dados também caracterizaram a hipertrofia ventricular, a partir do aumento da espessura da parede do VE com EAo19. Os 2 tratamentos induziram menor espessura da parede, em relação ao grupo EAo. Assim, o conjunto dos nossos resultados sugere que o bloqueio do sistema renina-angiotensina, com IECA ou bloqueador AT1, atenuou o desenvolvimento de hipertrofia ventricular induzida pela EAo. As evidências de que o bloqueio do sistema renina-angiotensina atenua o processo hipertrófico no modelo de EAo não são consistentes na literatura. Alguns autores encontraram diminuição da massa ventricular20,21, enquanto outros não22,23. Deve-se salientar que as razões para essas discrepâncias ainda não são conhecidas.
Em relação ao conteúdo de colágeno intersticial, em concordância a outros4,5, nosso trabalho evidenciou que a sobrecarga de pressão resultou em fibrose miocárdica, já que houve aumento da concentração de HOP no grupo EAo. O tratamento com LIS não influenciou o acúmulo de colágeno, uma vez que não houve diferença nessa variável em relação ao grupo EAo sem tratamento. Por outro lado, podemos inferir que a administração de LOS atenuou o desenvolvimento de fibrose, pois não encontramos diferença na concentração de HOP entre os animais LOS e controle. O modelo de EAo acompanha-se de ativação do sistema renina-angiotensina tissular cardíaco, tendo sido documentado aumento do RNA mensageiro para a ECA24 no miocárdio de ratos submetidos a estenose aórtica. Entretanto, no coração, ao contrário do que ocorre na circulação, a principal via de transformação da AI em AII parece ser a via das quimases7,8. Considerando-se que a AII é importante modulador da síntese de colágeno25, podemos inferir que, nesse modelo, o bloqueio dos receptores AT1 da AII seria mais eficaz na prevenção da fibrose que o bloqueio da ECA.
A análise funcional do VE efetuada por meio do ecocardiograma revelou que os grupos com EAo apresentaram função sistólica semelhante entre si e melhor do que o grupo controle, desde que porcentagem de encurtamento do VE foi maior nos animais com remodelação cardíaca. Em concordância com os nossos resultados, outros autores mostraram que, nas sobrecargas por pressão, o coração apresenta função inicialmente normal ou hiperdinâmica e, no decorrer do tempo, evolui com disfunção ventricular progressiva26,27.
Em relação à função diastólica do VE, a análise do tamanho do átrio esquerdo mostrou um aumento das dimensões atriais nos grupos EAo e LIS, em comparação com os animais controles. Como os grupos EAo e LIS apresentaram melhor função sistólica do que o controle, é provável que o aumento do átrio seja devido a disfunção diastólica, apesar da relação E/A não ter sido diferente entre os grupos. Por outro lado, o grupo LOS não apresentou diferença estatisticamente significante no tamanho do átrio em relação ao grupo controle. Já está bem consolidado o conceito de que a fibrose intersticial é importante determinante da rigidez passiva da câmara ventricular28. Assim, o conjunto de nossos resultados permite especular que o tratamento com LOS melhorou a função diastólica, pelo menos em parte, em conseqüência da atenuação da fibrose intersticial.
Considerando que, até o momento, não existe nenhuma terapia clínica para prevenir ou atenuar a progressão das repercussões da estenose aórtica, nosso estudo sugere que o bloqueio do sistema renina-angiotensina pode ser considerado como opção terapêutica, nessa situação. Os dados disponíveis sobre a comparação entre bloqueadores AT1 e IECA, nesse modelo, são escassos. Em trabalho elaborado por Liu e cols.21, tanto o captopril como o losartan atenuaram igualmente o desenvolvimento da hipertrofia, a diminuição da SERCA-2 e o aumento da beta-miosina, marcadores do processo de remodelação, após 8 semanas de tratamento. Apesar da necessidade de novos estudos para uma conclusão definitiva, o conjunto dos nossos resultados sugere que os bloqueadores dos receptores AT1 podem apresentar maior benefício em relação aos IECA, nesse modelo.
Nosso estudo nos leva a duas limitações: em algumas variáveis analisadas, os valores do grupo LIS e LOS não foram diferentes do grupo com estenose. Entretanto, diferentemente do grupo EAo, os valores dos grupos com tratamento também não foram diferentes do grupo controle. Assim, interpretamos que o tratamento utilizado resultou em valores intermediários entre os animais controle e com EAo. Outra consideração refere-se às doses utilizadas de lisinopril e losartan. Utilizamos doses ou equivalentes de doses usadas em outros estudos, assumindo o bloqueio do sistema renina-angiotensina com as duas estratégias. Entretanto, não realizamos testes para verificar a equivalência farmacológica das medicações utilizadas em nosso experimento.
Em conclusão, os dados do presente estudo indicam que, no modelo de EAo em ratos, o bloqueio do sistema renina-angiotensina, com bloqueador dos receptores AT1 da AII e com IECA, pode atenuar o desenvolvimento de hipertrofia cardíaca. No entanto, apenas o bloqueio dos receptores AT1 atenua a fibrose intersticial do VE.
Leonardo A. M. Zornoff Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP - Departamento de Clínica Médica Cep 18618-000 - Botucatu - SP E-mail:
Enviado em 06/07/2004 - Aceito em 29/09/2004
OBJECTIVE: To assess the role of the AT1 receptor blocker and the angiotensin-converting enzyme inhibitor in cardiac remodeling induced by aortic stenosis in rats. METHODS: Wistar rats were divided into the following 4 groups: 1) C - control (n=13); 2) AoS - aortic stenosis (n=11); 3) LIS - AoS treated with lisinopril, 20 mg/kg/day (n=11); and 4) LOS - AoS treated with losartan, 40 mg/kg/day (n=9). The treatments were initiated 3 days before surgery. After 6 weeks, the animals underwent echocardiographic study, and quantification of the hydroxyproline (HOP) concentration and the left ventricular (LV) myocyte cross-sectional area (CSA). RESULTS: Aortic stenosis induced an increase in left ventricular wall thickness. The LIS and LOS groups showed no difference as compared with the control group. The AoS and LIS rats had greater left atrial diameters than the control rats did, while no difference was observed in the LOS animals. The AoS animals had greater values of shortening percentage than control animals did. This fact was modified with neither LIS nor LOS. The cross-sectional area of the animals in the AoS group was greater than that in the control group. However, treatment with LOS and LIS attenuated the AoS-induced increase in area. Aortic stenosis caused an increase in HOP concentration, while the LOS group showed no difference as compared with the control group. CONCLUSION: Blockade of the renin-angiotensin system with AT1 blocker and ACEI may attenuate the development of heart hypertrophy, but only the blockade of AT1 receptors attenuates left ventricular interstitial fibrosis.
Blockade of renin-angiotensin system attenuates cardiac remodeling in rats undergoing aortic stenosis
Botucatu, SP - Brazil
Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP
The process of cardiac remodeling is characterized by alterations in heart geometry, volume, mass, and constitution in response to a certain aggression. Myocardial hypertrophy is an important component of cardiac remodeling, and it usually occurs in response to chronic hemodynamic overload. This adaptive mechanism allows the heart to maintain its basic functions in the presence of an increase in load conditions. In the long run, however, hypertrophy represents an independent risk factor for cardiac morbidity and mortality 1-3. Another important component of remodeling is the connective tissue. The myocytes represent only 30% of the total number of myocardial cells, the other cells being smooth muscle cells of the vessels, endothelial cells, and fibroblasts. A complex and organized collagen network exists surrounding and linking all those structures. The major functions of that network are as follows: to regulate apoptosis; to resist to pathological deformations; to maintain the alignment of the structures; and to regulate the transmission of force during cardiac fiber shortening. Therefore, collagen tissue is an important modulator of the cardiac architecture and function, and, depending on the stimulus, collagen may build up, characterizing myocardial fibrosis. This phenomenon may interfere with maintenance of the normal cardiac geometry or impair ventricular function, or both 4,5.
The stimuli for the development of cardiac remodeling include mechanical and biochemical factors, which have endocrine, paracrine, and autocrine actions. Such factors, acting on receptors, such as those of integrins, and ionic channels present in the sarcolemmal membrane activate signalers that cause an alteration in the gene expression and an increase in protein synthesis 6.
Among the stimuli involved in the remodeling process, angiotensin II (AII) stands out. Formed, both locally and systemically, from angiotensin I through the action of angiotensin-converting enzyme (ACE) and acting on AT1 receptors, AII stimulates cell growth and promotes collagen build up 5. In the heart, however, the AII may be formed predominantly through the action of the chymase and not the ACE 7,8.
Considering the pathophysiological role of the renin-angiotensin system in the process of cardiac remodeling, several studies have already reported that ACE inhibitors (ACEI) attenuate the morphological and functional alterations triggered by several stimuli 9-12. In aortic stenosis, in which persistent and severe elevation in left intraventricular pressure occurs with no elevation in systemic blood pressure, activation only of the cardiac renin-angiotensin system occurs. Thus, in that model, the benefit of the ACEI is less clear. In addition, the role of the AT1 blockers in AoS is less clear. Because AII blockers block the AII action independently of ACE or chymase, they could be more effective than ACEI.
This study aimed at analyzing the effects of the renin-angiotensin system blockade with AT1 blockers or ACEI on the ventricular remodeling process (hypertrophy, and ventricular fibrosis and function) induced by aortic stenosis in rats.
The experimental protocol of this study was conducted according to the Ethical Principles in Animal Experimentation adopted by the Brazilian College of Animal Experimentation 13.
Male Wistar rats weighing between 90 and 100 g were used in this study. After anesthesia with ketamine hydrochloride (50 mg/kg, intramuscular) and xylazine hydrochloride (10 mg/kg, intramuscular), the rats underwent median thoracotomy. The ascending aorta was dissected, and a 0.6-mm-inner-diameter silver clip was placed at approximately 3 mm from the aortic root. The thoracic wall was closed, and the sternum, the muscle layers, and the skin were reconstructed with mononylon 4-0 suture thread. During the surgery, the animals were manually ventilated with positive pressure and 100% oxygen. The control animals underwent the same surgery, but no clip was placed.
The rats were divided into the following 4 experimental groups: 1) C - control (n=13); 2) AoS - aortic stenosis (n=11); 3) LIS - AoS treated with lisinopril, 20 mg/kg/day (n=11); and 4) LOS - AoS treated with losartan, 40 mg/kg/day (n=9). The drugs were added to the drinking water, initiated 3 days before surgery, and maintained for 6 weeks.
After 6 weeks, the animals were anesthetized with ketamine hydrochloride (50 mg/kg, intramuscular) and xylazine hydrochloride (1 mg/kg, intramuscular) for echocardiographic study 14. After epilation of the anterior region of the chest, the animals were positioned in the left lateral decubitus for undergoing echocardiography with a Hewlett-Packard echocardiograph (Sonos 2000 model) equipped with a 7.5-MHz electronic transducer. The flows were assessed with the same transducer operating at 5.0 MHz. For measuring the cardiac structures, M-mode images were used with the ultrasound beam oriented by the 2-dimensional image, with the transducer in the short-axis parasternal view. The image of the left ventricular cavity was obtained by positioning the M-mode cursor right below the mitral valve plane between the papillary muscles. The images of the aorta and left atrium were also obtained in the short-axis parasternal view with the M-mode cursor positioned level with the aortic valve. The 1-dimensional image (velocity: 100 mm/s) was recorded by using a Sony Co printer, UP-890MD model. Later, the cardiac structures were manually measured with the aid of a pachymeter, according to the recommendations of the American Society of Echocardiography 15. The cardiac structures were measured in at least 5 consecutive cardiac cycles. The left ventricular diastolic diameter (LVDD) and the left ventricular diastolic posterior wall thickness (LVDPWT) were measured at the moment corresponding to the maximum diameter of the cavity. The left ventricular systolic diameter (LVSD) was measured at the moment of the maximum systolic excursion of the posterior wall of the cavity. The left ventricular systolic function was assessed by calculating the percentage of systolic shortening (LVDD-LVSD function)/LVDD x 100. The transmitral diastolic flow (E and A waves) was obtained with the transducer at the apical 4-chamber view. The flow measurements were performed directly on the echocardiographic monitor.
One to 3 days after the echocardiographic study, the animals were weighed, anesthetized with sodium pentobarbital (50 mg/kg, intraperitoneal), and underwent median thoracotomy for heart removal. The right (RV) and left (LV) ventricles were separated and weighed separately. From the central part of the LV, a 2- to 3-mm-thick ring was sectioned encompassing all the extension of the wall. The material was immersed in neutral and buffered 10% formalin for 48 hours at 4ºC. After that period, the tissue was washed, dehydrated, and embedded in paraffin. The 5- to 7-mm-thick histological sections were stained with hematoxylin and eosin, and analyzed under optical microscopy. The morphometric analysis was performed by using a video camera coupled to a Leica microscope connected to a computer equipped with a program for image analysis (Image-Pro 3.0, Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). In cross-sectional sections of the left ventricular subendocardial and subepicardial regions, the cross-sectional areas of at least 50 myocytes were measured, in which the nucleus was clearly identified in the center of the cell 16.
The hydroxyproline measurements were performed according to the Switzer technique 17. After dehydration in alcohol, samples of the LV tissue were dried in a vacuum oven for 24 hours at a constant temperature of 60ºC. The previously dehydrated samples were hydrolyzed in a 6N solution of chloride acid (10 mg of dry tissue/mL of 6N HCl) for 16 hours at 110ºC. The 50 mL aliquots of hydrolysate were dried in a vacuum oven for 24 hours and diluted in 1.6 mL of deionized water in a 150 × 16 mm test tube with a screw-type lid. This solution was alkalinized with 1 mL of borate buffer (pH=8.7), and then 0.3 mL of chloramine T were added. After a 20-minute rest at room temperature, 1.0 mL of 3.6 M sodium thiosulfate was added, and the test tube was vigorously agitated. Then, approximately 1.5 g of KCl were added to saturate the solution. The tubes were closed and warmed in boiling water for 20 minutes. After cooling of the sample, 2.0 mL of toluene were added, and the tubes were agitated for 5 minutes. After a short rest period, 1.0 mL of the supernatant toluene was transferred to a test tube, where 0.4 mL of the Ehrlich reagent were added (27.4 mL of sulfuric acid in 200 mL of ethanol; this was added to the solution of 120 g of p-dimethylaminobenzaldehyde in 200 mL of ethanol). After 30 minutes, optical density was read with a spectrophotometer at 565 nm, against a blank. The same sequences of reactions were performed in samples containing water and 20 mg/mL of the hydroxyproline solution, blank, and standard sample, respectively.
The data had a normal distribution and were expressed as mean ± standard deviation. The method used was analysis of variance (one-way ANOVA) complemented with the Tukey multiple comparisons test. The significance level adopted was 5%.
The results of the morphometric study are shown in
The morphological results of the echocardiographic study are shown in
The results of the functional study are shown in
This study aimed at assessing the influence of the blockade of the renin-angiotensin system with the AII AT1 receptor blocker and ACEI on cardiac remodeling by analyzing the development of left ventricular hypertrophy, myocardial interstitial fibrosis, and ventricular function in rats undergoing supravalvular AoS. In this model, the administration of ACEI or AT1 blockers does not significantly alter the values of left intraventricular pressure 18. Thus, the hemodynamic effects and the direct tissular effects caused by ACEI or AII AT1 receptor blockers may be dissociated from the cardiac remodeling variables. Because in this model activation of the cardiac renin-angiotensin system occurs, the possibility that the blockade with ACEI or AT1 blockers could attenuate cardiac remodeling was considered.
Our study showed that AoS caused left ventricular hypertrophy. The administration of LIS or LOS attenuated that process, because the 2 treatments resulted in a myocytic cross-sectional area similar to that of the control group. The echocardiographic assessment also characterized ventricular hypertrophy, based on the increase in left ventricular wall thickness with AoS 19. Both treatments induced a smaller wall thickness as compared with that in the AoS group. Thus, our results suggest that the blockade of the renin-angiotensin system with ACEI or AT1 blocker attenuated the development of ventricular hypertrophy induced by AoS. In the literature, evidence that the blockade of the renin-angiotensin system attenuates the hypertrophic process in the AoS model is not consistent. Some authors 20,21 have reported a decrease in ventricular mass, while others have not 22,23. It is worth emphasizing that the reasons for such discrepancies have not been clarified yet.
Regarding the content of interstitial collagen, in accordance with other studies 4,5, ours evidenced that cardiac pressure overload resulted in myocardial fibrosis, because an increase in HOP concentration was observed in the AoS group. Treatment with LIS did not influence the collagen build-up, because no difference was observed in that variable as compared with that in the AoS group without treatment. On the other hand, we may infer that the administration of LOS attenuated the development of fibrosis, because no difference was found in HOP concentration between the LOS animals and control animals. The AoS model comprises an activation of the cardiac tissue renin-angiotensin system, and an increase in messenger RNA for ACE has been documented 24 in the myocardium of rats undergoing aortic stenosis. However, in the heart, contrary to that which occurs in the circulation, the major pathway of transformation of AI into AII seems to be the chymase pathway 7,8. Considering that AII is an important modulator of collagen synthesis 25, we may infer that, in that model, the blockade of AII AT1 receptors is more effective than the ACE blockade in preventing fibrosis.
The left ventricular functional analysis performed by use of echocardiography revealed that the AoS groups had similar systolic functions, which were better than that in the control group, because the left ventricular shortening percentage was greater in animals with cardiac remodeling. In accordance with our results, other authors 26,27 have reported that, in cardiac pressure overload, the heart has initially normal or hyperdynamic function, and, over time, it evolves with progressive ventricular dysfunction.
In regard to the left ventricular diastolic function, analysis of the size of the left atrium showed an increase in atrial dimensions in the AoS and LIS groups as compared with that in control animals. Because the AoS and LIS groups had a better systolic function than the control group did, atrial enlargement may be due to diastolic dysfunction, although the E/A ratio did not differ between the groups. On the other hand, the LOS group showed no statistically significant difference in atrial size as compared with that in the control group. The concept that interstitial fibrosis is an important determinant of the passive stiffness of the ventricular chamber has been well established 28. Thus, our results allow the speculation that the treatment with LOS improved diastolic function, at least partially, due to attenuation of interstitial fibrosis.
Considering that, up to now, no clinical therapy exists to prevent or to attenuate the progression of the repercussions of aortic stenosis, our study suggests that the blockade of the renin-angiotensin system may be considered a therapeutic option in that situation. The data available on the comparison between AT1 blockers and ACEI in that model are scarce. In a study, Liu et al 21 reported that both captopril and losartan equally attenuated the development of hypertrophy, the decrease in SERCA-2, and the increase in beta-myosin, markers of the remodeling process, after 8 weeks of treatment. Although further studies are required for a definitive conclusion, our results suggest that AT1 receptor blockers may provide greater benefit compared with that of ACEI in that model.
Our study had 2 limitations. In some variables analyzed, the values of the LIS and LOS groups did not differ from those of the AoS group. However, differently from the AoS group, the values of the groups under treatment did not differ from those of the control group. Therefore, we interpreted that the treatment used resulted in intermediate values between those in control animals and in the AoS group. Another consideration refers to the dosages of lisinopril and losartan used. We used dosages that were equal or equivalent to those used in other studies, and the blockade of the renin-angiotensin system was performed with the 2 strategies. However, we did not perform tests to assess the pharmacological equivalence of the medications used in our experiment.
In conclusion, the data in the present study indicate that, in the AoS model in rats, the blockade of the renin-angiotensin system with AII AT1 receptor blockers and with ACEI may attenuate the development of cardiac hypertrophy. However, only the blockade of AT1 receptors attenuates left ventricular interstitial fibrosis.
Leonardo A. M. Zornoff Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP - Departamento de Clínica Médica Cep 18618-000 - Botucatu, SP, Brazil E-mail:
Sent for publication: 07/06/2004
Accepted for publication: 09/29/2004