abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil mHRpq4JNDGcSjsccvMMsgzN 00011 S0066-782X2005000300011 S0066-782X(05)08400311 10.1590/S0066-782X2005000300011 Artigos Originais Amiodarona causa vasodilatação dependente do endotélio em artérias coronárias caninas Rodrigues Alfredo José Evora Paulo Roberto Barbosa Maruo Ayako Schaff Hartzell V. São Paulo Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Brazil 03 2005 84 3 251 255 01 09 2003 26 01 2004 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

OBJETIVO: Avaliar os efeitos vasodilatadores da amiodarona em artérias coronárias caninas empregando soluções de amiodarona dissolvida em polisorbato 80 ou em água. MÉTODOS: Anéis de artéria coronária, com e sem o endotélio íntegro, foram imersos em solução de krebs e conectadas a um transdutor para aferição de força isométrica promovida por contração vascular. As artérias foram expostas a concentrações crescentes de polisorbato 80, amiodarona dissolvida em água, amiodarona dissolvida em polisorbato 80 e uma apresentação comercial da amiodarona (Cordarone®). Os experimentos foram conduzidos na presença e na ausência dos seguintes bloqueadores enzimáticos: apenas indometacina, Nômega-nitro-L-arginina associada à indometacina e apenas Nômega-nitro-L-arginina. RESULTADOS: O polisorbato 80 causou pequeno relaxamento não dependente do endotélio. O Cordarone®, a amiodarona dissolvida em água e em polisorbato 80 promoveram relaxamento dependente do endotélio, que foi de maior magnitude para a amiodarona dissolvida em polisorbato e para o Cordarone®. Apenas a associação de indometacina com a Nômega-nitro-L-arginina foi capaz de abolir o relaxamento dependente do endotélio provocado pela amiodarona dissolvida em polisorbato 80. CONCLUSÃO: Os resultados obtidos indicam que a vasodilatação promovida pela amiodarona em artérias coronárias caninas é causada principalmente pela estimulação da liberação de óxido nítrico e fatores endoteliais relaxantes dependentes das ciclo-oxigenases.

 endotélio amiodarona óxido nítrico ciclo-oxygenase circulação coronariana 19 08 2005

ARTIGO ORIGINAL

Amiodarona causa vasodilatação dependente do endotélio em artérias coronárias caninas

Alfredo José Rodrigues; Paulo Roberto Barbosa Evora; Ayako Maruo; Hartzell V. Schaff

Ribeirão Preto,SP / Mayo Clinic - Rochester, MN, USA

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP

Endereço para correspondência

RESUMO

OBJETIVO: Avaliar os efeitos vasodilatadores da amiodarona em artérias coronárias caninas empregando soluções de amiodarona dissolvida em polisorbato 80 ou em água.

MÉTODOS: Anéis de artéria coronária, com e sem o endotélio íntegro, foram imersos em solução de krebs e conectadas a um transdutor para aferição de força isométrica promovida por contração vascular. As artérias foram expostas a concentrações crescentes de polisorbato 80, amiodarona dissolvida em água, amiodarona dissolvida em polisorbato 80 e uma apresentação comercial da amiodarona (Cordarone®). Os experimentos foram conduzidos na presença e na ausência dos seguintes bloqueadores enzimáticos: apenas indometacina, Nw-nitro-L-arginina associada à indometacina e apenas Nw-nitro-L-arginina.

RESULTADOS: O polisorbato 80 causou pequeno relaxamento não dependente do endotélio. O Cordarone®, a amiodarona dissolvida em água e em polisorbato 80 promoveram relaxamento dependente do endotélio, que foi de maior magnitude para a amiodarona dissolvida em polisorbato e para o Cordarone®. Apenas a associação de indometacina com a Nw-nitro-L-arginina foi capaz de abolir o relaxamento dependente do endotélio provocado pela amiodarona dissolvida em polisorbato 80.

CONCLUSÃO: Os resultados obtidos indicam que a vasodilatação promovida pela amiodarona em artérias coronárias caninas é causada principalmente pela estimulação da liberação de óxido nítrico e fatores endoteliais relaxantes dependentes das ciclo-oxigenases.

Palavras-chave: endotélio, amiodarona, óxido nítrico, ciclo-oxygenase, circulação coronariana

Atualmente, a amiodarona é utilizada, exclusivamente, como um anti-arrítmico, todavia, foi primariamente introduzida como um vasodilatador para o tratamento da angina de peito1. Embora seu efeito vasodilatador, muitas vezes evidenciado como hipotensão após uso intravenoso2, 3, seja bem conhecido, os mecanismos responsáveis pela vasodilatação não o são. Demonstrou-se que a amiodarona e o seu metabolito, a N-desetilamiodarona, promovem relaxamento dependente do endotélio em veias humanas4, 5. Entretanto, são escassas as informações quanto aos mecanismos envolvidos no relaxamento de artérias sistêmicas, sobretudo as artérias coronárias.

Não obstante os efeitos intrínsecos da amiodarona, sabe-se que o polisorbato 80, solvente utilizado nas apresentações comerciais da amiodarona, pode influenciar o efeito de outras drogas6-8, promover a liberação de histamina9, além de ser potencialmente lesivo para o endotélio10, 11. Tais efeitos podem ser clinicamente relevantes, levando à procura de apresentações aquosas de amiodarona12.

A presente investigação foi elaborada com a finalidade de avaliar os efeitos vasodilatadores da amiodarona, bem como do polisorbato 80, em artérias coronárias caninas, empregando solução de amiodarona dissolvida em polisorbato 80, solução de amiodarona diluída em água e solução de polisorbato 80 diluído em água. Para avaliar, separadamente, cada uma das duas principais vias de produção e liberação de fatores endoteliais vasodilatadores (óxido nítrico e prostaciclinas), os experimentos foram realizados em presença de inibidor da óxido nítrico sintetase (Nw-Nitro-L-arginina), das ciclo-oxigenases (indometacina) e de ambos.

Métodos

Cães mestiços (25-30 kg), livres de verminoses e de ambos os sexos, foram anestesiados com tiopental sódico intravenoso (30 mg/kg; Abbott Lab., Chicago, IL) e exanguinados mediante secção das carótidas. O tórax foi rapidamente aberto e o coração, ainda em atividade, foi retirado e imerso em solução de Krebs gelada com a composição molar: NaCl- 118,3; KCI- 4,7; MgSO4- 1,2; KH2PO4- 1,22; CaCl2- 2,5; NaHCO3- 25,0 e glicose, 11,1. A investigação foi aprovada e realizada de acordo com o estabelecido pelo Guia de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revised 1996), e das normas do Comitê Institucional para o Cuidado e Uso de Animais da Mayo Foundation, Rochester, MN, EUA.

A artéria coronária circunflexa foi dissecada e um segmento retirado. Anéis vasculares com 4 a 5 mm de comprimento foram cuidadosamente obtidos a partir desse seguimento arterial. Os anéis foram suspensos em câmaras com capacidade de 25 ml, cheias com solução de Krebs a 37 ºC e aerada com mistura gasosa composta de 95% de O2 e 5% de CO2 (pH=7.4). Cada anel vascular foi suspenso por dois ganchos de aço inoxidável passados através do lúmen dos vasos. Um gancho era preso ao fundo da câmara e o outro ao transdutor de força Statham UC 2, Gould, Cleveland, Ohio. Após a estabilização da preparação, os anéis foram estirados progressivamente até a tensão preestabelecida de 10 g.

Em todos os experimentos a ausência ou a presença de endotélio íntegro foi averiguada pela resposta observada à dose única de acetilcolina (10-6 M), após contração induzida por 20 mM de cloreto de potássio. A remoção do endotélio foi realizada mecanicamente, introduzindo-se o ramo de uma pinça delicada na luz do vaso e rolando-o sob esse ramo da pinça.

Após a averiguação do estado funcional do endotélio os vasos eram mantidos nas câmaras cheias com solução de Krebs sem drogas por 30 min antes do início dos experimentos.

Todos os experimentos foram realizados em paralelo, utilizando-se pares de anéis vasculares compostos por um anel com endotélio e outro sem o endotélio. Inicialmente foram obtidas curvas concentração-resposta para a amiodarona dissolvida em água destilada (AMA) nas concentrações de 10-9 M a 10-4 M, para a solução de amiodarona dissolvida em polisorbato 80 (AMPO) nas concentração de 10-9 M a 10-4 M de amiodarona e de 10 –13 M a 10-8 M de polisorbato, para a solução de polisorbato 80 (10 -13 M to 10-8 M of polisorbato) e também para uma apresentação comercial da amiodarona (cordarone®, 10-9 M a 10-4 M de amiodarona). Todas as soluções foram testadas simultaneamente em anéis com endotélio e sem o endotélio.

O primeiro grupo de curvas concentração-resposta foi obtido sem o bloqueio das ciclo-oxigenases ou da oxido nítrico sintetase. Subseqüentemente, foram obtidas curvas concentração-resposta para amiodarona em água (AMA) e em polisorbato 80 (AMPO) na presença de indometacina (2x10-5 M), indometacina (2x10-5 M) em combinação com a Nw-Nitro-L-arginina (L-NA) (2x10-4 M) e L-NA (2x10-4 M) apenas. Os bloqueadores enzimáticos eram adicionados 1h antes do início da obtenção das curvas concentração-resposta. Em todos os experimentos a prostaglandina F2a (2x10-6 M) foi utilizada para contrair os vasos.

A acetilcolina, a indometacina, a prostaglandina F2a, a amiodarona, o polisorbato 80 e a Nw-Nitro-L-arginina foram adquiridas da Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo). O Cordarone® (150mg/3ml) é do Wyeth Laboratories, Inc., U.S.A. Todas as drogas foram preparadas com água destilada, exceto a indometacina que foi dissolvida em solução de NaHCO3 (10-5 M), ou a amiodarona quando dissolvida em polisorbato 80.

A solução de amiodarona em polisorbato 80 (AMPO) foi obtida dissolvendo-se polisorbato 80 em água destilada de modo a se obter uma solução com a concentração de inicial de 10-9 M de polisorbato. A seguir, adicionava-se à solução a amiodarona de modo a se obter concentração de amiodarona de 10-4 M. Esta solução inicial de amiodarona e polisorbato foi utilizada para obtenção das diluições subseqüentes, e a concentração inicial de polisorbato 80 (10-9 M) escolhida por ser a concentração de polisorbato 80, obtida ao se diluir 1 frasco de Cordarone® (150mg/3ml, Wyeth Laboratories, Inc.) visando uma concentração de amiodarona de 10-4 M.

Amiodarona dissolvida apenas em água foi obtida diluindo-se a amiodarona em água destilada aquecida a 40ºC e agitada com ultra som em banho aquecido até obter-se uma solução límpida.

Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão da porcentagem do platô de contração induzida pela prostaglandina F2a. O platô de contração, o ponto inicial da curva de concentração-resposta, foi considerado como 0% de relaxamento. O "n" indica o número de animas dos quais foram tomados os anéis vasculares.

Os seguintes testes estatísticos foram utilizados: two-way ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni e o teste de Kruskal-Wallis seguido do teste para comparações múltiplas de Dunn. Utilizou-se o software GraphPad Prism, versão 3.03 (GraphPad Software, Inc.). As diferenças foram consideradas significativas se p < 0.05.

Resultados

Não houve diferença significativa entre os platôs de contração (tab. I) comparando artérias com e sem endotélio dentro do mesmo grupo experimental ou entre os grupos.

O relaxamento promovido pela AMA (fig. 1, n=9) em artérias com endotélio variou de 0% a 57,0%±17,9 %, e de 0,37 %± 1.11% a 17.2%±15.56 % em artérias sem endotélio. As diferenças foram significativas (p<0.001) para as concentrações de 3,16x10-5 M e 10-4 M.

O Cordarone® (fig. 1, n=6) provocou relaxamento que variou de 0,4%±1,02%, na concentração mínima, a 94,40%±10,10%, na concentração máxima, em vasos com endotélio. Em vasos sem endotélio o relaxamento variou de 0% a 40,26%±18,44%. As diferenças entre o relaxamento de vasos com e sem endotélio foram significativas (p<0,001) para as concentrações de amiodarona de 3,16x10-5 e 10-4 M.

A solução de amiodarona em polisorbato (AMPO) (fig. 1, n=6) promoveu relaxamento em artérias com endotélio que variou de 0%, na concentração mínima, a 100%±0% na concentração máxima. Em artérias sem endotélio, o relaxamento variou de 0% a 28,46%±13,87%. As diferenças entre artérias com e sem endotélio foram significativas (p<0,001) para as concentrações de 10-5 M a 10-4 M.

O polisorbato 80 provocou um discreto relaxamento tanto em artérias com endotélio como naquelas sem endotélio (fig. 2, n=6). O relaxamento máximo em artérias com e sem endotélio foi de 27,43%±24,10% e 18,35%±15,08%, respectivamente. A diferença não foi significativa. É interessante que a adição de uma dose única de amiodarona dissolvida em água (10-4 M) após a última dose da curva concentração-resposta para o polisorbato 80 (10-8 M) provocou relaxamento imediato de 99,37%±1,39% nas artérias com endotélio e de 24,55%±15,28 % nas artérias sem endotélio (p<0,001).

Comparando-se as curvas obtidas com o Cordarone® àquelas obtidas com a amiodarona em polisorbato (AMPO), observamos que apenas para a concentração de 10-5 M houve diferença no relaxamento, com a AMPO promovendo relaxamento maior que aquele promovido pela amiodarona comercial (p<0,01), nas artérias com endotélio.

Assim, como o polisorbato 80 provocou relaxamento discreto e independente do endotélio e o relaxamento promovido pela AMPO foi similar àquele promovido pela amiodarona comercial, os experimentos subseqüentes foram realizados apenas com amiodarona dissolvida em água (AMA) e a amiodarona dissolvida em solução de polisorbato 80 (AMPO).

A presença de indometacina (2x10-5 M) provocou um desvio significativo para a direita da curva concentração-resposta (p<0,05) para a AMA (fig. 3, n=6), todavia, na máxima concentração (10-4 M) o relaxamento observado em vasos com endotélio ainda foi significativamente maior (38,81% ± 15,07%, p<0.001) àquele observado em vasos sem o endotélio (13.35% ± 6.63%).

A indometacina não afetou significativamente o relaxamento provocado pela AMPO (fig. 3, n=6). O relaxamento em artérias com endotélio variou de 0% a 85,76%±19,90%, e de 0% a 16,75%±8,30% nos vasos sem endotélio. A diferença de relaxamento entre os vasos com e sem endotélio foi significante (p<0,001) para as concentrações de 10-5 a 10-4 M.

A Nw-Nitro-L-Arginina (L-NA) (2x10-4 M) aboliu o relaxamento dependente do endotélio provocado pela AMA (fig. 4, n=6), desde que diferenças significativas não foram observadas entre o relaxamento de vasos com e sem endotélio. Embora a Nw-Nitro-L-Arginina tenha causado algum desvio à direita da curva concentração-resposta, ela não inibiu o relaxamento dependente do endotélio provocado pela AMPO (n=6, máximo de 88,73%± 15,67%). Observou que o relaxamento obtido com as concentrações de 3,16x10-5 M e 10-4 M de AMPO foi significativamente maior nas artérias com endotélio (p<0,001).

A combinação da Nw-Nitro-L-arginina (2x10-4 M) com a indometacina (2x 10-5 M) aboliu completamente o relaxamento dependente do endotélio promovido tanto pela AMA como pela AMPO (fig. 5, n=6), uma vez que não se observou diferença significativa entre o relaxamento de artérias com e sem endotélio para ambas as drogas, embora algum relaxamento independente do endotélio ainda tenha ocorrido.

Discussão

Como salientamos, anteriormente, já se demonstrou que a amiodarona e seu metabolito, a N-desetilamiodarona, causam relaxamento dependente do endotélio em veias humanas de modo similar ao que observamos nas artérias coronárias de cães, embora naquelas investigações apenas a amiodarona dissolvida em polisorbato tenha sido utilizada4,5.

Nossos resultados demonstraram que a amiodarona promove relaxamento que é em sua maior magnitude dependente do endotélio em artérias coronárias de cães. Todavia, parece-nos que a presença do solvente polisorbato influencia tal vasodilatação, uma vez que o polisorbato 80 sozinho não provocou relaxamento dependente do endotélio, mas sua associação com a amiodarona influenciou significativamente a magnitude do relaxamento dependente do endotélio.

Observando-se os resultados obtidos com amiodarona dissolvida em água constata-se que o bloqueio isolado das ciclo-oxigenases diminuiu, mas não aboliu, a vasodilatação. Todavia, o bloqueio isolado da óxido nítrico sintetase bloqueou a vasodilatação promovida pela amiodarona em água. Tal fato salienta a maior importância do óxido nítrico na vasodilatação promovida pela amiodarona. No entanto, somente a inibição simultânea das ciclo-oxigenases e da óxido nítrico sintetase aboliu a vasodilatação promovida pela amiodarona dissolvida em polisorbato 80. Se o polisorbato 80 atuou meramente promovendo melhor solubilização da amiodarona ou se ele também modulou os efeitos da amiodarona, em ambas as situações, propiciando a ampliação do efeito vasodilatador da amiodarona, é matéria para especulações.

Há evidências de que surfactantes, como os polisorbatos, podem influenciar a atividade enzimática do ácido aracdônico. Demonstrou-se que os surfactantes reduzem significativamente a inibição promovida pelo substrato das 15-lipoxigenases13 e promovem liberação de ácido aracdônico14,15. Ademais, demonstrou-se que o polisorbato 80 pode facilitar o transporte de diversos íons (K+, Na+, NH4+, Ca++) e moléculas inorgânicas através de modelos de membrana16-19. Há evidências, ainda, de que os polisorbatos também podem modular a sensibilidade a certos agentes anti-tumorais, aumentando o transporte desses agentes através da membrana ou facilitando sua interação com as mesmas6,19, visto que a amiodarona é uma droga altamente lipofílica20.

Estudos in vivo também sugerem que os polisorbatos não são inertes e podem influenciar os efeitos sistêmicos da amiodarona7,8,21, embora outros autores tenham demonstrado que o polisorbato pode lesar o endotélio vascular com concentrações maiores que as utilizadas por nós4,5,10,11.

O mecanismo exato pelo qual a amiodarona promove a liberação de fatores endoteliais relaxantes não é completamente conhecido, mas demonstrou-se que a amiodarona22 e a N-desetilamiodarona23 promovem um aumento sustentado nas concentrações de cálcio citoplasmático nas células endoteliais. Tal elevação do cálcio pode desencadear a ativação das vias dependentes da calmodulina e que resultam na liberação de fatores vasodilatadores. Ademais, há evidências de que a amiodarona estimula receptores tipo proteína-G 24.

Ainda que os resultados demonstrem claramente que a liberação de fatores endoteliais é o principal mecanismo de relaxamento vascular, os resultados obtidos com a inibição simultânea das ciclo-oxigenases e da óxido nítrico sintetase também demonstram que a amiodarona provoca alguma vasodilatação não dependente do endotélio (fig. 5), pois nota-se discreto relaxamento semelhante entre artérias com e sem endotélio, fato este que pode estar relacionado às suas propriedades bloqueadora de canais de cálcio25.

Embora a hipotensão após o uso intravenoso de amiodarona seja um efeito adverso conhecido2, 3, 26, vários mecanismos, além da liberação de fatores relaxantes endoteliais, podem ser os responsáveis in vivo. Demonstrou-se que a amiodarona pode provocar redução do desempenho cardíaco e/ou induzir a um estado de baixa resistência vascular periférica devido a um efeito bloqueador alfa-adrenérgico27,28. Ademais, o polisorbato, presente na formulação comercial da amiodarona, pode causar liberação de histamina 9, podendo resultar em hipotensão.

Concluindo, nossos resultados indicam que a vasodilatação promovida pela amiodarona em artérias coronárias caninas é causada principalmente pela estimulação da liberação de óxido nítrico e fatores endoteliais relaxantes dependentes das ciclo-oxigenases.

Endereço para correspondência

Alfredo José Rodrigues

Campus Universitário

Monte Alegre, s/nº

Cep 14048-900 - Ribeirão Preto - SP

E-mail:

alfredo@smnp.usp.br

Recebido em 01/09/2003 - Aceito em 26/01/2004

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OBJECTIVE: To assess the vasodilating effects of amiodarone on canine coronary arteries by using solutions of amiodarone dissolved in polysorbate 80 or water. METHODS: Rings of coronary arteries, with or without intact endothelium, were immersed in Krebs solution and connected to a transducer for measuring the isometric force promoted by a vascular contraction. The arteries were exposed to increasing concentrations of polysorbate 80, amiodarone dissolved in water, amiodarone dissolved in polysorbate 80, and a commercial presentation of amiodarone (Cordarone). The experiments were conducted in the presence of the following enzymatic blockers: only indomethacin, Nw-nitro-L-arginine associated with indomethacin, and only Nw-nitro-L-arginine. RESULTS: Polysorbate 80 caused a small degree of nonendothelium-dependent relaxation. Cordarone, amiodarone dissolved in water, and amiodarone dissolved in polysorbate 80 caused endothelium-dependent relaxation, which was greater for amiodarone dissolved in polysorbate and for Cordarone. Only the association of indomethacin and Nw-nitro-L-arginine could eliminate the endothelium-dependent relaxation caused by amiodarone dissolved in polysorbate 80. CONCLUSION: The results obtained indicate that vasodilation promoted by amiodarone in canine coronary arteries is mainly caused by stimulation of the release of nitric oxide and cyclooxygenase-dependent relaxing endothelial factors.

 endothelium amiodarone nitric oxide cyclooxygenase coronary circulation

ORIGINAL ARTICLE

Amiodarone causes endothelium-dependent vasodilation in canine coronary arteries

Alfredo José Rodrigues; Paulo Roberto Barbosa Evora; Ayako Maruo; Hartzell V. Schaff

Ribeirão Preto,SP / Mayo Clinic - Rochester, MN, USA

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil, and Mayo Clinic, Rochester, MN, USA

Correspondence

ABSTRACT

OBJECTIVE: To assess the vasodilating effects of amiodarone on canine coronary arteries by using solutions of amiodarone dissolved in polysorbate 80 or water.

METHODS: Rings of coronary arteries, with or without intact endothelium, were immersed in Krebs solution and connected to a transducer for measuring the isometric force promoted by a vascular contraction. The arteries were exposed to increasing concentrations of polysorbate 80, amiodarone dissolved in water, amiodarone dissolved in polysorbate 80, and a commercial presentation of amiodarone (Cordarone). The experiments were conducted in the presence of the following enzymatic blockers: only indomethacin, Nw-nitro-L-arginine associated with indomethacin, and only Nw-nitro-L-arginine.

RESULTS: Polysorbate 80 caused a small degree of nonendothelium-dependent relaxation. Cordarone, amiodarone dissolved in water, and amiodarone dissolved in polysorbate 80 caused endothelium-dependent relaxation, which was greater for amiodarone dissolved in polysorbate and for Cordarone. Only the association of indomethacin and Nw-nitro-L-arginine could eliminate the endothelium-dependent relaxation caused by amiodarone dissolved in polysorbate 80.

CONCLUSION: The results obtained indicate that vasodilation promoted by amiodarone in canine coronary arteries is mainly caused by stimulation of the release of nitric oxide and cyclooxygenase-dependent relaxing endothelial factors.

Key words: endothelium, amiodarone, nitric oxide, cyclooxygenase, coronary circulation

Currently, amiodarone is exclusively used as an antiarrhythmic agent. However, it was primarily introduced as a vasodilator for the treatment of angina pectoris 1. Although its vasodilating effect is well known and frequently evidenced as hypotension after its intravenous use 2,3, the mechanisms responsible for vasodilation have not been totally clarified. Amiodarone and its metabolite, N-desethylamiodarone, have been shown to cause endothelium-dependent relaxation in human veins 4,5. However, information about the mechanisms involved in relaxation of systemic arteries, mainly coronary arteries, is still scarce.

In addition to the intrinsic effects of amiodarone, polysorbate 80, a solvent used in commercial amiodarone, may influence the effect of other drugs 6-8, cause histamine release 9, and be potentially harmful to the endothelium 10,11. These effects may be clinically relevant, and have led to the search for other aqueous presentations of amiodarone 12.

The present investigation aimed at assessing the vasodilating effects of amiodarone, as well as those of polysorbate 80, in canine coronary arteries, by using a solution of amiodarone dissolved in polysorbate 80, a solution of amiodarone diluted in water, and a solution of polysorbate 80 diluted in water. To separately assess each of the 2 major pathways of production and release of vasodilating endothelial factors (nitric oxide and prostacyclins), the experiments were performed in the presence of the nitric oxide synthetase inhibitor (Nw-nitro-L-arginine), of cyclooxygenase (indomethacin), and of both.

Methods

Crossbred dogs (weight, 25-30 kg), of both sexes, and with no verminous disease, were anesthetized with intravenous thiopental sodium (30 mg/kg; Abbott Lab, Chicago, IL, USA), had their carotids sectioned, and died of bleeding. Their chests were rapidly opened, and their hearts, still active, were removed and immersed in cold Krebs solution with a molar composition (NaCl, 118.3; KCI, 4.7; MgSO4, 1.2; KH2PO4, 1.22; CaCl2, 2.5; NaHCO3, 25.0; and glucose, 11.1). The investigation was approved and performed according to the recommendations in the Guide for Care and Use of Laboratory Animals published by the US National Institutes of Health [DHHS Publication No. (NIH) 85-23, revised 1996], and the guidelines of the Institutional Committee for Animal Care and Use of the Mayo Foundation, Rochester, MN, USA.

The circumflex coronary artery was dissected and one segment was removed. Four- to 5-mm long vascular rings were carefully obtained from that arterial segment. The rings were suspended in 25-mL chambers containing Kreks solution at 37ºC and aired with a gas mixture composed of 95% O2 and 5% CO2 (pH = 7.4). Each vascular ring was suspended by 2 stainless steel hooks passed through the lumen of the vessels. One hook was attached to the end of the chamber and the other to the force transducer Statham UC 2 (Gould, Cleveland, Ohio, USA). After stabilization of the preparation, the rings were progressively stretched until the pre-established tension of 10 g.

In all experiments, the absence or presence of intact endothelium was assessed through the response to a single dose of acetylcholine (10-6 M) after contraction induced by 20 mM of potassium chloride. Removal of the endothelium was mechanically performed by introducing the arm of a delicate tweezers in the lumen of the vessel, and by rolling the vessel under that arm of the tweezers.

After assessing the functional status of the endothelium, the vessels were maintained in the chambers immersed in Krebs solution with no drug for 30 minutes before beginning the experiments.

All experiments were performed in parallel, using pairs of vascular rings composed of one ring with endothelium and another ring without endothelium. Initially, concentration-response curves were obtained for the following solutions: amiodarone dissolved in distilled water (AMA) at concentrations from 10-9 M to 10-4 M; amiodarone dissolved in polysorbate 80 (AMPO) at concentrations from 10-9 M to 10-4 M of amiodarone and 10–13 M to 10-8 M of polysorbate; polysorbate 80 (10-13 M to 10-8 M of polysorbate); and a commercial preparation of amiodarone (Cordarone, 10-9 M to 10-4 M of amiodarone). All solutions were simultaneously tested in rings with and without endothelium.

The first group of concentration-response curves was obtained without blocking the cyclooxygenases or nitric oxide synthetase. Afterwards, concentration-response curves were built for amiodarone in water (AMA) and in polysorbate 80 (AMPO) in the presence of indomethacin (2x10-5 M), indomethacin (2x10-5 M) in combination with Nw-nitro-L-arginine (L-NA) (2x10-4 M), and L-NA (2x10-4 M) only. The enzymatic blockers were added 1h before beginning to build the concentration-response curves. Prostaglandin F2a (2x10-6 M) was used to contract the vessels in all experiments.

Acetylcholine, indomethacin, prostaglandin F2a, amiodarone, polysorbate 80, and Nw-nitro-L-arginine were acquired from Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo, USA). Cordarone (150 mg/3 mL) was provided by Wyeth Laboratories Inc., USA. All drugs were prepared with distilled water, except for indomethacin, which was dissolved in a solution of NaHCO3 (10 -5 M), and amiodarone, when dissolved in polysorbate 80.

The solution of amiodarone in polysorbate 80 (AMPO) was obtained by dissolving polysorbate 80 in distilled water to obtain a solution with an initial concentration of 10-9 M of polysorbate. Then, amiodarone was added to the solution to obtain an amiodarone concentration of 10–4 M. That initial solution of amiodarone and polysorbate was used to obtain the subsequent dilutions, and that initial concentration of polysorbate 80 (10-9 M) chosen was obtained by diluting 1 flask of Cordarone (150 mg/3 mL, Wyeth Laboratories, Inc.), aiming at an amiodarone concentration of 10-4 M.

Amiodarone dissolved only in water was obtained by diluting amiodarone in distilled water at 40ºC and agitating with ultrasound in a warmed bath until obtaining a clear solution.

The results are expressed as mean ± standard deviation of the percentage of the plateau of contraction induced by prostaglandin F2a. The plateau of contraction, the initial point of the concentration-response curve, was considered as 0% of relaxation. "n" indicates the number of animals from which the vascular rings were obtained.

The following statistical tests were used: 2-way ANOVA followed by the Bonferroni post-test, the Kruskal-Wallis test, and the Dunn multiple comparisons test. GraphPad Prism software, version 3.03 (GraphPad Software Inc.) was used. The differences were considered significant when P < 0.05.

Results

No significant difference was observed between the plateaus of contraction (tab. I) when comparing arteries with and without endothelium within the same experimental group or between groups.

The relaxation caused by AMA (fig. 1, n=9) in arteries with endothelium ranged from 0% to 57.0%±17.9%, and, in arteries without endothelium, from 0.37%±1.11% to 17.2%±15.56%. The differences were significant (P < 0.001) for the concentrations of 3.16x10-5 M and 10-4 M.

Cordarone (fig. 1, n=6) caused relaxation that ranged from 0.4%±1.02%, at the minimum concentration, to 94.40% ± 10.10%, at the maximum concentration, in vessels with endothelium. In vessels without endothelium, the relaxation ranged from 0% to 40.26% ± 18.44%. The differences between relaxation of the vessels with and without endothelium were significant (P<0.001) for the concentrations of amiodarone of 3.16x10-5 and 10-4 M.

The solution of amiodarone in polysorbate (AMPO) (fig. 1, n=6) caused relaxation in arteries with endothelium that ranged from 0%, at the minimum concentration, to 100% ± 0%, at the maximum concentration. In arteries without endothelium, relaxation ranged from 0% to 28.46% ± 13.87%. The differences between the arteries with and without endothelium were significant (P < 0.001) for the concentrations from 10-5 M to 10-4 M.

Polysorbate 80 caused a mild relaxation in arteries with and without endothelium (fig. 2, n=6). The maximum relaxation in arteries with and without endothelium was 27.43%±24.10% and 18.35%±15.08%, respectively. The difference was not significant. It is worth noting that the addition of a single dose of amiodarone dissolved in water (10-4 M) after the last dose of the concentration-response curve for polysorbate 80 (10-8 M) caused immediate relaxation of 99.37%±1.39% in arteries with endothelium and of 24.55%±15.28% in arteries without endothelium (P<0.001).

Comparing the curves obtained with Cordarone with those obtained with amiodarone in polysorbate (AMPO), a difference in relaxation was observed only for the concentration of 10-5 M, and AMPO caused greater relaxation than that provided by commercial amiodarone (P < 0.01) in the arteries with endothelium.

Thus, as polysorbate 80 caused mild relaxation independently of the endothelium, and as the relaxation provided by AMPO was similar to that caused by commercial amiodarone, the subsequent experiments were performed only with amiodarone dissolved in water (AMA) and amiodarone dissolved in the polysorbate 80 solution (AMPO).

The presence of indomethacin (2 x 10–5 M) caused a significant deviation to the right of the concentration-response curve (P<0.05) for AMA (fig. 3, n=6); however, at the maximum concentration (10-4 M), the relaxation observed in vessels with endothelium was still significantly greater (38.81%±15.07%, P<0.001) than that observed in vessels without endothelium (13.35%±6.63%).

Indomethacin did not significantly affect the relaxation caused by AMPO (fig. 3, n=6). Relaxation in the arteries with endothelium ranged from 0% to 85.76%±19.90%, and from 0% to 16.75%± 8.30% in the vessels without endothelium. The difference in relaxation between the vessels with and without endothelium was significant (P<0.001) for the concentrations from 10-5 to 10 -4 M.

Nw-nitro-L-arginine (L-NA) (2x10-4 M) eliminated the endothelium-dependent relaxation caused by AMA (fig. 4, n=6), because no significant differences in relaxation were observed in vessels with and without endothelium. Although Nw-nitro-L-arginine has caused some deviation in the concentration-response curve to the right, it has not inhibited endothelium-dependent relaxation caused by AMPO (n=6, maximum of 88.73%±15.67%). The relaxation obtained with the AMPO concentrations of 3.16x10-5 M and 10-4 M was significantly greater in arteries with endothelium (P<0.001).

The combination of Nw-nitro-L-arginine (2x10-4 M) with indomethacin (2x 10–5 M) eliminated completely the endothelium-dependent relaxation caused by both AMA and AMPO (fig. 5, n=6), because no significant difference was observed between relaxation of arteries with and without endothelium for both drugs, although some endothelium-independent relaxation occurred.

Discussion

As already emphasized, amiodarone and its metabolite, N-desethylamiodarone, have already been shown to cause endothelium-dependent relaxation in human veins similarly to that observed in canine coronary arteries, although only amiodarone dissolved in polysorbate was used in those investigations 4,5.

Our results show that amiodarone causes relaxation, which is mainly endothelium-dependent in canine coronary arteries. However, although polysorbate 80 alone does not cause endothelium-dependent relaxation, it seems that the presence of the solvent polysorbate influences that vasodilation, because its association with amiodarone significantly influences the magnitude of endothelium-dependent relaxation.

Considering the results obtained with amiodarone dissolved in water, it is evident that the isolated blockage of cyclooxygenases decreased, but did not eliminate, vasodilation. However, the isolated blockage of nitric oxide synthetase blocked vasodilation promoted by amiodarone in water. Such a fact emphasizes the greater importance of nitric oxide in the vasodilation promoted by amiodarone. However, only the simultaneous inhibition of cyclooxyge nases and nitric oxide synthetase eliminated vasodilation promoted by amiodarone dissolved in polysorbate 80. Whether polysorbate 80 acted merely promoting better solubilization of amiodarone or whether it also modulated the effects of amiodarone, in both situations propitiating amplification of the vasodilating effect of amiodarone, is still questionable.

Evidence suggests that surfactants, such as polysorbates, may influence the enzymatic activity of the arachidonic acid. Surfactants have been shown to significantly reduce the inhibition promoted by the substrate of 15-lipoxygenases13 and promote the release of arachidonic acid14,15. In addition, polysorbate 80 has been shown to facilitate the transportation of several ions (K+, Na+, NH4+, Ca++) and inorganic molecules through membrane models 16-19. Evidence exists that polysorbates may also modulate sensitivity to certain antitumor agents, increasing the transportation of those agents through the membrane or facilitating their interaction 6,19, considering that amiodarone is a highly lipophilic drug 20.

In vivo studies have also suggested that polysorbates are not inert and may influence the systemic effects of amiodarone 7,8,21, although other authors have shown that polysorbate may damage the vascular endothelium at concentrations greater than those used in our study 4,5,10,11.

The exact mechanism by which amiodarone causes the release of relaxing endothelial factors has not been completely clarified, but amiodarone 22 and N-desethylamiodarone 23 have been shown to promote a sustained increase in the concentrations of cytoplasmic calcium in endothelial cells. Such calcium elevation may trigger the activation of the calmodulin-dependent pathway, which results in the release of vasodilating factors. In addition, evidence exists that amiodarone stimulates protein-G type receptors 24.

Although the results have clearly shown that the release of endothelial factors is the major mechanism of vascular relaxation, the results obtained with the simultaneous inhibition of the cyclooxygenases and nitric oxide synthetase have also shown that amiodarone causes some nonendothelium-dependent vasodilation (fig. 5), because a similar discreet relaxation is observed in arteries with and without endothelium. This fact may be related to its calcium channel blocking properties 25.

Although hypotension after the intravenous use of amiodarone is a well-known side effect 2,3,26, several mechanisms may be involved in vivo, in addition to the release of endothelial relaxing factors. Amiodarone has been shown to cause a reduction in cardiac performance or to induce a state of low peripheral vascular resistance due to an alpha-adrenergic blocking effect 27,28. In addition, polysorbate, present in the commercial formulation of amiodarone, may cause the release of histamine 9, and result in hypotension.

In conclusion, our results show that vasodilation promoted by amiodarone in canine coronary arteries is mainly caused by the stimulation of the release of nitric oxide and cyclooxygenase-dependent endothelial relaxing factors.

References