OBJETIVO: Avaliar os efeitos do lisinopril (L) sobre as taxas de mortes (M), insuficiência cardíaca (ICC), características da remodelação miocárdica, geométrica e funcional do ventrículo esquerdo (VE), em ratos com estenose aórtica supravalvar (EAS). MÉTODOS: Ratos foram submetidos a EAS ou cirurgia simulada (GC:n=10). Randomizados após 6 semanas para receber L (GL:n=30) ou nenhum tratamento (GE:n=73) sendo avaliados 6s e 21s por estudos ecocardiográfico, hemodinâmico e morfológico concomitantes. RESULTADOS: As taxas de M (GE: 53,9% vs GL: 16,7% e ICC GE: 44,8% vs GL: 20% p<0,05). No final do experimento, os valores da pressão sistólica do VE dos grupos GE e GL foram equivalentes e significantemente mais elevados do que no grupo GC; (p<0,05) não diferindo dos observados 6 semanas após os procedimentos cirúrgicos. Os valores da pressão diastólica do VE no grupo GE foram maiores do que os do grupo GL (p<0,05) sendo ambos maiores do que os do grupo GC (4 ± 2 mmHg, p<0,05). O mesmo comportamento foi observado com as variáveis: razão E/A; índice de massa, área seccional dos miócitos e conteúdo de hidroxiprolina do VE. A porcentagem de encurtamento do VE foi semelhante nos grupos GC e GL (p>0,05) sendo ambos maiores que os verificados no grupo GE. Comportamento semelhante foram obtidos com os valores da primeira derivada positiva e negativa da pressão do VE. CONCLUSÃO: Em ratos com EAS o L reduziu as taxas de M e ICC e exerceu efeitos benéficos sobre a remodelação e a função do VE.
Edson Antonio Bregagnollo; Katashi Okoshi; Isamara Fernanda Bregagnollo; Carlos Roberto Padovani; Marina P. Okoshi; Antonio Carlos Cicogna
Botucatu, SP
Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP - Botucatu - SP
A hipertrofia ventricular esquerda (HVE) é uma resposta adaptativa do coração às sobrecargas sustentadas de trabalho. Dados da literatura1 demonstram que as condições de carga e sistemas neurohumorais, entre os quais se destaca o sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA), modulam as características da hipertrofia ventricular esquerda que se desenvolve na vigência de sobrecargas pressóricas crônicas. Estudos clínicos2,3 evidenciam que os inibidores da enzima de conversão da angiotensina (IECA) melhoram a sobrevivência em pacientes com insuficiência cardíaca, retardam a descompensação cardíaca em pacientes com disfunção ventricular esquerda assintomática e atenuam a progressão da dilatação e disfunção do ventrículo esquerdo após infarto do miocárdio. Estudos experimentais4-6 mostram que os IECA atenuam o remodelamento ventricular, melhoram a sobrevivência e retardam a progressão da disfunção do ventrículo esquerdo em ratos com infarto do miocárdio e em hamster com cardiomiopatia. Também tem sido evidenciado que os IECA regridem a hipertrofia ventricular esquerda em humanos7 e em animais experimentais com sobrecarga pressórica crônica8,9.
Os efeitos favoráveis dos IECA sobre a sobrevivência e regressão da hipertrofia ventricular esquerda na insuficiência cardíaca e hipertensão arterial são freqüentemente atribuídos à interferência com o SRAA sistêmico, resultando em redução da pressão arterial e resistência vascular periférica com consequente redução da sobrecarga cardíaca10. Entretanto diversos estudos10-12 demonstram que a atividade da enzima de conversão da angiotensina (ECA) e o SRAA tecidual miocárdico encontram-se ativados em modelos animais de insuficiência e hipertrofia cardíaca. Embora a eficácia dos IECA em prolongar a sobrevivência, retardar o desenvolvimento de disfunção ventricular e reverter a hipertrofia cardíaca seja amplamente reconhecida, tem sido difícil dissociar os efeitos hemodinâmicos destes agentes sobre a pressão arterial sistêmica dos efeitos do bloqueio da ECA tecidual miocárdica. Assim, o uso dos IECA na hipertensão arterial, infarto agudo do miocárdio e miocardiopatia é claramente fundamentada visto que estas drogas bloqueiam a atividade do SRAA, reduzem a carga cardíaca e revertem a hipertrofia ventricular esquerda. A validade desta estratégia é controversa quando o aumento da carga cardíaca é relativamente fixo, como no caso da estenose aórtica valvar. Nesta circunstância, a redução da hipertrofia ventricular esquerda pode ser vista como perda de mecanismo adaptativo que poderia resultar em desajuste da pós-carga, dilatação e comprometimento da função do ventrículo esquerdo. Alternativamente, desde que a hipertrofia ventricular esquerda é um fator preditivo de morbidade e mortalidade cardiovascular independente de outras condições13 a limitação da resposta hipertrófica do ventrículo esquerdo pode associar-se a efeitos benéficos não relacionados à redução da carga hemodinâmica. Ainda é controverso na literatura8,9,12 se a longo prazo, a interferência dos IECA, sobre a hipertrofia ventricular esquerda na presença de sobrecarga pressórica persistente (SPP), tal como na estenose aórtica, resulta em efeitos benéficos ou adversos sobre a sobrevivência, incidência de insuficiência cardíaca e função do ventrículo esquerdo. Se a ativação do SRAA tecidual cardíaco contribui para o desenvolvimento de hipertrofia ventricular esquerda e subsequente falência miocárdica14-16, a administração crônica de IECA deverá diminuir a extensão da resposta hipertrófica e modificar, favoravelmente, a função ventricular em ratos com hipertrofia ventricular esquerda estabelecida mesmo na vigência de SPP e severa. Os objetivos deste estudo foram avaliar, a longo prazo, os efeitos do lisinopril sobre: a mortalidade, a incidência de insuficiência cardíaca, o remodelamento miocárdico e as funções sistólica e diastólica do ventrículo esquerdo em ratos com hipertrofia ventricular esquerda compensada na presença de SPP desencadeada por estenose aórtica supravalvar.
Neste experimento, a hipertrofia ventricular esquerda foi desencadeada por sobrecarga pressórica persistente promovida pela bandagem da aorta ascendente em ratos machos, da raça Wistar, pesando entre 70 e 90 g, anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/kg – IP) e a seguir, ventilados mecanicamente com oxigênio 100% a 30 cps. Após esternotomia mediana, a aorta ascendente foi dissecada e isolada e um clipe metálico com 0,60 mm de diâmetro interno colocado na aorta imediatamente após a emergência do saco pericárdico. A cavidade torácica foi fechada sendo o esterno, as camadas musculares e a pele reconstruídos por planos. Um grupo de animais foi submetido à cirurgia simulada, na qual eram realizados todos os procedimentos de bandagem aórtica, excetuando-se a colocação do clipe metálico.
Terminados os procedimentos cirúrgicos os ratos foram colocados em caixas plásticas para recuperação com livre acesso à ração e à água, ciclos claro/escuro de 12h e temperatura ambiente controlada (21 a 24oC).
Seis semanas após os procedimentos cirúrgicos foram obtidos ecocardiogramas de todos os ratos submetidos a cirurgia simulada (n=20) ou de bandagem aórtica (n=103). A seguir 10 ratos submetidos à cirurgia simulada e 10 ratos com bandagem aórtica foram randomizados para avaliação hemodinâmica
Para as avaliações ecocardiográfica e hemodinâmica os animais eram anestesiados com ketamina (50 mg/kg) e xylasina (1 mg/kg) administrados por via intramuscular. Utilizando-se ecocardiógrafo Sonos 2000, (Hewlett-Packard) equipado com transdutor de 7,5 MHz, foi obtida imagem bidimensional do menor eixo do ventrículo esquerdo imediatamente abaixo do plano da valva mitral, e realizados registros, em modo-M, das estruturas cardíacas com velocidade de transporte do papel de 100 mm/s. No plano apical quatro câmaras foi obtida curva de velocidade de fluxo diastólico transmitral, posicionando-se a amostra de volume do Doppler pulsátil imediatamente abaixo da face ventricular das cúspides da valva mitral. Em todos os animais incluídos nos grupos foram obtidos registros que permitiram avaliações adequadas dos parâmetros morfológicos e funcionais do ventrículo esquerdo. Posteriormente, os traçados foram calibrados, manualmente com auxílio de paquímetro (precisão de leitura 0,1 mm) utilizando-se pelo menos 3 ciclos cardíacos consecutivos. Esta metodologia já se encontra padronizada em nosso laboratório e apresenta reprodutibilidade e variabilidade comparáveis às referidas na literatura18,19. Após obtenção dos ecocardiogramas, era realizada incisão na linha mediana da parte superior do abdome e o ápex cardíaco palpado. Uma agulha hipodérmica (25x9) conectada a transdutor Stathan P23ID, preenchido com soro fisiológico, era introduzida na cavidade ventricular esquerda através do ápex. Aguardava-se período de aproximadamente 1min para estabilização hemodinâmica, e a seguir obtinha-se registro da pressão ventricular e sua primeira derivada temporal. Para os registros foi utilizado polígrafo Gould Windograf modelo 40–9800–20 sendo 100 mm/s a velocidade de transporte de papel. Traçados representativos dos registros obtidos, encontram-se na
Após registro pressórico os animais foram sacrificados, o tórax aberto e o coração rapidamente removido. Os átrios extirpados e a musculatura ventricular dividida em parede livre do ventrículo direito e massa muscular do ventrículo esquerdo incluindo o septo que foram pesados separadamente. A ponta do ventrículo esquerdo foi utilizada para dosagem do conteúdo de hidroxiprolina de acordo com técnica descrita por Switzer20. Um fragmento da musculatura da parede livre do ventrículo esquerdo foi fixado em formól a 10% e incluído em parafina de onde se obtiveram cortes histológicos com 4 mm de espessura, corados com hematoxilina-eosina e analisados em microscópio óptico (amplificação 40x) acoplado a câmara de vídeo. Com auxílio de microcomputador equipado com programa de análise de imagens (
Nas avaliações realizadas 6 e 21 semanas após os procedimentos cirúrgicos foram estudadas as seguintes variáveis: peso corporal (PC, g); freqüência cardíaca (Fc, bpm); espessura diastólica da parede posterior (EDPP, mm) e diâmetro diastólico (DDVE, mm) do ventrículo esquerdo; porcentagem de encurtamento (DD%); relação entre as velocidades de pico do fluxo transmitral precoce (E) e tardio (A) (relação E/A); pressão sistólica (PSVE, mmHg) e diastólica final (PDFVE, mmHg) do ventrículo esquerdo; 1º derivada positiva (+dP/dt, mmHg/s) e negativa (-dP/dt, mmHg/s) da pressão do ventrículo esquerdo; índice de massa do ventrículo esquerdo (IMVE, mg/g) correspondendo ao peso da massa muscular do VE/PC; conteúdo de hidroxiprolina do ventrículo esquerdo (HPVE, mg%); área seccional transversa dos miócitos do ventrículo esquerdo (AS, mm2); teor de água dos pulmões (H2O P, %) e do fígado (H2O F, %).
Os resultados obtidos nos GC e GE nas avaliações realizadas 6 semanas após cirurgia simulada ou bandagem aórtica foram confrontados para se avaliar o grau de hipertrofia, a severidade da sobrecarga pressórica e a função ventricular esquerda antes do início do tratamento com lisinopril. Os resultados observados nos grupos GC, GE e GL, 21 semanas após os procedimentos cirúrgicos foram comparados para se avaliar os efeitos do tratamento com lisinopril sobre a severidade da sobrecarga pressórica, morfologia e função do ventrículo esquerdo. Em cada grupo, os resultados verificados 6 e 21 semanas após a cirurgia foram comparados para caracterizar a evolução temporal das variáveis analisadas. Dado que os animais com insuficiência cardíaca sabidamente apresentam comprometimento da função ventricular esquerda, neste estudo o confronto dos dados ecocardiográficos, hemodinâmicos e morfológico obtidos 6 e 21 semanas após a cirurgia referem-se apenas aos animais que não apresentavam evidencias de descompensação cardíaca no final do seguimento.
Todos os valores são expressos em média (x) ± desvio padrão (sd). As análises relacionadas com a freqüência de mortes e insuficiência cardíaca no final do experimento foram realizadas pelo teste do qui-quadrado (D2). As análises que confrontaram as variáveis ecocardiográficas, hemodinâmicas e morfológica, avaliadas 6 e 21 semanas após os procedimentos cirúrgicos, foram realizadas pela ANOVA univariada, modelo inteiramente casualizado, complementada com o teste de comparações múltiplas de Bonferroni. O estudo da área seccional dos miócitos e conteúdo de hidroxiprolina do ventrículo esquerdo foi realizado pela ANOVA univariada, inteiramente casualizada, complementada com o teste de Tuckey para as comparações entre todos os pares de médias. Todas as discussões foram realizadas no nível de 5% de significância.
Não houve diferença estatisticamente significante entre os pesos corporais dos animais no momento em que foram incluídos no estudo (GC: 74 ± 6 vs GE: 76 ± 5 vs 73 ± 7 g, p>0,05). Nas avaliações realizadas 6 semanas após a cirurgia não foram encontrados sinais clínicos e morfológicos de descompensação cardíaca nos grupos GC e GE. Em ratos com hipertrofia ventricular esquerda estabelecida, a administração do IECA, lisinopril, durante 15 semanas, reduziu a freqüência de mortes e insuficiência cardíaca. Durante o período de seguimento não houve mortes ou insuficiência cardíaca no GC. No grupo GE (n=63) 34 ratos morreram (53,9%) e dos 27 sobreviventes 13 (44,8%) apresentavam sinais de descompensação cardíaca no final do experimento, enquanto que no grupo GL (n=30) 5 ratos morreram (44,8%) e dos 25 sobreviventes apenas 5 (20%) se encontravam em insuficiência cardíaca, p<0,05 (
Na
Na
Na
Nos modelos animais de hipertrofia ventricular esquerda desencadeada por sobrecarga pressórica, como na estenose aórtica e hipertensão arterial, o remodelamento ventricular consiste em aumento da espessura da parede, aumento do diâmetro dos miócitos e modificações dos componentes intersticiais do miocárdio, incluindo, na maioria das vezes, acúmulo de colágeno miocárdico21-23. Dados da literatura21 evidenciam que ratos espontaneamente hipertensos e ratos submetidos bandagem da aorta torácica apresentam função contrátil, e desempenho ventricular inicialmente normais que no decorrer do tempo evoluem com depressão progressiva do estado contrátil, insuficiência cardíaca e morte prematura. Estes modelos animais são úteis para avaliações, a longo prazo, das características morfológicas, bioquímicas e funcionais da hipertrofia ventricular esquerda bem como o efeito de drogas sobre a mortalidade, o desenvolvimento de hipertrofia ventricular esquerda e insuficiência cardíaca.
Admite-se21,24 que, quando a bandagem aórtica é realizada em ratos jovens, como no nosso estudo, a sobrecarga pressórica inicialmente é leve, acentuando-se progressivamente, à medida que os animais crescem, o que de certo modo se assemelha à estenose aórtica no homem. Neste estudo o período de avaliação de 21 semanas após EAo foi selecionado visto que associa-se com elevadas taxas de mortalidade e engloba a transição para descompensação cardíaca com alterações na reprogramação gênica14,21.
Os resultados obtidos nas avaliações ecocardiográfica (
Nas sobrecargas pressóricas sustentadas, o crescimento e a função do miocárdio são modulados pelas características da carga e por sistemas neurohumorais, dentre os quais se destaca a SRAA. Neste sentido, o modelo de bandagem da aorta ascendente, é adequado para se dissociar os efeitos relacionados com a inibição do SRAA tecidual miocárdico daqueles associados com a redução da carga hemodinâmica. Os resultados observados evidenciaram que a inibição crônica da ECA com lisinopril reduz a mortalidade, retarda a transição para a insuficiência cardíaca, altera favoravelmente o remodelamento miocárdico e atenua o grau de comprometimento das funções sistólica e diastólica do ventrículo esquerdo mesmo na vigência de sobrecarga pressórica.
Diversos fatores podem ter contribuído para redução da mortalidade nos ratos tratados com lisinopril. A maior freqüência de mortes nos ratos do grupo GE pode estar associada ao desenvolvimento de disfunção ventricular esquerda mais precoce e severa que a verificada no grupo GL. A constatação do maior comprometimento da função sistólica e diastólica do ventrículo esquerdo e maior incidência de insuficiência cardíaca no grupo GE verificadas no final do seguimento reforçaram este aspecto. Outra possibilidade para redução da mortalidade no grupo tratado é que a inibição da ECA preveniu as mortes prematuras decorrentes de arritmias desencadeadas por isquemia miocárdica. Estudos25-27 apontam que, neste modelo a reserva coronariana está diminuída, a angiotensina II agrava, os IECA protegem contra arritmias de reperfusão após isquemia miocárdica transitória em ratos26,28 e que a atividade do SRAA tecidual miocárdico encontra-se exacerbada12,21,29.
Antes do início do tratamento, os animais do grupo GE apresentavam IMVE 34,7% maior que o do grupo GC. No final do experimento a EAo resultou, em relação ao GC, em aumentos de 68% e 36% nos valores do IMVE nos grupos GE e GL respectivamente, o que representa uma diferença de 52,9% no grau de HVE. Em relação às dimensões dos miócitos observamos aumentos de 64% e 31% nos valores da AS o que representa diferença de 51% entre os grupos GE e GL.
Considerando-se que nos animais não tratados os valores do IMVE aumentaram e que nos animais tratados com lisinopril os valores do IMVE se equivaleram, nas avaliações realizadas 6 e 21 semanas após a bandagem aórtica, é licito admitir que o tratamento com lisinopril evitou a acentuação do grau de HVE (
As dosagens de HPVE evidenciaram que o tratamento com lisinopril reduziu o acúmulo de colágeno miocárdico. Estes resultados são concordantes com as proposições da literatura que apontam a participação da angiotensina II entre os principais mecanismos envolvidos no acúmulo de colágeno miocárdico30,31.
Neste estudo ficou evidenciado que a administração de lisinopril em ratos com EAo previne o aumento da extensão da hipertrofia ventricular e reduz o acúmulo de colágeno miocárdico mesmo na vigência de SPP. Estes resultados suportam a proposição que a sobrecarga pressórica isoladamente não é o único fator determinante da remodelação cardíaca. Nas condições experimentais vigentes é possível inferir que o SRAA tecidual miocárdico também participa sendo responsável, pelo menos em parte, pelo desenvolvimento do remodelamento patológico que culmina com disfunção ventricular esquerda progressiva. O menor grau de hipertrofia, disfunção ventricular esquerda, e acúmulo de colágeno miocárdico evidenciados no final do experimento nos animais tratados com lisinopril suportam estes aspectos.
Atualmente parece claro que o crescimento cardíaco pode ser modulado por modificações na carga e ativação neuro-humoral1-9,10,11,21,29. Estudos em animais submetidos a bandagem proximal da aorta ou artéria pulmonar, simultaneamente tratados com agentes que modulam a atividade do SRAA, obtiveram resultados conflitantes24,32-36. Dos 6 estudos analisados três não evidenciaram nenhum efeito do bloqueio do SRAA sobre a extensão da hipertrofia ventricular esquerda ou direita34-36 e, em três, o bloqueio do SRAA reduziu ou preveniu a hipertrofia ventricular24,32,33. A importância da sobrecarga hemodinâmica não deve ser minimizada dado que em recente estudo37 ficou evidenciado que a remoção da sobrecarga pressórica, promovida pela bandagem da aorta torácica em cobaias resulta em reversão completa da hipertrofia e da função ventricular esquerda. Nossos resultados sugerem que o bloqueio do SRAA reduz a extensão da hipertrofia ventricular esquerda mesmo na vigência de sobrecarga pressórica sustentada, presença de SPP. Outros mecanismos neuro-humorais podem ter participado do remodelamento cardíaco observada neste estudo. A angiotensina II aumenta a liberação de neurotransmissores simpáticos e a menor extensão da hipertrofia ventricular esquerda nos animais tratados com lisinopril poderia estar relacionada em parte com a redução do efeito trófico decorrente da estimulação simpática sobre o crescimento do miócito1,8-10.
No final do experimento, ficou evidenciado que na vigência de sobrecarga pressórica severa e equivalente nos animais dos grupos GE e GL, a incidência de insuficiência cardíaca foi 2,8 vezes menor nos ratos tratados, evidenciando assim que a inibição crônica da ECA com lisinopril resultou em redução significativa da incidência de insuficiência cardíaca e por conseguinte atenuou o comprometimento da função cardíaca. Os resultados dos indicadores da função sistólica (+dP/dt, DD%) e diastólica (PDFVE, relação E/A e –dP/dt) dos ratos que não se encontravam em insuficiência cardíaca mostraram que o tratamento com lisinopril exerceu efeitos benéficos promovendo preservação da função sistólica e atenuando o comprometimento da função diastólica do ventrículo esquerdo.
Embora o remodelamento miocárdico possa ser considerado como mecanismo adaptativo no sentido de preservar a função ventricular, o processo pode tornar-se mal adaptativo quando o estímulo desencadeante é patológico e contínuo, como se observa na estenose aórtica e hipertensão arterial. Nestas condições o remodelamento miocárdico contínuo, habitualmente evolui, em tempo variável, com disfunção ventricular progressiva, que culmina com insuficiência cardíaca e morte prematura, se o processo não for efetivamente contraposto o mais precocemente possível.
Diversas características que ocorrem durante o processo de remodelamento cardíaco desencadeado por sobrecarga pressórica são apontados na literatura16,29,30,38-43, como participantes do comprometimento funcional do coração, entre os quais se destacam: alterações fenotípicas devido a reexpressão de genes que codificam a síntese de proteínas miocárdicas com características fetais; hipertrofia dos miócitos, acúmulo de fibrose miocárdica, déficit de vasos sangüíneos e redução da reserva coronariana, déficit de mitocôndrias, defeitos no ciclo do cálcio, síntese de miosinas com menor atividade ATPásica e morte de miócitos devido a necrose e/ou apoptose.
Neste estudo ficou evidenciado que os efeitos benéficos do lisinopril sobre o remodelamento e a função ventricular esquerda não dependeram da redução das condições de carga ou da freqüência cardíaca, equivalentes nos ratos tratado e não tratados. Assim, se os efeitos benéficos da inibição da ECA não foram devidos à melhora das condições de carga e o tratamento com lisinopril preveniu a deterioração da função cardíaca, mesmo na presença de um menor grau de hipertrofia cardíaca no final do seguimento, mecanismos alternativos pelos quais a inibição da ECA preserva a contratilidade necessitam ser considerados. Estudos experimentais44-48 evidenciam que o tratamento com IECA melhora a resposta contrátil ao cálcio extracelular em ratos com bandagem aórtica24,47 ou infarto agudo do miocárdio46. Existem também evidências de que os IECA reduzem a apoptose na hipertrofia ventricular esquerda desencadeada por sobrecarga pressórica48. Assim, outro possível emprego dos IECA na estenose aórtica poderia ser a redução da perda de miócitos funcionantes devido à apoptose e/ou necrose mediada pela angiotensina II.
O papel emergente da matriz extracelular no processo de remodelamento miocárdico pode ser evidenciado em diferentes modelos animais de hipertrofia ventricular esquerda desencadeada por sobrecarga pressórica23,30,31,41-43. De modo simplificado, tem sido proposto que a fibrose intersticial excessiva pode virtualmente estrangular o coração, inicialmente na diástole e tardiamente na sístole. Os encontros de maior comprometimento da função sistólica e diastólica do ventrículo esquerdo e acúmulo de colágeno miocárdico nos ratos do grupo GE e a preservação da função sistólica, atenuação do comprometimento da função diastólica e redução do conteúdo de hidroxiprolina no ventrículo esquerdo no grupo GL, estão de acordo com as proposições de que a matriz colágena do miocárdio também participa da disfunção ventricular.
Diversos estudos e revisões da literatura apontam que o tratamento com IECA pode modificar favoravelmente a capacidade contrátil do miocárdio e reduzir o acúmulo de colágeno miocárdico6,8,21,24,29,30,34,43-45 . Neste estudo não é possível destacar os mecanismos responsáveis pela preservação da função sistólica e pela atenuação do comprometimento da função diastólica nos ratos tratados com o lisinopril. O menor comprometimento da função diastólica observado nos ratos tratados com lisinopril pode ser devido ao menor comprometimento da distensibilidade miocárdica decorrente da hipertrofia ventricular esquerda menos acentuada e/ou menor acúmulo de colágeno miocárdico23,30,41-43,48. Alternativamente, a atenuação do comprometimento da função distólica do ventrículo esquerdo observada no grupo GL poderia ser devida aos efeitos do bloqueio ou redução da angiotensina II produzida localmente pelo SRAA tecidual miocárdico11,16,49,50. Trabalhos da literatura49,50 apontam que na presença de hipertrofia ventricular esquerda a ativação da AII intracardíaca retarda e lentifica o relaxamento49 e que a administração endovenosa de IECA em pacientes com EAo grave50 melhoram a distensibilidade e o relaxamento miocárdico. Assim, com base nos resultados observados é pertinente inferir que o SRAA é responsável, pelo menos em parte, pelo advento da hipertrofia cardíaca patológica, com conseqüente disfunção sistólica e diastólica do ventrículo esquerdo, descompensação cardíaca e morte prematura por mecanismos distintos daqueles relacionados com a elevação da pressão arterial e com o grau de hipertrofia ventricular esquerda.
Nossos achados fornecem suporte experimental que apóiam a idéia de que, o uso de IECA pode exercer efeitos favoráveis em pacientes com estenose aórtica para os quais ainda não existe tratamento clínico que, comprovadamente, modifique a história natural da doença. Cabe no entanto ressaltar embora no modelo experimental deste estudo, a sobrecarga pressórica para o ventrículo esquerdo seja sustentada tal como acontece na EAo em humanos, a bandagem aórtica é colocada distalmente aos óstios das coronárias e, portanto, a circulação coronariana está exposta às mesmas pressões elevadas vigentes na cavidade ventricular esquerda. Assim, embora estudos experimentais8,21,24,39,41,43 sugiram que os IECA possam exercer efeitos benéficos em pacientes com estenose aórtica, devemos reconhecer os perigos potenciais para o uso até que estudos clínicos demonstrem claramente os benefícios desta terapêutica neste grupo de pacientes, principalmente naqueles com estenose aórtica grave e/ou disfunção ventricular esquerda.
Aos Srs. Alexandre Luís Loureiro e Mario Augusto Dallaqua, pela digitação e editoração do texto e ao Sr. Vitor Marcos de Souza pela assistência técnica.
Endereço para correspondência Dr. Edson Bregagnollo Faculdade de Medicina - Clínica Médica - Rubião Junior Cep 18618-970 Botucatu - SP E-mail:
Recebido em 23/07/02 - Aceito em 04/05/04
OBJECTIVE: To assess the effects of lisinopril (L) on mortality (M) rate and congestive heart failure (CHF), and the characteristics of geometrical myocardial remodeling and left ventricular function in rats with supravalvular aortic stenosis (SAS). METHODS: Some Wistar rats underwent SAS or the simulated surgery (CG, n=10). After 6 weeks, the animals were randomized to receive lisinopril (LG, n=30) or no treatment (SG, n=73) for 15 weeks. Cardiac remodeling was assessed in the sixth and 21st weeks after the surgical procedures through concomitant echocardiographic, hemodynamic, and morphological studies. RESULTS: The M were 53.9% and 16.7% in SG and LG, respectively; the incidence of CHF was 44.8% and 20%, in SG and LG, respectively, (P<0.05). At the end of the experiment, the values of LV systolic pressure in SG and LG were equivalent and significantly greater than those in CG;(P<0.05) and did not differ from those observed 6 weeks after the surgical procedures. The values of LV diastolic pressure in SG were greater than those in LG;(P<0.05), and both were greater than those in CG;(P<0.05). The same behavior was observed with the following variables: E/A ratio; mass index; sectional area of the myocytes; and LV hydroxyproline content. Left ventricular shortening percentage was similar in CG and LG;(P>0.05), and both were greater than those in SG;(P<0.05). Similar results were obtained with the values of the positive and negative first derivate of LV pressure. CONCLUSION: In rats with SAS, the treatment with L reduced M rate and ICC and had beneficial effects on geometrical myocardial remodeling and left ventricular function.
Effects of the prolonged inhibition of the angiotensin-converting enzyme on the morphological and functional characteristics of left ventricular hypertrophy in rats with persistent pressure overload
Edson Antonio Bregagnollo; Katashi Okoshi; Isamara Fernanda Bregagnollo; Carlos Roberto Padovani; Marina P. Okoshi; Antonio Carlos Cicogna
Botucatu, SP - Brazil
Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP
Left ventricular hypertrophy (LVH) is an adaptive response of the heart to sustained work overload. Data in the literature 1 have shown that the load conditions and neurohumoral systems, among which the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) stands out, modulate the characteristics of left ventricular hypertrophy that develop in the presence of chronic pressure overload. Clinical studies 2,3 have shown that angiotensin-converting enzyme inhibitors (ACEI) improve the survival of patients with heart failure, delay heart decompensation in patients with asymptomatic left ventricular dysfunction, and attenuate the progression of left ventricular dilation and dysfunction after myocardial infarction. Experimental studies 4-6 have shown that ACEIs attenuate ventricular remodeling, improve survival, and delay the progression of left ventricular dysfunction in rats with myocardial infarction and hamsters with cardiomyopathy. Angiotensin-converting enzyme inhibitors have also been proved to decrease left ventricular hypertrophy in human beings 7 and in experimental animals with chronic pressure overload 8,9.
The favorable effects of ACEI on survival and regression of left ventricular hypertrophy in heart failure and arterial hypertension are frequently attributed to interference with the RAAS, resulting in a reduction in blood pressure and peripheral vascular resistance with a consequent reduction in cardiac overload 10. However, several studies 10-12 have reported that the angiotensin-converting enzyme (ACE) and the myocardial tissue RAAS are activated in animal models of heart failure and cardiac hypertrophy. Although the efficacy of the ACEI in prolonging survival, delaying the development of ventricular dysfunction, and reversing cardiac hypertrophy is widely recognized, it has been difficult to dissociate the hemodynamic effects of those agents on systemic blood pressure from the effects of the myocardial tissue ACE blockade. Therefore, the use of ACEI in arterial hypertension, acute myocardial infarction, and cardiomyopathy is clearly justified, because those drugs block RAAS activity, reduce cardiac load, and reverse left ventricular hypertrophy. The validity of that strategy is controversial when the increase in cardiac load is relatively fixed, as in the case of aortic valvular stenosis. In that circumstance, the reduction in left ventricular hypertrophy may be seen as a loss of the adaptive mechanism that can result in maladjustment of the afterload, and dilation and impairment of left ventricular function. Alternatively, because left ventricular hypertrophy is a predictive factor of cardiovascular morbidity and mortality independent of other conditions 13, the limitation of the left ventricular hypertrophic response may be associated with beneficial effects not related to the reduction in hemodynamic load. Controversy still exists in the literature 8,9,12 about whether in the long run the influence of the ACEI on left ventricular hypertrophy in the presence of persistent pressure overload (PPO), such as aortic stenosis, results in beneficial or adverse effects on survival, incidence of heart failure, and left ventricular function. If the activation of the cardiac tissue RAAS contributes to the development of left ventricular hypertrophy and subsequent myocardial failure 14-16, the chronic administration of ACEI should decrease the extension of the hypertrophic response and favorably modify the ventricular function in rats with established left ventricular hypertrophy even in the presence of severe PPO.
This study aimed at assessing the long-term effects of lisinopril on mortality, incidence of heart failure, myocardial remodeling, and left ventricular systolic and diastolic functions in rats with compensated left ventricular hypertrophy in the presence of PPO caused by supravalvular aortic stenosis.
In this experiment, left ventricular hypertrophy was caused by persistent pressure overload caused by ascending aortic banding in male Wistar rats, weighing between 70 and 90 g, which were anesthetized with sodium pentobarbital (50 mg/kg – IP), and then mechanically ventilated with 100% oxygen at 30 cps. After a median sternotomy, the ascending aorta was dissected and isolated with a 0.60-mm inner diameter metallic clip placed in the aorta immediately after the pericardial sac emergence. The thoracic cavity was closed, and the sternum, the muscle layers, and the skin were reconstructed in planes. Another group of animals underwent simulated surgery, in which all the procedures of aortic banding were performed, except for placement of the metallic clip.
After the surgical procedure, the rats were placed in plastic boxes for recovery, with free access to food preparation and water, 12-hour lightness/darkness cycles, and controlled environmental temperature (21 to 24oC).
Six weeks after the surgical procedures, all rats that had undergone simulated surgery (n=20) or aortic banding (n=103) underwent echocardiography. Then, 10 rats that had undergone simulated surgery and 10 rats with aortic banding were randomized for in vivo hemodynamic assessment, being later sacrificed for morphological study. Their results represent the baseline conditions before the beginning of the observation period. The remaining rats with aortic stenosis were randomized to receive lisinopril or no treatment for 15 consecutive weeks. Three experimental groups were constituted as follows: control group (CG; n=10), comprising rats that had undergone simulated surgery; aortic stenosis group (SG; n=63), comprising rats with aortic banding that had not undergone treatment; and lisinopril group (LG; n=30), comprising rats with aortic stenosis that received lisinopril orally (20 mg/kg/day) dissolved into the water of the cages. The control of the dose ingested was performed daily by measuring the water volume drunk by each animal. That dose has antiproliferative and antihypertensive effects 17. In the period from 6 to 21 weeks, the animals were assessed daily and the deaths recorded. Twenty-one weeks after the surgical procedures, all animals underwent new echocardiographic, hemodynamic, and morphological assessments, including measurement of the left ventricular hydroxyproline content, and, at the end of follow-up, the presence of heart failure was assessed. The clinical signs of heart failure were tachypnea, edema, ascites, pleural or pericardial effusion, or both. The morphological signs of heart failure were the presence of left atrial thrombus and water content in the lungs and liver. The criteria for diagnosing heart failure were as follows: animals with one clinical sign; one clinical sign + morphological sign; and 2 or more morphological signs.
For the echocardiographic and hemodynamic assessments, the animals were anesthetized with ketamine (50 mg/kg) and xylazine (1 mg/kg) administered intramuscularly. A Sonos 2000 echocardiographic device (Hewlett-Packard) equipped with a 7.5-MHz transducer was used for obtaining the 2-dimensional image of the smaller left ventricular axis immediately below the mitral valve plane. M-mode recordings of the cardiac structures were performed with paper transportation velocity of 100 mm/s. A curve of transmitral diastolic flow velocity in the apical 4-chamber plane was obtained by positioning the volume sample of pulsatile Doppler immediately below the ventricular face of the leaflets of the mitral valve. Recordings allowing adequate evaluations of the morphological and functional left ventricular parameters were obtained in all animals. Later, the tracings were manually calibrated with the aid of a pachymeter (reading accuracy, 0.1 mm) and using at least 3 consecutive cardiac cycles. This methodology has already been standardized in our laboratory and has reproducibility and variability comparable to those reported in the literature 18,19. After the echocardiography, an incision was made in the median line of the upper abdomen, and the cardiac apex was palpated. A hypodermal needle (25x9) was connected to a Stathan P23ID transducer filled with saline solution, and introduced into the left ventricular cavity through the apex. Approximately 1minute was allowed for hemodynamic stabilization, after which recordings of the ventricular pressure and its first temporal derivate were obtained. A Gould Windograf polygraph, model 40–9800–20, was used for recordings, at a paper transportation velocity of 100 mm/s.
After blood pressure recording, the animals were sacrificed, their chests opened, and their hearts were rapidly removed. The atria were extirpated, and the ventricular musculature was divided into right ventricular smooth wall and left ventricular muscular mass, including the septum. Those structures were separately weighed. The left ventricular tip was used for measuring the hydroxyproline content, according to the technique described by Switzer 20. A fragment of the musculature of the left ventricular free wall was fixed in 10% formalin and embedded in paraffin, and, then, cut into 4-mm histological sections that were stained with hematoxylin-eosin and analyzed under optical microscopy (40x magnification) coupled to a video camera. With the aid of a microcomputer equipped with an image analysis program (IMAGE-PRO PLUS 3.0, Media Cybernetics, Silverspring Maryland, USA), the sectional area of the myocytes was measured and used as an indicator of cell size. In each animal, at least 50 myocytes transversely cut with a clearly central nucleus were measured. Fragments of the lungs and liver were weighed and then put to dehydrate at 70oC for 96 hours, and, then, weighed again, enabling the determination of the water content of those organs.
In the assessments performed 6 and 21 weeks after the surgical procedures, the following variables were analyzed: body weight (BW, g); heart rate (HR, bpm); diastolic thickness of the left ventricular posterior wall (DTPW, mm); left ventricular diastolic diameter (LVDD, mm); shortening percentage (DD %); ratio between the peak velocities of the early (E) and late (A) transmitral flow (E/A ratio); left ventricular systolic (LVSP, mmHg) and end-diastolic (LVEDP, mmHg) pressures; positive (+dP/dt, mmHg/s) and negative (-dP/dt, mmHg/s) first derivate of left ventricular pressure; left ventricular mass index (LVMI, mg/g), corresponding to the weight of the left ventricular muscular mass divided by body weight; left ventricular hydroxyproline content (LVHP, mg%); sectional area of left ventricular myocytes (SA, mm2); water content of the lungs (H2O Lu, %) and liver (H2O Li, %).
The results obtained in CG and SG in the evaluation performed 6 weeks after the simulated surgery or aortic banding were compared for assessing the degree of hypertrophy, the severity of pressure overload, and the left ventricular function before starting the treatment with lisinopril. The results obtained in CG, SG, and LG 21 weeks after the surgical procedures were compared for assessing the effects of the treatment with lisinopril on the severity of left ventricular pressure overload, morphology, and function. In each group, the results obtained 6 and 21 weeks after surgery were compared for characterizing the temporal evolution of the variables analyzed. Considering that the animals with heart failure are known to have impaired left ventricular function, in this study, the analysis of the echocardiographic, hemodynamic and morphological data obtained 6 and 21 weeks after surgery refer only to those animals with no evidence of heart decompensation at the end of follow-up.
All values are expressed as mean (x) ± standard deviation (sd). The analyses related to the frequency of death and heart failure at the end of the experiment were performed with the chi-square (c2) test. The analyses of the echocardiographic, hemodynamic, and morphological variables assessed 6 and 21 weeks after the surgical procedures were performed with univariate ANOVA, an entirely casual model, complemented with the Bonferroni multiple comparisons test. The study of the sectional area of the myocytes and left ventricular hydroxyproline content was performed with the univariate ANOVA, an entirely casual model, complemented with the Tukey test for the comparisons between all pairs of means. The significance level adopted was 5%.
No statistically significant difference was observed in the body weights of the animals at the time they were included in the study (CG: 74 ± 6 vs SG: 76 ± 5 vs 73 ± 7 g; P>0.05). In the assessments performed 6 weeks after the surgery, neither clinical nor morphological signs of heart decompensation were found in CG and SG. In rats with established left ventricular hypertrophy, the administration of the ACEI, lisinopril, for 15 weeks reduced the frequency of deaths and heart failure. During the follow-up period, neither death nor heart failure was observed in CG. In SG (n=63), 34 rats died (53.9%) and, of the 27 survivors, 13 (44.8%) had signs of cardiac decompensation at the end of the experiment. In LG (n=30), 5 rats (44.8%) died, and, of the 25 survivors, only 5 (20%) had heart failure, P<0.05 (
In the animal models of left ventricular hypertrophy triggered by pressure overload, such as aortic stenosis and arterial hypertension, ventricular remodeling consists of an increase in the thickness of the wall, an increase in the diameter of the myocytes, and changes in the myocardial interstitial components, which most of the time include accumulation of myocardial collagen 21-23. Data in the literature 21 have shown that spontaneously hypertensive rats and those undergoing banding of the thoracic aorta have initially normal contractile function and ventricular performance, which evolve to progressive depression of the contractile status, heart failure, and early death. These animal models are useful for long-term evaluations of the morphological, biochemical, and functional characteristics of left ventricular hypertrophy, as well as the assessment of the drug effect on mortality, left ventricular hypertrophy development, and heart failure.
When the aortic banding is performed in young rats, such as in our study, pressure overload is admittedly 21,24 mild initially and progressively increases as the animals grow, which, in a way, is similar to aortic stenosis in men. In this study, the assessment period of 21 weeks after AoS was chosen because it was associated with a high mortality rate, encompassing the transition to cardiac decompensation with alterations in gene reprogramming 14,21.
The results obtained in the echocardiographic (
In sustained pressure overloads, myocardial growth and function are modulated by the characteristics of the load and neurohumoral systems, of which, the RAAS stands out. The ascending aortic banding model is adequate for separating the effects related to the myocardial tissue RAAS inhibition from those associated with the reduction in the hemodynamic load. The results observed showed that chronic ACE inhibition with lisinopril reduces mortality, delays the transition to heart failure, favorably alters myocardial remodeling, and attenuates the degree of impairment of the left ventricular systolic and diastolic functions even in the presence of pressure overload.
Several factors may have contributed to the reduction in mortality in rats treated with lisinopril. The greatest frequency of deaths in the SG rats may be associated with the development of an earlier and more severe left ventricular dysfunction than that observed in the LG group. The greater impairment in left ventricular systolic and diastolic function and greater incidence of heart failure in SG observed at the end of the experiment reinforce that aspect. Another possibility for reducing mortality in the group treated is that ACE inhibition prevented the early deaths due to the arrhythmias triggered by myocardial ischemia. Several studies 25-27 have reported that, in that model, the coronary reserve is decreased, angiotensin II worsens and ACEIs protect against arrhythmias of reperfusion after transient myocardial ischemia in rats 26,28, and the myocardial tissue RAAS activity is exacerbated 12,21,29.
Before treatment, the SG animals had a 34.7% greater LVMI than that of the CG animals. At the end of the experiment, AoS caused 68% and 36% increases in the LVMI in SG and LG, respectively, as compared with that in CG. This represents a difference of 52.9% in the degree of LVHR. Regarding the dimensions of myocytes, 64% and 31% increases in the SA values were observed, representing a 51% difference between SG and LG.
Considering that, in the assessments performed 6 and 21 weeks after aortic banding, LVMI values increased in nontreated animals and were equivalent in lisinopril-treated animals, one may assume that the treatment with lisinopril prevented the aggravation in the degree of LVH (
The LVHP measurements evidenced that the treatment with lisinopril reduced the accumulation of myocardial collagen. These results are in accordance with the reports in the literature indicating the participation of angiotensin II among the major mechanisms involved in the accumulation of myocardial collagen 30,31.
This study showed that the administration of lisinopril to rats with AoS prevents the increase in ventricular hypertrophy extension and reduces the accumulation of myocardial collagen even in the presence of PPO. These results support the proposition that isolated pressure overload is not the only determining factor of cardiac remodeling. In the present experimental conditions, one may infer that myocardial tissue RAAS also participates, accounting for, at least partially, the development of pathological remodeling that culminates in progressive left ventricular dysfunction. The smaller degree of hypertrophy, left ventricular dysfunction, and accumulation of myocardial collagen evidenced at the end of the experiment in the animals treated with lisinopril support those aspects.
Currently, it seems clear that heart enlargement may be modulated by changes in load and neurohumoral activation 1-9,10,11,21,29. Some studies in animals undergoing banding of the proximal aorta or pulmonary artery simultaneously treated with agents that modulate RAAS activity had controversial results24,32-36. Of the 6 studies analyzed, 3 showed no effect of RAAS blockage on the extension of left or right ventricular hypertrophy34-36, and 3 showed that RAAS blockage reduced or prevented ventricular hypertrophy24,32,33. The importance of the hemodynamic overload should not be minimized, because a recent study 37 showed that the removal of pressure overload promoted by banding of the thoracic aorta in guinea pigs resulted in complete reversion of left ventricular hypertrophy and function. Our results suggest that the RAAS blockage reduces the extension of left ventricular hypertrophy even in the presence of persistent pressure overload, PPO. Other neurohumoral mechanisms may have participated in the cardiac remodeling observed in this study. Angiotensin II increases the release of sympathetic neurotransmitters, and the smaller extension of left ventricular hypertrophy in animals treated with lisinopril could be partially related to the reduction in the trophic effect due to the sympathetic stimulation of the myocyte growth 1,8-10.
At the end of the experiment, in the presence of severe and equivalent pressure overload in SG and LG animals, the incidence of heart failure was 2.8 times smaller in treated rats. This showed that chronic ACE inhibition with lisinopril resulted in a significant reduction in the incidence of heart failure, and, therefore, attenuated the impairment of heart function. The results of the indicators of systolic (+dP/dt, DD%) and diastolic (LVEDP, E/A ratio, and –dP/dt) function in rats without heart failure showed that treatment with lisinopril was beneficial, promoting preservation of systolic function and attenuating impairment in left ventricular diastolic function.
Although myocardial remodeling may be considered an adaptive mechanism, because it preserves ventricular function, the process may become maladaptive when the triggering stimulus is pathological and continuous, such as in aortic stenosis and arterial hypertension. In such conditions, continuous myocardial remodeling usually evolves, for a variable length of time, with progressive ventricular dysfunction, which culminates in heart failure and early death, if the process is not effectively stopped as early as possible.
Several characteristics that occur during the process of cardiac remodeling triggered by pressure overload have been reported 16,29,30,38-43 as participating in functional cardiac impairment, such as the following: phenotypic changes due to reexpression of genes that codify the synthesis of myocardial proteins with fetal characteristics; hypertrophy of myocytes; accumulation of myocardial fibrosis; blood vessel deficit; reduction in coronary reserve; mitochondrial deficit; defective calcium cycle; synthesis of myosin with lower ATPase activity; and death of myocytes due to necrosis or apoptosis, or both.
This study showed that the beneficial effects of lisinopril on left ventricular remodeling and function did not depend on the reduction in load conditions or heart rate, which were equivalent in treated and nontreated rats. Therefore, if the beneficial effects of ACE inhibition were not due to an improvement in load conditions, and the treatment with lisinopril prevented deterioration of cardiac function, even in the presence of a lower degree of cardiac hypertrophy at the end of follow-up, alternative mechanisms through which the ACE inhibition preserves contractility need to be considered. Experimental studies 44-48 have shown that the treatment with ACEI improves the contractile response to extracellular calcium in rats with aortic banding 24,47 or acute myocardial infarction 46. There is evidence that ACEIs reduce apoptosis in left ventricular hypertrophy triggered by pressure overload 48. Therefore, another possible use of ACEI in aortic stenosis could be to reduce the loss of functioning myocytes due to angiotensin II-mediated apoptosis or necrosis, or both.
The emerging role of extracellular matrix in the process of myocardial remodeling can be evidenced in different animal models of left ventricular hypertrophy triggered by pressure overload 23,30,31,41-43. In a simplified way, it has been proposed that excessive interstitial fibrosis may strangle the heart, initially during diastole, and, later, during systole. The greater impairment in left ventricular systolic and diastolic function and accumulation of myocardial collagen in SG, and the preservation of systolic function, attenuation of diastolic function impairment, and reduction in left ventricular hydroxyproline content in LG rats are in accordance with the propositions that the myocardial collagen matrix also participates in ventricular dysfunction.
Several studies and a literature review indicate that the treatment with ACEI may favorably change myocardial contractile capacity and reduce the accumulation of myocardial collagen 6,8,21,24,29,30,34,43-45. This study could not identify the mechanisms responsible for the preservation of systolic function and for the attenuation of diastolic function impairment in rats treated with lisinopril. The lower diastolic function impairment observed in rats treated with lisinopril may be due to the lower myocardial distensibility impairment resulting from the less marked left ventricular hypertrophy or smaller accumulation of myocardial collagen, or both 23,30,41-43,48. Alternatively, the attenuation of left ventricular diastolic function observed in LG could be due to the blockade or reduction in angiotensin II (AII) locally produced by the myocardial tissue RAAS 11,16,49,50. Some studies 49,50 have reported that, in the presence of left ventricular hypertrophy, the activation of intracardiac AII delays and slows relaxation 49, and that the intravenous administration of ACEI in patients with severe AoS 50 improves myocardial distensibility and relaxation. Therefore, based on the results observed, one may infer that the RAAS accounts for, at least partially, the appearance of pathological cardiac hypertrophy, with consequent left ventricular systolic and diastolic dysfunction, cardiac decompensation, and early death through mechanisms distinct from those related to blood pressure elevation and the degree of left ventricular hypertrophy.
Our findings provide experimental support to the idea that the use of ACEI may have favorable effects in patients with aortic stenosis, for whom no clinical treatment that unquestionably modifies the natural history of the disease is yet available. However, it is worth noting that, although in the experimental model of this study left ventricular pressure overload is sustained, as it is in human AoS, the aortic banding is placed distally to the coronary ostia, and, therefore, coronary circulation is exposed to the same high left ventricular blood pressure levels. Therefore, although experimental studies 8,21,24,39,41,43 have suggested that the ACEI may have beneficial effects on patients with aortic stenosis, we should recognize the potential dangers of their use until clinical studies clearly demonstrate the benefits of that therapy in that group of patients, mainly in those with severe aortic stenosis or left ventricular dysfunction, or both.
We thank Alexandre Luís Loureiro and Mario Augusto Dallaqua for text typing and editoring, and Vitor Marcos de Souza for technical support.
Edson Bregagnollo Faculdade de Medicina Clínica Médica - Rubião Junior Cep 18618-970 Botucatu, SP, Brazil E-mail:
Received for publication: 07/23/02
Accepted for publication: 05/04/04
English version by Stela Maris Costalonga