OBJETIVO: Investigar os efeitos de baixas concentrações de LDL oxidada (LDL-ox) sobre a proliferação e a motilidade espontânea de células endoteliais de artérias coronárias humanas (CEACH) em cultura. MÉTODOS: Culturas de CEACH foram tratadas com baixas concentrações de LDL nativa (LDLn), isolada de plasma humano, e com LDL minimamente oxidada por diferentes métodos químicos, e os efeitos, comparados entre si. RESULTADOS: LDLn não apresentou efeitos deletérios sobre o endotélio em proliferação e na motilidade in vitro de CEACH, porém na mais alta concentração e por tempo mais prolongado inibiu a proliferação celular. As LDL-ox, quimicamente, pela espermina nonoato (ENO) e 3-morfolinosidnonimina (SIN-1) expressaram efeitos inibitórios significativos sobre a proliferação e a motilidade in vitro de CEACH proporcionais às maiores concentrações e graus de oxidação das LDL. CONCLUSÃO: LDL-ox apresenta efeito citotóxico, inibindo a proliferação e a motilidade espontânea de células endoteliais de artérias coronárias humanas em cultura, proporcionalmente à concentração e ao grau de oxidação da LDL, enquanto, LDL nativa é relativamente inócua.
Efeitos da lipoproteína LDL-oxidada sobre a proliferação e a motilidade espontânea
São Paulo, SP
Instituto do Coração da Faculdade de Medicina da USP e Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP
Níveis plasmáticos elevados de lipoproteína de baixa densidade (LDL) são considerados um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento de doença aterosclerótica cardiovascular. A hipótese da resposta à injúria da aterosclerose propõe que o primeiro passo na aterogênese é a disfunção endotelial induzida pela ação dos fatores de risco, em especial, pela exposição do endotélio vascular à LDL oxidada (LDL-ox)1.
Estudos preliminares revelaram que preparações de LDL humana isolada exercem efeitos tóxicos sobre células endoteliais em cultura2-4. As LDL nativas (LDLn) sofrem alterações químicas relacionadas com a peroxidação de ácidos graxos polinsaturados, constituintes da lipoproteína, que resultam em um grande aumento na sua susceptibilidade à fagocitose e à degradação por macrófagos5.
Foi demonstrado
Estudos recentes demonstraram que os componentes lipídicos da LDL-ox8,9 causariam um aumento parodoxal na produção do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) por células endoteliais em cultura, um provável mecanismo protetor frente à agressão celular. Foi observado um duplo efeito da LDL-ox, induzindo proliferação celular em baixas concentrações (5 a 10 mg/mL) e apoptose em concentrações acima de 50 mg/mL10.
As células endoteliais constituem uma população heterogênea. Células endoteliais oriundas de diversos leitos vasculares expressam antígenos de superfície característicos, transportadores intracelulares específicos e regulação de enzimas intracelulares diferentes 11.
Considerando a importância da heterogeneidade da célula endotelial, os dados contraditórios da literatura e visando contribuir para um melhor entendimento dos processos básicos que envolvem a interação LDL-ox e célula endotelial, realizamos o primeiro estudo sistematizado utilizando células endoteliais de artérias coronárias humanas (CEACH) em cultura, cujo papel na aterogênese coronária é primordial.
Investigamos e descrevemos os efeitos de baixas concentrações das lipoproteínas LDLn e LDL-ox quimicamente por diferentes métodos e tempos de oxidação sobre a proliferação celular e a motilidade espontânea
Utilizamos a linhagem celular de células endoteliais de artérias coronárias humanas obtidas através da CLONETICS (
A contagem de células para a avaliação da proliferação e migração celular foi feita sob microscopia direta (Nikon-TMS) com aumento de 100 vezes e realizada em três campos microscópicos distintos representativos para cada placa e calculada a média de células visualizadas.
O ensaio de migração celular foi realizado de acordo com o modelo de cicatrização
Após 24h de incubação, contamos o número de núcleos celulares que cruzaram a linha demarcada na placa, em três campos microscópicos distintos representativos para cada placa e calculamos a média de células que ultrapassaram a linha demarcada.
A purificação da LDLn foi feita a partir do plasma humano utilizando-se o método descrito por Sevanian e cols13. A LDLn foi armazenada em temperatura inferior a -70ºC até o momento da sua utilização.
As amostras de LDL (0,5 mg/ml de proteína) foram submetidas à oxidação com 1,0 mM de 3-morfolinosidnonimina (SIN-1) ou 1,0 mM de esperminanonoato (ENO) (SIGMA). As amostras foram incubadas em banho-maria (37ºC) sob agitação constante nos tempos 1, 5, 10, 15, 30, e 60min. A reação foi bloqueada com 100 mM de ácido dietileno tetraminopentacético, 100 mM de butilhidroxitolueno, 125 unidades/ml de superóxido dismutase e 125 unidades/ml de catalase. Todas as amostras foram mantidas em freezer a -20ºC até o momento dos experimentos14.
Na análise estatística, para a comparação das concentrações foi utilizado o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis, considerado o mais eficiente para amostras independentes e para as comparações múltiplas foi utilizado o teste de Dunn15. Foram utilizados testes não-paramétricos porque a suposição de normalidade dos dados foi rejeitada. O nível de significância utilizado para os testes foi de 5%.
A
Observamos um efeito inibitório da LDLn sobre a proliferação celular na concentração máxima utilizada, o que pode ser explicado pelo maior tempo de exposição e à oxidação da LDL pelas próprias células endoteliais em cultura.
Nas
As
Em resumo, os resultados do tratamento de culturas endoteliais parcialmente confluentes, por 72h, com LDLn e LDL-ox pelos sistemas químicos da ENO e SIN-1 sobre a proliferação celular, mostraram que: a LDL oxidada pela ENO e pela SIN-1 exerceram efeito inibitório na proliferação celular proporcional ao tempo de oxidação e à concentração de LDL-ox; a LDL oxidada pela SIN-1 apresentou efeito tóxico mais intenso que os outros tratamentos; a LDLn apresentou efeito inibitório somente na maior concentração estudada.
A
As
A
Em resumo, os resultados do tratamento de culturas endoteliais com LDLn e LDL-ox pelo sistema SIN-1, por 24 horas, na avaliação da motilidade celular, pela técnica de Burk, mostraram que: a LDLn não apresentou efeito inibitório na migração celular; a LDL-ox pela SIN-1 inibiu a migração celular; e o efeito observado foi proporcional ao tempo de oxidação e à concentração de LDL- ox.
Recentemente, estudos têm demonstrado que os produtos de oxidação do colesterol, gerados pela modificação oxidativa da LDL, os hidroperóxidos de colesterol, conferem citotoxicidade à partícula e são relevantes para a patogênese e progressão da aterosclerose tendo sido identificados em placas de ateroma e em plasma humano16,17.
Os mecanismos moleculares que iniciam a oxidação da LDL
As concentrações de LDL-ox comumente utilizadas em experimentos (25 a 100 mg/mL) são consideravelmente mais elevadas do que os níveis de LDL-ox encontrados no plasma humano (0,1 mg/mL)21,22. Devemos considerar, porém, que nas lesões ateroscleróticas a LDL-ox está localizada e concentrada no espaço subendotelial, porque é retida na matriz extracelular durante a formação da placa de ateroma. Assim, grandes quantidades de LDL-ox, em concentrações muito maiores que as plasmáticas, estão acumuladas nessa região. A LDL retida nesse microambiente, ideal para oxidação, é mais intensamente oxidada apresentando características similares às LDL oxidadas pelos diversos sistemas utilizados nos estudos experimentais23.
Neste estudo, optamos por utilizar baixas concentrações (1 a 8 mg/mL) de LDL procurando agregar maior relevância aos nossos resultados em função das concentrações estudadas encontrarem-se mais próximas da situação fisiológica real e assim, investigarmos os seus efeitos biológicos sobre as culturas celulares.
Dados de experimentação obtidos com células endoteliais provenientes de um determinado órgão, não devem ser extrapolados automaticamente para outros sistemas, em decorrência da heterogeneidade dessa linhagem celular. Parte considerável das informações existentes na literatura sobre os complexos mecanismos envolvidos na aterosclerose e na angiogênese humana foi obtida com células endoteliais de cordão umbilical, o que mereceria, portanto, uma certa cautela na interpretação dos resultados: o endotélio do cordão umbilical convive com altíssimas concentrações de hormônios esteróides e baixo regime pressórico, diferentemente do leito endotelial que participa do processo aterosclerótico coronariano11. Por esse motivo, optamos pela utilização em nosso trabalho da linhagem de células endoteliais de artérias coronárias humanas.
Culturas de células endoteliais totalmente confluentes podem servir de modelo para estudos
Em nossos experimentos, observamos que LDL-ox inibiu a proliferação e a motilidade
Recentemente, foi demonstrado pela primeira vez que níveis plasmáticos elevados de LDL-ox se relacionam diretamente com a instabilidade da placa em lesões ateroscleróticas de artérias coronárias humanas. Os níveis de LDL-ox foram dosados em pacientes com infarto agudo do miocárdio, angina instável, angina estável e controles, revelando uma correlação positiva com a gravidade da síndrome coronariana aguda. Os níveis séricos de LDL-ox eram quatro vezes mais elevados nos pacientes com infarto agudo do miocárdio quando comparados aos controles, sugerindo que LDL-ox circulante pode se constituir em um marcador de gravidade em eventos cardiovasculares26.
Considerando os nossos resultados, com a demonstração de que LDL-ox, em concentrações semelhantes às encontradas na fase aguda de síndromes coronarianas, inibe a proliferação e a motilidade de células endoteliais de artérias coronárias humanas
Concluímos, então, que os efeitos da LDL-ox sobre o endotélio coronariano em cultura, inibindo a proliferação e a motilidade celular, mecanismos capitais na reendotelização de áreas lesadas da parede e no processo de angiogênese vascular, são proporcionais à concentração e ao grau de oxidação da LDL e poderíamos ainda, inferir que intervenções clínicas que controlem e preservem a integridade dessas variáveis devam ser perseguidas para minimizar os efeitos deletérios e mudar a história natural da doença arterial coronariana.
A interpretação de nossos dados, porém deve ser feita à luz das limitações inerentes da experimentação
Hermes Toros Xavier Av. Bartolomeu de Gusmão, 178/73 Cep 11030-500 - Santos, SP E-mail:
Recebido para publicação em: 11/06/2003
Aceito em: 14/04/2004
OBJECTIVE: To investigate the effects of low concentrations of oxidized LDL (oxLDL) on the proliferation and spontaneous motility of human coronary artery endothelial cells (HCAEC) in culture. METHODS: Cultures of HCAEC were treated with low concentrations of native LDL (nLDL) isolated from human plasma and with LDL minimally oxidized through different chemical methods; the effects were compared. RESULTS: Native LDL had no deleterious effects on in vitro proliferation and motility of HCAEC; however, at its highest concentration and for a longer exposure, nLDL inhibited cell proliferation. The LDL chemically oxidized by spermine nonoate (SNO) and 3-morpholinylsydnonimine (SYN-1) had significant inhibiting effects on in vitro proliferation and motility of HCAEC, which were proportional to the greatest concentrations and degrees of oxidation of LDL. CONCLUSION: OxLDL has a cytotoxic effect, inhibiting the proliferation and spontaneous motility of HCAEC in culture. This effect is proportional to the concentration and degree of oxidation of LDL; native LDL is relatively innocuous.
Effects of oxidized LDL on in vitro proliferation and spontaneous motility of human coronary artery endothelial cells
São Paulo, SP - Brazil
Instituto do Coração da Faculdade de Medicina da USP and Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP
High plasmatic levels of low-density lipoprotein (LDL) are considered one of the major risk factors for the development of cardiovascular atherosclerotic disease. The hypothesis of response to injury to explain atherosclerosis proposes that the first step in atherogenesis is endothelial dysfunction induced by the action of risk factors, especially the exposure of the vascular endothelium to oxidized LDL (oxLDL) 1.
Preliminary studies revealed that preparations of isolated human LDL have toxic effects on endothelial cells in culture 2-4. Native LDL (nLDL) undergoes chemical alterations related to peroxidation of polyunsaturated fatty acids, components of the lipoprotein, which result in a great increase in its susceptibility to phagocytosis and break down by macrophages 5.
The major types of vascular wall cells, the endothelial cells, the smooth muscle cells, and the macrophages were shown in vitro to be able to oxidize native LDL6. Oxidized LDL inhibits endothelial cell migration, which is an essential mechanism in the processes of reestablishing vascular integrity after injury and angiogenesis, proportionally to the concentration and degree of oxidation of LDL, mediated by the formation of lipid hydroperoxides7.
Recent studies have shown that the lipid components of oxLDL 8,9 can cause a paradoxical increase in the production of vascular endothelial growth factor (VEGF) by endothelial cells in culture, which may be a protective mechanism in face of cellular injury. OxLDL was observed to have a double effect on cell cycle: to induce cell proliferation at low concentrations (5 to 10 mg/mL), and apoptosis at concentrations above 50 mg/mL 10.
The endothelial cells constitute a heterogeneous population. Endothelial cells originating from different vascular beds express characteristic surface antigens, specific intracellular transporters, and regulation of different intracellular enzymes 11.
Considering the importance of endothelial cell heterogeneity and the contradictory data in the literature, and aiming at contributing to a better understanding of the basic processes involved in the interaction between oxLDL and endothelial cell, we carried out the first systematized study using human coronary artery endothelial cells (HCAEC) in culture, whose role in coronary atherogenesis is primordial.
This study aimed at investigating and describing the effects of low concentrations of nLDL and LDL chemically oxidized through different methods and oxidation times on in vitro cell proliferation and spontaneous motility.
This study was performed with the cell line of human coronary artery endothelial cells obtained through CLONETICS (BioWhittaker Inc., Walkersville, MD, USA). The culture medium used was MCDB-131 (GIBCO) with the addition of the following: EGF (INTERGEN), 10 mg/mL; hydrocortisone (SIGMA), 1.0 mg/mL; amphotericin B (GIBCO), 50 mg/mL; penicillin, 100 U/mL; streptomycin (GIBCO), 100 U/mL; and 10% fetal calf serum (GIBCO) with 1 mM L-glutamine (GIBCO). The experiments were performed in culture media with 5% fetal calf serum.
Cell count for assessing cell proliferation and migration was performed under direct microscopy (Nikon-TMS) with a 100X magnification in 3 different representative microscopic fields in each culture plate. The mean of the visualized cells was calculated.
The assay of cell migration was performed according to the model of in vitro healing established by Burk 12. Briefly, the endothelial cells were cultivated in 60-mm culture plates (FALCON) with 5 mL of culture medium and 10% fetal calf serum. Two days after the culture became totally confluent, we created a lesion in the unicellular confluent layer with the aid of a razor blade pressed against the floor of the culture plate, cutting the cell layer and marking the plate. The razor blade was then carefully moved to the side, removing part of the unicellular layer. The cells were twice washed with PBS for removing the cell material pushed aside. Experimental culture medium (5% fetal calf serum) supplemented with variable concentrations of nLDL and oxLDL was added. Four culture plates were used as control or experimental, for each phase of the experiment.
After 24 hours of incubation, the number of cell nuclei that crossed the line demarcated in the culture plate was counted, in 3 distinct microscopic fields representative of each culture plate. The mean number of cells that surpassed the demarcated line was calculated.
nLDL was extracted from human plasma and purified according to the method reported by Sevanian et al 13. nLDL was stored at a temperature lower than -70ºC until its use.
The LDL samples (0.5 mg/mL of protein) underwent oxidation with 1.0 mM of 3-morpholinylsydnonimine (SYN-1) or 1.0 mM of spermine nonoate (SNO) (SIGMA). The samples were incubated in a hot-water bath (37ºC) under constant agitation at the following times: 1, 5, 10, 15, 30, and 60 minutes. The reaction was blocked with 100 mM of diethylene tetramine pentacetic acid, 100 mM of butylhydroxytoluene, 125 units/mL of superoxide dismutase, and 125 units/mL of catalase. All samples were maintained in the freezer at -20ºC until the time of the experiments 14.
In statistical analysis, for comparing the concentrations, the Kruskal-Wallis nonparametric test was used, because it is considered the most efficient test for independent samples, and the Dunn test was used for multiple comparisons 15. Nonparametric tests were used because the supposition of data normality was rejected. The significance level adopted for the tests was 5%.
An inhibiting effect of nLDL was observed on cell proliferation at the maximum concentration used, which may be attributed to the longest exposure and oxLDL by the endothelial cells in culture.
Briefly, the results of the treatment of partially confluent endothelial cell cultures for 72 hours with nLDL and oxLDL by the SNO and SYN-1 chemical systems on cell proliferation were as follows: oxLDL by SNO and SYN-1 had an inhibitory effect on cell proliferation proportional to the duration of oxidation and to the concentration of oxLDL; LDL oxidized by SYN-1 had a more intense toxic effect than the other treatments did; nLDL had an inhibitory effect only at the greatest concentration studied.
Briefly, the effects of the treatment of endothelial cell cultures with native and SYN-1 system oxLDL for 24 hours on cell motility, according to the Burk technique, were as follows: nLDL had no inhibitory effect on cell migration; SYN-1 oxLDL inhibited cell migration; the effect observed was proportional to the duration of oxidation and the concentration of oxLDL.
Recent studies have shown that the products of cholesterol oxidation generated by the oxidative modification of LDL, the cholesterol hydroperoxides, provide cytotoxicity to the particle, are relevant to the pathogenesis and progression of atherosclerosis, and have been identified in atheroma plaques and human plasma 16,17.
The molecular mechanisms that initiate in vivo oxidation of LDL are yet to be identified; however, some chemical substances, such as peroxynitrite, participate effectively in the process of LDL modification, the lipid peroxidation 18. The method of LDL chemical oxidation through 2 systems, SYN-1 and SNO, was used. SYN-1 is known as a generator of peroxynitrite, and its use in the experiments may be justified because the process is slow and constant, and, therefore, more similar to the path of peroxynitrite formation in physiological situations. SYN-1 has a high capacity of oxidation, because it oxidizes both the protein and lipid portions of LDL 19,20. On the other hand, SNO, generator of nitric oxide, has a low oxidation capacity, because it oxidizes only the lipid portion of LDL. Therefore, the generation of products of oxidation by the 2 systems produces an LDL particle with different degrees of oxidation in different sites of the molecule 14.
The concentrations of oxLDL commonly used in the experiments (25 to 100 mg/mL) are considerably more elevated than the levels of oxLDL found in the human plasma (0.1 mg/mL) 21,22. It is worth nothing, however, that, in atherosclerotic lesions, oxLDL is located and concentrated in the subendothelial space, because it is retained in the extracellular matrix during the formation of the atheroma plaque. Therefore, large quantities of oxLDL, in much higher concentrations than the plasmatic ones, accumulate in that region. The LDL retained in that microenvironment, ideal for oxidation, is more intensely oxidized and has characteristics similar to those of LDL oxidized by the different systems used in experimental studies 23.
In this study, we chose to use low concentrations (1 to 8 mg/mL) of LDL aiming at obtaining values closer to those of the real physiological situation, and, therefore, at investigating the biological effects of LDL on cell cultures.
Experimental data obtained with endothelial cells originating from a certain organ should not be automatically extrapolated to other systems, due to the heterogeneity of that cell line. A considerable part of the information in the literature about the complex mechanisms involved in human atherosclerosis and angiogenesis was obtained with endothelial cells of the umbilical cord, which would, therefore, require certain care in interpreting the results. The endothelium of the umbilical cord is submitted to extremely high concentrations of the steroid hormones and low pressure regimen, differently from the endothelial bed that participates in the coronary atherosclerotic process 11. Thus, in our study, we chose to use the human coronary artery endothelial cell line.
Totally confluent endothelial cell cultures may serve as a model for in vitro studies of the vascular endothelium, because the basic properties of the endothelial cell are preserved. The cells in partially confluent culture (60%) are proliferating, and in that phase they are much more sensitive to adverse agents than in the state of plain integrity of total confluence.
In our experiments, oxLDL inhibited in vitro proliferation and motility of human coronary artery endothelial cells, effects directly related to the concentration and degree of oxidation of the lipoprotein. Our results may suggest the occurrence of similar effects of the oxLDL present in vascular walls, atherosclerotic plaques, and even circulating in the plasma, reinforcing the data in the literature that indicate the participation of oxLDL in cardiovascular events 24,25.
Recently, elevated oxLDL plasma levels were shown for the first time to directly relate to plaque instability in atherosclerotic lesions of human coronary arteries. OxLDL levels were measured in patients with acute myocardial infarction, unstable angina, stable angina, and controls, revealing a positive correlation with the severity of acute coronary syndrome. The serum levels of oxLDL were 4 times more elevated in patients with acute myocardial infarction when compared with those of controls, suggesting that circulating oxLDL may be a marker of severity in cardiovascular events 26.
Our results indicate that oxLDL concentrations similar to those found in the acute phase of coronary syndromes inhibit the
In conclusion, the effects of oxLDL on the coronary endothelial cells in culture, inhibiting cell proliferation and motility, capital mechanisms in reendothelization of the injured areas of the wall and in the process of vascular angiogenesis, are proportional to the concentration and degree of oxidation of LDL. One could thus infer that clinical interventions to control and preserve the integrity of these variables should be pursued to minimize the deleterious effects and change the natural history of coronary artery disease.
Our data, however, should be interpreted considering the limitations inherent to in vitro experimentation, which is very valuable in clarifying pathophysiological mechanisms. Nevertheless, our results should not be directly extrapolated to the in vivo situation, upon which innumerous other noncontrolled factors act.
Hermes Toros Xavier Av. Bartolomeu de Gusmão, 178/73 Cep 11030-500 - Santos, SP, Brazil E-mail:
Received for publication: 06/11/2003
Accepted for publication: 04/14/2004
English version by Stela Maris Costalonga