abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil PCMfXQQLg4mhknqV5LJFXHz 00006 S0066-782X2004001800006 S0066-782X(04)08300606 10.1590/S0066-782X2004001800006 Artigos Originais Avaliação da dosagem direta do colesterol-LDL em amostras de sangue de 10.664 pacientes em comparação com o uso da fórmula de Friedewald Cordova Caio Maurício Mendes de Schneider Carlos Rudi Juttel Iara Deise Cordova Maurício Mendes de Universidade Regional de Blumenau Departamento de Ciências Farmacêuticas Brazil Blumenau SC Laboratório Santa Isabel de Análises Clínicas 12 2004 83 6 476 481 18 02 2004 10 09 2003 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

OBJETIVO: Avaliar a dosagem direta do colesterol LDL (LDL-C) por um método homogêneo, em comparação com a estimativa pela fórmula de Friedewald, em uma grande população heterogênea. MÉTODOS: As dosagens do colesterol total (ColT) e dos triglicerídeos (Trig) foram realizadas por métodos enzimáticos tradicionais. As dosagens do HDL-C e do LDL-C foram realizadas por métodos diretos, sem precipitação, e a estimativa da fração LDL-C calculada pela fórmula de Friedewald. RESULTADOS: Por análise de regressão linear, os dois métodos apresentaram coeficientes de correlação extremamente significativos (p<0,001). Entretanto, a fórmula de Friedewald apresentou um bias positivo em relação ao método direto, mais pronunciado com níveis de ColT > 201 mg/dL. Este bias positivo também ocorreu com relação a níveis de Trig < 150 mg/dL. Com níveis de Trig entre 151-200 mg/dL e entre 201-300 mg/dL, não foi observado bias entre os dois métodos. Por outro lado, com níveis de Trig entre 301-400 mg/dL, este bias da fórmula de Friedewald tornou-se negativo. CONCLUSÃO: Foi possível demonstrar que a fórmula de Friedewald não apresenta um desempenho homogêneo para a estimativa do LDL-C em amostras com diferentes níveis de Trig, em comparação com o método direto, podendo causar dúvidas na classificação quanto ao risco de desenvolver doença arterial coronariana.

 colesterol LDL-C LDL direto fórmula de Friedewald 07 01 2005

ARTIGO ORIGINAL

Avaliação da dosagem direta do colesterol-LDL em amostras de sangue de 10.664 pacientes em comparação com o uso da fórmula de Friedewald

Caio Maurício Mendes de Cordova; Carlos Rudi Schneider; Iara Deise Juttel; Maurício Mendes de Cordova

Blumenau, SC

Departamento de Ciências Farmacêuticas/FURB e Laboratório Santa Isabel de Análises Clínicas, Blumenau, SC

Endereço para correspondência

RESUMO

OBJETIVO: Avaliar a dosagem direta do colesterol LDL (LDL-C) por um método homogêneo, em comparação com a estimativa pela fórmula de Friedewald, em uma grande população heterogênea.

MÉTODOS: As dosagens do colesterol total (ColT) e dos triglicerídeos (Trig) foram realizadas por métodos enzimáticos tradicionais. As dosagens do HDL-C e do LDL-C foram realizadas por métodos diretos, sem precipitação, e a estimativa da fração LDL-C calculada pela fórmula de Friedewald.

RESULTADOS: Por análise de regressão linear, os dois métodos apresentaram coeficientes de correlação extremamente significativos (p<0,001). Entretanto, a fórmula de Friedewald apresentou um bias positivo em relação ao método direto, mais pronunciado com níveis de ColT > 201 mg/dL. Este bias positivo também ocorreu com relação a níveis de Trig < 150 mg/dL. Com níveis de Trig entre 151-200 mg/dL e entre 201-300 mg/dL, não foi observado bias entre os dois métodos. Por outro lado, com níveis de Trig entre 301-400 mg/dL, este bias da fórmula de Friedewald tornou-se negativo.

CONCLUSÃO: Foi possível demonstrar que a fórmula de Friedewald não apresenta um desempenho homogêneo para a estimativa do LDL-C em amostras com diferentes níveis de Trig, em comparação com o método direto, podendo causar dúvidas na classificação quanto ao risco de desenvolver doença arterial coronariana.

Palavras-chave: colesterol, LDL-C, LDL direto, fórmula de Friedewald

A doença arterial coronariana é responsável pelo maior número de mortes de indivíduos adultos no mundo1. Vários estudos têm demonstrado a relação de níveis aumentados do colesterol presente nas lipoproteínas de baixa densidade (LDL-C) com o risco de desenvolvimento da doença2,3. O III Consenso Brasileiro sobre Dislipidemias estratifica faixas de valores de LDL-C para avaliação do risco para o desenvolvimento da doença arterial coronariana: desejável abaixo de 130 mg/dL, limítrofe entre 130-159 mg/dL, e alto a partir de 160 mg/dL4. Estas faixas de valores são bastante estreitas, de modo que o National Colesterol Education Program – NCEP estabeleceu que os laboratórios clínicos devem utilizar metodologias para a dosagem do LDL-C com um erro analítico total que não exceda 12%, com imprecisão <4% e inexatidão <4%1. O método considerado de referência para a determinação do LDL-C é a b-quantificação5, que requer ultracentrifugação das amostras, impraticável para os laboratórios de rotina. Por isso, a maioria dos laboratórios utiliza a estimativa do LDL-C pela fórmula de Friedewald, a partir das concentrações do colesterol total, do colesterol presente nas lipoproteínas de alta densidade (HDL-C), e dos triglicerídeos6. Entretanto, o erro da determinação do LDL-C por esta estimativa compreende o erro analítico somado dos três parâmetros utilizados no cálculo, e normalmente não atende os critérios de erro total do NCEP. Além disso, o uso da fórmula tem severas limitações, não podendo ser aplicada em amostras com triglicerídeos (Trig) >400 mg/dL, em amostras com quilomícrons, nem em amostras de pacientes com disbetalipoproteinemia (Fredrickson Tipo III)7. Alguns autores demonstraram inclusive que a fórmula não deve ser usada em certos grupos de pacientes, como diabéticos e pacientes com hepatopatias ou nefropatias, mesmo com níveis de triglicerídeos <400 mg/dL8.

Recentemente, vários métodos homogêneos têm sido desenvolvidos por diferentes fabricantes para a dosagem direta do LDL-C, na expectativa de que sejam atendidos os critérios do NCEP e as necessidades da comunidade médica na prevenção da doença arterial coronariana e do infarto do miocárdio. Estes métodos parecem ser melhores que os métodos anteriores que utilizam precipitação química seletiva ou imunoprecipitação, que são trabalhosos e apresentam um bias significativo em comparação com o método de referência7, 9. No entanto, principalmente devido ao seu custo, a utilização destes reagentes nos laboratórios clínicos não vem sendo amplamente disseminada, o que acarreta a escassez de dados sobre o desempenho e a validação dos métodos. No presente estudo propusemo-nos a avaliar o desempenho de um método direto homogêneo para a dosagem do LDL-C em comparação com a estimativa pela fórmula de Friedewald, analisando uma grande amostragem, obtida em dois anos de experiência com estes reagentes.

Métodos

Foram analisadas amostras de sangue de pacientes que procuraram nosso laboratório, para realizar exames de colesterol total, LDL-C, HDL-C e triglicerídeos, de janeiro 2000 a dezembro 2002. Foram analisadas amostras de 10.664 pacientes, sendo 5.846 (54,82%) do sexo feminino, e 4.818 (45,18%) do sexo masculino, com idades entre 14 e 93 anos. As amostras de sangue foram coletadas após jejum de 12 a 14h, incubadas em banho-maria por 15 minutos para coagulação, e centrifugadas a 2.000 x g por 5 minutos. O soro foi separado e os ensaios foram realizados no mesmo dia da coleta.

As dosagens dos triglicerídeos e do colesterol total foram realizadas com os reagentes Triglycerides FS (DiaSys Diagnostic Systems GmbH & Co. KG, Holzheim, Germany), e Cholesterol (BioSystems S.A., Barcelona, Spain), respectivamente, de acordo com as especificações dos fabricantes, em um equipamento Spectrum CCX II (Abbott Diagnostics, Abbott Park, IL, USA). Os testes foram calibrados com o CCX Multicalibrator Set (Abbott), com curvas de três pontos.

A dosagem do LDL-C homogêneo foi feita com o reagente LDL-C Select FS (DiaSys), de acordo com as especificações do fabricante. O método é baseado na proteção seletiva do LDL-C com a adição do reagente 1 (Tampão Good's pH 6,8 22 mmol/L, colesterol esterase > 2 kU/L, colesterol oxidase > 2 kU/L, N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina (H-DAOS) 0,43 mmol/L, catalase > 400 kU/L, concentrações finais), enquanto o colesterol das outras lipoproteínas é processado pela colesterol oxidase, e o peróxido de hidrogênio formado é degradado pela catalase. Após 5 minutos, com a adição do reagente 2 (Tampão Good's pH 7,0 22 mmol/L, 4-aminoantipirina 0,68 mmol/L, peroxidase > 3 kU/L, concentrações finais), o LDL-C é liberado para o processamento enzimático e revelação pela reação de Trinder. Todos os reagentes são líquidos estáveis. Não há interferência com níveis de triglicerídeos até 1.000 mg/dL, bilirrubina até 50 mg/dL, hemoglobina até 500 mg/dL ou ácido ascórbico até 50 mg/dL, segundo o fabricante. Os testes foram realizados em um equipamentos Spectrum CCX II (Abbott) através de programação especial, e calibrados com TruCal (DiaSys).

O LDL-C foi estimado pela fórmula de Friedewald: LDL-C = ColT– HDL-C – (Trig/5), para as amostras que tiveram resultado de triglicerídeos < 400 mg/dL 6.

A dosagem do HDL-C foi feita por um método homogêneo sem precipitação, utilizando o reagente HDL-C Immuno FS (DiaSys). O método é baseado na formação de imunocomplexos das lipoproteínas LDL, VLDL e quilomícrons com anticorpos anti-b lipoproteínas humanas após a adição do reagente 1 (Tampão Good's pH 7,0 26 mmol/L, 4-aminoantipirina 0,60 mmol/L, peroxidase 1.600 U/L, ascorbato oxidase 1.800 U/L, concentrações finais, e anticorpos de carneiro anti-b lipoproteínas humanas), seguida do processamento enzimático do HDL-C com a adição, após 5 minutos, do reagente 2 (Tampão Good's pH 7,0 26 mmol/L, colesterol esterase 800 U/L, colesterol oxidase 4.000 U/L, N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxi-4-fluoranilina sódica 0,16 mmol/L). Todos os reagentes são líquidos estáveis. Não há interferência com níveis de triglicerídeos até 1.200 mg/dL, bilirrubina até 40 mg/dL, hemoglobina até 500 mg/dL ou ácido ascórbico até 50 mg/dL, segundo o fabricante. Os testes foram realizados em um equipamentos Spectrum CCX II (Abbott) através de programação especial, e calibrados com TruCal (DiaSys).

A determinação do coeficiente de variação dos testes realizados foi feita através da análise dos resultados obtidos durante 20 dias consecutivos, utilizando alíquotas de soro controle Accumark ™ (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA), lote 111K6403.

A comparação entre os métodos de dosagem do LDL-C homogêneo e estimativa do LDL-C pela fórmula de Friedewald foi feita segundo método de Passing e Bablok10, através de análise de correlação, expressa pela equação y =bx + a, onde b é a inclinação da reta, representando o erro proporcional, e a é a intersecção no eixo y, representando o erro constante. Para melhorar a comparação entre os métodos, as amostras foram estratificadas de acordo com os níveis de colesterol total: 70-150 mg/dL, 151-200 mg/dL, 201-250 mg/dL, 251-550 mg/dL, e com os níveis de triglicerídeos: < 150 mg/dL, 151-200 mg/dL, 201-300 mg/dL, e 301-400 mg/dL.

A análise estatística dos resultados obtidos foi feita com o auxílio dos softwares GraphPad InStat ™ e GraphPad Prism ™ (San Diego, CA, USA). Foram considerados significativos valores de p < 0,05. Média, desvio padrão e coeficiente de variação foram calculados com o auxílio do Software Excel (Microsoft).

Resultados

O coeficiente de variação da dosagem do LDL-C pelo método homogêneo foi de 4%. Para as dosagens do colesterol total, dos triglicerídeos e do HDL-C, os coeficientes de variação foram de 3%, 4% e 3%, respectivamente. As recomendações do National Cholesterol Education Program – NCEP são dosagens do LDL-C com imprecisão < 4%1 e as dosagens realizadas em nosso laboratório atenderam o critério.

As concentrações de colesterol total e lipoproteínas obtidas neste estudo em relação aos diferentes níveis de triglicerídeos encontram-se na tabela I. As concentrações de triglicerídeos e lipoproteínas em relação aos diferentes níveis de colesterol total na tabela II.

A comparação dos métodos [LDL-C homogêneo (x) versus LDL-C calculado (y)] resultou em equações de regressão de y = 0,6905 x + 27,9 para níveis de colesterol total entre 70 e 150 mg/dL, de y = 0,6387 x + 44,8 para níveis de colesterol entre 151 e 200 mg/dL, de y = 0,6039 x + 63,7 para níveis de colesterol entre 201 e 250 mg/dL, e de y = 0,7256 x + 60,7 para níveis de colesterol > 250 mg/dL. Os coeficientes de correlação entre os métodos, de acordo com os níveis de colesterol total, de 0,6105, 0,6160, 0,6735 e 0,7822, respectivamente, foram extremamente significantes (< 0,001). Entretanto, a estimativa do LDL-C pela fórmula de Friedewald tende a produzir resultados um pouco mais elevados em comparação com a dosagem do LDL-C pelo método homogêneo. Este bias praticamente não ocorre com níveis de colesterol até 150 mg/dL, onde foi observada uma diferença média de 7 ± 12,1 mg/dL (11,5% ± 16,1%), com um erro proporcional de – 30,9 % [(inclinação da reta - 1) x 100), e um erro constante de + 27,9 mg/dL. Mas, com níveis de colesterol entre 151 e 200 mg/dL, observamos um aumento do erro constante, que passa para + 44,8 mg/dL, com um erro proporcional de - 36 %, resultando num desvio médio de 8 ± 14,5 mg/dL (9,5% ± 13,3%). Da mesma forma, com níveis de colesterol entre 201-250 mg/dL e > 250 mg/dL, observamos um aumento do erro constante para + 63,7 mg/dL e + 60,7 mg/dL, com erros proporcionais de – 40% e – 27%, resultando em desvios médios de 10 ± 15,3 mg/dL (8,3% ± 10,5%) e de 10 ± 20,4 mg/dL (6,5% ± 10,5%), respectivamente. Os resultados destas comparações estão resumidos na (tab. III e fig. 1).

A comparação dos métodos [LDL-C homogêneo (x) versus LDL-C calculado (y)] resultou em equações de regressão de y = 0,9746 x + 17,6 para níveis de triglicerídeos < 150 mg/dL, de y = 0,9593 x + 12,6 para níveis de triglicerídeos entre 151-200 mg/dL, de y = 0,9459 x + 6,7 para níveis de triglicerídeos entre 201-300 mg/dL, e de y = 0,8999 x - 0,1 para níveis de triglicerídeos entre 301-400 mg/dL. Os coeficientes de correlação entre os métodos, de acordo com os níveis de triglicerídeos, de 0,9426, 0,9332, 0,9345 e 0,9072, respectivamente, foram extremamente significantes (< 0,001). Entretanto, a estimativa do LDL-C pela fórmula de Friedewald também tende a produzir resultados mais elevados em comparação com as dosagens do LDL-C pelo método homogêneo para níveis de triglicerídeos até 150 mg/dL, onde encontramos uma diferença média de 14 ± 13 mg/dL (12,8% ± 9,2%), com um erro constante de + 17,6 mg/dL e um erro proporcional de – 3%. Com níveis de triglicerídeos entre 151-200 mg/dL este desvio tende a diminuir, apresentando uma diferença média de 7 ± 14,5 mg/dL (5,3% ± 9,5%), onde observamos um erro proporcional de - 4 % com + 12,6 mg/dL de erro constante. Com níveis de triglicerídeos entre 201 e 300 mg/dL este desvio praticamente não existe: 2 ± 15,3 mg/dL (0,8% ± 10%), com um erro proporcional de - 5 % e um erro constante de + 6,7 mg/dL. Por outro lado, com níveis de triglicerídeos entre 301-400 mg/dL, a estimativa do LDL-C pela fórmula de Friedewald tende a produzir resultados mais baixos, com uma diferença média de – 16 ± 19,4 mg/dL (- 10,3% ± 12,4%), em comparação com a dosagem do LDL-C pelo método homogêneo, onde encontramos um erro proporcional de – 10 %, com – 0,1 mg/dL de erro constante (tab. III e fig.2).

Discussão

Neste trabalho, propusemo-nos a avaliar o desempenho de um método homogêneo para a dosagem direta do LDL-C, em comparação com a estimativa do LDL-C pela fórmula de Friedewald. Apesar das inovações tecnológicas, a fórmula de Friedewald continua sendo usada por muitos laboratórios, e sua aplicação foi inclusive recomendada pelo III Consenso Brasileiro sobre Dislipidemias, para amostras com triglicerídeos até 400 mg/dL. Entretanto, como outros autores9,11-17 e por nós demonstrado, métodos homogêneos e a fórmula de Friedewald não são capazes de fornecer resultados idênticos. Esta conclusão também fica evidente analisando os resultados das amostras do presente estudo, de acordo com seus respectivos níveis de colesterol total ou de triglicerídeos.

Avaliando os resultados das amostras de acordo com diferentes níveis de colesterol total, pudemos observar que a estimativa do LDL-C pela Fórmula de Friedewald apresenta uma correlação extremamente significativa (P < 0,001) em comparação com o método direto (tab. II). Porém, os coeficientes de correlação entre os dois métodos não são extremamente próximos (0,6105 a 0,7822) (tab. III). De fato, a fórmula de Friedewald apresenta um desvio, ou bias, positivo em relação ao método direto. Esse bias não é muito pronunciado com níveis de colesterol total entre 70-150 mg/dL (desvio médio de 7 ± 21 mg/dL) nem com níveis de colesterol total entre 151-200 mg/dL (8 ± 14,5 mg/dL). Mas, a partir de níveis de colesterol total entre 201-250 mg/dL, este desvio tende a aumentar, com a média de 10 ± 15,3 mg/dL. Da mesma forma, com níveis de colesterol total > 250 mg/dL, temos um bias positivo de 10 ± 20,4 mg/dL. Assim, um paciente que teria, por exemplo, um resultado de LDL-C de 125 mg/dL pelo método direto, poderia ter um resultado de 139 mg/dL pela estimativa da fórmula de Friedewald (fig. 1B), considerando a equação de regressão linear obtida para níveis de colesterol total entre 201-250 mg/dL (y = 0,6039 x + 63,7). Deste modo, apesar de não haver significância estatística, teoricamente uma parcela da população poderia sair do limite desejável para valores de LDL-C (< 130 mg/dL) para um valor limítrofe (130-159 mg/dL), sujeita a controles da dieta ou até mesmo tratamento com estatinas. Da mesma forma, pacientes classificados dentro de valores limítrofes pelo método direto, poderiam cair na faixa de valores altos (160-189 mg/dL) com a estimativa pela fórmula de Friedewald (fig. 1C).

Por outro lado, avaliando os resultados destas amostras de acordo com diferentes níveis de triglicerídeos, observamos um padrão de inversão deste bias (tab. I), apesar de os dois métodos apresentarem excelentes coeficientes de correlação (0,9072 a 0,9426) (tab. III). Com níveis de triglicerídeos até 150 mg/dL, observamos uma bias positivo médio de 14 ± 13 mg/dL da fórmula de Friedewald. Assim, mesmo sem haver significância estatística, teoricamente um paciente com resultado de LDL-C de 125 mg/dL pelo método direto e triglicerídeos < 150 mg/dL, poderia ter um valor de LDL-C estimado pela fórmula de Friedewald de 139 mg/dL (fig. 2A), considerando a equação de regressão linear para esta faixa de triglicerídeos (y = 0,9746 x + 17,6). Esse paciente passaria de um valor desejável para um valor limítrofe. O mesmo aconteceria com um paciente com 150 mg/dL de LDL-C pelo método direto, que passaria da faixa de valores limítrofes para a faixa de valores altos (164 mg/dL), pela estimativa da fórmula.

Vários autores encontraram resultados mais baixos para métodos diretos de dosagem do LDL-C em comparação com a b-quantificação após ultracentrifugação11, 12, enquanto outros observaram este bias com um determinado reagente, e uma correlação perfeita com outro reagente, apesar de ambos utilizarem detergentes, mas com princípios diferentes13. Os reagentes utilizados no presente estudo seguem um princípio de proteção com detergentes semelhante ao método utilizado no estudo citado, que não apresentou bias em comparação com o método de referência. Alguns autores também não encontraram esta variação do bias em relação a diferentes níveis de triglicerídeos com um método que também utiliza tensoativos específicos12, ao contrário da maioria dos métodos diretos9, 14-18, o que pode ser devido a uma diferença de componentes dos reagentes.

Para níveis de triglicerídeos entre 151-200 mg/dL, com nossos resultados este desvio diminui para 7 ± 14,5 mg/dL, e para níveis de triglicerídeos entre 201-300 m/dL, este bias praticamente inexiste (2 ± 15,3 mg/dL).

Por outro lado, nas amostras com níveis de triglicerídeos entre 301-400 mg/dL, este bias da fórmula de Friedewald torna-se negativo, com um desvio médio de – 16 ± 19,4 mg/dL. Desta maneira, como pode ser demonstrado com nossos resultados, um paciente com triglicerídeos entre 301-400 mg/dL e um resultado de LDL-C dosado pelo método direto de 140 mg/dL, teoricamente poderia ter um valor de LDL-C estimado pela Fórmula de Friedewald de 126 mg/dL (fig. 2D), considerando a equação de regressão linear para esta faixa de triglicerídeos (y = 0,8999x – 0,1), apesar de não haver significância estatística. O paciente passaria de um valor limítrofe para um valor desejável de LDL-C. O mesmo aconteceria com um paciente com 170 mg/dL de LDL-C pelo método direto, que passaria da faixa de valores altos para a faixa de valores limítrofes (153 mg/dL).

Uma das explicações para estes resultados mais altos de LDL-C pelo método direto em comparação com a fórmula de Friedewald, segundo alguns autores, seria a diferença na relação triglicerídeos/colesterol nas partículas de VLDL, em pacientes com dislipidemias do tipo IIb, III e IV de Fredrickson. Partículas de VLDLs ricas em triglicerídeos induziriam os métodos diretos a um bias negativo13. VLDLs ricas em colesterol, seriam responsáveis por um bias positivo19. Entretanto, isto não explicaria o bias positivo do método direto em pacientes com altos níveis de triglicerídeos, encontrado em nossos resultados.

Outra explicação seria a possibilidade da dosagem do colesterol presente nas partículas de lipoproteínas de densidade intermediária (IDL) como LDL-C, nos casos de pacientes dislipidemia do tipo III de Fredrickson, por alguns métodos diretos13, o que poderia estar acontecendo com o método em questão, mas esta hipótese não pode explicar esta tendência em todos os pacientes com triglicerídeos entre 301-400 mg/dL, demonstrada por nossos resultados. De fato, como argumentam esses autores, esses pacientes com dislipidemia do tipo III tenderiam a ser erroneamente classificados no tipo IIb utilizando o método direto para a dosagem do LDL-C, superestimando a fração LDL-C. Porém, a estimativa pela fórmula de Friedewald não auxilia a classificação correta, superestimando a fração VLDL (triglicerídeos/5), pois também é incapaz de indicar a presença das IDLs, que poderia ser suspeitada apenas pelos altos níveis de triglicerídeos. No caso específico dos pacientes com dislipidemia do tipo III, uma boa comunicação do clínico com o laboratório, que teria condições de informar se o método que utiliza pode superestimar a fração LDL-C, no caso do método direto, ou a fração VLDL, no caso da estimativa pela fórmula de Friedewald, seria uma excelente contribuição para o diagnóstico.

Para a estimativa do LDL-C, a fórmula de Friedewald padroniza o valor da fração VLDL como o valor dos triglicerídeos dividido por cinco. Entretanto, as partículas encontradas nos pacientes com hipertrigliceridemia (tipos IIb, III, IV e V) são normalmente uma mistura heterogênea de remanescentes de quilomícrons, VLDL e remanescentes de VLDL (IDLs). Como é sabido, a relação triglicerídeos/colesterol é bastante variável entre esta gama de partículas. De fato, segundo nossos resultados, a estimativa do LDL-C pela fórmula de Friedewald apresenta um bom desempenho em amostras com níveis de triglicerídeos entre 151-300 mg/dL, em comparação com o método direto. Entretanto, nos extremos desta faixa, nas amostras com < 150 mg/dL e entre 301-400 mg/dL de triglicerídeos, a fórmula não apresenta um bom desempenho. De fato, a fórmula de Friedewald pode classificar erroneamente, segundo alguns autores, até 25% dos pacientes com valores de triglicerídeos entre 301-400 mg/dL13. Esta percentagem pode ser ainda maior dependendo do método utilizado para a dosagem do HDL-C.

Assim, pacientes com triglicerídeos <150 mg/dL com resultados desejáveis de LDL-C pelo método direto, poderiam estar recebendo tratamento com base em resultados de LDL-C obtidos com a estimativa pela fórmula de Friedewald. Por outro lado, pacientes com triglicerídeos entre 301-400 mg/dL e valores de LDL-C em níveis limítrofes ou altos pelo método direto, não estariam recebendo o tratamento adequado com uso da fórmula de Friedewald. Obviamente os limites de valores de LDL-C para a classificação de risco para doença arterial coronariana são bastante estreitos, mas como são os valores recomendados pelo III Consenso Brasileiro sobre Dislipidemias4, o laboratório clínico deve esforçar-se ao máximo para realizar a dosagem desta fração com o melhor desempenho diagnóstico possível, isto é, com o menor coeficiente de variação, e com a probabilidade de melhor classificar corretamente os pacientes para a avaliação do risco de doença arterial coronariana.

Com este trabalho, analisando amostragem de mais de 10.000 pacientes, foi possível demonstrar que o método direto utilizado para dosagem do LDL-C tem um desempenho muito bom, com boa reprodutibilidade e coeficiente de variação dentro das exigências do NCEP, dificilmente obtido com a fórmula de Friedewald. Entretanto, apesar de um dos objetivos ter sido discutir que os dois métodos não apresentam resultados idênticos, é importante salientar que ainda permanece o consenso de que a fórmula de Friedewald pode ser utilizada nos pacientes com níveis de triglicerídeos até 400 mg/dL, que não apresentem quilomícrons e que não tenham IDLs (classificação de Fredrickson tipo III)4, 20. De fato, muitos laboratórios ainda continuam utilizando a estimativa do LDL-C pela fórmula, devido ao custo dos reagentes para a dosagem do LDL-C pelos métodos diretos existentes. Com a diminuição destes custos e com uma melhor avaliação do desempenho destes reagentes, os métodos diretos tenderiam a ser mais amplamente utilizados pelos laboratórios, possibilitando uma melhor classificação dos pacientes, como resultados mais confiáveis de LDL-C, dentro dos critérios do NCEP. Certas populações seriam extremamente beneficiadas com a utilização dos métodos diretos, como por exemplo os diabéticos, que são naturalmente propensos a desenvolver doença arterial coronariana, e cujos valores de LDL-C não são corretamente estimados pela fórmula8.

No futuro, novos métodos podem estar sendo implementados para a determinação do LDL-C, como um método descrito recentemente, sem reagentes, baseado na absorção espectrofotométrica das lipoproteínas no infravermelho21. Este método apresentou excelente desempenho, e sua avaliação pode lançar novas perspectivas no debate sobre a introdução ou não de novos métodos para a determinação do LDL-C.

Recentemente, alguns autores demonstraram que dois métodos diretos para a dosagem do LDL-C não apresentam uma boa recuperação do subtipo de LDL pequena e densa (sdLDL), previamente separada por ultracentrifugação22. A determinação dos níveis deste subtipo de LDL tem sido implicada como um fator na avaliação do risco de desenvolvimento de doença arterial coronariana mais sensível do que a determinação do LDL-C total. Métodos para a determinação rotineira de sdLDL ainda estão em desenvolvimento, mas possivelmente, num futuro próximo, os laboratórios estarão incluindo mais este parâmetro no perfil de lipídeos e lipoproteínas à disposição dos clínicos23.

Da mesma forma, o desempenho do método direto para a dosagem do HDL-C apresentou um desempenho excelente, com um coeficiente de variação muito baixo. Em nossa experiência, este método apresenta um ótimo desempenho na rotina do laboratório, é facilmente automatizável, e não apresenta os problemas de interferências, como os métodos de precipitação1, que acarretam um erro adicional na estimativa do LDL-C pela fórmula de Friedewald. Outros autores puderam demonstrar que o método direto não apresenta resultados mais baixos de HDL-C como os métodos de precipitação, em comparação com o método de referência24.

Agradecimentos

À Empresa DiaSys Diagnostic Systems pelo suporte parcial na realização deste trabalho.

Caio M. M. de Cordova

Departamento de Ciências Farmacêuticas/FURB Campus III

R. Antônio da Veiga, 140

CP 1507 - Cep 89010-971 - Blumenau, SC

E-mail:

cmcordova@furb.br

Recebido para Publicação em: 10/09/2003

Aceito em: 18/02/2004

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OBJECTIVE: To compare direct measurement of LDL-cholesterol (LDL-C) determined by a homogeneous method with LDL-cholesterol estimation determined by the Friedewald formula in a large heterogeneous population. METHODS: The measurements of total cholesterol (TC) and triglycerides (TG) were performed using traditional enzymatic methods. The measurements of HDL-C and LDL-C were performed using direct methods with no precipitation, and the estimation of the LDL-C fraction was calculated using the Friedewald formula. RESULTS: On linear regression analysis, the 2 methods had extremely significant correlation coefficients (P < 0.001). However, the Friedewald formula had a positive bias in regard to the direct method, more pronounced with TC levels > 201 mg/dL. This positive bias also occurred in regard to TG levels < 150 mg/dL. No bias was observed between the methods for TG levels ranging from 151 to 200 mg/dL and from 201 to 300 mg/dL. On the other hand, for TG levels ranging from 301 to 400 mg/dL, this bias of the Friedewald formula became negative. CONCLUSION: The Friedewald formula did not have a homogeneous performance for estimating LDL-C levels in samples with different TG levels as compared with that of the direct method, what could launch doubts on patients classification on the risk of developing coronary artery disease.

 cholesterol LDL-C direct LDL Friedewald formula

ORIGINAL ARTICLE

Comparison of LDL-cholesterol direct measurement with the estimate using the Friedewald formula in a sample of 10,664 patients

Caio Maurício Mendes de Cordova; Carlos Rudi Schneider; Iara Deise Juttel; Maurício Mendes de Cordova

Blumenau, SC - Brazil

Departamento de Ciências Farmacêuticas/FURB and Laboratório Santa Isabel de Análises Clínicas, Blumenau, SC

Correspondence

ABSTRACT

OBJECTIVE: To compare direct measurement of LDL-cholesterol (LDL-C) determined by a homogeneous method with LDL-cholesterol estimation determined by the Friedewald formula in a large heterogeneous population.

METHODS: The measurements of total cholesterol (TC) and triglycerides (TG) were performed using traditional enzymatic methods. The measurements of HDL-C and LDL-C were performed using direct methods with no precipitation, and the estimation of the LDL-C fraction was calculated using the Friedewald formula.

RESULTS: On linear regression analysis, the 2 methods had extremely significant correlation coefficients (P < 0.001). However, the Friedewald formula had a positive bias in regard to the direct method, more pronounced with TC levels > 201 mg/dL. This positive bias also occurred in regard to TG levels < 150 mg/dL. No bias was observed between the methods for TG levels ranging from 151 to 200 mg/dL and from 201 to 300 mg/dL. On the other hand, for TG levels ranging from 301 to 400 mg/dL, this bias of the Friedewald formula became negative.

CONCLUSION: The Friedewald formula did not have a homogeneous performance for estimating LDL-C levels in samples with different TG levels as compared with that of the direct method, what could launch doubts on patients classification on the risk of developing coronary artery disease.

Key words: cholesterol, LDL-C, direct LDL, Friedewald formula

Coronary artery disease accounts for the greatest number of deaths of adult individuals worldwide 1. Several studies have shown the correlation existing between the increased levels of cholesterol in low-density lipoproteins (LDL-C) and the risk of developing that disease 2,3. The III Brazilian Consensus on Dyslipidemias stratifies the following ranges of LDL-C levels for assessing the risk of developing coronary artery disease: desirable, below 130 mg/dL; borderline, between 130 and 159 mg/dL; and high, above 160 mg/dL 4. These ranges are very narrow, and the National Cholesterol Education Program (NCEP) established that clinical laboratories should use methodologies for measuring LDL-C levels with a total analytical error < 12%, imprecision < 4%, and inaccuracy < 4% 1. The reference method for determining LDL-C is b-quantitation 5, which requires ultracentrifugation of the samples, which is not feasible in laboratory routine. Therefore, most laboratories estimate LDL-C levels with the Friedewald formula, based on the concentrations of total cholesterol, the cholesterol present in high-density lipoproteins (HDL-C), and triglycerides 6. However, the error of determining LDL-C through that estimation comprises the addition of the analytical errors of the 3 parameters used in the calculus, which usually does not meet the NCEP criteria for total error. In addition, the use of that formula has severe limitations and cannot be applied to samples containing triglyceride (TG) levels > 400 mg/dL, to samples with chylomicrons, and to samples of patients with dysbetalipoproteinemia (Fredrickson Type III) 7. Some authors have demonstrated that that formula should not be used in certain groups of patients, such as patients with diabetes, hepatopathies, or nephropathies, even with triglyceride levels < 400 mg/dL 8.

Recently, several homogeneous methods have been developed by different manufacturers for the direct measurement of LDL-C levels, expecting that the NCEP criteria are met, as well as that the medical community's need to prevent coronary artery disease and myocardial infarction are fulfilled. These methods seem to be better than the previous ones that use selective chemical precipitation or immunoprecipitation, which are laborious and have a significant bias as compared with the reference method 7, 9. However, mainly due to the costs of the reagents, their use in clinical laboratories has not been largely disseminated, resulting in scarcity of data about the performance and validation of those methods. This study aimed at assessing the performance of a direct homogeneous method for measuring LDL-C and at comparing it with the estimation of LDL-C levels using the Friedewald formula, analyzing a large sample obtained over 2 years of experience with those reagents.

Methods

This study assessed the blood samples of 10,664 patients who sought our laboratory to undergo total cholesterol, LDL-C, HDL-C, and triglyceride measurements from January 2000 to December 2002. Their ages ranged from 14 to 93 years; 5,846 (54.82%) were females, and 4,818 (45.18%) were males. Blood samples were collected after a 12- to 14-hour fast, incubated in a hot-water bath for 15 minutes for coagulation, and centrifuged at 2,000 x g for 5 minutes. The serum was separated and the assays were performed on the same day of sample collection.

The measurements of the triglycerides and total cholesterol were performed with the reagents Triglycerides FS (DiaSys Diagnostic Systems GmbH & Co. KG, Holzheim, Germany), and Cholesterol (BioSystems S.A., Barcelona, Spain), respectively, according to the specifications of the manufacturers, in a Spectrum CCX II device (Abbott Diagnostics, Abbott Park, IL, USA). The tests were calibrated with the CCX Multicalibrator Set (Abbott), with curves of 3 points.

The LDL-C measurement with the homogeneous method was performed with the reagent LDL-C Select FS (DiaSys), according to the specifications of the manufacturer. The method is based on the selective protection of LDL-C with the addition of reagent 1 [Good's buffer, pH 6.8, 22 mmol/L, cholesterol esterase > 2 kU/L, cholesterol oxidase > 2 kU/L, N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline (H-DAOS) 0.43 mmol/L, catalase > 400 kU/L, final concentrations]. The cholesterol of the other lipoproteins is processed by cholesterol oxidase, and the hydrogen peroxide formed is broken down by catalase. After 5 minutes, with the addition of reagent 2 (Good's buffer, pH 7.0, 22 mmol/L, 4-aminoantipyrine 0.68 mmol/L, peroxidase > 3 kU/L, final concentrations), LDL-C is released for enzymatic processing and development by the Trinder reaction. All reagents are stable fluids. According to the manufacturer, no interference occurs with triglyceride levels up to 1,000 mg/dL, bilirubin up to 50 mg/dL, hemoglobin up to 500 mg/dL, or ascorbic acid up to 50 mg/dL. The tests were performed using special programming in a Spectrum CCX II device (Abbott) calibrated with TruCal (DiaSys).

For samples with triglyceride levels < 400 mg/dL, the LDL-C level was estimated using the Friedewald formula: LDL-C = TC – HDL-C – (TG/5) 6.

The HDL-C measurement was performed using a homogeneous method without precipitation with the HDL-C Immuno FS reagent (DiaSys). The method is based on the formation of immunocomplexes of LDL and VLDL lipoproteins and chylomicrons with human anti-b lipoprotein antibodies after the addition of reagent 1 (Good's buffer, pH 7.0, 26 mmol/L, 4-aminoantipyrine 0.60 mmol/L, peroxidase 1,600 U/L, ascorbate oxidase 1,800 U/L, final concentrations, and sheep antibodies anti human-b lipoproteins). Then, enzymatic processing of HDL-C occurred with the addition, after 5 minutes, of reagent 2 [Good's buffer, pH 7.0, 26 mmol/L, cholesterol esterase 800 U/L, cholesterol oxidase 4,000 U/L, sodium N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxy-4-fluoroaniline 0.16 mmol/L]. All reagents are stable fluids. According to the manufacturer, no interference occurs with triglyceride levels up to 1,200 mg/dL, bilirubin up to 40 mg/dL, hemoglobin up to 500 mg/dL, or ascorbic acid up to 50 mg/dL. The tests were performed using special programming in a Spectrum CCX II device (Abbott) calibrated with TruCal (DiaSys).

The coefficient of variation of the tests performed was determined by analysis of the results obtained during 20 consecutive days using Accumark control serum aliquots (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA), 111K6403 lot.

The comparison between the LDL-C measurement methods, homogeneous and estimation through the Friedewald formula, was performed according to the Passing and Bablok method 10, using analysis of correlation expressed by the equation y = bx + a, where b is the gradient of the line and represents the proportional error, and a is the intersection in the y axis and represents the constant error. To improve the comparison between the methods, the samples were stratified according to total cholesterol levels (70-150 mg/dL, 151-200 mg/dL, 201-250 mg/dL, and 251-550 mg/dL) and to triglyceride levels (< 150 mg/dL, 151-200 mg/dL, 201-300 mg/dL, and 301-400 mg/dL).

The statistical analysis of the results was performed with the aid of GraphPad InStat and GraphPad Prism software (San Diego, CA, USA). The significance level adopted was P < 0.05. Mean, standard deviation, and coefficient of variation were calculated with the aid of Excel software (Microsoft).

Results

The coefficient of variation of the LDL-C measurement using the homogeneous method was 4%. The coefficients of variation of the total cholesterol, triglyceride, and HDL-C measurements were 3%, 4%, and 3%, respectively. In regard to LDL-C measurements, the National Cholesterol Education Program (NCEP) recommends imprecision < 4% 1. The measurements performed in our laboratory met that criterion.

The concentrations of total cholesterol and lipoproteins obtained in this study in regard to the different triglyceride levels are shown in table I. The concentrations of triglycerides and lipoproteins in regard to the different levels of total cholesterol are shown in table II.

The comparison of the methods [homogeneous LDL-C (x) versus calculated LDL-C (y)] resulted in the following regression equations: y = 0.6905 x + 27.9, for total cholesterol levels between 70 and 150 mg/dL; y = 0.6387 x + 44.8, for total cholesterol levels between 151 and 200 mg/dL; y = 0.6039 x + 63.7, for total cholesterol levels between 201 and 250 mg/dL; and y = 0.7256 x + 60.7, for total cholesterol levels > 250 mg/dL. According to the total cholesterol levels, the correlation coefficients between the methods of 0.6105, 0.6160, 0.6735, and 0.7822, respectively, were extremely significant (< 0.001). However, the LDL-C estimate determined with the Friedewald formula tends towards producing slightly greater results as compared with those from LDL-C measurements using the homogeneous method. This bias practically does not occur with cholesterol levels up to 150 mg/dL, in which a mean difference of 7 ± 12.1 mg/dL (11.5% ± 16.1%) was observed, with a proportional error of –30.9% [(gradient of the line - 1) x 100), and a constant error of +27.9 mg/dL. However, with cholesterol levels between 151 and 200 mg/dL, the constant error increased to +44.8 mg/dL, and the proportional error was -36%, which resulted in a mean deviation of 8 ± 14.5 mg/dL (9.5% ± 13.3%). In the same way, with cholesterol levels between 201 and 250 mg/dL and > 250 mg/dL, the constant error increased to +63.7 mg/dL and +60.7 mg/dL, respectively, with proportional errors of –40% and –27%, respectively. This resulted in mean deviations of 10 ± 15.3 mg/dL (8.3% ± 10.5%), and 10 ± 20.4 mg/dL (6.5% ± 10.5%), respectively. The results of these comparisons are summarized in table III and figure 1.

The comparison of the methods [homogeneous LDL-C (x) versus calculated LDL-C (y)] resulted in the following regression equations: y = 0.9746 x + 17.6, for triglyceride levels < 150 mg/dL; y = 0.9593 x + 12.6, for triglyceride levels between 151 and 200 mg/dL; y = 0.9459 x + 6.7, for triglyceride levels between 201 and 300 mg/dL; and y = 0.8999 x - 0.1, for triglyceride levels between 301 and 400 mg/dL. In those different triglyceride levels, the correlation coefficients between the methods of 0.9426, 0.9332, 0.9345, and 0.9072, respectively, were extremely significant (< 0.001). However, the LDL-C estimate using the Friedewald formula also tends towards producing greater results as compared with those obtained in LDL-C measurements through the homogeneous method for triglyceride levels up to 150 mg/dL, in which a mean difference of 14 ± 13 mg/dL (12.8% ± 9.2%) was found, with a constant error of +17.6 mg/dL, and a proportional error of –3%. With triglyceride levels between 151 and 200 mg/dL, this deviation tends towards decreasing, with a mean difference of 7 ± 14.5 mg/dL (5.3% ± 9.5%), a proportional error of -4%, and a constant error of +12.6 mg/dL. With triglyceride levels between 201 and 300 mg/dL, this deviation almost does not exist: 2 ± 15.3 mg/dL (0.8% ± 10%), with a proportional error of -5% and a constant error of +6.7 mg/dL. On the other hand, with triglyceride levels between 301 and 400 mg/dL, the LDL-C estimate with the Friedewald formula tends towards producing lower values, with a mean difference of -16 ± 19.4 mg/dL (-10.3% ± 12.4%), as compared with the LDL-C measurement using the homogeneous method, in which a proportional error of -10% and a constant error of -0.1 mg/dL are observed (tab. III and fig.2).

Discussion

This study aimed at assessing the performance of a homogeneous method for direct LDL-C measurement, as compared with the LDL-C estimate by using the Friedewald formula. Despite the technological innovations, the Friedewald formula continues to be used in many laboratories, and its application has been recommended by the III Brazilian Consensus on Dyslipidemias for samples with triglyceride levels up to 400 mg/dL. However, as already reported by other authors 9,11-17 and ourselves, the homogeneous methods and the Friedewald formula are not capable of providing identical results. This conclusion is also evident when the results of the samples of this study are analyzed according to their respective levels of total cholesterol and triglycerides.

Assessing the results according to the different levels of total cholesterol, the LDL-C estimate through the Friedewald formula was observed to have an extremely significant correlation (P < 0.001), as compared with the direct method (tab. II). However, the correlation coefficients between the 2 methods are not extremely close (0.6105 to 0.7822) (tab. III). In fact, the Friedewald formula has a positive deviation or bias in regard to the direct method. This bias is neither very pronounced with total cholesterol levels between 70 and 150 mg/dL (mean deviation of 7 ± 21 mg/dL), nor with total cholesterol levels between 151 and 200 mg/dL (8 ± 14.5 mg/dL). But, from total cholesterol levels between 201 and 250 mg/dL onwards, this deviation tends towards increasing, with a mean of 10 ± 15.3 mg/dL. Similarly, with total cholesterol levels > 250 mg/dL, a positive bias of 10 ± 20.4 mg/dL occurs. Therefore, if a patient had an LDL-C level of 125 mg/dL on the direct method, the result by using the estimate of the Friedewald formula could be 139 mg/dL (fig. 1B), considering the linear regression equation obtained for total cholesterol levels between 201 and 250 mg/dL (y = 0.6039 x + 63.7). Therefore, although with no statistical significance, theoretically, LDL-C levels of a part of the population could pass from desirable values (< 130 mg/dL) to borderline values (130-159 mg/dL), which are subject to dietary control and even treatment with statins. Similarly, patients classified as within borderline values through the direct method could pass into the high value range (160-189 mg/dL) through estimate calculation by using the Friedewald formula (fig. 1C).

On the other hand, when assessing the results according to the different levels of triglycerides, a pattern of inversion of that bias is observed (tab. I), although the 2 methods have excellent correlation coefficients (0.9072 to 0.9426) (tab. III). With triglyceride levels up to 150 mg/dL, a mean positive bias of 14 ± 13 mg/dL is observed for the Friedewald formula. Therefore, theoretically, even without statistical significance, a patient with triglycerides < 150 mg/dL and an LDL-C level of 125 mg/dL, by using the direct method, could have an LDL-C level estimated through the Friedewald formula of 139 mg/dL (fig. 2A), considering the linear regression equation for that triglyceride range (y = 0.9746x + 17.6). That hypothetical patient would pass from a desirable LDL-C value to a borderline value. The same would happen to a patient with an LDL-C level of 150 mg/dL measured by the direct method, who would pass from the range of borderline values to that of high values (164 mg/dL) according to the estimate through the formula.

Several authors reported lower results obtained through the direct methods of LDL-C measurement as compared with those obtained through b-quantitation after ultracentrifugation 11,12. Others, however, reported that bias with a certain reagent, and a perfect correlation with another reagent, although both used detergents, but with different principles 13. The reagents used in this study follow a principle of detergent protection similar to the method used in the study cited, which reported no bias, as compared with the reference method. Some authors have also not found that variation in bias in regard to different levels of triglycerides with a method that also uses specific tensoactive agents 12, differently from most direct methods 9, 14-18, which may be due to a difference in the components of the reagents.

In our study, for triglyceride levels between 151 and 200 mg/dL, that bias decreased to 7 ± 14.5 mg/dL, and, for triglyceride levels between 201 and 300 mg/dL, that bias almost did not exist (2 ± 15.3 mg/dL).

On the other hand, in the samples with triglyceride levels between 301 and 400 mg/dL, that bias of the Friedewald formula became negative, with a mean deviation of -16 ± 19.4 mg/dL. This way, as can be demonstrated with our results, a patient with triglyceride levels between 301 and 400 mg/dL and an LDL-C level measured through the direct method of 140 mg/dL could theoretically have an LDL-C level estimated through the Friedewald formula of 126 mg/dL (fig. 2D), considering the linear regression equation for that range of triglyceride levels (y = 0.8999x – 0.1), although no statistical significance was observed. The patient would pass from a borderline LDL-C value to a desirable LDL-C value. The same would happen to a patient with an LDL-C level of 170 mg/dL measured through the direct method, who would pass from the range of high values to the range of borderline values (153 mg/dL).

According to other authors 13,19, one explanation for these higher LDL-C levels obtained through the direct method as compared with those obtained through the Friedewald formula could be the difference in the triglyceride/cholesterol ratio in the VLDL particles in patients with types IIb, III, and IV Fredrickson dyslipidemias. Triglyceride-rich VLDL particles could induce a negative bias in the direct methods 13. Cholesterol-rich VLDL particles could induce a positive bias 19. However, this would not explain the positive bias of the direct method in patients with high triglyceride levels in our study.

Another explanation would be the possibility of measuring the cholesterol present in the particles of intermediate-density lipoproteins (IDL), such as LDL-C, in patients with type III Fredrickson dyslipidemia through some direct methods 13. This could be happening with the method in question, but that hypothesis cannot explain the tendency in all patients with triglyceride levels between 301 and 400 mg/dL, shown in our study. In fact, as reported by those authors, those patients with type III dyslipidemia would tend to be erroneously classified as type IIb using the direct method for measuring LDL-C, overestimating the LDL-C fraction. However, the estimate through the Friedewald formula does not help in the correct classification, overestimating the VLDL fraction (triglycerides/5), because it cannot indicate the presence of IDLs, which could also be suspected only because of the high triglyceride levels. In the specific case of patients with type III dyslipidemia, good communication between the clinician and the laboratory is an excellent contribution to the diagnosis, because the latter would be able to determine whether the method used may overestimate the LDL-C fraction, in the case of the direct method, or the VLDL fraction, in the case of estimate through the Friedewald formula.

For LDL-C estimate, the Friedewald formula standardizes the value of the VLDL fraction as the triglyceride level divided by 5. However, the particles found in patients with hypertriglyceridemia (types IIb, III, IV, and V) are usually a heterogeneous mixture of remaining chylomicrons, VLDL, and remaining VLDL (IDLs). As is already known, the triglyceride/cholesterol ratio varies a lot within that range of particles. In fact, according to our results, the LDL-C estimate through the Friedewald formula has good performance in samples with triglyceride levels between 151 and 300 mg/dL, as compared with the direct method. However, in the extremes of that range, in the samples with triglyceride levels < 150 mg/dL and between 301 and 400 mg/dL, the formula does not have good performance. In fact, according to some authors, the Friedewald formula may erroneously classify up to 25% of the patients with triglyceride levels between 301 and 400 mg/dL 13. That percentage may be even higher, depending on the method used for measuring HDL-C levels.

Thus, patients with triglyceride levels < 150 mg/dL and desirable LDL-C levels measured through the direct method could be being treated based on an LDL-C level estimated through the Friedewald formula. On the other hand, patients with triglyceride levels between 301 and 400 mg/dL and borderline or high LDL-C levels measured through the direct method would not be receiving the appropriate treatment with the results obtained through the use of the Friedewald formula. Obviously, the limits of LDL-C levels for risk classification for coronary artery disease are very narrow, but as those are the values recommended by the III Brazilian Consensus on Dyslipidemias 4, the clinical laboratory should strive to perform the measurement of that fraction with the best possible diagnostic performance, ie, with the lowest coefficient of variation, and with the best likelihood of correctly classifying the patients for assessing the risk for coronary artery disease.

This study, analyzing a sample with more than 10,000 patients, demonstrated that the direct method used for measuring LDL-C has very good performance, with good reproducibility and a coefficient of variation within the requirements of the NCEP, which is hardly obtained with the Friedewald formula. It is worth noting, however, that although one of the objectives was to discuss that the 2 methods do not have identical results, it is still a consensus that the Friedewald formula may be used in patients with triglyceride levels up to 400 mg/dL, who have neither chylomicrons, nor IDLs (type III of the Fredrickson classification) 4,20. In fact, many laboratories still continue to estimate LDL-C levels by using that formula, because of the costs of the reagents for the existing direct LDL-C measuring methods. With a decrease in those costs and a better assessment of the performance of the reagents, the direct methods tend to be more widely used in laboratories, providing a better classification of the patients, with more reliable LDL-C level results, according to the NCEP criteria. Certain populations would benefit extremely by the use of the direct methods, such as diabetic patients, who are naturally prone to developing coronary artery disease, and whose LDL-C levels are not correctly estimated with the Friedewald formula 8.

In the future, new methods may be implemented for determining LDL-C levels, such as one recently described, which is reagent-free and based on infrared spectrophotometric absorption of lipoproteins 21. That method had excellent performance, and its assessment may shed light on the debate about the introduction of new methods for LDL-C measurement.

Recently, some authors reported that 2 direct methods for LDL-C measurement did not have good retrieval of the small, dense LDL subtype (sdLDL), previously separated by ultracentrifugation 22. The determination of that LDL subtype levels has been implicated as a more sensitive factor for assessing the risk of developing coronary artery disease than the determination of total LDL-C has. Methods for the routine sdLDL measurement are still being developed, but, in the near future, the laboratories may also be including that parameter in the lipid and lipoprotein profile available for clinicians 23.

Similarly, the direct method for HDL-C measurement had excellent performance, with a very low coefficient of variation. In our experience, that method has excellent performance in laboratory routine, is easily automated, and does not suffer from interference, as occurs in precipitation methods 1, which cause additional error in LDL-C estimated with the Friedewald formula. Other authors 24 reported that, in comparison with the reference method, the direct method does not provide lower HDL-C levels, as occurs in precipitation methods.

Acknowledgements

We thank the DiaSys Diagnostic Systems by their partial support.

References

Caio M. M. de Cordova

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E-mail:

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Received for publication: 09/10/2003

Accepted for publication: 02/18/2004

English version by Stela Maris Costalonga