RESUMO OBJETIVO:Avaliar a associação do polimorfismo A1166C do gene do receptor AT1 da angiotensina II (AT1R) com o infarto agudo do miocárdio e a severidade da doença arterial coronariana. MÉTODOS: Estudo prospectivo, transversal de 110 pacientes com infarto agudo do miocárdio submetidos à angiografia coronariana com lesão significante (> 50%) avaliada por três critérios de severidade: número de vasos lesados, morfologia da placa aterosclerótica e escore de risco coronariano. Sem lesões coronarianas 104 indivíduos controles. O polimorfismo A1166C do gene do AT1R foi determinado pela reação em cadeia da polimerase no DNA dos leucócitos do sangue periférico. Os fatores de risco coronariano clássicos foram analisados em todos os indivíduos. RESULTADOS: Na estratificação dos genótipos em relação aos fatores de risco apenas o tabagismo teve predominância nos heterozigotos AC (p = 0,02). A freqüência dos genótipos nos pacientes infartados foi de AA = 54,5%; AC = 35,5% e CC = 10%, sendo similar e não significativa em relação aos controles (p = 0,83). Não houve aumento do risco de infarto agudo do miocárdio nas comparações dos genótipos CC vs AA (OR = 1,35; IC-95% = 0,50 - 3,59), AC vs AA (OR = 1,03; IC-95% = 0,58 - 1,84 e AA+AC vs AA (OR = 1,33; IC-95% = 0,51 - 3,45). Nenhum dos critérios de severidade teve associação significativa com os genótipos. CONCLUSÃO: Os nossos resultados indicam não haver associação do polimorfismo A1166C do AT1R com o infarto agudo do miocárdio e nem com a severidade da doença arterial coronariana segundo nossos resultados.
O polimorfismo A1166C do receptor tipo 1 da angiotensina II no infarto agudo do miocárdio
Uberlândia, MG
Universidade Federal de Uberlândia e Instituto do Coração do Triângulo Mineiro
O sistema renina-angiotensina compreende uma cascata de reações enzimáticas, resultando na formação da angiotensina II, a partir do substrato angiotensinogênio. Os efeitos fisiológicos da angiotensina II são mediados por uma via final comum, ligando-se a receptores específicos localizados na membrana celular1,2. Duas isoformas de receptores endoteliais para a angiotensina II são conhecidas até o momento: AT1 e AT2. A maioria dos seus efeitos fisiológicos é mediada pela ativação de receptores do subtipo AT1. Os receptores pertencem à super família de receptores acoplados a proteínas G e, no caso dos receptores AT1 (AT1R), o acoplamento ocorre via proteínas Gq. Conseqüentemente, a estimulação de receptores AT1 ativa a fosfolipase C, aumenta os níveis de diacilglicerol (DAG) e trifosfato de inosotol (IP3), eleva a concentração de Ca+2 intracelular e promove ativação de várias quinases modulando as funções celulares3,4. A angiotensina II atua como mitógeno em células de músculo liso vascular através da ativação de várias vias de sinalização, incluindo fosfolipase C, fosfolipase A2 e fosfolipase D, bem como pela ativação de um grande número de quinases: tirosinaquinases, proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), quinase c-src, Janus e receptores com atividade de tirosina quinase. Ela também estimula fatores de transcrição como a proteína ativadora-1, ativadores de transdução de sinal e transcrição (STATs) e o fator nuclear kappa B (NFkB)5,6. Vários estudos demonstram que os efeitos proliferativos da angiotensina II são mediados pela ativação de receptores AT17. Mais recentemente, foi relatado um estudo em pacientes com infarto do miocárdio, onde níveis circulantes de angiotensina II estavam aumentados e a administração dos antagonistas do AT1R apresentava importante implicação farmaco-terapêutica8.
Com a clonagem do cDNA do receptor AT1 foi identificado um polimorfismo na região 3', não traduzida (A1166C) e correspondente a uma transversão A®C (substituição da adenina por citosina) na posição do nucleotídeo 1166 da seqüência do mRNA, resultando em dois genótipos homozigotos (CC e AA) e o heterozigoto AC9. Os homozigotos CC parecem estar associados com uma maior incidência de infarto do miocárdio10.
Evidências crescentes mostram a importância da participação do sistema renina-angiotensina no processo de proliferação endotelial e aterosclerose coronariana. A ação do receptor AT1 sugere a sua participação na gênese da aterosclerose coronariana e do infarto do miocárdio. O presente estudo tem por objetivo avaliar a associação do polimorfismo A1166C do gene do AT1R com o infarto agudo do miocárdio e com a severidade da doença arterial coronariana.
Estudo prospectivo de delineamento transversal com processo de amostragem consecutiva de 110 pacientes elegíveis (66,6% do sexo masculino e 36,4% do feminino, média de idade 61,82 ± 10,81 anos) foram incluídos no estudo com o diagnóstico de infarto agudo do miocárdio com base em dados clínicos, eletrocardiográficos e enzimáticos11, comprovados pela angiografia coronariana. Os controles corresponderam a 104 indivíduos, 57,7% do sexo feminino e 42,3% masculino, com média de idade 56,69 ± 11,52 anos, portadores de doença cardíaca valvular, dor torácica atípica e doadores para transplante renal que não apresentaram lesões nas artérias coronárias e no músculo cardíaco na cineangiocardiografia. Todos os indivíduos foram submetidos a avaliação dos fatores de risco coronariano clássicos como antecedente familiar em primeiro grau de coronariopatia, níveis de colesterol (HDL < 35 mg/dL, LDL > 159 mg/dL) e triglicérides > 200 mg/dL, antecedentes de tabagismo (fumante ativo ou que tenha deixado de fumar nos últimos 12 meses), hipertensão arterial sistêmica (pressão arterial sistólica > 140 mmHg e diastólica > 90 mmHg), diabetes melittus (indivíduos em tratamento com insulina ou hipoglicemiantes orais ou nível de glicose em jejum = 140 mg/dL), sedentarismo (prática de atividade física aeróbica em uma freqüência inferior a 3 vezes por semana), sobrepeso e obesidade (índice de massa corpórea — IMC > 25 kg/m2). A cineangiocardiografia foi utilizada para comprovação e avaliação da extensão da doença arterial coronariana elegendo-se para o estudo pacientes com lesão obstrutiva maior que 50%.
A severidade da doença arterial coronariana foi avaliada pelos critérios: número de vasos acometidos (uniarterial ou multiarterial)12; característica morfológica da placa aterosclerótica (A: lesão concêntrica proximal < 10 mm; B1: lesão excêntrica entre 10 e 20 mm, com tortuosidade moderada, proximal; B2: lesão excêntrica entre 10 e 20mm, com tortuosidade moderada, distal, ostial ou em bifurcações; C: lesão > 20mm ou oclusão total) segundo Ellis e cols.13; escore de risco coronariano que é um método simples para estimar a quantidade de músculo cardíaco em risco baseado na localização proximal, média, distal e grau de estenose da lesão obstrutiva, sendo que os escores mais elevados estão associados com uma baixa fração de ejeção do ventrículo esquerdo propiciando uma maior informação prognóstica, segundo Califf e cols.14.
Foram excluídos os pacientes com doença maligna sistêmica, enfermidade crônica terminal, antecedentes de infarto do miocárdio prévio, cirurgia de revascularização miocárdica e angioplastia coronariana.
O protocolo de pesquisa foi avaliado e liberado pelo conselho de ética. Todos os pacientes foram informados dos riscos e benefícios potenciais da pesquisa e assinaram o termo de consentimento.
A análise do polimorfismo do gene do AT1R foi realizada pela técnica da reação em cadeia da polimerase (
As amostras foram centrifugadas a 2.500 rpm por 15min., recolheu-se o sobrenadante e adicionaram-se 800 µL de etanol absoluto gelado, misturando-se por inversão até que ocorresse a precipitação. Girou-se o tubo em seu eixo no sentido horizontal, para prender o DNA à parede do tubo, descartando-se o sobrenadante. O pelete foi lavado em 1,0 mL de etanol 70%. Descartou-se o álcool e os peletes foram ressuspendidos em volume variável de TE [TRIS - HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,4)] de acordo com o seu tamanho. A seguir foi feito o cálculo da concentração de DNA por espectrofotômetro a 260 nm. Cada reação consistiu 100 ng de DNA genômico, 25 pmol de primer, 1,5 mmol/L de MgCl2, 0,5 mmol/L de cada dNTP, 1 U de Taq DNA polimerase e tampão da Taq DNA polimerase 1X em um volume de reação de 30 mL. A PCR utilizou o programa: 30 ciclos a 93 ºC por 1,5 min, 58 ºC por 2 min e 72 ºC por 2 min. Um fragmento do gene do AT1R contendo 856 pb, localizado na região 3' não traduzida, foi amplificado pelo par de primers: 5'-AAT GCT TGT AGC CAA AGT CAC CT-3'; 5'-GGC TTT GCT TTG TCT TGT TG-3'. Esta região abriga a variante 1166, caracterizada pela transversão Adenina®Citosina (A® C) no nucleotídeo que ocupa essa posição.
Cada reação de PCR foi feita com: 100 ng de DNA genômico, tampão da Taq-DNA polimerase, 10 pmoles de cada primer, 200 mM de cada dNTP, 2,5 mM de MgCl2 e 1,5 U da enzima Taq-DNA polimerase. O programa utilizado para amplificação do fragmento consistiu de uma desnaturação inicial de 5min. a 95 ºC, seguida por 34 ciclos compostos por desnaturação a 94 ºC por 30s, anelamento a 58 ºC por um minuto e extensão a 72 ºC por 35s. O produto amplificado foi visibilizado em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo. Dez microlitros do produto amplificado foram digeridos com três unidades da enzima de restrição Dde I durante 5h a 37 ºC de acordo com as instruções do fabricante (
No fragmento em estudo do gene AT1R ocorre um sítio de restrição no alelo mutante, pois a substituição de um A por C, cria outro sítio de reconhecimento da enzima Dde I. Assim, o alelo A do gene do AT1R possui um sítio de restrição para a enzima gerando dois fragmentos de 600 e 256 pb e o alelo C, mutante, possui dois sítios produzindo três fragmentos de 600, 146 e 110 pb cada. O produto de restrição foi visibilizado em gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo após eletroforese. Indivíduos homozigotos para o alelo A apresentam duas bandas de 600 e 256 pb, os homozigotos para o alelo C apresentam três bandas de 600, 146 e 110 pb e os heterozigotos A/C possuem quatro bandas de 600, 256, 146 e 110 pb10.
O programa Statistica 5.5 Statsoft, Inc.16 foi utilizado para fazer as análises. Para indicar o nível de significância estatística foi considerado o erro a < 5% (p< 0,05). O teste do qui-quadrado de Pearson foi utilizado para analisar variáveis dicotômicas. As variáveis foram transformadas em numéricas atribuindo-se o valor zero 0 para a ausência e 1 para a presença. As variáveis contínuas foram expressas como média-desvio padrão e as diferenças entre os grupos foram comparadas usando o teste t de Student. O risco relativo foi avaliado pelo cálculo da razão de chances (odds ratio — OR) e seus intervalos de confiança (IC). As diferenças entre as freqüências de pacientes, quanto aos fatores de risco convencionais, em relação às classes genotípicas foram avaliadas por regressão logística17.
A prevalência do tabagismo, do antecedente familiar de coronariopatia, da hipertensão arterial sistêmica, do diabetes mellitus, dos níveis elevados de colesterol total, colesterol LDL e triglicérides foi significativamente alta nos pacientes com infarto agudo do miocárdio em relação aos controles. Apenas a obesidade (avaliada pelo IMC), o sedentarismo e o colesterol HDL não apresentaram significância estatística entre os grupos (
A análise da genotipagem dos pacientes e controles para o polimorfismo A1166C do gene do AT1R, por restrição enzimática com a enzima Dde I resultou em um padrão de bandas diferenciado para os genótipos AA, AC e CC, ocorrido devido à modificação no fragmento amplificado de 856 pb, quando se verifica a substitução de um A (adenina) por um C (citosina) que cria um novo sítio de restrição para essa enzima. Portanto, foi verificado em gel de agarose, corado com brometo de etídeo, o seguinte padrão de bandas: homozigoto AA: bandas de 600 e 256 pb, heterozigoto AC: bandas de 600, 256, 146 e 110 pb e o homozigoto mutante CC: bandas de 600, 146 e 110 pb (
Quando a população dos pacientes infartados e dos indivíduos controles foi estratificada pelos genótipos do AT1R observou-se que não houve predominância de sexo entre os genótipos no grupo controle (p = 0,212) e nem nos pacientes (p = 0,739); a média de idade foi semelhante nos dois grupos (56,3 ±12,9 anos). Quando foram analisados os fatores de risco coronariano clássicos nos indivíduos controles estratificados pelos genótipos do AT1R constatou-se não haver diferença estatística significativa em nenhum deles (
A
A severidade da doença arterial coronariana foi avaliada pelos critérios: número de vasos acometidos (uniarterial ou multiarterial), característica morfológica da placa aterosclerótica (A, B1, B2, C) e o escore de risco coronariano e não foi observada diferença estatística entre os genótipos do AT1R. Os dados observados na
A aterosclerose, processo básico da doença arterial coronariana e a sua manifestação maior, o infarto do miocárdio, tornou-se a principal causa de óbitos no mundo ocidental. É geralmente desencadeado por instabilização da placa aterosclerótica e obstrução abrupta da artéria coronária pela formação de um trombo local18. A participação do componente genético herdado, representado pelo histórico familiar de coronariopatia, já descrito na literatura19, ficou comprovada neste estudo pela maior prevalência no grupo de infartados (p = 0,028). O tabagismo, a hipertensão arterial sistêmica e a hipercolesterolemia (total e LDL) são os principais fatores de risco e contribuem em graus aproximadamente iguais para a doença isquêmica do coração20,21, fatos confirmados nesta pesquisa com elevada significância estatística (p=0,001; p=0,005 e p=0,0001, respectivamente). A hipertrigliceridemia é a alteração lipídica mais comumente associada ao diabetes mellitus22,23, relação constatada neste estudo onde a proporção de diabéticos nos pacientes correspondeu a quase o dobro dos controles. A obesidade e o sedentarismo, diferentemente do descrito na literatura24,25, não foram fatores de risco importantes nessa população.
Os estudos de associação entre o infarto do miocárdio e variações polimórficas de genes candidatos ou de marcadores (seqüência de DNA não codificantes) são empregados para demonstrar o papel de fatores genéticos na etiologia desta doença multifatorial. Como a angiotensina II é o agente fundamental na seqüência de reações que culminam nas suas ações fisiológicas e patológicas, o seu principal receptor, o AT1R, torna-se elemento importante nos estudos que avaliam o papel do SRA no infarto agudo do miocárdio.
Este estudo mostrou não existir predominância de nenhum dos fatores de risco coronariano clássicos entre os genótipos do AT1R nos controles, exceto para o sedentarismo (p = 0,05). No grupo de infartados apenas o tabagismo teve diferença estatística significativa, sendo maior no genótipo AC, indicando a possibilidade da interação com um fator ambiental de alta prevalência com o genótipo26. Como os demais fatores de risco coronariano tiveram distribuição similar entre os genótipos nos controles e infartados é provável que os genótipos do AT1R não estejam associados a esses fatores, no sentido de desenvolver infarto do miocárdio.
Neste estudo a homozigose para o alelo A do polimorfismo A1166C no loco do receptor AT1 foi mais freqüente, tanto nos controles quanto nos infartados. No grupo controle, foi encontrada a distribuição: AA = 56,7%; AC = 35,6%; CC = 7,7% e, na combinação dos genótipos AA/AC de 92,3%. Nos infartados foi AA = 54,5%; AC = 35,5%, CC = 10,0% e na combinação dos genótipos AA/AC de 90,0%. Os resultados indicaram não haver significância estatística entre os grupos (p = 0,83) e que não aumentava a chance de desenvolver infarto agudo do miocárdio, observado nas comparações dos genótipos CC vs AA (OR = 1,35; IC-95% = 0,50 — 3,59), AC vs AA (OR = 1,03; IC-95% = 0,58 — 1,84) e AA+AC vs AA (OR = 1,33; IC-95% = 0,51 — 3,45). Numa pesquisa entre a associação de infarto do miocárdio e o AT1R, Berge e cols.27 encontraram as seguintes freqüências dos genótipos nos controles: AA = 52,1%; AC = 42,7%; CC = 5,2% e na combinação dos genótipos AA+AC = 94,8%. Neste estudo, nos pacientes infartados o genótipo AA correspondeu a 49,3%, o AC a 41,3% e o CC a 9,4% e na combinação dos genótipos AA+AC a 90%. Desta forma, o presente trabalho corroborou estes resultados e demonstrou, também, não haver associação deste polimorfismo com o infarto agudo do miocárdio. Entretanto, Canavy e cols.28, entre outros, demonstraram uma associação positiva do polimorfismo AA1166C com uma prevalência alta do alelo C em pacientes com infarto do miocárdio10,29. Duncan e cols.30, numa recente revisão da literatura de estudos de associação do gene do AT1 centralizados em metas clínicas, descreveram as controvérsias relacionadas a este gene com o infarto do miocárdio.
No presente estudo foi demonstrado não haver associação do polimorfismo A1166C do gene do AT1R com a severidade do acometimento das lesões coronarianas quando foram comparados os genótipos CC vs AC vs AA, CC vs AC e AC vs AA; resultados semelhantes permitiram a outros autores chegarem à mesma conclusão31.
Ao se analisar o polimorfismo A1166C do gene do AT1R à luz dos resultados deste estudo, conclui-se que não há associação dele com o infarto agudo do miocárdio e nem com a severidade da doença arterial coronariana. Os desfechos das principais publicações sobre estes fatos ainda não estão absolutamente determinados, provavelmente, devido à maneira como as análises são realizadas ou às limitações do conjunto de dados obtidos e ao viés de publicação predominante de trabalhos com resultados positivos. Vários outros polimorfismos genéticos, particularmente os relacionados ao sistema renina-angiotensina, estão em andamento e poderão estabelecer, definitivamente, o papel causal destes genes.
Endereço para correspondência Dr. Messias Antônio de Araújo R: Olavo Bilac, 394 Uberlândia - MG - Cep 38401-047 E-mail:
Recebido para publicação em 13/8/03
Aceito em 11/2/04
OBJECTIVE: To assess the association of the A1166C polymorphism of the angiotensin II type-1 receptor (AT1R) gene with acute myocardial infarction and also with the severity of coronary artery disease. METHODS: A prospective, cross-sectional study was carried out with 110 patients with acute myocardial infarction, who, on coronary angiography, had significant lesions (> 50%) assessed according to 3 criteria of severity: number of vessels affected, morphology of the atherosclerotic plaque, and coronary risk score. The control group comprised 104 individuals with no coronary lesions. The A1166C polymorphism of AT1R gene was determined by polymerase chain reaction in the DNA of leukocytes in peripheral blood. The classic coronary risk factors were analyzed in all individuals. RESULTS: When stratifying the genotypes in regard to risk factors, only smoking predominated in the AC heterozygous patients (P = 0.02). The genotypic frequency in the infarcted patients was as follows: AA = 54.5%; AC = 35.5%; and CC = 10%, which was similar and nonsignificant in regard to that in the control group (P = 0.83). No risk increase occurred for acute myocardial infarction when comparing the genotypes as follows: CC vs AA (OR = 1.35; 95% CI = 0.50 - 3.59); AC vs AA (OR = 1.03; 95% CI = 0.58 - 1.84); and AA+AC vs AA (OR = 1.33; 95% CI = 0.51 - 3.45). None of the severity criteria showed a significant correlation with the genotypes. CONCLUSION: According to our results, no correlation exists between the A1166C polymorphism of the angiotensin II type-1 receptor (AT1R) gene and acute myocardial infarction or the severity of coronary artery disease.
The A1166C polymorphism of the angiotensin II type-1 receptor in acute myocardial infarction
Uberlândia, MG - Brazil
Universidade Federal de Uberlândia and Instituto do Coração do Triângulo Mineiro
The renin-angiotensin system comprises a cascade of enzymatic reactions, which results in the production of angiotensin II from the angiotensinogen substrate. The physiological effects of angiotensin II are mediated by a final common pathway, through angiotensin II binding to specific receptors located on the cell membrane 1,2. Two isoforms of endothelial receptors for angiotensin II are known so far: AT1 and AT2. Most of their physiological effects are mediated by the activation of AT1-subtype receptors. The receptors belong to the superfamily of the G-protein-coupled receptors, and, in the case of AT1 receptors (AT1R), coupling occurs via Gq proteins. Consequently, stimulation of AT1 receptors activates phospholipase C, increases the levels of diacylglycerol (DAG) and inosotol triphosphate (IP3), elevates the intracellular Ca+2 concentration, and activates several kinases, modulating cell functions 3,4. Angiotensin II acts as a mitogen in vascular smooth muscle cells by activating several signaling pathways, such as that of phospholipase C, phospholipase A2, and phospholipase D, as well as by activating a large number of kinases, such as tyrosine kinases, mitogen-activated protein kinases (MAPKs), c-src kinase, Janus-associated tyrosine kinase, and receptors with tyrosine-kinase activity. Angiotensin II also stimulates transcription factors, such as the activating protein 1, signal transduction and transcription activators (STATs), and the nuclear factor kappa B (NFkB) 5,6. Several studies have reported that the proliferative effects of angiotensin II are mediated by the activation of AT1 receptors 7. More recently, a study including patients with myocardial infarction and high circulating levels of angiotensin II reported that the administration of AT1R antagonists had a significant pharmacotherapeutic implication 8.
Cloning of cDNA of the AT1 receptor provided the identification of a polymorphism in the nontranslated region 3' (A1166C), corresponding to an A®C transversion (adenine replaced by cytosine) in the position of the nucleotide 1166 of the mRNA sequence, resulting in 1 heterozygous (AC) and 2 homozygous (CC and AA) genotypes 9. The homozygous CC genotype seems to be associated with a greater incidence of myocardial infarction 10.
Increasing evidence has shown the importance of the participation of the renin-angiotensin system in the process of endothelial proliferation and coronary atherosclerosis. The action of the AT1 receptor suggests its participation in the genesis of coronary atherosclerosis and myocardial infarction. This study aimed at assessing the correlation of the A1166C polymorphism of the AT1R gene with acute myocardial infarction and with the severity of coronary artery disease.
A prospective cross-sectional study was carried out with 110 consecutive patients (66.6% of the male sex, and 36.4% of the female sex, mean age = 61.82 ± 10.81 years) diagnosed with acute myocardial infarction based on clinical, electrocardiographic, and enzymatic data 11, and confirmed through coronary angiography. The control group comprised 104 patients (57.7% of the female sex, and 42.3% of the male sex, mean age = 56.69 ± 11.52 years), who were renal transplant donors or had valvular heart disease or atypical chest pain, but had lesions neither in the coronary arteries nor in the cardiac muscle on coronary angiography. All patients underwent assessment of the following classical coronary risk factors: first-degree familial history of coronary artery disease; serum levels of cholesterol (HDL < 35 mg/dL, LDL > 159 mg/dL) and triglycerides (> 200 mg/dL); smoking (active smoker or someone who had quit smoking within the previous 12 months); systemic arterial hypertension (systolic blood pressure > 140 mmHg and diastolic blood pressure > 90 mmHg); diabetes mellitus (patients treated with insulin or oral hypoglycemic agents, or fasting glucose level = 140 mg/dL); sedentary lifestyle (practice of aerobic physical activity at a frequency lower than 3 times a week); overweight; and obesity [body mass index (BMI) > 25 kg/m2]. Coronary angiography was used to confirm the presence or assess the extension of coronary artery disease, and patients with obstructive lesions greater than 50% were selected for the study.
Severity of the coronary artery disease was assessed according to the following criteria: 1) number of vessels affected (single-vessel or multivessel disease) 12; 2) morphological characteristics of the atherosclerotic plaque according to Ellis et al 13 (A: proximal concentric lesion < 10 mm; B1: eccentric lesion between 10 and 20 mm, with moderate proximal tortuosity; B2: eccentric lesion between 10 and 20 mm, with moderate distal, ostial tortuosity, or tortuosity in the bifurcations; C: lesion > 20 mm, or total occlusion); and 3) coronary risk score, which is a simple method to estimate the amount of cardiac muscle at risk based on the location (proximal, middle, or distal) and degree of stenosis of the obstructive lesion. The greatest scores are associated with low left ventricular ejection fraction, providing greater prognostic information, according to Califf et al 14.
Patients with the following conditions were excluded: systemic malignant disease, terminal chronic illness, previous myocardial infarction, coronary artery bypass grafting, coronary angioplasty.
The research protocol was assessed and approved by the committee on ethics. All patients were instructed about the potential risks and benefits of the study and signed a written informed consent.
Analysis of the polymorphism of the AT1R gene was performed by use of the polymerase chain reaction technique (PCR). The DNA extractions were performed according to the DNA isolation method of Sambrook et al 15. Peripheral blood was collected in a 5-mL vacutainer tube with EDTA, stored at 4ºC, and centrifuged for separation of the leukocyte layer. A 500-µL aliquot of the leukocyte layer was transferred to a 1.5-mL Eppendorf tube, and 1.0 mL of the buffer solution of lytic red blood cells [155 mM of NH4Cl, 10 mM of KHCO3, and 1mM of EDTA] was added to each sample, which was then mixed by inversion for 30 seconds. This mixture was centrifuged at 2,500 rpm for 5 minutes for nuclear pelletization. The floating material was ruled out, and the process was repeated 2 to 3 times, until the pellet acquired a light beige color. Then, 150 µL of the buffer solution of nuclear lysis [10 mM of Tris - HCl (pH 8.0), 2 mM of EDTA, 400 mM of NaCl] was added, and the pellet was resuspended. Then, 5 µL of cold 10% sodium dodecyl sulfate and 2.5 µL of proteinase K (20 mg/mL) were added to the solution, and the samples were incubated for 6 hours at 60 ºC. After that, 100 µL of saturated NaCl was added to the samples, which were placed on ice for 10 minutes.
The samples were centrifuged at 2,500 rpm for 15 minutes, the floating material was removed, and 800 µL of cold absolute ethanol were added, mixing by inversion until precipitation occurred. The tube was horizontally rotated on its axis, so that DNA attached to the wall of the tube, and the floating material was ruled out. The pellet was washed in 1.0 mL of 70% ethanol. The alcohol was ruled out and the pellets were resuspended in a variable volume of TE [10 mM of TRIS - HCl, 1 mM of EDTA (pH 7.4)] according to their size. Then, the DNA concentration was calculated with a spectrophotometer at 260 nm. Each reaction consisted of 100 ng of genomic DNA, 25 pmol of primer, 1.5 mmol/L of MgCl2, 0.5 mmol/L of each dNTP, 1 U of Taq DNA polymerase, and Taq DNA polymerase buffer 1X in 30 mL of the reaction. The PCR used the following program: 30 cycles at 93ºC for 1.5 minute, 58ºC for 2 minutes, and 72ºC for 2 minutes. A fragment of the AT1R gene containing 856 pb, located in the nontranslated 3' region was amplified by the pair of primers: 5'-AAT GCT TGT AGC CAA AGT CAC CT-3'; 5'-GGC TTT GCT TTG TCT TGT TG-3'. This region houses the 1166 variant, characterized by the Adenine®Cytosine (A®C) transversion in the nucleotide occupying that position.
Each PCR was performed with 100 ng of genomic DNA, Taq-DNA polymerase buffer, 10 pmoles of each primer, 200 mM of each dNTP, 2.5 mM of MgCl2, and 1.5 U of the Taq-DNA polymerase enzyme. The program used for amplification of the fragment consisted of initial denaturation for 5 minutes at 95ºC, followed by 34 cycles comprising denaturation at 94ºC for 30 seconds, annealing at 58ºC for 1 minute, and extension at 72ºC for 35 seconds. The amplified product was visualized in 1.5% agarose gel stained with ethidium bromide. Ten microliters of the amplified product were digested with 3 units of the Dde I restriction enzyme for 5 hours at 37ºC, according to the instructions of the manufacturer (Life Technologies). This enzyme recognizes the following restriction site: 5'- C ¯ TNAG —3'; 3'- GANT C —5'.
In the AT1R gene fragment studied, a restriction site occurs in the mutant allele, because the replacement of an A by a C creates another site of recognition of the Dde I enzyme. Therefore, the A allele of the AT1R gene has a restriction site for that enzyme generating 2 fragments of 600 and 256 pb, and the mutant C allele has 2 restriction sites producing 3 fragments of 600, 146, and 110 pb each. The restriction product was visualized in 2% agarose gel stained with ethidium bromide after electrophoresis as follows: homozygous individuals for the A allele have 2 bands of 600 and 256 pb; homozygous individuals for the C allele have 3 bands of 600, 146, and 110 pb; and AC heterozygous individuals have 4 bands of 600, 256, 146, and 110 pb 10.
The Statistica 5.5 Statsoft, Inc. program 16 was used to perform the analyses. An error a < 5% (P< 0.05) was considered to indicate the statistical significance level. Pearson chi-square test was used to analyze the dichotomous variables. The variables were transformed into numerals by attributing a zero value for the absence and 1 for the presence. The continuous variables were expressed as mean ± standard deviation, and the differences between the groups were compared using the Student
The prevalence of smoking, familial history of coronary artery disease, systemic arterial hypertension, diabetes mellitus, and high levels of total cholesterol, LDL-cholesterol and triglycerides was significantly high in patients with acute myocardial infarction as compared with that of the control group. Only obesity (assessed through BMI), sedentary lifestyle, and HDL-cholesterol showed no statistical significance in the groups (
Genotyping of the patients and controls for A1166C polymorphism of the AT1R gene by use of Dde I enzyme restriction resulted in a differentiated band pattern for the AA, AC, and CC genotypes. This was due to the modification in the amplified fragment of 856 pb, when replacement of an A (adenine) by a C (cytosine) occurred, creating a new restriction site for that enzyme. Therefore, the following band pattern was observed in the agarose gel stained with ethidium bromide: AA homozygous, 600 and 256 pb bands; AC heterozygous: 600, 256, 146, and 110 pb bands; and mutant CC homozygous: 600, 146, and 110 pb bands (
Stratifying the population of the infarcted and control patients by the AT1R genotypes, no sex predominance was observed between the genotypes in the control group (P = 0.212) and in the infarcted patients (P = 0.739), the mean age being similar in both groups (56.3 ± 12.9 years). Analyzing the classical coronary risk factors in the controls stratified by the AT1R genotypes, no significant statistical difference was observed (
The severity of coronary artery disease was assessed by using the following criteria: number of vessels affected (single-vessel or multivessel disease); morphological characteristic of the atherosclerotic plaque (A, B1, B2, C); and the coronary risk score. No statistical difference was observed between the AT1R genotypes. The comparisons of the genotypes (CC vs AC vs AA) showed no difference between the groups (P < 0.05), a fact also observed in the comparisons CC vs AC and CC vs AA (
Atherosclerosis, the basic process of coronary artery disease, and its major manifestation, myocardial infarction, has become the major cause of death in the occident world. It is usually triggered by destabilization of the atherosclerotic plaque and sudden obstruction of the coronary artery by formation of a local thrombus 18. The participation of an inherited genetic component, represented by the familial history of coronary artery disease, already described in the literature 19, was confirmed in this study by its greater prevalence in the group of infarcted patients (P = 0.028). Smoking, systemic arterial hypertension, and hypercholesterolemia (total and LDL) are the major risk factors, contributing in approximately equal degrees to ischemic heart disease 20,21, facts confirmed in this study with elevated statistical significance (P = 0.001; P = 0.005; and P = 0.0001, respectively). Hypertriglyceridemia is the lipid alteration most commonly associated with diabetes mellitus 22,23, a correlation observed in this study, in which the proportion of diabetic individuals among the infarcted patients corresponded to almost twice that among controls. Obesity and sedentary lifestyle, contrary to that which has been reported in the literature 24,25, were not important risk factors in that population.
The studies about the correlation between myocardial infarction and polymorphic variations in candidate genes or markers (noncodifying DNA sequence) are used to demonstrate the role played by genetic factors in the etiology of this multifactorial disease. As angiotensin II is the fundamental agent in the sequence of reactions that culminate with its physiological and pathological actions, its major receptor, AT1R, is an important element for the studies assessing the role of the renin-angiotensin system (RAS) in acute myocardial infarction.
This study showed that the classical coronary risk factors did not predominate among the AT1R genotypes in controls, except for sedentary lifestyle (P = 0.05). In the group of infarcted patients, only smoking had a significant statistical difference, greater for the AC genotype, indicating that an interaction of a highly prevalent environmental factor with genotype may exist 26. As the other coronary risk factors had a similar distribution among the genotypes of controls and infarcted individuals, the AT1R genotypes are likely not to be associated with these factors, in regard to the development of myocardial infarction.
In this study, homozygosis for the A allele of the A1166C polymorphism in the locus of the AT1 receptor was more frequent both in controls and infarcted individuals. In the control group, the following distribution was observed: AA = 56.7%; AC = 35.6%; CC = 7.7%; and the genotypic combination AA/AC = 92.3%. In the infarcted individuals, the distribution was as follows: AA = 54.5%; AC = 35.5%, CC = 10.0%; and the genotypic combination AA/AC = 90.0%. The results showed no statistical significance between the groups (P = 0.83) and that the chance of developing acute myocardial infarction did not increase, which was observed in the comparisons of the genotypes CC vs AA (OR = 1.35; 95% CI = 0.50 — 3.59), AC vs AA (OR = 1.03; 95% CI = 0.58 — 1.84), and AA+AC vs AA (OR = 1.33; 95% CI = 0.51 — 3.45). In a study about the correlation between myocardial infarction and AT1R, Berge et al 27 reported the following frequencies of the genotypes in controls: AA = 52.1%; AC = 42.7%; CC = 5.2%; and the combination of genotypes AA+AC = 94.8%. In our study, the frequencies of the genotypes in infarcted patients were as follows: AA = 49.3%; AC = 41.3%; CC = 9.4%, and the combination of genotypes AA+AC = 90%. Therefore, this study corroborated those results and also showed no correlation between that polymorphism and acute myocardial infarction. However, Canavy et al 28 reported a positive correlation between AA1166C polymorphism and the high prevalence of the C allele in patients with myocardial infarction 10,29. Duncan et al 30, in a recent literature review of the studies on the associations of the AT1 gene focused on clinical goals, reported the controversies of the association between that gene and myocardial infarction.
The present study showed no association between the A1166C polymorphism of the AT1R gene and the severity of the coronary lesions, when comparing the genotypes CC vs AC vs AA, CC vs AC, and AC vs AA. Similar results allowed other authors to reach the same conclusion 31.
Analyzing A1166C polymorphism of the AT1R gene considering the results of this study, one can conclude that no correlation exists between that gene polymorphism and acute myocardial infarction, and the severity of coronary artery disease. The outcomes of the major publications about these facts have not been completely determined, probably due to the way the analyses are performed, the limitations of the data obtained, and the bias of the predominance of studies reporting positive results. Several other studies on gene polymorphisms, particularly those related to the renin-angiotensin system, are being carried out and may definitely establish the causal role played by these genes.
Correspondence to Messias Antônio de Araújo Rua Olavo Bilac, 394 Cep 38401-047 - Uberlândia, MG, Brazil E-mail:
Received for publication: 8/13/03
Accepted for publication: 2/11/04
English version by Stela Maris Costalonga