abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil WZSjZNj8WCktPgXQqZygSmJ 00004 S0066-782X2004001600004 S0066-782X(04)08300404 10.1590/S0066-782X2004001600004 Artigos Originais O transplante em conjunto de células mioblásticas esqueléticas e mesenquimais (cocultivadas) na disfunção ventricular pós-infarto do miocárdio Souza Luiz Cesar Guarita Carvalho Katherine Athayde Teixeira de Rebelatto Carmen Senegaglia Alessandra Furuta Marcus Miyague Nelson Hansen Paula Francisco Julio C Brofman Paulo Roberto Slud Paraná Pontifícia Universidade Católica do Paraná Brazil 10 2004 83 4 288 293 03 04 2004 22 06 2004 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

OBJETIVO: A terapia celular no miocárdio tem sido realizada fundamentalmente com dois tipos celulares: as células mioblásticas esqueléticas (miogênicas) e as mesenquimais (angiogênicas) com resultados satisfatórios. Foi analisado o resultado do transplante em conjunto destas células (CEM) em ratos infartados. MÉTODOS: Foram induzidos ao infarto do miocárdio, por meio de ligadura da coronária esquerda 26 ratos Wistar. Após uma semana, os animais foram submetidos à ecocardiografia para avaliação da fração de ejeção (FE,%) e dos volumes diastólico e sistólico finais do ventrículo esquerdo (VDF, VSF,ml). Após dois dias os animais foram reoperados e divididos em dois grupos: 1) controle (n=10) que recebeu 0,15 ml de meio de cultura e 2) CEM (n=16) que recebeu 7.5x106 células mioblásticas esqueléticas e mesenquimais, heterólogas, na região do infarto. As células foram obtidas a partir da punção da crista ilíaca e da biópsia do músculo esquelético, ambas submetidas à cultura celular in vitro. Após um mês, os animais foram submetidos a nova ecocardiografia. RESULTADOS: Não houve diferença significativa entre os dois grupos quanto a FE, VDF e VSF nos valores ecocardiográficos de base. Um mês após o transplante, foram observados diminuição da FE no grupo controle (29.31 ± 5.6% para 23.54 ± 6.51% p=0.048) e acréscimo da FE no grupo CEM (24.03 ± 8.68% para 31.77 ± 9.06%, p=0.011). Identificou-se a presença de neovasos e fibras musculares, nas regiões de fibrose miocárdica no grupo CEM. CONCLUSÃO: O cocultivo das células mioblásticas esqueléticas e das células mesenquimais é funcionalmente efetivo.

 Transplante células mioblásticas esqueléticas células mesenquimais disfunção ventricular infarto do miocárdio 22 10 2004

ARTIGO ORIGINAL

O transplante em conjunto de células mioblásticas esqueléticas e mesenquimais (cocultivadas) na disfunção ventricular pós-infarto do miocárdio

Luiz Cesar Guarita Souza; Katherine Athayde Teixeira de Carvalho; Carmen Rebelatto; Alessandra Senegaglia; Marcus Furuta; Nelson Miyague; Paula Hansen; Julio C Francisco; Paulo Roberto Slud Brofman

Curitiba, PR

Pontifícia Universidade Católica do Paraná

Endereço para Correspondência

RESUMO

OBJETIVO: A terapia celular no miocárdio tem sido realizada fundamentalmente com dois tipos celulares: as células mioblásticas esqueléticas (miogênicas) e as mesenquimais (angiogênicas) com resultados satisfatórios. Foi analisado o resultado do transplante em conjunto destas células (CEM) em ratos infartados.

MÉTODOS: Foram induzidos ao infarto do miocárdio, por meio de ligadura da coronária esquerda 26 ratos Wistar. Após uma semana, os animais foram submetidos à ecocardiografia para avaliação da fração de ejeção (FE,%) e dos volumes diastólico e sistólico finais do ventrículo esquerdo (VDF, VSF,ml). Após dois dias os animais foram reoperados e divididos em dois grupos: 1) controle (n=10) que recebeu 0,15 ml de meio de cultura e 2) CEM (n=16) que recebeu 7.5x106 células mioblásticas esqueléticas e mesenquimais, heterólogas, na região do infarto. As células foram obtidas a partir da punção da crista ilíaca e da biópsia do músculo esquelético, ambas submetidas à cultura celular in vitro. Após um mês, os animais foram submetidos a nova ecocardiografia.

RESULTADOS: Não houve diferença significativa entre os dois grupos quanto a FE, VDF e VSF nos valores ecocardiográficos de base. Um mês após o transplante, foram observados diminuição da FE no grupo controle (29.31 ± 5.6% para 23.54 ± 6.51% p=0.048) e acréscimo da FE no grupo CEM (24.03 ± 8.68% para 31.77 ± 9.06%, p=0.011). Identificou-se a presença de neovasos e fibras musculares, nas regiões de fibrose miocárdica no grupo CEM.

CONCLUSÃO: O cocultivo das células mioblásticas esqueléticas e das células mesenquimais é funcionalmente efetivo.

Palavras-chave: Transplante, células mioblásticas esqueléticas, células mesenquimais, disfunção ventricular, infarto do miocárdio

Embora existam evidências de divisão mitótica no coração1 após o infarto do miocárdio, na grande maioria das vezes, os cardiomiócitos não se regeneram e a insuficiência cardíaca pode ser uma das complicações. Os tratamentos atuais propostos, tanto clínicos como cirúrgicos, tratam, fundamentalmente, as conseqüências do infarto do miocárdio.

Duas novas linhas de pesquisas estão sendo propostas para tratar a principal consequência do infarto do miocárdio, que é a perda da célula contrátil, objetivando a regeneração miocárdica: a administração de fatores angiogênicos e o transplante de células.

As células mioblásticas esqueléticas2-5 e as mesenquimais6-8 (originárias das células da medula óssea), estão sendo utilizadas em vários estudos, tanto experimentais como clínicos, com resultados satisfatórios.

Apesar do transplante das células mioblásticas esqueléticas ter se mostrado efetivo no miocárdio infartado, pois estas células puderam se diferenciar em músculo viável na fibrose miocárdica, a sua não diferenciação morfológica em cardiomiócito, a ausência de discos intercalares entre as células transplantadas e os cardiomiócitos adultos nativos, dificultando a conexão entre eles, e a presença de arritmia ventricular pós-transplante9 (provavelmente de origem isquêmica) em alguns pacientes, apresentam alguns questionamentos.

Por outro lado, a característica das células da medula óssea de se diferenciar de acordo com o meio em que estejam em contato10, abriu uma perspectiva, dentre várias outras, para a regeneração do músculo infartado. As células da medula óssea podem sofrer dois processos de diferenciação11, a linhagem hematopoiética, que originará as células do sangue (linfócitos, eosinófilos, basófilos, neutrófilos, células vermelhas e plaquetas) e a linhagem mesenquimal que poderá originar células musculares, hepatócitos, osteócitos e condrócitos.

Alguns trabalhos6, no infarto agudo do miocárdio sugerem uma melhora funcional após o transplante das células da medula óssea, outros uma diferenciação em cardiomiócitos7 e, outros ainda, apenas um potencial angiogênico12.

Assim, o objetivo deste trabalho foi realizar uma análise funcional e anatomopatológica do transplante em conjunto de células mioblásticas esqueléticas e mesenquimais, cocultivadas, no miocárdio infartado.

Métodos

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o "Guia de Cuidados de Animais", aprovado pela Sociedade Americana de Fisiologia.

Foram operados 50 ratos Wistar com peso médio de 250g. A indução anestésica foi realizada com a administração de 50mg/kg/ de ketamina e 10mg/kg/ de xylazina, ambas por via intramuscular. Os animais foram submetidos à entubação endotraqueal, sem exposição cirúrgica da traquéia e ventilação mecânica com freqüência de 55 ciclos/min com 2.5 ml de volume (Harvard®, Inc., respirador modelo 683, Massachusetts, USA).

Em todos os animais foi realizada toracotomia lateral esquerda, pela qual se procedeu à pericardiotomia e, em seguida, à ligadura da artéria coronária esquerda, com fio poliproplilene 7/0 (Ethicon®, Inc., Somerville, NJ), induzindo o infarto da parede ântero-lateral do ventrículo esquerdo. Foi comprovada a efetividade do procedimento quando houve alteração da coloração da parede ventricular esquerda. Ocorreu uma mortalidade de 30% dos animais submetidos ao procedimento.

Passados sete dias do infarto do miocárdio, os animais foram submetidos a anestesia com administração de 50mg/kg/ de ketamina e 10mg/kg/ de xylazina, ambas por via intramuscular e a avaliação ecocardiográfica transtorácica bidimensional (Hewlet Packard modelo Sonos 5500, com transdutores setorial S12 (5 -12 mHz) e limiar 15L6 (7-15mHz), permitindo uma análise de até 160Hz e especificamente produzida para estudo ultra-sônico em pequenos animais. O transdutor foi posicionado na porção ântero-lateral esquerda do tórax e os corações foram visualizados pelo modo bidimensional com visão axial do ventrículo esquerdo, incluindo a valva mitral, aórtica e o ápex na mesma imagem. A conversão digital da imagem foi obtida pela delimitação do septo interventricular e a parede posterior do ventrículo esquerdo. A seguir realizaram-se as seguintes medidas: superfície sistólica e diastólica finais, comprimento sistólico e diastólico finais do ventrículo esquerdo e freqüência cardíaca, para posteriores cálculos dos volumes sistólico e diastólico finais e da fração de ejeção do ventrículo esquerdo. Todas as medidas foram realizadas pelo mesmo ecocardiografista, três vezes, sendo em seguida calculada a média de cada parâmetro, de forma cega, ou seja, o examinador desconhecia a fase do estudo e a qual grupo o animal pertencia. Somente foram incluídos no estudo animais com fração de ejeção do ventrículo esquerdo < 40%, justamente para caracterizar disfunção ventricular. Os animais que apresentaram fração de ejeção > 40%, foram excluídos do estudo, o que correspondeu a 18% dos animais.

Volume ventricular-fórmula: V=8x(S)2/(3x3.1415926xC), onde V=volume, S=área e C=peso.

Fração de ejeção do ventrículo esquerdo-fórmula: FE= VDF - VSF/VDF, onde FE = fração de ejeção do ventrículo esquerdo, VDF = volume diastólico final do ventrículo esquerdo, VSF = volume sistólico final do ventrículo esquerdo.

A partir deste momento os animais foram divididos em dois grupos: controle, n=10 e CEM (esquelética e mesenquimal), n=16.

O isolamento das células mioblásticas esqueléticas foi realizado após biópsia do músculo esquelético do membro inferior, através da técnica de Delaporte13 e o isolamento das células mesenquimais foi realizado a partir da punção aspirativa da medula óssea, da crista ilíaca póstero-superior de ratos Wistar14. Após a centrifugação das células e separação por gradiente de densidade, utilizando a solução Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences), as células mesenquimais aderiram à superfície das placas, ao passo que as de origem hematopoiéticas não. Após centrifugação das células da medula óssea, as células mononucleares foram distribuídas nos frascos e após 48h seguiu-se à lavagem com PBS, restando aderidas apenas as células estromais, que continham as células mesenquimais.

Foram realizados ensaios em frascos de 25cm2 de área e as células semeadas na proporção 2 células mioblásticas esqueléticas para 1 célula mesenquimal (2:1), cerca de 5 x105/ml por 12 dias. O meio de cultura utilizado foi o DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium), contendo 15% de FCS (Fetal Calf Serum) 1% de antibiótico e 10ng/ml de IGF-I (insuline growth factor)(Gibcco BRL, Life Technologies, Inc, Rockville, Md). As culturas foram mantidas em estufa com 5% de CO2 á 37ºC. Como trata-se de co-cultivo, combinações dessas células foram distribuídas por 12 dias, sendo o meio de cultura trocado a cada 48h.

Realizada a análise histológica da cultura celular, a identificação das células de origem muscular através da marcação com o anticorpo anti-desmina (Dako-Anti-Human Desmin-Clone D33). (fig. 1) e das células mesenquimais foi realizada através da marcação com a proteína anti-vimentina (Imunoperoxidase-Sigma, IMMH-10-Vimentin S-20 Santa Cruz Biotechnology, FITC) (fig. 2).

A viabilidade das células transplantadas variou de 85 a 95%, através da coloração de azul de Tripan.

Os estudos histológicos, das peças anatômicas, foram realizados com a hematoxilina-eosina e tricômico de Gomori, para identificação de zonas de infarto do miocárdio e a presença ou não de novas estruturas na fibrose miocárdica

Utilizou-se o Anti-BrDu (Bromodeoxyuridine-monoclonal antibody detecting cells proliferation and activation, BD) por meio da imunofluorescência direta, para marcar as células antes do transplante e poder identificá-las após o procedimento.

Nove dias após o infarto do miocárdio, os animais foram reoperados, submetidos a uma esternotomia mediana. Após individualização da área do miocárdio infartada, foi realizada injeção subepicárdica de 0.15 ml de meio de cultura (MEM a 57% e BSA a 0.5% Fraction V, Sigma) no grupo controle. O grupo CEM recebeu células mioblásticas esqueléticas e células mesenquimais heterólogas na quantidade de 7.5x106 células diluídas em 0,15 ml de meio de cultura. Todos os animais receberam ciclosporina (15mg/kg/peso/dia) antes da esternotomia e manteve-se a mesma dosagem até o dia do sacrifício.

Um mês após o transplante das células, todos os animais foram submetidos a uma nova avaliação ecocardiográfica, avaliando-se os mesmos parâmetros usados no exame pré-transplante. Em seguida, os animais foram sacrificados para avaliação anatomopatológica.

Os dados foram apresentados sob a forma de médias ± SD e a significância estatística foi aceita quando o p<0.05. Comparação entre os grupos nos períodos de base e 1 mês após o transplante foi realizada com teste t pareado.

Após a avaliação da homogeneidade da variância e a distribuição normal dos dados, a análise da variância foi realizada para determinar a diferença entre os grupos em cada período (base e 1 mês). O teste de Fisher para analisar a proporção de casos que melhoraram ou mantiveram-se estáveis após um mês do transplante.

Resultados

Não houve diferença estatística entre os dois grupos, controle e CEM, nos parâmetros da fração de ejeção e dos volumes sistólico e diastólico finais do ventrículo esquerdo, após o infarto do miocárdio e antes do transplante. Todos os animais foram considerados homogêneos (29.31 ± 5.60% e 24.03 ± 8.68% p=0.10, 0,36 ± 0,09 e 0,37 ± 0,06 p=0.593 e 0.50 ± 0.11ml e 0.49 ± 0.08ml, p=0.757, respectivamente).

Entretanto, 1 mês após o transplante das células, foi observada uma diferença significativa entre o grupo CEM e o grupo controle no parâmetro da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (31.77 ± 9.06% vs 23.54±6.51% p=0.020) (fig. 3).

Analisando-se os grupos individualmente, observou-se um decréscimo da fração de ejeção do ventrículo esquerdo no grupo controle (29.31±5.60% para 23.54±6.51% p=0.048) e um acréscimo da fração de ejeção no grupo CEM (24.03±8.68% para 31.77±9.06% p=0.011) (tab. I).

Analisando-se o volume diastólico final do ventrículo esquerdo, não foi identificada diferença estatística entre o grupo controle e o grupo CEM, após um mês do transplante (0.69 ± 0.19ml vs 0.67 ± 0.12ml, p=0.791, respectivamente). (fig. 4). Entretanto, os grupos, controle e CEM, isoladamente, apresentaram um aumento do volume diastólico final do ventrículo esquerdo (0.50 ± 0.11ml para 0.69 ± 0.19ml p=0.008 e 0.49 ± 0.08ml para 0.67 ± 0.12ml p<0.001, respectivamente). (tab. II).

Analisando-se o volume sistólico final do ventrículo esquerdo, não foi identificada diferença estatística entre o grupo controle e o grupo CEM, um mês após o transplante (0,54 ± 0,17ml vs 0,47 ± 0,12ml, p=0.233, respectivamente). (fig. 5). Entretanto, os grupos, controle e CEM, isoladamente, apresentaram um aumento do volume sistólico final do ventrículo esquerdo (0,36 ± 0,09ml para 0,36 ± 0,09ml p=0.002 e 0,37 ± 0,06 para 0,47 ± 0,12ml p=0.011, respectivamente) (tab. III).

Analisando-se os animais individualmente em cada grupo, observou-se que no grupo CEM, dos 16 animais, 14 (87.5%) animais apresentaram melhora da fração de ejeção. No grupo controle, dos 10 animais, oito apresentaram piora da função e apenas dois (20%) apresentaram melhora, apesar de não terem sido submetidos ao transplante de células (tab. IV). Os animais foram sacrificados um mês após o transplante das células, os corações removidos e divididos em duas partes, o ápex contendo a área de infarto e a base. Cada parte foi congelada em nitrogênio líquido a -80°C e submetida a cortes fracionados a cada cinco micra, envolvendo a zona de transição entre o miocárdio íntegro e a região de fibrose.

Identificaram-se células transplantadas na região de infarto, após um mês, no grupo CEM, através da coloração com hematoxilina-eosina e tricômico de Gomori.

Morfologicamente, as células identificadas apresentavam característica de fibra muscular esquelética que coloniza a região de fibrose. Identificou-se também a formação de novos vasos sangüíneos nessa região, no grupo CEM. No grupo controle, comparativamente, não foi visualizada a presença de músculo e nem de vasos sangüíneos na região de fibrose miocárdica (fig. 6a e b).

No grupo CEM, as células transplantadas foram identificadas com o anti-BrDu, 24h após o transplante (fig. 7).

Discussão

Na grande maioria dos estudos onde se realiza o transplante de mioblastos esqueléticos no miocárdio tem-se objetivado a recolonização das regiões de fibrose miocárdica, com células contráteis. Esses estudos, tanto experimentais2-4 como clínicos5, sugerem uma melhora funcional do coração; entretanto a não diferenciação dos mioblastos esqueléticos em cardiomiócitos, a ausência das junções GAP entre as células transplantadas e o miocárdio íntegro e as arritmias ventriculares identificadas em alguns pacientes operados9, não poderiam deixar de serem questionadas.

Por outro lado, nos estudos com células da medula óssea, existem algumas divergências em relação à sua diferenciação em cardiomiócitos e o real benefício funcional que o transplante dessas células poderia proporcionar. Orlic e cols.8 realizaram o transplante de células da medula óssea na região de transição entre o miocárdio íntegro e o infartado, após 5h de oclusão de coronária descendente anterior, identificando uma melhora funcional do coração, com presença de células endoteliais e músculo liso nos animais estudados. Entretanto, células da medula óssea diferenciadas em cardiomiócitos não foram identificadas na região infartada, apenas na zona de transição. A presença de músculo liso pode ser justificada pela estrutura da túnica média do vaso sangüíneo neoformado.

Ferem e cols.15, acreditam que as células mononucleares da medula óssea, quando transplantadas em pacientes com miocardiopatia isquêmica, apresentam benefícios funcional e clínico importantes.

A característica fundamental das células da medula óssea, principalmente das células mesenquimais, é a sua diferenciação meio dependente, ou seja, estas células adquirem as características das células com que estão em contato. Por exemplo, as células da medula óssea, em contato com osso, terão tendência de se diferenciar em osso; da mesma forma, as que estiverem em contato com células do fígado, se diferenciarão em hepatócitos; se em contato com células cardíacas poderão diferenciar-se em cardiomiócitos, e assim por diante16. Seguindo este mesmo raciocínio, quando essas células fossem transplantadas para uma região de infarto do miocárdio crônico, ou seja, com fibrose, essas células, conseqüentemente, teriam a tendência de se diferenciar em fibrose. Partindo deste princípio, é difícil acreditar que as células da medula óssea poderiam recolonizar o miocárdio infartado, cronicamente, com novas fibras musculares cardíacas.

Alguns trabalhos12,17 têm demonstrado, à anatomia patológica, que quando se transplantam células da medula óssea (mononucleares e/ou mesenquimais) em modelos de infarto crônico do miocárdio, observa-se uma neoformação de vasos sangüíneos na região da fibrose miocárdica.

A idéia de associação das células mioblásticas esqueléticas, que de fato recolonizam o miocárdio infartado com novas fibras musculares de origem esquelética, e das células derivadas de medula óssea, que estimulam a formação de novos vasos na região de fibrose, foi justamente sustentada na hipótese de realizar uma regeneração ângio-muscular e não somente muscular e ou angiogênica isoladamente.

Analisando-se isoladamente o grupo CEM, a melhora funcional identificada entre o período após o infarto do miocárdio e um mês após o transplante das células foi significativa (24,03 ± 8,68% para 31,77 ± 9,06; p=0.011). O mesmo ocorre quando o grupo CEM é comparado com o grupo controle após um mês do transplante (23,54 ± 6,51% vs 31,77 ± 9,06%; p=0.020). Estes dados sugerem a efetividade do transplante de células cocultivadas. Entretanto, é difícil identificar qual das células transplantadas, se não ambas, é a responsável pelo aumento da fração de ejeção do ventrículo esquerdo.

Ainda na análise funcional, utilizando-se apenas os animais que mantiveram estável ou melhoraram a fração de ejeção do ventrículo esquerdo, observou-se que o efeito placebo esteve presente em dois animais do grupo controle, pois apresentaram melhora mesmo sem qualquer tipo de tratamento. No grupo CEM 14 (87,5%) animais dentre os 16 apresentaram melhora. O fato de dois animais não terem apresentado melhora da função cardíaca, pode ter sido atribuído a problemas técnicos, como falha na injeção das células ou até sua embolização.

Apesar da efetividade do transplante de células no grupo CEM, no parâmetro da fração de ejeção do ventrículo esquerdo, foi observado um aumento significativo do volume diastólico final do ventrículo esquerdo (p<0.001) após um mês do transplante, sugerindo a ocorrência do remodelamento ventricular independentemente da melhora da função cardíaca. O grupo controle apresentou evolução de forma semelhante, e foi diferença significativa não foi observada entre ambos os grupos neste parâmetro e no mesmo período. Vários trabalhos com transplante de mioblásto esquelético2,4 no miocárdio infartado, apresentam o remodelamento ventricular, apesar da melhora funcional, inclusive em estudos clínicos9. Acredita-se que a capacidade de regeneração do miocárdio infartado, com as células mioblásticas esqueléticas seja limitada apenas ao local onde as células foram injetadas, não tendo efeito global anti-remodelamento ventricular.

Com relação ao volume sistólico final do ventrículo esquerdo, observou-se um aumento tanto no grupo controle como no grupo CEM, após um mês do transplante, sugerindo uma perda da atividade contrátil (p=0.002 e p=0.011, respectivamente).

Em um estudo realizado por Pouzet e cols.18, onde foram analisados animais submetidos ao transplante de mioblastos esqueléticos associado ao tratamento clínico com inibidor da angiotensina, observou-se uma limitação da dilatação ventricular esquerda, provavelmente, em decorrência dos efeitos do tratamento clínico.

Os mecanismos responsáveis pela melhora da função cardíaca após o transplante de mioblastos esqueléticos ainda não estão bem definidos; acredita-se que possa ser por uma forma ativa, pela melhora da contratilidade regional e por que diminui a região de infarto. Entretanto é importante ressaltar que existe uma relação direta entre o número de células transplantadas e a melhora funcional19 e que o benefício do transplante depende também da qualidade das células transplantadas e da sua sobrevivência após o transplante20, visto que uma grande porcentagem de células morre após o transplante.

Em um outro estudo17 comparando-se os efeitos do transplante isolado de mioblastos esqueléticos e células mesenquimais no infarto do miocárdio, observou-se uma melhora significativa da fração de ejeção do ventrículo esquerdo no grupo que recebeu células mioblásticas em relação ao grupo controle; já o grupo que recebeu células mesenquimais apresentou uma estabilização da fração de ejeção do ventrículo esquerdo. Neste grupo, à anatomia patológica, não se identificaram novas fibras musculares na região de infarto, local da injeção das células, e sim uma intensa neoangiogênese. Tal característica que pode justificar a estabilização da fração de ejeção do ventrículo esquerdo, pois a formação de novos vasos sangüíneos pode diminuir a apoptose, a expansão do infarto, preservando o miocárdio. Resultado funcional semelhante foi também observado em outro estudo21, onde foram comparadas as células de linhagem hematopoiéticas (CD 133+) e as células mioblásticas esqueléticas.

A presença de arritmia, demonstrada por Menasché e cols.9 em seus estudos com células mioblásticas esqueléticas, não foi um achado isolado, Zhang e cols.22, também, sugerem que as células da medula óssea embrionárias, quando transplantadas no miocárdio infartado, também podem apresentar características arritmogênicas.

A isquemia miocárdica, dentre outras, é uma das causas de arritmias ventriculares. Assim, acredita-se que no grupo de estudo do Menasché e cols.9, a causa das arritmias possa ser isquêmica, pois após o transplante de células esqueléticas em uma região de fibrose, a região tornou-se viável, visualizada por tomografia com emissão de pósitrons (PET-SCAN). Entretanto, nessa região, previamente infartada e agora viável, pode-se suspeitar que houve isquemia miocárdica, pois o suprimento sangüíneo nos pacientes estudados estava ausente, em decorrência de uma oclusão coronariana sem circulação colateral.

Neste estudo, a identificação, à anatomia patológica, de novas fibras musculares na região de fibrose e a presença de novos vasos sangüíneos na região, corroboram com a hipótese da regeneração angiomuscular.

Segundo Pouzet e cols.18, existe uma importante mortalidade das células logo após o transplante, possivelmente em decorrência da própria reação inflamatória local do infarto ou mesmo da injeção das células. Um das causas da mortalidade tardia das células transplantadas, poderia ser a isquemia crônica na região. A presença de novos vasos sangüíneos, na região onde as células musculares foram transplantadas, pode auxiliar na preservação das novas fibras musculares e diminuir a isquemia, atrofia e morte dos cardiomiócitos.

Em conclusão, a associação das células mioblásticas esqueléticas e mesenquimais mostrou-se efetiva na regeneração da fibrose miocárdica, com identificação de novas fibras musculares esqueléticas e novos vasos sangüíneos na região de fibrose miocárdica.

Agradecimentos

Ao Dr. Marcio Scorsin e à CAPES.

Endereço para Correspondência

Luiz César Guarita Souza

Rua Silveira Peixoto, 1062/162

80240-120

Curitiba – PR

E-mail:

llccggss@hotmail.com

Enviado para publicação em 03/04/2004

Aceito em 22/06/2004

1. Kajstura J, Leri A, Finato N, et al. Myocite proliferation in end-stage cardiac failure in humans. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95:8801-5. Myocite proliferation in end-stage cardiac failure in humans Proc Natl Acad Sci USA. 1998 8801 5 95 Kajstura J Leri A Finato N 2. Ghostine S, Carrion C, Guarita Souza LC, et al. Long term efficacy of myoblast transplantation on regional structure and function afer myocardial infartction. Circulation.2002;106(Suppl I):131-136. Long term efficacy of myoblast transplantation on regional structure and function afer myocardial infartction Circulation 2002 131 136 106 Ghostine S Carrion C Guarita Souza LC 3. Murry C, Wiseman R, Schwartz S, et al. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis. J Clin Invest. 1996; 98:2512-23. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis J Clin Invest. 1996 2512 23 98 Murry C Wiseman R Schwartz S 4. Scorsin M, Hagege A, Vilquin JT, et al. Comparison of the effects of fetal cardiomyocyte and skeletal myoblast transplatation on post-infarct left ventricular function. J Thorac and Cardiovas Surgery. 2000; 119:1169-75. Comparison of the effects of fetal cardiomyocyte and skeletal myoblast transplatation on post-infarct left ventricular function J Thorac and Cardiovas Surgery. 2000 1169 75 119 Scorsin M Hagege A Vilquin JT 5. Menasché P,Hagége AA, Scorsin M, et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 2001;357:279-80. Myoblast transplantation for heart failure Lancet. 2001 279 80 357 Menasché P Hagége AA Scorsin M 6. Strauer BE, Brehm M, Zeus T, et al. Repair of infracted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation.2002;106:1913-8. Repair of infracted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans Circulation 2002 1913 8 106 Strauer BE Brehm M Zeus T 7. Arjun D, Shaohua W, Kimberly A, et al. Bone marow-derived cardiomyocites are present in adult human heart. Circulation. 2003;107:1247-9. Bone marow-derived cardiomyocites are present in adult human heart Circulation. 2003 1247 9 107 Arjun D Shaohua W Kimberly A 8. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice. Ann. N Y Acad Sci. 2001;938:221-9. Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice Ann. N Y Acad Sci. 2001 221 9 938 Orlic D Kajstura J Chimenti S 9. Menasché P, Hagege A, Vilquin J T, et al. Autologous skeletal myoblast transplantation for severe postinfarction left ventricular dysfunction. J Am. Coll Cardiol. 2003;41:1078-83. Autologous skeletal myoblast transplantation for severe postinfarction left ventricular dysfunction J Am. Coll Cardiol. 2003 1078 83 41 Menasché P Hagege A Vilquin J T 10. Verfaillie CM. Adult stem cells: assessing the case for pluripotency. Trends Cells Bio. 2002;12:502-8. Adult stem cells: assessing the case for pluripotency Trends Cells Bio. 2002 502 8 12 Verfaillie CM 11. Friedenstein A, Petrakova K, Kurolesova A. Heterotopic of boné marrow. Analysis of percursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 2002;6: 230-247. Heterotopic of boné marrow: Analysis of percursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues Transplantation. 2002 230 247 6 Friedenstein A Petrakova K Kurolesova A. 12. Bel A, Messas E, Agbulut O, et al. Transplantation of autologous fresh boné marrow into infarcted myocardium: A word of caution. Circulation. 2003;108 [suppl II]:247-252. Transplantation of autologous fresh boné marrow into infarcted myocardium: A word of caution Circulation 2003 247 252 108 Bel A Messas E Agbulut O 13. Delaporte C, Dehaupas M, Fardeau M. Comparison between the growth pattern of cell cultures from normal and Duchenne Dystrophy Muscle. J Neurol Sci. 1984; 64:149-60. Comparison between the growth pattern of cell cultures from normal and Duchenne Dystrophy Muscle J Neurol Sci. 1984 149 60 64 Delaporte C Dehaupas M Fardeau M 14. Boyüm A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scan J Clin Lab Invest. 1968; 21(suppl): 77-89. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood Scan J Clin Lab Invest. 1968 77 89 21 Boyüm A 15. Perin E, Dohman H, Radovan B, et al. Transendocardial autologous bone marrow cell transplantation for severe chronic ischemic heart failure. Circulation. 2003;107:2294-302. Transendocardial autologous bone marrow cell transplantation for severe chronic ischemic heart failure Circulation. 2003 2294 302 107 Perin E Dohman H Radovan B 16. Malouf NN, Coleman WB, Girsham JW, et al. Adult derived stem cells from the liver become myocytes in the heart in vivo. Am J Pathol, 2001:158:1929-1935. Adult derived stem cells from the liver become myocytes in the heart in vivo Am J Pathol 2001 1929 1935 158 Malouf NN Coleman WB Girsham JW 17. Guarita Souza LC, Carvalho KAT, Rebelato C. The effectivennes of myoblast and bone marrow cells transplantation, on post-infarct ventricular dysfunction. Circulation, 2003;(suppl IV) 108. The effectivennes of myoblast and bone marrow cells transplantation, on post-infarct ventricular dysfunction Circulation 2003 Guarita Souza LC Carvalho KAT Rebelato C 18. Pouzet B, Ghostine S, Vilquin JT et al. Is skeletal myoblast transplantation clinically relevant in the era of angiotensin-converting enzyme inhibitors? Circulation. 2001 Sep 18;104(12 Suppl 1):I223-8. Is skeletal myoblast transplantation clinically relevant in the era of angiotensin-converting enzyme inhibitors? Circulation 09 18 2001 I223 8 12 104 Pouzet B Ghostine S Vilquin JT 19. Pouzet B, Vilquin JT, Hagege AA, et al. Factors affecting functional outcome after autologous skeletal myoblast transplantation. Ann Thorac Surg. 2001;71:844-50. Factors affecting functional outcome after autologous skeletal myoblast transplantation Ann Thorac Surg. 2001 844 50 71 Pouzet B Vilquin JT Hagege AA 20. Pouzet B, Hagege AA, Vilquin JT. Transplantation of autologous skeletal myoblasts in ischemic cardiac insufficiency. J Soc Biol. 2001; 195: 47-9. Transplantation of autologous skeletal myoblasts in ischemic cardiac insufficiency J Soc Biol. 2001 47 9 195 Pouzet B Hagege AA Vilquin JT 21. Agbulut O, Velde S, Attar N, et al. Which cell type for regeneration of chronically infarcted myocardium? A face-to-face comparison of skeletal myoblasts and marrow-derived hematopoietic stem cells. Circulation. 2003;(suppl IV): 108. Which cell type for regeneration of chronically infarcted myocardium? A face-to-face comparison of skeletal myoblasts and marrow-derived hematopoietic stem cells Circulation. 2003 108 Agbulut O Velde S Attar N 22. Zhang Y, Hartzell C, Narlow M, et al. Stem cell-derived cardiomycytes demonstrate arrhythmic potencial. Circulation. 2002;106:1294-9. Stem cell-derived cardiomycytes demonstrate arrhythmic potencial Circulation. 2002 1294 9 106 Zhang Y Hartzell C Narlow M Original Articles Combined transplantation of skeletal myoblasts and mesenchymal cells (cocultivation) in ventricular dysfunction after myocardial infarction

OBJECTIVE: Cell therapy in the myocardium has been mainly performed with satisfactory results using 2 cell types: skeletal myoblasts (myogenic) and mesenchymal cells (angiogenic). This study assessed the combined transplantation of those 2 cell types (SMM) into infarcted rats. METHODS: Myocardial infarction was induced by ligature of the left coronary artery in 26 Wistar rats. After one week, the animals underwent echocardiography for assessing ejection fraction (EF%) and left ventricular end-diastolic and systolic volumes (EDV, ESV, mL). After 2 days, the animals were reoperated on and divided into 2 groups: 1) control (n=10), which received 0.15 mL of culture medium; and 2) SMM (n=16), which received 7.5x10(6) heterologous skeletal myoblasts and mesenchymal cells in the infarcted region. The cells were obtained from puncture of the iliac crest and biopsy of skeletal muscle, and were cultured in vitro. After one month, the animals underwent a new echocardiography. RESULTS: No significant difference in EF, EDV, and ESV was observed between the 2 groups on baseline echocardiographic values. One month after transplantation, the following was observed: a reduction in EF in the control group (29.31 ± 5.6% to 23.54 ± 6.51%; P=0.048); and an increase in EF in the SMM group (24.03 ± 8.68% to 31.77 ± 9.06%; P=0.011). The presence of neovascularization and muscle fibers was identified in the regions of myocardial fibrosis in the SMM group. CONCLUSION: Cocultivation of skeletal myoblasts and mesenchymal cells is functionally effective.

 Transplantation skeletal myoblasts mesenchymal cells ventricular dysfunction myocardial infarction

ORIGINAL ARTICLE

Combined transplantation of skeletal myoblasts and mesenchymal cells (cocultivation) in ventricular dysfunction after myocardial infarction

Luiz Cesar Guarita Souza; Katherine Athayde Teixeira de Carvalho; Carmen Rebelatto; Alessandra Senegaglia; Marcus Furuta; Nelson Miyague; Paula Hansen; Julio C Francisco; Paulo Roberto Slud Brofman

Curitiba, PR - Brazil

Pontifícia Universidade Católica do Paraná - Curitiba

Correspondence

ABSTRACT

OBJECTIVE: Cell therapy in the myocardium has been mainly performed with satisfactory results using 2 cell types: skeletal myoblasts (myogenic) and mesenchymal cells (angiogenic). This study assessed the combined transplantation of those 2 cell types (SMM) into infarcted rats.

METHODS: Myocardial infarction was induced by ligature of the left coronary artery in 26 Wistar rats. After one week, the animals underwent echocardiography for assessing ejection fraction (EF%) and left ventricular end-diastolic and systolic volumes (EDV, ESV, mL). After 2 days, the animals were reoperated on and divided into 2 groups: 1) control (n=10), which received 0.15 mL of culture medium; and 2) SMM (n=16), which received 7.5x106 heterologous skeletal myoblasts and mesenchymal cells in the infarcted region. The cells were obtained from puncture of the iliac crest and biopsy of skeletal muscle, and were cultured in vitro. After one month, the animals underwent a new echocardiography.

RESULTS: No significant difference in EF, EDV, and ESV was observed between the 2 groups on baseline echocardiographic values. One month after transplantation, the following was observed: a reduction in EF in the control group (29.31 ± 5.6% to 23.54 ± 6.51%; P=0.048); and an increase in EF in the SMM group (24.03 ± 8.68% to 31.77 ± 9.06%; P=0.011). The presence of neovascularization and muscle fibers was identified in the regions of myocardial fibrosis in the SMM group.

CONCLUSION: Cocultivation of skeletal myoblasts and mesenchymal cells is functionally effective.

Keywords: Transplantation, skeletal myoblasts, mesenchymal cells, ventricular dysfunction, myocardial infarction

Despite the evidence of mitotic division in the heart 1 after myocardial infarction, most of the time, cardiomyocytes do not regenerate, and heart failure may be one of the complications. The current treatments proposed, both clinical and surgical, fundamentally manage the consequences of myocardial infarction.

Two new research lines have been proposed to treat the major consequence of myocardial infarction, which is loss of the contractile cell, aiming at myocardial regeneration: the administration of angiogenic factors and cell transplantation.

Skeletal myoblasts 2-5 and mesenchymal cells 6-8 (originating from bone marrow cells) have been used in several studies, both experimental and clinical, with satisfactory results.

The transplantation of skeletal myoblasts has proved to be effective in the infarcted myocardium, because those cells can differentiate into viable muscle amidst myocardial fibrosis. However, the following facts may lead to questions: skeletal myoblasts do not morphologically differentiate into cardiomyocytes; the absence of intercalated disks between the transplanted cells and the native adult cardiomyocytes hinders the connection between them; and the presence of posttransplantation ventricular arrhythmia 9 (probably of ischemic origin) in some patients.

On the other hand, the characteristic that bone marrow cells differentiate according to the medium they are in contact with 10 opened a new perspective for the regeneration of infarcted muscle. Bone marrow cells may undergo the following 2 processes of differentiation: the hematopoietic cell line, which generates blood cells (lymphocytes, eosinophils, basophils, neutrophils, red blood cells, and platelets); and the mesenchymal line, which may generate muscle cells, hepatocytes, osteocytes, and chondrocytes 11.

Regarding acute myocardial infarction, some studies 6 have suggested the occurrence of functional improvement after bone marrow cell transplantation; others have suggested the occurrence of differentiation into cardiomyocytes7; and, yet, others have suggested only the existence of an angiogenic potential 12.

Thus, this study aimed at performing a functional and anatomicopathological assessment of combined transplantation of cocultivated skeletal myoblasts and mesenchymal cells for the treatment of infarcted myocardium.

Methods

All experiments were performed according to the "Guiding Principles in the Care and Use of Animals" of The American Physiological Society.

Fifty Wistar rats with a mean weight of 250g were operated upon. Anesthetic induction was performed with the intramuscular administration of ketamine, 50 mg/kg, and xylazine, 10 mg/kg. The animals underwent endotracheal intubation, without surgical exposure of the trachea, and mechanical ventilation with a volume of 2.5 mL at a frequency of 55 cycles/minute (model 683 respirator, Harvard, Inc., Massachusetts, USA).

All animals underwent left lateral thoracotomy, through which pericardiotomy was performed. Then, the left coronary artery was ligated with a 7/0 polypropylene thread (Ethicon, Inc., Somerville, NJ), inducing infarct in the left ventricular anterolateral wall. Effectiveness of the procedure was confirmed when an alteration in left ventricular wall coloration occurred. A 30% mortality was observed in the animals undergoing the procedure.

Seven days after myocardial infarction, the animals were anesthetized with intramuscular administration of ketamine, 50 mg/kg, and xylazine, 10mg/kg, and underwent 2-dimensional transthoracic echocardiography with a Sonos 5500 model device (Hewlett Packard) with sectorial transducers S12 (5 -12 MHz) and threshold of 15L6 (7-15mHz), which allowed an analysis of up to 160Hz and was specifically produced for the ultrasound study of small animals. The transducer was positioned in the left anterolateral portion of the thorax, and the hearts were visualized by using 2-dimensional mode with the axial view of the left ventricle, including the mitral and aortic valves and the apex in the same image. Digital conversion of the image was obtained by delimiting the interventricular septum and the left ventricular posterior wall. Then, for the calculation of the left ventricular end-systolic and end-diastolic volumes and ejection fraction, the following measurements were taken: left ventricular end-systolic and end-diastolic surfaces, end-systolic and end-diastolic length, and heart rate. All measures were taken 3 times by the same echocardiographer. Then, the mean for each parameter was blindly calculated, ie, the examiner ignored the phase of the study and the group the animal belonged to. The study included only the animals with left ventricular ejection fraction < 40%, which characterizes ventricular dysfunction. The animals with ejection fraction > 40% were excluded from the study, which corresponded to 18% of the animals.

The formula for calculating the ventricular volume was: V=8x(S)2/(3x3.1415926xC), where V=volume; S=area; and C=weight.

The formula for calculating the left ventricular ejection fraction was: EF=EDV-ESV/EDV, where EF = left ventricular ejection fraction; EDV = left ventricular end-diastolic volume; ESV = left ventricular end-systolic volume.

From this moment on, the animals were divided into 2 groups: control, n=10, and SMM (skeletal myoblasts and mesenchymal cells), n=16.

Skeletal myoblasts were isolated after biopsy of the skeletal muscle of the lower limb, according to the technique of Delaporte 13. Mesenchymal cells were isolated through bone marrow aspiration of the posterosuperior iliac crest of Wistar rats 14. After cell centrifugation and separation according to density using the Ficoll-Paque PLUS solution (Amersham Biosciences), the mesenchymal cells adhered to the surface of the plate, while those of hematopoietic origin did not. After centrifugation of the bone marrow cells, the mononuclear cells were distributed in flasks, and, after 48 hours, they were washed with PBS, and only the stromal cells remained adhered, containing the mesenchymal cells.

The assays were performed in 25-cm2 flasks, and the cells were distributed in the proportion of 2 skeletal myoblasts to 1 mesenchymal cell (2:1), approximately 5 x105/mL per 12 days. The culture medium used was DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) containing 15% Fetal Calf Serum (FCS), 1% of antibiotics, and 10 ng/mL of insulin growth factor (IGF-I) (Gibcco BRL, Life Technologies, Inc, Rockville, MD). The cultures were maintained at 37°C in the incubator with 5% of CO2. As this was a cocultivation, the mesenchymal cells and skeletal myoblasts were distributed for 12 days, and the culture medium was changed every 48 hours.

The cell culture was histologically analyzed. Identification of the cells of muscular origin and of the mesenchymal cells was performed through labeling with the anti-desmin antibody (Dako-Anti-Human Desmin-Clone D33) (fig. 1) and the anti-vimentin protein (Immunoperoxidase-Sigma, IMMH-10-Vimentin S-20, Santa Cruz Biotechnology, FITC) (fig. 2), respectively.

The viability of transplanted cells, assessed through the trypan blue stain, ranged from 85 to 95%.

The histological studies of the anatomical specimens were performed with hematoxylin-eosin and Gomori's trichrome for identifying areas of myocardial infarct and presence of new structures in myocardial fibrosis.

The anti-BrDu antibody (Bromodeoxyuridine-monoclonal antibody detecting cells proliferation and activation, BD) through direct immunofluorescence was used to label the cells before transplantation, so that they could be identified after the procedure.

Nine days after myocardial infarction, the animals were reoperated on through a median sternotomy. After individualization of the infarcted myocardial area, 0.15 mL of culture medium (57% MEM and 0.5% BSA, Fraction V, Sigma) was subepicardially injected in the control group. The SMM group received 7.5x106 skeletal myoblasts and heterologous mesenchymal cells diluted in 0.15 mL of culture medium. All animals received cyclosporine (15mg/kg/day) before sternotomy, and the same dose was maintained until the day of sacrifice.

One month after cell transplantation, all animals underwent a new echocardiography, in which the same parameters used in the pretransplant examination were assessed. Then, the animals were euthanized for anatomicopathological analysis.

All data are presented as means ± SD, and the statistical significance level adopted was P < 0.05. The groups were compared at baseline and 1 month after transplantation with the paired t test.

After assessing homogeneity of variance and normal distribution of data, analysis of variance was performed for determining the difference between the groups in each period (baseline and one month later). The Fisher exact test was used to analyze the proportion of cases that improved or were stable one month after transplantation.

Results

No statistical difference was observed between groups, control and SMM, in regard to left ventricular ejection fraction and end-systolic and end-diastolic volumes after myocardial infarction and before transplantation. All animals were considered homogeneous (29.31 ± 5.60% and 24.03 ± 8.68%, P=0.10; 0.36 ± 0.09 and 0.37 ± 0.06, P=0.593; and 0.50 ± 0.11 mL and 0.49 ± 0.08 mL, P=0.757; respectively).

One month after cell transplantation, however, a significant difference in left ventricular ejection fraction was observed between the control and SMM groups (31.77±9.06% vs 23.54±6.51%, P=0.020) (fig. 3).

Analyzing the groups individually, left ventricular ejection fraction decreased in the control group (from 29.31±5.60% to 23.54± 6.51%, P=0.048) and increased in the SMM group (from 24.03± 8.68% to 31.77±9.06%, P=0.011) (tab. I).

Analyzing the left ventricular end-diastolic volume, no statistical difference was identified between the control and SMM groups one month after transplantation (0.69 ± 0.19mL vs 0.67 ± 0.12mL, P=0.791, respectively) (fig. 4). In isolation, however, the control and SMM groups showed an increase in the left ventricular end-diastolic volume (from 0.50 ± 0.11mL to 0.69 ± 0.19mL, P=0.008, and from 0.49 ± 0.08mL to 0.67 ± 0.12mL, P<0.001, respectively) (tab. II).

Analyzing the left ventricular end-systolic volume, no statistical difference was identified between the control and SMM groups one month after transplantation (0.54 ± 0.17mL vs 0.47 ± 0.12mL, P=0.233, respectively) (fig. 5). In isolation, the control and SMM groups had an increase in the left ventricular end-systolic volume (from 0.36 ± 0.09mL to 0.36 ± 0.09mL, P=0.002, and from 0.37 ± 0.06 to 0.47 ± 0.12mL, P=0.011, respectively) (tab. III).

Analyzing the animals per each group, in the SMM group, of the 16 animals, 14 (87.5%) improved their ejection fraction. In the control group, of the 10 animals, 8 worsened their ejection function, and only 2 (20%) improved their ejection fraction, although no cell was transplanted (tab. IV).

The animals were euthanized one month after cell transplantation, and their hearts were removed and divided into 2 parts, the apex containing the infarcted area and the base. Each part was frozen in liquid nitrogen at -80°C, divided into fractioned sections every 5 microns, involving the zone of transition between the intact myocardium and the region of fibrosis.

In the SMM group, one month after intervention, transplanted cells were identified in the infarcted region by use of the hematoxylin-eosin and Gomori's trichrome stains. Morphologically, the identified cells had characteristics of skeletal muscular fibers that colonize the region of fibrosis. The formation of new blood vessels was also identified in this region in the SMM group. In the control group, however, the presence of neither muscle nor blood vessels was visualized in the region of myocardial fibrosis (fig. 6a and b).

In the SMM group, the transplanted cells were identified by use of the anti-BrDu antibody 24 hours after transplantation (fig. 7).

Discussion

The great majority of the studies about transplantation of skeletal myoblasts into the myocardium have aimed at recolonizing the regions of myocardial fibrosis with contractile cells. These studies, both experimental 2-4 and clinical 5, have suggested the occurrence of functional improvement in the heart; however, the lack of differentiation of skeletal myoblasts into cardiomyocytes, the absence of GAP junctions between the transplanted cells and the intact myocardium, and the ventricular arrhythmias identified in some patients operated on 9, could not pass unquestioned.

On the other hand, the studies with bone marrow cells disagree in regard to their differentiation into cardiomyocytes and the real functional benefit that the transplantation of these cells may provide. Orlic et al 8 transplanted the bone marrow cells into the transition region between the intact and the infarcted myocardium 5 hours after occlusion of the anterior descending coronary. These authors reported cardiac functional improvement with the presence of endothelial cells and smooth muscle in the animals studied, but no bone marrow cells differentiated into cardiomyocytes were identified in the infarcted region, only in the transition zone. The smooth muscle may be justified by its presence in the tunica media of the neoformed blood vessels. Ferem et al 15 believe that the mononuclear cells of the bone marrow, when transplanted into patients with ischemic cardiomyopathy, provide significant functional and clinical benefits.

The fundamental characteristic of the bone marrow cells, mainly the mesenchymal cells, is their medium-dependent differentiation, ie, those cells acquire the characteristics of the cells they are in contact with. For example, the bone marrow cells in contact with bone tend towards differentiating into bone; similarly, those in contact with liver cells tend towards differentiating into hepatocytes; those in contact with cardiac cells tend towards differentiating into cardiomyocytes, and so forth 16. Following this same rationale, when those cells are transplanted into the region of chronic myocardial infarct, ie, into the fibrotic area, they would consequently tend towards differentiating into fibrosis. Based on that principle, it is hard to believe that bone marrow cells could recolonize the chronically infarcted myocardium with new cardiac muscle fibers.

Some studies 12,17 have shown by use of anatomicopathological analysis that, when bone marrow cells (mononuclear and/or mesenchymal cells) are transplanted into models of chronic myocardial infarct, neoformation of blood vessels is observed in the region of myocardial fibrosis.

The idea of using a combination of skeletal myoblasts, which do really recolonize the infarcted myocardium with new muscle fibers of skeletal origin, and cells derived from the bone marrow, which stimulate the formation of new vessels in the region of fibrosis, was based on the hypothesis of providing an angiomuscular regeneration and not only an isolated muscular or angiogenic regeneration.

Analyzing the SMM group separately, the functional improvement identified between the period after myocardial infarction and one month after cell transplantation was significant (form 24.03 ± 8.68% to 31.77 ± 9.06, P=0.011). The same was observed when the SMM group was compared with the control group one month after transplantation (23.54 ± 6.51% vs 31.77 ± 9.06%, P=0.020). These data suggest the effectiveness of the transplantation of cocultivated cells. However, it is difficult to identify which transplanted cell, if not both, is responsible for the increase in left ventricular ejection fraction.

Still in regard to functional analysis and considering only the animals that maintained their left ventricular ejection fraction as stable or improved it, the placebo effect was present in 2 of the control group animals, because their ejection fraction improved even without any type of treatment. In the SMM group, 14 (87.5%) animals of the 16 improved their ejection fraction. The fact that 2 animals had no improvement in their cardiac function may be attributed to technical problems, such as a failure in cell injection or even embolization.

Despite the effectiveness of cell transplantation in the SMM group in regard to left ventricular ejection fraction, a significant increase in left ventricular end-diastolic volume (P<0.001) was observed one month after transplantation, suggesting the occurrence of ventricular remodeling independent of improvement in cardiac function. The outcome of the control group was similar, and no significant difference was observed between both groups in regard to that parameter in the same period. Other studies 2,4 on transplantation of skeletal myoblasts into the infarcted myocardium, including some clinical studies 9, reported the occurrence of ventricular remodeling despite the functional improvement. The capacity of regeneration of the infarcted myocardium with skeletal myoblasts is believed to be limited to the site of cell injection with no overall anti-ventricular remodeling effect.

In regard to left ventricular end-systolic volume, an increase was observed in the control and SMM groups one month after cell transplantation, suggesting a decrease in the contractile activity (P=0.002 and P=0.011, respectively).

Pouzet et al 18, in a study of animals undergoing transplantation of skeletal myoblasts in association with clinical treatment with an angiotensin-converting enzyme inhibitor, reported a limitation in left ventricular dilation, probably due to the effects of clinical treatment.

The mechanisms responsible for the improvement in cardiac function after transplantation of skeletal myoblasts have not been well established. That improvement is believed to result from an active process due to the improvement in the regional contractility and a decrease in the infarcted region. However, it is worth emphasizing that a direct relation exists between the number of cells transplanted and functional improvement 19, and that the benefit of the intervention also depends on the quality of the cells transplanted and their survival after the procedure 20, because a large percentage of cells die after transplantation.

Another study 17, which compared the effects of the transplantation of skeletal myoblasts alone and mesenchymal cells alone into myocardial infarct, reported a significant improvement in left ventricular ejection fraction in the group receiving the skeletal myoblasts as compared with that in the control group; on the other hand, the group receiving the mesenchymal cells showed stabilization of left ventricular ejection fraction. The anatomicopathological examination of the group receiving the mesenchymal cells revealed no new muscular fibers in the infarcted region, where the cells had been injected, but an intense neoangiogenesis. This fact may explain the stabilization of left ventricular ejection fraction, because the formation of new blood vessels can reduce apoptosis and the expansion of the infarct, thus preserving the myocardium. A similar functional result has also been reported in another study 21, which compared cells of the hematopoietic line (CD 133+) and skeletal myoblasts.

The presence of arrhythmia reported by Menasché et al 9 in their studies with skeletal myoblasts was not an isolated finding. Zhang et al 22 have also suggested that bone marrow embryonic cells, when transplanted into the infarcted myocardium, may also show arrhythmogenic characteristics.

Myocardial ischemia is one of the causes of ventricular arrhythmias. Therefore, in the study by Menasché et al 9, the cause of arrhythmias is believed to be ischemic, because after the transplantation of skeletal cells into a region of fibrosis, that region became viable, visualized on positron emission tomography (PET-SCAN). However, in that viable region, which was previously infarcted, myocardial ischemia may be suspected, because blood supply to the patients studied was absent due to one coronary artery occlusion without collateral circulation.

On anatomicopathological examination in this study, the identification of new muscular fibers in the region of fibrosis and the presence of new blood vessels in the region confirm the hypothesis of angiomuscular regeneration.

Pouzet et al 18 reported the existence of a significant cell mortality right after cell transplantation, possibly due to the local inflammatory reaction of the infarct or even of cell injection. One cause of late mortality of transplanted cells could be the chronic ischemia in the region. The presence of new blood vessels in the region into which the muscular cells were transplanted may help to preserve the new muscular fibers and reduce ischemia, atrophy, and cardiomyocyte death.

In conclusion, the combination of skeletal myoblasts and mesenchymal cells proved to be effective in the regeneration of myocardial fibrosis, with identification of new skeletal muscular fibers and new blood vessels in the region of myocardial fibrosis.

Acknowledgements

We thank Dr. Marcio Scorsin and CAPES.

References

Correspondence to

Luiz César Guarita Souza

Rua Silveira Peixoto, 1062/162

80240-120

Curitiba, PR, Brazil

E-mail:

llccggss@hotmail.com

Received for publication: 04/03/2004

Accepted for publication: 06/22/2004

English version by Stela Maris Costalonga