OBJECTIVE: To characterize the follow-up of an experimental model of left ventricular hypertrophy (LVH) induced by supravalvular ascending aortic stenosis in young rats. METHODS: Wistar rats were submitted to thoracotomy and aortic stenosis was created by placing a clip on the ascending aorta (AoS group, n=12). Age-matched control animals underwent a sham operation (C group, n=12). Cardiac function was analysed by echocardiograms performed 6, 12, and 21 weeks after aortic banding. Myocardial morphological features and myocardial hydroxyproline concentration (HOP) were evaluated 2, 6, 12, and 21 weeks after surgery in additional animals. RESULTS: Aortic banding promoted early concentric LVH and a progressive increase in HOP. Under light microscopy, we observed myocyte hypertrophy and wall thickening of the intramural branches of the coronary arteries due to medial hypertrophy. Cardiac function was supranormal after 6 weeks (percentage of fractional shortening - EAo6: 70.3±10.8; C6: 61.3±5.4; p<0.05), and depressed in the last period. Diastolic dysfunction was detected after 12 weeks (ratio of early-to-late filling velocity - EAo12: 4.20±3.25; C12: 1.61±0.16; p<0.05). CONCLUSION: Ascending aortic stenosis promotes concentric LVH with myocardial fibrosis and minimal histological changes. According to the period of evaluation, cardiac function may be improved, normal, or depressed. The model is suitable and useful for studies on pathophysiology and treatment of the different phases of cardiac hypertrophy.
Follow-up study of morphology and cardiac function in rats undergoing induction of supravalvular aortic stenosis
Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP. Botucatu, SP - Brazil
Cardiac hypertrophy is an important adapting mechanism that occurs as a response to chronic hemodynamic overload, allowing the heart to maintain its basic functions during overloaded conditions 1,2. However, left ventricular hypertrophy is a risk factor for the development of congestive heart failure and sudden death 3.
Several experimental models have been proposed for the study of left ventricular hypertrophy due to pressure overload. Among them, the induction of renovascular stenosis 4, of abdominal aorta stenosis 5,6, or thoracic aorta stenosis 7, or even the development of animals genetically modified, such as spontaneously hypertensive rats 8-12. However, several of these animal models have limitations for use in experimental studies. For example, the induction of renovascular stenosis or abdominal aortic stenosis, in rats, in addition to leading to systemic blood hypertension and left ventricular hypertrophy, can also promote systemic activation of the adrenergic nervous system, and of the renin-angiotensin-aldosterone system 13-15. The intense neuro-hormonal activation is associated with the presence of important cardiac lesions, such as myocardial necrosis, peripheral arteritis, and reparative fibrosis 4,6. Thus, these models may be very aggressive in the myocardium and, therefore, less representative of the chronic lesions that develop gradually in humans with chronic pressure overload. On the other hand, spontaneously hypertensive rats develop a gradual increase in systemic blood hypertension at 1 month of age, and, at 3 months, they already have established left ventricular hypertrophy 16,17. However, these rats have a long period of stable myocardial hypertrophy, without heart failure, which usually occurs by 20 months of age 9,11,18. Therefore, although in this model cardiac alterations are similar to those occurring in human hypertensive heart disease 9,16, the prevention studies of heart failure are expensive, because the animals have to be kept in captivity for a long period.
More recently, the model of ascending aorta stenosis has been used to promote the gradual development of left ventricular hypertrophy in young rats 7,19-25. The animals, 3 to 4 weeks after delivery, undergo median thoracotomy to place a band, with an internal diameter of approximately 0.6 mm, around the thoracic aorta, 2 to 3 mm above its root. Immediately after the thoracic banding, the diameter of the artery is maintained; with animal growth, the vessel diameter is maintained and aortic stenosis progressively appears. The rats develop left ventricular hypertrophy precociously, which is associated, in the short term, with improvement in the systolic function of the heart. Then, the animals start to experience depression of mechanical heart performance, and develop cardiac decompensation, 20 weeks after the induction of aortic stenosis 7,20,26-28. In this model of left ventricular hypertrophy, no systemic activation of the sympathic nervous system or of the renin-angiotensin-aldosterone system occurs 7,21,26,29. Probably because of this fact, histological evaluation, performed 21 weeks after aortic stenosis induction, did not demonstrate the presence of important cardiac lesions, such as peripheral arteritis, myocardial necrosis, or extensive fibrosis 7,26.
The advantages of this experimental model are the gradual development of left ventricular hypertrophy, absence of severe anatomical lesions in the myocardium, and the low cost of the maintenance of animals because of the short period necessary to develop left ventricular hypertrophy and heart failure. In the several studies performed with this model 7,19-21,26,30,31, different periods were used for the morphological or functional analysis of the heart, or both, and no studies exist regarding simultaneous and follow-up evaluations of myocardial histology and of cardiac function after induction of aortic stenosis.
The objective of this study was to characterize the follow-up of the experimental model of left ventricular hypertrophy because of supravalvular aortic stenosis, in young Wistar rats, using morphologic and functional evaluation of the heart. Myocardial morphology was analyzed, using optical microscopy, 2, 6, 12, and 21 weeks after the induction of aortic stenosis and cardiac function was assessed,
Male Wistar rats, weighing 90 to 100g, were used from our biotery. Animals were kept in cages with 4 rats per box, at 23oC, with luminosity cycles of 12h and fed with Purina rat ration and water ad libitum. The protocol used was approved by the Ethical Committee for Animal Research of the Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP.
Rats underwent median thoracotomy after being anesthetized with ketamine hydrochloride (50 mg/kg intramuscular) and xylidine hydrochloride (10 mg/kg intramuscular). Next, the ascending aorta was dissected and a silver band with an internal diameter of 0.6 mm was placed at approximately 3 mm of the aortic root. During surgery, the rats were manually ventilated with positive pressure. Control animals underwent the same surgery; however, a band was not implanted.
Rats were divided into 2 groups: control (C) and aortic stenosis (AoS). For morphologic and biochemical evaluation (hydroxyproline dose), 5 to 7 animals from each group were sacrificed 2, 6, 12, and 21 weeks after AoS induction. The subgroups formed were given the following designations: C2, C6, C12, C21, and AoS2, AoS6, AoS12, and AoS21.
The other groups of rats (C and AoS) were formed only for functional study. Because this evaluation was performed in vivo and without later sacrifice of the animals, the same rats were assessed in 3 experimental periods: 6, 12, and 21 weeks after the induction of AoS (n= 12 for the C and AoS groups). Due to the difficulty in obtaining adequate echocardiographic images in low-weight rats, the functional study was not performed in the 2-week period after AoS induction.
Rats were weighed and anesthetized with sodium pentobarbital (50 mg/kg intraperitoneal) then underwent median thoracotomy to remove the heart, which was rapidly washed in saline solution. Next, the right ventricle (RV) and left ventricle (LV) were dissected and weighed separately. From the central part of the left ventricle, a 2- to 3-mm thick annulus was cut, taking all the extension of its wall. The material was immersed in neutral and tamponade formalin 10% for 48 hours at 4oC. After this period, the tissue was washed, dehydrated, and imbedded in paraffin. The histological cuts 5- to 7-mm thick were dyed with hematoxylin-eosin and were analyzed with optical microscopy.
Morphometric analyses were performed using a VCR attached to a Leica microscope connected to the computer equipped with an analysis program (Image-Pro Plus 3.0, Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). In left ventricle transverse sections, sectional areas (SA) of at least 50 cardiac fibers, whose nucleus was clearly identified in the center of the cell, were measured.
Myocardial concentration of hydroxyproline was assessed in tissue obtained at the tip of the left ventricle, according to the methods described by Switzer 32, using a previously described technique used in other studies at our laboratory 33-35.
The level of ventricular hypertrophy was assessed by the ratio between humid weight of the right and left ventricle and the body weight of the animals.
Rats received anesthesia with ketamine hydrochloride (50 mg/kg) and xylidine hydrochloride (1 mg/kg), administered intramuscularly. A trichotomy was performed in the anterior region of the thorax, and the animals were placed in the left lateral decubitus position for the performance of echocardiography 36 with the Sonos 2000 from Hewlett-Packard Co., equipped with an electronic transducer with a 7.5 MHz frequency.
To measure cardiac structures, M-mode images were obtained with an ultrasound beam guided by the bi-dimensional mode, with the transducer positioned at the smaller parasternal axis. An image of the left ventricle was obtained with the M-mode cursor positioned right below the mitral valve plane at the papillary muscle level 22,37,38. Aorta (AO) and left atrium (LA) images were obtained with the M-mode cursor positioned at the level of the aortic valve plane. Images obtained were recorded afterwards with the UP-890 printer from the Sony Co.; cardiac structures were measured manually with the help of a pachymeter.
Left ventricle diastolic diameter (LVDD) and systolic diameter (LVSD) were measured at the period of the cardiac cycle when their values were maximum and minimum, respectively. Diastolic thickness of the posterior left ventricle wall (LVDT) was measured at the same period of the cardiac cycle when left ventricle diastolic diameter was assessed. Aortic root diameter (AO) was obtained in the period immediately prior to the opening of the aortic valve. The left atrium (LA) was assessed when its diameter was at its maximum 22,38. From the dimensions above described, we obtained: relative left ventricle thickness (RLVT), LA/AO, LVDD/BW, and LA/BW.
Left ventricle systolic function was assessed by using the shortening percentage (DD): [(LVDD – LVSD)/LVDD] X 100, and the diastolic function analyzed by the ratio between initial filling flow velocity (E wave) and of the atrial contraction (A wave) of the transmitral flow.
One day after the performance of echocardiography, corresponding to 21 weeks, the animals were sacrificed while under anesthesia with sodium pentobarbital. At this time, signs of heart failure were identified, according to Conrad et al 39 and Cicogna et al 11,18 as tachypnea, pleuropericardial effusion, ascites, and the presence of left atrial thrombus.
Regarding the statistical analysis, numerical data are expressed as mean ± standard deviation. Study of the morphometric variables and of the myocardial concentration of hydroxyproline was performed with analysis of variance (ANOVA) for the factorial scheme 2X4, for the entirely casual model, completed with the
Corporal parameters are provided in
Of the 12 animals in the AoS group, which evolved for 21 weeks, 3 had signs of heart failure, including tachypnea, pleural effusion, and ascites.
In the left ventricle histological evaluation, C groups had normal morphology. In the AoS groups, progressive hypertrophy of the myocytes was observed at 2-week follow-up. Intramural branches of the coronary artery had medium lower hypertrophy that was discreet after 2 and 6 weeks, becoming evident after 12 weeks (
The cross sectional area of left ventricle myocytes was significantly greater in the AoS groups than in the C groups, in all periods studied. In both groups, a progressive increase of the myocyte cross sectional areas occurred during the evolvement process (
Myocardial concentration of hydroxyproline was greater in the AoS groups than in C groups, at 6 weeks of evolvement. In the C groups the concentration was similar in all periods of evaluation, and in AoS, a progressive increase in their values occurred with the evolvement of the hypertrophic process (
Mean and standard deviations of the left ventricle, left atrium, and aorta measures are presented in
Means and standard deviation of the heart rate (HR), and the systolic and diastolic function indexes are demonstrated in
In this study, we assessed the cardiac function, morphology, and development of myocardial fibrosis in young rats undergoing induction of supravalvular aortic stenosis in different periods of follow-up.
AoS induction rapidly encourages left ventricle hypertrophy, which is evident in the early period of evaluation, with 2 weeks of follow-up. After 6 weeks, left ventricle weight or ventricular wall diastolic thickness did not increase, which could suggest that, after aortic stenosis induction, left ventricular hypertrophy occurs precociously and then it becomes stable. However, morphometric evaluation demonstrated that the values of the cross sectional area of the myocytes increased progressively until 12 weeks, demonstrating the presence of additional hypertrophy during the evolvement of the process.
Echocardiographic study allowed the definition of left ventricular hypertrophy as concentric, characterized by increased wall thickness with normal or reduced dimensions of the ventricular cavity. According to several authors 7,26, animals start to develop heart failure in the 21st week after the induction of aortic stenosis. Thus, it would be expected that eccentric hypertrophy would be found during the last period of study. Because only 25% of our rats had heart failure after the 21 weeks of evolvement, it is probable that the final evaluation was performed when most animals were in the compensated phases of left ventricular hypertrophy and, therefore, still having concentric hypertrophy. However, the increase in right ventricle weight in the last assessment period demonstrates that the change from compensated left ventricular hypertrophy to heart failure may have already occurred. Histological analysis of the myocardium confirmed the findings of other authors 7,26, who did not find relevant tissue lesions, such as myocyte necrosis, extensive areas of myocardial fibrosis, or peripheral arteritis, after 21 weeks of aortic stenosis induction. In our study, in addition to myocyte cell hypertrophy, we observed the presence of vascular remodeling characterized by medium-layer hypertrophy in the intramyocardial arteries, which was discreet in the first assessment periods and became evident after 12 weeks of follow-up. Thickening of the medium layer of the arteries is usually found in human beings with systemic hypertension 40. This finding may be due to hypertrophy or hyperplasia of the smooth muscle, or both; to an increase in water and/or collagen content of the vascular wall; and thickening of the basal membrane 40.
Although this model is not associated with severe fibrosis 7, myocardial concentration of hydroxyproline was greater in the AoS groups at 6 weeks, and it increased progressively during the evolvement of the hypertrophic process. In the present study, we did not perform morphometric quantification of the collagen content and, therefore, we were not able to state whether the increase was due to the interstitial collagen or perivascular. Weinberg et al 26, using
The analysis of left ventricle systolic function demonstrated that in the initial phases of the hypertrophic process the shortening is increased. A decrease in contractile function of the chamber occurred over time, evidenced by the progressive increase in LVSD and by the reduction of DD. These indexes were significantly different between the periods of 6 and 21 weeks after aortic stenosis. It is possible to detect the 3 evolvement phases of systolic function during the hypertrophic process in this model: initially, the presence of supranormal performance, which is followed by unchanged cardiac performance, and, finally, by depression of the contractile capacity of the heart. Similar results were observed by other authors who also assessed cardiac function sequentially with echocardiography 7,22.
Diastolic dysfunction may be detected in the 12th week of evolvement by the E/A ratio, which was significantly greater in the AoS groups than in the respective C groups. After this period, additional variation was not observed in the values of this ratio. However, the increase in LA diameter, verified in the 6th week, demonstrates that diastolic dysfunction may have occurred earlier. Similar results were observed during the serial study of left ventricle function with echocardiography 22. E/A increase reflects the restrictive pattern of ventricular filling alteration. Currently, this filling model has been attributed, in great part, to the increase in left atrial pressure and also to the increase in passive stiffness of the ventricular chamber, which may be due to the increase in wall thickness or interstitial fibrosis, or both of these 22.
In conclusion, induction of supravalvular aortic stenosis in young rats promotes early development of concentric left ventricular hypertrophy with cardiac function initially supranormal, followed by diastolic dysfunction in the 12th week of evolvement. Reduction of systolic ventricular performance occurred only in the late period after 21 weeks of AoS induction. Cardiac function alterations are followed by myocardial fibrosis without expressive histological lesions. These characteristics demonstrate that the model is suitable and potentially useful for studies on physiopathology and treatment of cardiac hypertrophy due to chronic pressure overload both in the compensated stage and during transition to heart failure.
For the valuable technical support of Vitor Marcos de Souza, José Carlos Georgette, and Mário Augusto Dallaqua and to the support of CNPQ/PIBIC.
Correspondence to Henrique Barbosa Ribeiro Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP - Depto de Clínica Médica Rubião Júnior, S/N Cep 18618-000 Botucatu, SP, Brazil E-mail:
Received 12/5/02
Accepted 2/23/03
OBJETIVO: Caracterizar, evolutivamente, o modelo experimental de hipertrofia ventricular esquerda (HVE) por indução de estenose aórtica supravalvar em ratos jovens. MÉTODOS: Ratos Wistar foram submetidos a toracotomia para colocação de clipe ao redor da aorta torácica (grupo EAo, n=12). Animais controle foram submetidos à mesma cirurgia, porém sem a colocação do clipe (grupo C, n=12). A função cardíaca foi analisada por ecocardiogramas seriados após 6, 12 e 21 semanas. Outros grupos foram utilizados para avaliação histológica e quantificação da hidroxiprolina miocárdica (HOP: 2, 6, 12 e 21 semanas). RESULTADOS: A EAo promoveu precocemente HVE concêntrica e aumento progressivo da concentração de HOP. À microscopia óptica, observou-se hipertrofia dos miócitos e da camada média dos ramos intramurais das artérias coronárias. A função sistólica foi supranormal no período 6 semanas (porcentagem de encurtamento - EAo6:70,3±10,8; C6: 61,3±5,4; p<0,05), apresentando-se reduzida apenas no último período. A partir de 12 semanas, verificou-se disfunção diastólica (E/A - EAo12: 4,20± 3,25; C12: 1,61±0,16; p<0,05). CONCLUSÃO: A indução de EAo promove HVE concêntrica e fibrose miocárdica. A função cardíaca, dependendo do período de análise, encontra-se melhorada, normal ou deprimida. O modelo é adequado e potencialmente útil para estudos sobre a fisiopatologia e tratamento nas diferentes fases evolutivas da hipertrofia cardíaca.
Estudo evolutivo da morfologia e função cardíaca em ratos submetidos a estenose aórtica supravalvar
Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP. Botucatu, SP
A hipertrofia cardíaca representa um importante mecanismo adaptativo, ocorrido em resposta à sobrecarga hemodinâmica crônica, permitindo o coração de manter suas funções básicas em vigência de aumento das condições de carga1,2. Entretanto, a hipertrofia ventricular esquerda constitui um fator de risco para o desenvolvimento de insuficiência cardíaca congestiva e morte súbita3.
Diversos modelos experimentais têm sido propostos para o estudo da hipertrofia ventricular esquerda por sobrecarga pressórica. Entre eles, destacam-se a indução de estenose de artéria renal4 e de aorta abdominal5,6 ou torácica7, ou mesmo o desenvolvimento de animais geneticamente modificados, como o rato espontaneamente hipertenso8-12. No entanto, muitos desses modelos animais apresentam limitações para seu uso em trabalhos experimentais. Por exemplo, a indução de estenose de artéria renal ou de aorta abdominal, em ratos, além de acarretar hipertensão arterial sistêmica e hipertrofia ventricular esquerda, pode também promover importante ativação sistêmica do sistema nervoso adrenérgico e do sistema renina-angiotensina-aldosterona13-15. A intensa ativação neurohormonal está associada à ocorrência de importantes lesões cardíacas, como necrose miocárdica, peri-arterite e fibrose reparativa4,6. Desta maneira, estes modelos podem ser muito agressivos ao miocárdio e, portanto, pouco representativos das lesões que se desenvolvem, gradualmente, em humanos com sobrecarga pressórica crônica. Por outro lado, os ratos espontaneamente hipertensos desenvolvem aumento gradual da pressão arterial sistêmica a partir de um mês de idade e, aos três meses, já apresentam estabelecida hipertrofia ventricular esquerda16,17. Entretanto, esses ratos exibem longo período de hipertrofia miocárdica estável, sem desenvolver insuficiência cardíaca, ocorrida, em geral, somente a partir de 20 meses de idade9,11,18. Portanto, embora nesse modelo as alterações cardíacas sejam semelhantes às que ocorrem na cardiopatia hipertensiva humana9,16, há um custo muito elevado para os estudos de prevenção e tratamento de insuficiência cardíaca, porque os animais têm que ser mantidos em biotério por longo período de tempo.
Mais recentemente, o modelo de estenose da aorta ascendente tem sido utilizado para promover o desenvolvimento gradual de hipertrofia ventricular esquerda em ratos jovens7,19-25. Os animais, três a quatro semanas após o nascimento, são submetidos a toracotomia mediana para colocação de clipe, com cerca de 0,6mm de diâmetro interno, ao redor da aorta torácica, 2 a 3mm acima de sua raiz. Imediatamente após a colocação do clipe, o diâmetro da aorta se mantém preservado; com o crescimento do animal e a manutenção do diâmetro do vaso, ocorre o aparecimento progressivo da estenose aórtica. Precocemente, os ratos desenvolvem hipertrofia ventricular esquerda que está associada, a curto prazo, com melhora da função sistólica do coração; a seguir, os animais começam a apresentar depressão do desempenho mecânico do coração e desenvolvem quadro clínico de insuficiência cardíaca, a partir de 20 semanas após a indução da estenose aórtica7,20,26-28. Neste modelo de hipertrofia ventricular esquerda, não existe ativação sistêmica do sistema nervoso simpático ou do sistema renina-angiotensina-aldosterona7,21,26,29 . Provavelmente, em decorrência desse fato, a avaliação histológica, realizada 21 semanas após a indução da estenose aórtica, não revelou a presença de importantes lesões cardíacas, como peri-arterite, necrose miocárdica ou áreas extensas de fibrose7,26.
As vantagens deste modelo experimental são o desenvolvimento gradual de hipertrofia ventricular esquerda, a ausência de severas lesões anatômicas no miocárdio e o baixo custo para a manutenção dos animais devido ao curto período necessário para o desenvolvimento de hipertrofia ventricular esquerda e de insuficiência cardíaca. Nos vários trabalhos realizados com este modelo7,19-21,26,30,31, foram utilizados diferentes períodos para a análise morfológica e/ou funcional do coração, não existindo estudos sobre a avaliação simultânea e evolutiva da histologia miocárdica e da função cardíaca após a indução da estenose aórtica.
O objetivo deste trabalho foi caracterizar, evolutivamente, o modelo experimental de hipertrofia ventricular esquerda por estenose aórtica supravalvar, em ratos Wistar jovens, por meio de avaliação morfológica e funcional do coração. A morfologia miocárdica foi analisada, à microscopia óptica, 2, 6, 12 e 21 semanas após a indução da estenose aórtica e a função cardíaca foi avaliada,
Foram utilizados ratos Wistar machos, com peso corporal de 90 a 100g, provenientes do Biotério do Campus de Botucatu da Universidade Estadual Paulista (UNESP). Os animais foram mantidos em gaiolas, com quatro ratos por caixa, à temperatura ambiente de 23oC, com ciclos de luminosidade de 12h e alimentados com ração Purina e água
Após anestesia com cloridrato de cetamina (50 mg/kg intramuscular) e cloridrato de xilidino (10 mg/kg intramuscular), os ratos foram submetidos a toracotomia mediana. A seguir, a aorta ascendente foi dissecada e um clipe de prata, com 0,6mm de diâmetro interno, foi colocado a, aproximadamente, 3mm da raiz da aorta. Durante a cirurgia, os ratos foram ventilados manualmente, com pressão positiva. Os animais controles foram submetidos à mesma cirurgia, porém sem a colocação do clipe.
Os ratos foram divididos em dois grupos: controle (C) e estenose aórtica (EAo). Para avaliação morfológica e bioquímica (dosagem de hidroxiprolina), cinco a sete animais de cada grupo foram mortos 2, 6, 12 e 21 semanas após a indução da EAo. Os subgrupos formados receberam a denominação: C2, C6, C12, C21 e EAo2, EAo6, EAo12 e EAo21.
Outros grupos de ratos (C e EAo) foram constituídos somente para o estudo funcional. Como esta avaliação foi feita
Os ratos foram pesados, anestesiados com pentobarbital sódico (50mg/kg intraperitoneal) e submetidos a toracotomia mediana para a remoção do coração, lavado rapidamente em soro fisiológico. A seguir, os ventrículos direito (VD) e esquerdo (VE) foram dissecados e pesados separadamente. Da parte central do ventrículo esquerdo, foi cortado um anel com 2 a 3mm de espessura, compreendendo toda a extensão de sua parede. O material foi imerso em formalina 10% neutra e tamponada, durante 48h, a 4oC. Após esse período, o tecido foi lavado, desidratado e incluído em parafina. Cortes histológicos com 5 a 7µm de espessura foram submetidos à coloração por hematoxilina e eosina e analisados em microscopia óptica.
A análise morfométrica foi realizada utilizando-se uma câmara de vídeo acoplada a um microscópio Leica conectado a computador equipado com um programa analisador de imagem (
A concentração miocárdica de hidroxiprolina foi mensurada em tecido obtido da ponta do ventrículo esquerdo, de acordo com o método descrito por Switzer32, utilizando-se a técnica previamente descrita em outros trabalhos de nosso laboratório33-35.
O grau de hipertrofia ventricular foi avaliado pela relação entre o peso úmido dos ventrículos direito e esquerdo e o peso corporal dos animais.
Os ratos foram anestesiados com cloridrato de cetamina (50 mg/kg) e cloridrato de xilidino (1 mg/kg), administrados por via intramuscular, em seguida, realizada tricotomia na região anterior do tórax e os animais posicionados em decúbito lateral esquerdo para realização do ecocardiograma36, utilizado o modelo
Para mensuração das estruturas cardíacas, foram obtidas imagens em modo monodimensional (modo-M) com feixe de ultra-som orientado pelas imagens em modo bidimensional, estando o transdutor em posição para-esternal eixo menor. A imagem do ventrículo esquerdo foi obtida posicionando o cursor do modo-M logo abaixo do plano da valva mitral no nível dos músculos papilares22,37,38. As imagens da aorta (AO) e do átrio esquerdo (AE) foram obtidas com o cursor do modo-M posicionado ao nível do plano da valva aórtica. As imagens obtidas foram registradas em impressora modelo
Os diâmetros diastólico (DDVE) e sistólico (DSVE) do ventrículo esquerdo foram medidos no momento do ciclo cardíaco em que seus valores eram máximo e mínimo, respectivamente. A espessura diastólica da parede posterior do ventrículo esquerdo (EDVE) foi medida no mesmo momento do ciclo cardíaco em que foi realizada a medida do diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo. O diâmetro da raiz da aorta (AO) foi obtido no instante imediatamente anterior à abertura da valva aórtica. O átrio esquerdo (AE) foi medido no momento em que seu diâmetro era máximo22,38. Foram derivadas das dimensões acima descritas: espessura relativa do ventrículo esquerdo (EDVE/DDVE), AE/AO, DDVE/PC e AE/PC.
A função sistólica do ventrículo esquerdo foi avaliada pela porcentagem de encurtamento (DD): [(DDVE - DSVE) / DDVE] X 100, e a função diastólica analisada pela razão entre picos de velocidade de fluxo de enchimento inicial (onda E) e da contração atrial (onda A) do fluxo transmitral.
Um dia após a realização do ecocardiograma correspondente ao período de 21 semanas, os animais foram mortos sob anestesia com pentobarbital sódico. Nesse momento, procurou-se identificar sinais de insuficiência cardíaca, segundo Conrad e cols.39 e Cicogna e cols.11,18: taquipnéia, derrame pleuro-pericárdico, ascite e presença de trombo no átrio esquerdo.
Com relação à análise estatística, os dados numéricos estão expostos como média ± desvio padrão. O estudo das variáveis morfométricas e da concentração miocárdica de hidroxiprolina foi realizado pelo método de análise de variância (ANOVA) para o esquema fatorial 2 X 4, para o modelo inteiramente casualizado, complementado com o teste de comparações múltiplas de
Os parâmetros corporais estão expostos na
Dos 12 animais do grupo EAo que evoluíram por 21 semanas, 3 apresentaram sinais de insuficiência cardíaca incluindo taquipnéia, derrame pleural e ascite.
À avaliação histológica do ventrículo esquerdo, os grupos C tiveram morfologia normal. Nos grupos EAo, observou-se hipertrofia progressiva dos miócitos a partir de 2 semanas de evolução. Os ramos intramurais das artérias coronárias apresentaram hipertrofia da camada média, que era discreta após 2 e 6 semanas, tornando-se mais evidente a partir de 12 semanas (
A área seccional dos miócitos do ventrículo esquerdo foi significantemente maior nos grupos EAo que nos C, em todos os momentos estudados. Em ambos os grupos, ocorreu aumento progressivo das áreas seccionadas miocitárias durante o processo evolutivo (
A concentração miocárdica de hidroxiprolina foi maior nos grupos EAo que nos C, a partir de 6 semanas de evolução; nos C, a concentração foi semelhante em todos os períodos de avaliação e, nos EAo, ocorreu aumento progressivo de seus valores com a evolução do processo hipertrófico (
As médias e os desvios padrão das medidas do ventrículo esquerdo, átrio esquerdo e aorta estão apresentados na
As médias e os desvios padrão da freqüência cardíaca (FC) e dos índices de função sistólica e diastólica estão expostos na
Neste estudo, avaliamos a função cardíaca, a morfologia e o desenvolvimento de fibrose no miocárdio de ratos jovens submetidos a estenose aórtica supravalvar por diferentes períodos evolutivos.
A indução de EAo rapidamente estimula a hipertrofia ventricular esquerda, que se torna evidente já no período mais precoce de avaliação, com duas semanas de evolução. A partir de 6 semanas, não ocorreu aumento do peso do ventrículo esquerdo ou da espessura diastólica da parede ventricular, o que poderia sugerir que, após a indução da estenose aórtica, a hipertrofia ventricular esquerda ocorre precocemente, mantendo-se estável a seguir. Entretanto, à avaliação morfométrica, verificou-se que os valores da área seccional dos miócitos aumentaram progressivamente até 12 semanas, mostrando a existência de hipertrofia adicional durante a evolução do processo.
O estudo ecocardiográfico permitiu definir a hipertrofia ventricular esquerda como sendo do tipo concêntrica, caracterizada por aumento da espessura da parede com dimensões normais ou reduzidas da cavidade ventricular. Segundo vários autores7,26, os animais começam a desenvolver insuficiência cardíaca a partir de 21 semanas após a indução da estenose aórtica. Assim, seria esperado o encontro de hipertrofia excêntrica no último período de estudo. Como somente 25% de nossos ratos apresentaram quadro de insuficiência cardíaca após as 21 semanas de evolução, é provável que a avaliação final tenha sido realizada enquanto a maioria dos animais se encontrava em fase compensada da hipertrofia ventricular esquerda e, portanto, ainda na fase de hipertrofia concêntrica. Entretanto, o aumento do peso do ventrículo direito no último período de avaliação mostra que já poderia estar ocorrendo a transição da fase de hipertrofia ventricular esquerda compensada para a fase de insuficiência cardíaca.
A análise histológica do miocárdio confirmou os achados de outros autores7,26 que também não encontraram, após 21 semanas de indução da estenose aórtica, lesões teciduais relevantes, tais como necrose de miócitos, áreas extensas de fibrose miocárdica ou peri-arterite. Em nosso estudo observamos, além da hipertrofia das células miocitárias, a presença de remodelação vascular caracterizada por hipertrofia da camada média das artérias intramiocárdicas, que era discreta nos primeiros momentos de avaliação, tornando-se evidente a partir de 12 semanas de evolução. O espessamento da camada média das artérias é habitualmente encontrado em humanos com hipertensão arterial sistêmica40. Esse achado pode ser decorrente de hipertrofia e/ou hiperplasia de células da musculatura lisa, aumento do conteúdo de água e/ou colágeno da parede vascular e espessamento da membrana basal40.
Embora este modelo não seja associado com severa fibrose7, a concentração miocárdica de hidroxiprolina foi maior nos grupos EAo a partir de 6 semanas e aumentou progressivamente durante a evolução do processo hipertrófico. No presente estudo, não realizamos a quantificação morfométrica do conteúdo de colágeno e, portanto, não pudemos diferenciar o aumento como sendo de colágeno intersticial e/ou perivascular. Weinberg e cols.26, utilizando a coloração
A análise da função sistólica do ventrículo esquerdo mostrou que na fase inicial do processo hipertrófico o encurtamento está aumentado. Com o tempo, ocorreu depressão da função contrátil da câmara, evidenciada pelo aumento progressivo de DSVE e pela redução de DD, sendo que esses índices foram significantemente diferentes entre os períodos de 6 e 21 semanas após a estenose aórtica. Assim, no modelo é possível detectar as três fases da evolução da função sistólica durante o processo hipertrófico: inicialmente, a presença do desempenho supranormal, que é seguido por desempenho cardíaco inalterado e, finalmente, por depressão da capacidade contrátil do coração. Resultados semelhantes foram observados por outros autores que também avaliaram, seqüencialmente, a função cardíaca por ecocardiograma7,22.
O comprometimento da função diastólica pôde ser detectado a partir de 12 semanas de evolução pela relação E/A, que foi significantemente maior nos grupos EAo que nos respectivos C. Após esse período, não se observou variação adicional nos valores dessa relação. Entretanto, o aumento do diâmetro do AE, constatado a partir da 6º semana, mostra que a disfunção diastólica pode ter ocorrido mais precocemente. Resultados semelhantes foram observados durante estudo seriado da função do ventrículo esquerdo por ecocardiografia22. O aumento de E/A reflete alteração do enchimento ventricular de padrão restritivo. Atualmente, este modelo de enchimento tem sido atribuído, em grande parte, à elevação da pressão atrial esquerda e também ao aumento da rigidez passiva da câmara ventricular, que pode ser decorrente de aumento da espessura da parede e/ou de fibrose intersticial22.
Em resumo, a indução de estenose aórtica supravalvar em ratos jovens promove o desenvolvimento precoce de hipertrofia ventricular esquerda concêntrica com função cardíaca supranormal inicialmente, seguida por disfunção diastólica a partir de 12 semanas de evolução. A redução do desempenho ventricular sistólico somente ocorre em período mais tardio, após 21 semanas da indução da EAo. As alterações da função cardíaca são acompanhadas por fibrose miocárdica e por lesões histológicas pouco expressivas. Estas características mostram que o modelo é adequado e potencialmente útil para estudos sobre fisiopatologia e tratamento da hipertrofia cardíaca por sobrecarga pressórica crônica, tanto na fase compensada como durante a transição para a insuficiência cardíaca.
À valiosa assistência técnica de Vitor Marcos de Souza, José Carlos Georgette e Mário Augusto Dallaqua e ao apoio da CNPQ/PIBIC.
Endereço para correspondência Henrique Barbosa Ribeiro Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP - Depto de Clínica Médica Rubião Júnior, S/N - Cep 18618-000 Botucatu, SP E-mail:
Recebido para publicação em 5/12/02
Aceito em 23/2/03