Artigo Original

Morfologia e Estereologia do Miocárdio em Ratos Hipertensos. Correlação com o Tempo de Inibição da Síntese do Óxido Nítrico

Leila Maria Meirelles Pereira, Glória Maria Moraes Vianna, Carlos Alberto Mandarim-de-Lacerda

Rio de Janeiro, RJ

OBJETIVO: Estudar mudanças estruturais do miocárdio decorrentes do tempo de inibição da síntese do óxido nítrico.

MÉTODOS: Estudaram-se 4 grupos de 10 ratos: controle e L-Name (50mg/kg/dia) com 25 e 40 dias de experimentação. Os animais foram sacrificados e os corações processados tecnicamente para estudo em microscopia de luz, onde cortes corados pelo picro-sirius foram estudados com e sem luz polarizada para análise do colágeno do interstício cardíaco. Determinaram-se densidades de volume de miócitos (Vv[m]) e interstício cardíaco (Vv[int]), densidade numérica de miócitos (Nv[m]) e área transversal dos miócitos (A[m]).

RESULTADOS: Compararam-se os animais L-Name com os respectivos controles. Nos L-Name a pressão da cauda aumentou 74,5 e 90,2% aos 25 e 40 dias, respectivamente. O peso cardíaco aumentou 50% e 28% aos 25 e 40 dias, respectivamente. O miocárdio dos animais L-Name apresentou hipertrofia de miócitos com aumento da A(m), fibrose perivascular e intersticial, espessamento das túnicas íntima e média das artérias intramiocárdicas. Aos 40 dias diminuíram Vv(m) e Nv(m) e aumentou Vv(int).

CONCLUSÃO: Inibição da síntese do óxido nítrico provoca modificações miocárdicas que progridem com o tempo de administração de L-Name. A estereologia é uma metodologia útil para determinar e avaliar as modificações miocárdicas decorrentes deste modelo experimental de hipertensão arterial.

Palavras-chave: óxido nítrico, miocárdico, hipertensão, estereologia

Morphology and Stereology of the Myocardium in Hypertensive Rats. Correlation with the Time of Nitric Oxide Synthesis Inhibition

PURPOSE: To study structural changes of the myocardium in relation to the time of nitric oxide synthesis inhibition.

METHODS: Four groups of 10 rats each were studied: 2 control groups and 2 groups with administration of L-Name (50mg/kg/day), one during 25 days and the other during 40 days. The animals were then sacrificed and the hearts were prepared for study in light microscopy, where sections stained by picro-sirius were studied with and without polarized light for analysis of the cardiac interstitium collagen. Volume densities of myocytes (Vv[m]) and interstitium (Vv[int]), the numerical density of myocytes (Nv[m]) and the mean cross-sectional area of myocytes were (A[m]) also determined.

RESULTS: The L-Name animals were compared with the respective controls. In the L-Name rats, the tail arterial pressure increased 74.5 and 90.2% in the 25 days group and in the 40 days group, respectively. The heart weight increased 50% in the 25 days group and 28.6% in the 40 days group. The myocardium of the L-Name animals presented myocyte hypertrophy with increased A(m), perivascular and interstitial fibrosis, thickness of the tunica intima and tunica media of the intramyocardial arteries. In the 40 days group the L-Name animals had decreased Vv(m) and Nv(m) and increased Vv(int).

CONCLUSION: Inhibition of nitric oxide synthesis provokes myocardial changes that progress with the time of L-Name administration. The stereology is useful to determine and to evaluate the myocardial changes in this model of arterial hypertension.

Key-word: nitric oxide, myocardium, hypertension, stereology

A hipertrofia miocárdica é a tentativa de adaptação do coração à sobrecarga de trabalho, evoluindo para falência cardíaca quando o processo de adaptação é esgotado ¹. No conjunto da hipertrofia miocárdica há alterações vasculares, com o aumento da espessura da parede dos vasos da microcirculação coronária com conseqüente redução do lume vascular e aumento da biossíntese de colágeno na parede vascular, e mudanças na estrutura do miocárdio, como o remodelamento intersticial, com acúmulo de colágeno fibrilar que causa enrijecimento miocárdico ^2-4. A ação do sistema renina-angiotensina-aldosterona também promove acúmulo miocárdico de colágeno tipos I e III aumentando a disfunção ventricular sistólica e diastólica. Em conseqüência, o remodelamento estrutural da matriz colágena do coração faz progredir a disfunção ventricular até a falência cardíaca congestiva ^5,6.

Miofibroblastos atuam na matriz extracelular do coração com atividade contráctil e metabólica. São células transformadas fenotipicamente em fibroblastos que expressam a-actina de músculo liso e são responsáveis pelo turnover do colágeno nos locais de reparação miocárdica. Hoje, sabe-se que a síntese "de novo" de angiotensina II pelos miofibroblastos nos locais de reparação miocárdica tem importante função autócrina e parácrina. Assim, as formas de fibrose miocárdica regressiva, persistente e progressiva estão relacionadas com a ação dos miofibroblastos e os sinais que eles geram ⁷.

A inibição da enzima sintetizadora do óxido nítrico promove hipertensão arterial (HA) de modo rápido e permanente, caracterizando-se por um aumento na resistência periférica total dos vasos sangüíneos ⁸. O L-Name (N^G-nitro-metil-ester-L-arginina), cuja ação está ligada à competição com o aminoácido L-arginina (seu análogo enantiométrico) na via de produção do óxido nítrico, leva a inibição da síntese deste último com conseqüente vasoconstrição e elevação dos níveis de pressão arterial (PA) ^9-11. A deficiência crônica de óxido nítrico causa HA acompanhada de hipertrofia cardíaca ^12-15. Mas, ainda há controvérsia quanto a exata interpretação dos alterações miocárdicas causadas por este modelo de HA ^12,16,17. Em animais submetidos ao uso de L-Name, a hipertrofia miocárdica não é proporcional aos níveis tensionais e as alterações miocárdicas intersticiais são mais intensas que às apresentadas em outros modelos de HA (Goldblatt II, por exemplo) ^4,18.

O presente estudo morfológico e quantitativo em ratos hipertensos pela administração de L-Name tem o objetivo de analisar as mudanças estruturais do miocárdio, particularmente os ramos intramiocárdicos das artérias coronárias.

Métodos

Foram utilizados 40 rattus norvegicus, variedade Wistar, adultos jovens, machos, não consangüíneos, inicialmente com peso corporal entre 200 e 280g e PA da cauda inferior a 130mmHg. Antes de iniciar o estudo os animais foram mantidos, por duas semanas, em observação. A PA foi verificada a cada semana, caracterizando a normotensão. A partir daí, foram divididos em quatro grupos de 10 ratos, mantidos em caixas plásticas adequadas; a) controle 25 dias; b) controle 40 dias; c) L-Name 25 dias; d) L-Name 40 dias.

Os animais dos grupos controles receberam água e ração padrão Purina® ad libitum durante 25 e 40 dias, respectivamente. Os animais dos grupos experimentais (grupos L25 e L40), receberam L-Name (hidrocloreto de N^G-nitro-L-arginina-metil, ester, Sigma Co, St. Louis, lote 44H0102) por 25 ou 40 dias, respectivamente, na dose de 50mg/kg/dia, dissolvidos na água do bebedouro.

No 26^o e no 41^o dias de experimentação os animais dos grupos L-Name e seus respectivos controles foram anestesiados por inalação de éter etílico e sacrificados com injeção intracardíaca de KC1 a 10% (promove parada cardíaca em diástole). Os corações foram retirados, pesados em balança analítica segundo o método de Scherle ¹⁹ suspensos por um fio e imersos em solução fisiológica num recipiente sobre o prato da balança sem tocar as paredes do recipiente. Depois, foram imediatamente fixados em solução de formol 10% tamponado (pH 7,2) por 48h.

Fragmentos do miocárdio da parede ventricular esquerda e septo interventricular foram obtidos conforme o método de clivagem denominado orthotrip ²⁰, obtendo-se cortes "aleatórios e uniformemente isotrópicos", necessários para o estudo estereológico ²¹. Processou-se o material tecnicamente com inclusão em parafina e microtomia com 5µm de espessura. Os cortes foram corados com picro-sirius e tricrômico de van Gieson.

As densidades de volume e de número dos miócitos cardíacos foram determinados. Os cálculos estereológicos foram realizados em 15 campos microscópicos aleatórios por coração ^22-24. Usou-se objetiva de imersão em óleo e sistema de vídeo-microscopio composto por microscópio Leica® modelo DMRBE acoplado a uma câmara de vídeo Kappa® CF 15/5 e um monitor Sony®. O sistema-teste M42 foi sobreposto a tela do monitor e calibrado com micrômetro-objeto 1mm/100 Leitz®. Os parâmetros estereológicos foram determinados de acordo com a metodologia previamente estabelecida ^14,15,18.

Além da estatística descritiva, as diferenças estereológicas, comparando os grupos de animais controle com L-Name nos dias 25 e 40 foram testadas pelo teste não paramétrico Mann-Whitney com índice de significância de 0,05 ²⁵.

Resultados

Nos animais que receberam L-Name a PA da cauda foi significativamente maior que nos respectivos controles. Foi 74,5% mais elevada com 25 dias e 90,2% com 40 dias. Comparando os animais hipertensos com os respectivos controles de mesma idade, o peso cardíaco foi maior 50% com 25 dias e 28,6% com 40 dias de experimentação (tab. I e II).

Com 25 dias, e mais intensamente com 40 dias de HA, os miócitos cardíacos estiveram hipertrofiados com acentuado aumento de miofibrilas citoplasmáticas. Nestes animais hipertensos, o miocárdio, além das áreas de fibrose, mostrou áreas com lesões isquêmicas apresentando infiltrado inflamatório e fibrose cicatricial (de substituição). Isto, provavelmente, deveu-se a necrose de miócitos nestas áreas onde também observou-se espessamento da túnica média dos vasos intramiocárdicos.

Na figura 1, observa-se o miocárdio normal de animais do grupo controle 40 dias e nas figuras 2 a 4 o miocárdio dos animais hipertensos pelo uso do L-Name. Identificam-se áreas de lesão isquêmica aguda do miocárdio com a presença de células inflamatórias (fig. 2), áreas com extensa fibrose intersticial, predominantemente no endomísio e no perimísio, caracterizadas pela cor vermelha na coloração pelo picro-sirius (fig. 3A) e, sob luz polarizada, por aumento na concentração de fibras colágenas de cor vermelho alaranjada (provavelmente colágeno tipo I) e, em menor quantidade, de fibras colágenas de cor verde (provavelmente colágeno tipo III) (fig. 3B). Nos animais hipertensos, tanto aos 25 quanto aos 40 dias, também observou-se fibrose perivascular com espessamento da túnica média nas artérias coronárias intramiocárdicas de menor calibre, com aumento no conteúdo de colágeno, principalmente o do tipo I. Nos animais hipertensos, houve progressão na intensidade da fibrose intersticial e perivascular de 25 a 40 dias, com espessamento da túnica média dos vasos (fig. 4A e B).

Os resultados estereológicos encontram-se nas tabelas I e II. Comparando os animais hipertensos com seus respectivos controles de mesma idade, a densidade de volume dos miócitos (Vv[m]) não apresentou diferença aos 25 dias, mas diminuiu 12,6% aos 40 dias. Da mesma forma, a densidade de volume do interstício cardíaco (Vv[int]) não apresentou diferença aos 25 dias, mas aumentou 14,8% aos 40 dias. A densidade numérica de miócitos (Nv[m]) também não apresentou diferença entre os animais hipertensos e os respectivos controles aos 25 dias, mas foi 23,5% menor nos animais hipertensos aos 40 dias. A área transversal média dos miócitos (A[m]) foi 111,4% maior aos 25 dias e apenas 15,5% maior aos 40 dias.

Discussão

O aumento da PA nos animais que receberam L-Name, no presente estudo, foi superior ao relatado na literatura, utilizando protocolo semelhante ao nosso ^10,26. Contudo, as alterações morfológicas observadas aqui assemelham-se às descritas na literatura para a inibição da síntese do óxido nítrico ^{4, 14-15,27}.

Na sobrecarga de trabalho devido ao aumento da PA há aumento no tamanho do coração sem proliferação celular ²⁸. A parede dos ventrículos do coração de mamíferos apresenta extraordinária hipertrofia dos miócitos e hiperplasia das células intersticiais ²⁹. O remodelamento estrutural do miocárdio na HA ocorre por alteração do colágeno decorrente do crescimento de fibroblastos cardíacos, uma vez que estas células contêm o código genético responsável por iniciar a síntese de colágeno fibrilar ³⁰. Na verdade, parece que os miofibroblastos têm importante função nesta síntese de colágeno ⁷.

A hipertrofia dos miócitos cardíacos contribui para o aumento da massa miocárdica e/ou enrijecimento de suas paredes. A área transversal média dos miócitos pode dobrar, provocando mudança na forma desta célula ²⁹. Os resultados atuais demonstram aumento significativo da área transversal média dos miócitos nos animais que receberam L-Name. Houve também aumento tanto da área transversal média quanto da densidade numérica dos miócitos nos animais dos grupos controle com 25 e 40 dias. É importante salientar que, embora o crescimento do miocárdio adulto seja realizado por hipertrofia, há, até um certo período da vida pós-natal, um aumento hiperplástico cujos níveis vão gradativamente diminuindo com a idade até desaparecer. No rato, o número de miócitos quadruplica em dois anos de idade ³¹. Além disso, com o crescimento corporal, há um aumento no volume ventricular e conseqüente aumento na tensão mecânica das paredes do ventrículo, o que é um estímulo importante para o crescimento do miócito cardíaco. A observação do presente estudo nos animais dos grupos controle, provavelmente, se deve ao processo normal de crescimento dos animais no período estudado ³². Pode também acompanhar a hipertrofia miocárdica a proliferação de células não-miócitos. A proliferação destas células indica remodelamento estrutural do interstício cardíaco com aumento desproporcional das células não-miócitos, ocasionando perda da relação entre os compartimentos muscular e intersticial do miocárdio, o que é considerado patológico ³³.

Observou-se no presente estudo que, nos animais hipertensos com 25 dias de experimentação, o miocárdio ainda não apresentava alteração nas densidades de volume do interstício e do miócito, mas houve aumento significativo do peso cardíaco nesse período, o que parece ter sido causado pela hipertrofia dos miócitos cardíacos, uma vez que houve aumento significativo da área transversal média dos miócitos. Com 40 dias de experimentação, os animais hipertensos apresentaram miócitos com área transversal média um pouco maior, densidades de volume dos miócitos diminuída e do interstício significativamente aumentada. Estes resultados concordam com Contard e col ³⁴ que verificaram que o aumento do peso cardíaco em animais hipertensos experimentalmente está correlacionado, principalmente, com o aumento do conteúdo de colágeno no miocárdio hipertrofiado, também concorda com Zhang e col ³⁵, que afirmam que o tamanho do coração é, primariamente, determinado pelo diâmetro dos miócitos cardíacos nas fibras miocárdicas.

O modelo experimental de HA com L-Name causa uma fibrose (perivascular e intersticial reparativa) e desorganização do músculo cardíaco que são mais intensas que as observadas no modelo renovascular (Goldblatt II) ⁴. Animais hipertensos pelo uso de L-Name e tratados com a administração de hidralazina, continuam apresentando remodelagem da microvascularização coronariana e hipertrofia miocárdica ²⁷. Estes resultados sugerem que as lesões miocárdicas em animais submetidos ao L-Name não são devidas exclusivamente a HA, mas estão associadas, principalmente, a inibição crônica da síntese do óxido nítrico e a lesão do endotélio vascular ^4,15,27.

Mudanças na túnica média do vaso são comuns na HA, enquanto que mudanças na túnica íntima são normalmente associadas à hipercolesterolemia e aterosclerose e são restritas as grandes artérias. Há evidências, em modelos experimentais de HA, que a pressão sangüínea aumentada estimula a proliferação de células musculares lisas na túnica íntima dos vasos ³⁶. Essa proliferação pode ser o resultado de lesões endoteliais causadas por alta pressão intravascular ³⁷. O prejuízo da reserva vasodilatadora coronária na HA pode ser atribuído primariamente, às alterações estruturais nos vasos coronários de resistência. A hipertrofia miocárdica também pode contribuir para aumentar forças compressivas extravasculares que elevam a resistência coronária. A administração de L-Name por oito semanas foi associada a mudanças estruturais nos microvasos coronários, causando espessamento da túnica média e aumento de fibrose perivascular, mas essas alterações não ocorreram nas grandes artérias coronárias ²⁷. Os resultados atuais mostraram uma maior fibrose perivascular com o aumento no tempo de uso de L-Name em ratos. O aumento de tecido conjuntivo nas túnicas média e adventícia pode contribuir para a alteração na reatividade vasomotora e na reserva vasodilatadora coronária, levando, desse modo, a isquemia miocárdica com conseqüente perda de miócitos cardíacos ³⁸.

Os miócitos cardíacos hipertrofiados não têm tamanhos homogêneos nos estágios mais avançados da hipertrofia miocárdica, ocasionando também uma variação importante no espaço intercapilar ³⁹. Isto, adicionado ao processo inflamatório perivascular muito freqüente nestes casos, leva à isquemia de miócitos ⁴⁰. Apesar da possibilidade de haver proliferação de capilares miocárdicos, parece não ser suficiente para a manutenção dos níveis de oxigenação dos miócitos, havendo, em conseqüência, necrose de miócitos ⁴¹. Na HA ocasionada pelo L-Name, o aumento da demanda metabólica miocárdica provocado pela HA está agravado porque os microvasos estão estreitados, há hipertensão e hipertrofia de miócitos, facilitando a isquemia miocárdica e provocando necrose de miócitos. Além do mais, a produção local de angiotensina II, endotelinas e/ou catecolaminas relacionadas à HA, possivelmente, tem um papel importante na necrose miocárdica e subseqüente fibrose ²⁷. No presente estudo, a densidade numérica de miócitos nos animais hipertensos só diminuiu significativamente com 40 dias de uso do L-Name. Nesse período a isquemia miocárdica estava mais acentuada, tendo sido vistos inúmeros campos microscópicos com áreas de fibrose de substituição (região necrose antiga de miócitos) e outras áreas com infiltrado inflamatório (região de necrose recente de miócitos).

A apoptose é uma forma de morte celular distinta da necrose e pode ser explicada como um mecanismo homeostático que afeta a depleção seletiva de células cuja sobrevivência pode prejudicar o bem estar do organismo. A hipóxia relativa do miócito, devida à hipertrofia ventricular esquerda, pode também levar à apoptose. Parece que este processo de morte celular é um dos mecanismos que leva ao estágio final da doença cardíaca ^42,43. A proporção relativa de células necróticas/apoptóticas num determinado tecido depende do tipo e da duração da lesão. Necrose e apoptose de miócitos são observadas no miocárdio, inclusive no homem. Sem dúvida, é a intensidade e a duração da isquemia miocárdica que ditam a ocorrência relativa de cada um dos tipos de morte celular. Estudos experimentais demonstraram que a isquemia miocárdica continuada provoca inicialmente morte celular por apoptose, seguida depois de algumas horas por necrose de miócitos ⁴⁴.

No presente estudo, a inibição da síntese do óxido nítrico concordou com os trabalhos que caracterizaram este modelo experimental na indução de HA. Com a estereologia, quantificaram-se as principais modificações adaptativas normais e patológicas, que ocorrem no miocárdio em decorrência do uso do L-Name como inibidor da síntese do óxido nítrico. Analisando a duração do uso de L-Name, constatou-se que há uma progressão nas lesões miocárdicas, inicialmente com hipertrofia dos miócitos e, mais tardiamente, com extensa fibrose intersticial e perivascular. Também tardiamente detectou-se diminuição de miócitos que, provavelmente, está associada aos fenômenos de necrose e apoptose.

Agradecimentos

Trabalho parcialmente financiado pelo CNPq (Proc. 57.41.14/97-1) e Faperj (Proc. E-26/170.315/95 e E-26/170.086/97)

Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes - Laboratório de Morfometria e Morfologia Cardiovascular - UERJ

Correspondência: Leila Maria Meirelles Pereira - Centro Biomédico - Av. 28 de Setembro, 87 (fundos) - 20551-030 - Rio de Janeiro, RJ

Recebido para publicação em 26/1/98

Aceito em 1/4/98