Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC 7NL5ZgSPNnsTTPXh8vCg6cm S0066-782X2026000200603 00603 10.36660/abc.20240616 Artigo Original Cardiomiopatia PRKAG2: Um Estudo Caso-Controle sobre o Rendimento Diagnóstico da Histopatologia e da Análise Ultraestrutural da Biópsia Endomiocárdica 0000-0002-8154-9606 Honorato-Sampaio Kinulpe Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Oliveira Carla de Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito 2 0000-0001-9996-4405 Araújo Stanley de Almeida Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 3 Correa Frederico Soares Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 4 0000-0002-7221-1515 Dias Glauber Monteiro Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 5 Bahia Antônio Fernandino de Castro Neto Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 6 Cantuária Vinícius Lopes Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 3 Yavari Arash Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 7 Moreira Maria da Consolação Vieira Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 8 Pena José Luiz Barros Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 10 Brasileiro Geraldo Filho Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 9 0000-0003-3249-3711 Sternick Eduardo Back Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 4 Faculdade de Medicina Universidade Federal do Vale do Jequitinhonha e Mucuri Diamantina MG Brasil Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Vale do Jequitinhonha e Mucuri, Diamantina, MG – Brasil Faculdade de Ciências Médicas Belo Horizonte MG Brasil Faculdade de Ciências Médicas, Belo Horizonte, MG – Brasil Hospital das Clínicas Universidade Federal de Minas Gerais Belo Horizonte MG Brasil Hospital das Clínicas - Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG – Brasil Hospital Biocor Rede D’Or São Luiz Nova Lima MG Brasil Hospital Biocor, Rede D’Or São Luiz, Nova Lima, MG – Brasil Laboratório de Biologia Celular e Tecidual Centro de Biociências e Biotecnologia Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro Campos dos Goytacazes RJ Brasil Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Centro de Biociências e Biotecnologia - Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, RJ – Brasil Departamento de Cardiologia Hospital Nossa Senhora das Graças Sete Lagoas MG Brasil Departamento de Cardiologia - Hospital Nossa Senhora das Graças, Sete Lagoas, MG – Brasil Experimental Therapeutics and Division of Cardiovascular Medicine Radcliffe Department of Medicine University of Oxford Oxford United Kingdom Experimental Therapeutics and Division of Cardiovascular Medicine, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, Oxford – United Kingdom Departamento de Clínica Médica Faculdade de Medicina Universidade Federal de Minas Gerais Belo Horizonte MG Brasil Departamento de Clínica Médica - Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG – Brasil Departamento de Anatomia Patológica Faculdade de Medicina Universidade Federal de Minas Gerais Belo Horizonte MG Brasil Departamento de Anatomia Patológica, Faculdade de Medicina - Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG – Brasil Hospital Felício Rocho Belo Horizonte MG Brasil Hospital Felício Rocho, Belo Horizonte, MG – Brasil Eduardo Sternick Alameda do Morro, 85, T-4, suite 1900. CEP 34006-083, Vila da Serra, Nova Lima, MG – Brasil E-mail: eduardosternick@gmail.com

Natália Olivetti

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 16 03 2026 02 2026 123 2 e20240616 10 03 2025 25 09 2025 13 01 2026 Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da licença de atribuição pelo Creative Commons Resumo Fundamento

As características histopatológicas da cardiomiopatia PRKAG2 foram relatadas de forma fragmentada.

 Objetivo

Nosso objetivo foi avaliar sistematicamente as características patológicas cardíacas da cardiomiopatia PRKAG2 em uma grande coorte de pacientes e avaliar seu potencial diagnóstico em comparação com o sequenciamento genético.

 Métodos

Realizamos um estudo observacional, transversal, caso-controle, incluindo 18 pacientes com cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2 e 11 receptores de transplante cardíaco como grupo controle. Todos os pacientes foram submetidos a biópsia endomiocárdica percutânea do ventrículo direito. As amostras de tecido foram analisadas por meio de coloração com hematoxilina-eosina (H&E), coloração com ácido periódico-Schiff para glicogênio, tricrômico de Masson para fibrose e avaliação ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão. A significância estatística foi definida em p < 0,05 para todas as análises.

 Resultados

Os corações com cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2 apresentaram aumento significativo dos cardiomiócitos, mitocôndrias com aparência normal, extensa vacuolização da maioria das miofibras, fibrose intersticial mínima (apenas dois pacientes apresentaram fibrose leve) e ausência de infiltração de células inflamatórias. A microscopia eletrônica de transmissão revelou abundante glicogênio citosólico, principalmente na região perinuclear, com depósitos adicionais nas áreas intermiofibrilares e subsarcolemáticas. Esse acúmulo pronunciado de glicogênio, observado consistentemente em todos os pacientes com PRKAG2, estava ausente nos controles.

 Conclusão

O exame histológico e ultraestrutural de amostras de biópsia endomiocárdica do ventrículo direito revela um conjunto distinto de características que sugerem fortemente a cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2.

Cardiomiopatia PRKAG2: Um Estudo Caso-Controle sobre o Rendimento Diagnóstico da Histopatologia e da Análise Ultraestrutural da Biópsia Endomiocárdica A análise histológica e ultraestrutural da biópsia endomiocárdica do ventrículo direito revela um conjunto consistente de características sugestivas de cardiomiopatia PRKAG2, incluindo aumento do tamanho dos cardiomiócitos, vacuolização pronunciada, ausência de fibrose intersticial, acúmulo substancial de glicogênio e densidade volumétrica mitocondrial preservada.

Palavras-chave Proteínas Quinases Ativadas por AMP Cardiomegalia Microscopia Eletrônica de Transmissão Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico 303206/2022-5 Os autores gostariam de agradecer ao Centro de Microscopia da Universidade Federal de Minas Gerais (http://www.microscopia.ufmg.br) pelo fornecimento de equipamentos e suporte técnico para experimentos envolvendo microscopia eletrônica, e Kinulpe Honorato Sampaio é beneficiário do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (303206/2022-5). Introdução

Mutações no gene PRKAG2, que codifica a subunidade regulatória γ2 da proteína quinase ativada por AMP, levam a um fenótipo altamente penetrante de hipertrofia ventricular, pré-excitação, taquiarritmias atriais, bradicardia sinusal progressiva e anormalidades da condução cardíaca.1 A principal característica patológica – acúmulo anormal de glicogênio nos cardiomiócitos – levou inicialmente à sua classificação como uma cardiomiopatia de armazenamento de glicogênio e uma fenocópia da cardiomiopatia hipertrófica sarcomérica.2

Desde suas primeiras descrições, as características morfológicas da cardiomiopatia PRKAG2 têm sido relatadas principalmente utilizando amostras de biópsia endomiocárdica (BEM) do septo ventricular direito,2-15 um número limitado de autópsias de pacientes que morreram subitamente,2,14,16,17,18e corações explantados de receptores de transplante.7,19 Os achados patológicos parecem depender do momento da biópsia dentro da história natural da doença, com anormalidades mais pronunciadas observadas em pacientes com manifestações clínicas graves.1-19Por exemplo, corações explantados de receptores de transplante com insuficiência cardíaca terminal frequentemente exibem características distintas em comparação com aqueles de pacientes jovens que sucumbiram à morte súbita cardíaca.

Desde a identificação do gene PRKAG2,20,21 o sequenciamento genético se tornou o padrão ouro para o diagnóstico. No entanto, o papel potencial da avaliação da patologia cardíaca nunca foi examinado sistematicamente. A BEM do ventrículo direito (VD) é uma ferramenta diagnóstica segura que foi amplamente utilizada na avaliação de suspeitas de cardiomiopatias por armazenamento de glicogênio antes da ampla disponibilidade dos testes genéticos.22,23 No Brasil e em outros países de baixa renda, o acesso aos testes genéticos permanece limitado, enquanto a BEM é coberta pelo sistema público de saúde. Não está claro, porém, se a BEM oferece acurácia diagnóstica comparável à do sequenciamento genético, que apresenta um rendimento relatado de 100%.

Assim, realizamos um estudo transversal caso-controle para avaliar sistematicamente as características histológicas e ultraestruturais da cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2, utilizando: (1) uma coorte de 18 pacientes de cinco famílias portadoras das variantes R302Q (a variante patogênica mais frequentemente relatada) e H401Q do gene PRKAG2; (2) um grupo controle de 11 corações transplantados estruturalmente normais. A análise histológica e ultraestrutural da BEM do VD revelou um conjunto de características sugestivas de cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2, incluindo aumento do tamanho dos cardiomiócitos, vacuolização pronunciada, ausência de fibrose intersticial, acúmulo substancial de glicogênio e densidade volumétrica mitocondrial preservada (Figura Central).

 Métodos Desenho do estudo

Este estudo observacional prospectivo de caso-controle foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais (SISNEP CAAE: 0511.0.203.418-11). O consentimento livre e esclarecido para a realização da BEM foi obtido de todos os participantes. O estudo foi delineado para avaliar o desempenho diagnóstico da BEM em pacientes com cardiomiopatia por PRKAG2 geneticamente confirmada, utilizando receptores de transplante como grupo controle.

 População do estudo

O grupo de casos compreendeu 18 pacientes com variantes patogênicas do gene PRKAG2 (16 com a mutação R302Q e dois com a mutação H401Q, recentemente relatada pelo nosso grupo12). O grupo controle consistiu em 11 receptores de transplante cardíaco sem evidência clínica de rejeição do enxerto, submetidos a BEM de rotina em até 10 dias após o transplante para monitoramento de rejeição. Os corações transplantados apresentavam estrutura e eletrocardiografia normais, conforme avaliado por ecocardiografia e eletrocardiografia.

 Análise genética

O DNA genômico de pacientes com cardiomiopatia PRKAG2, isolado de leucócitos do sangue total, foi sequenciado utilizando um painel de 52 genes para cardiomiopatia. Uma biblioteca genômica foi preparada com um painel personalizado AmpliSeq e sequenciada utilizando um sistema PGM Ion Torrent. As sequências foram alinhadas ao genoma de referência hg19 e as variantes de nucleotídeos foram filtradas seguindo as diretrizes do American College of Medical Genetics and Genomics e da Association for Molecular Pathology.24,25 Os membros da família foram submetidos a triagem específica para mutações por sequenciamento de Sanger utilizando um analisador genético ABI 3500XL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA).

 Biópsia endomiocárdica

Sob anestesia local, um operador experiente realizou BEM utilizando uma pinça de biópsia miocárdica Cook® (Bloomington, IN, EUA), visando o septo interventricular direito para obter cinco amostras de tecido. Três fragmentos foram fixados em formalina a 10% por 12 horas à temperatura ambiente para microscopia óptica. Os dois restantes foram fixados em solução de Karnovsky (2,5% de glutaraldeído e 2% de paraformaldeído em tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,4) durante a noite a 4 °C para microscopia eletrônica. Nenhum paciente apresentou complicações.

 Microscopia ótica

Fragmentos de BEM fixados em formalina foram incluídos em parafina, seccionados (2 µm) e corados com hematoxilina-eosina (H&E), ácido periódico-Schiff (PAS) e tricrômico de Masson. O diâmetro dos cardiomiócitos (≥12 miócitos por paciente) foi medido utilizando o software ImageJ v1.49 (National Institutes of Health, EUA). As fotomicrografias foram obtidas com aumento de 400× utilizando um microscópio Axio Imager Z2 - Apotome 2 (Zeiss, EUA).

 Microscopia eletrônica de transmissão

As amostras foram pós-fixadas em OsO4 a 1%, coradas durante a noite com acetato de uranila a 2%, desidratadas em etanol e incluídas em Epon 812 (EMS, EUA). Cortes ultrafinos (50 nm) foram obtidos utilizando um ultramicrótomo com lâmina de diamante, montados em grades de cobre e corados com citrato de chumbo de Reynolds. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi realizada a 80 kV utilizando um microscópio FEI Tecnai G2-12 Spirit, equipado com uma câmera CCD SIS-MegaView 3. As micrografias foram obtidas com ampliação de 9.900×. Imagens foram selecionadas aleatoriamente de regiões centrais de cardiomiócitos e analisadas utilizando o software ImageJ. As densidades volumétricas (Vv) de glicogênio, mitocôndrias e miofibrilas foram determinadas usando o método clássico de contagem de pontos com uma grade de 165 pontos (500 × 500 nm) projetada em cada imagem, seguindo Cantuária et al.26 Pelo menos 10 cardiomiócitos por paciente foram submetidos à análise morfométrica.

 Análise estatística

Como a cardiomiopatia PRKAG2 é uma doença extremamente rara, a amostra do estudo foi definida por conveniência, incluindo todos os pacientes elegíveis disponíveis durante o período do estudo. As imagens de microscopia foram analisadas de forma cega por dois investigadores. Quaisquer discrepâncias foram resolvidas por consenso com um terceiro investigador. Os dados foram analisados utilizando o GraphPad Prism v6.1 (GraphPad Software, EUA) e apresentados como média ± desvio padrão (DP). As variáveis categóricas foram apresentadas como frequências absolutas e relativas. Os dados morfométricos apresentaram distribuição normal (teste de Shapiro-Wilk). A correlação de Pearson avaliou a relação entre o diâmetro dos cardiomiócitos e o Vv da análise por MET. As comparações entre os grupos foram realizadas utilizando o teste exato de Fisher bicaudal e o teste t de Student não pareado. A significância estatística foi definida como p < 0,05.

 Resultados Pacientes

O estudo incluiu 18 pacientes com cardiomiopatia PRKAG2 de cinco famílias não relacionadas (Tabela 1): 10 homens (55,5%), com idade média de 38,5 ± 11,8 anos. A pré-excitação ventricular foi altamente prevalente (15/18; 83,3%), consistentemente associada a uma via fasciculoventricular, e nenhuma via acessória atrioventricular foi identificada. Arritmias atriais ocorreram em 11 pacientes (61,1%), sendo taquicardia atrial em seis (33,3%), flutter atrial em três (16,7%) e fibrilação atrial em dois (11,1%). O grupo controle foi composto por 11 receptores de transplante cardíaco, 8 homens (72,7%), com idade média de 54,9 ± 9,6 anos (idade média dos doadores: 27 ± 8,7 anos, significativamente menor que o grupo PRKAG2, p = 0,043). Quatro doadores apresentavam hipertensão sistêmica, estavam em tratamento anti-hipertensivo e demonstraram hipertrofia leve na ecocardiografia. Em conjunto, esses achados destacam a pré-excitação ventricular e as arritmias atriais como características clínicas definidoras da cardiomiopatia PRKAG2.

– Características clínicas dos pacientes e perfil histopatológico da biópsia endomiocárdica
Casos Diagnóstico Variante Idade do doador Idade dos casos Sexo Onda delta Feixe fascículo-ventricular Taquicardia atrial Flutter atrial Fibrilação atrial Ecocardiograma Hipertrofia do VE Vacúolos (HE/Manson) Vacúolos qualitativos Fibrose intersticial Desarranjo de miócitos Inflamação Diâmetro do miócito (µm2) Vv Miofibrilas (%) Vv Mitocôndrias (%) Vv Glicogênio (%)
1 PRKAG2 R302Q 47 F sim/MP sim* não sim pronunciado não não não 19,20 48,18 27,58 14,85
2 PRKAG2 R302Q 32 F sim sim não sim pronunciado não não não 20,16 29,09 33,03 31,82
3 PRKAG2 R302Q 48 F não não não sim pronunciado não não não 18,85 x x x
4 PRKAG2 R302Q 38 F sim sim paroxístico não sim pronunciado não não não 20,18 39,40 38,18 13,64
5 PRKAG2 R302Q 50 M sim/MP sim* paroxístico não sim pronunciado não não não 17,20 45,10 29,21 16,89
6 PRKAG2 R302Q 39 F não não não sim pronunciado não não não 19,32 41,52 27,88 21,21
7 PRKAG2 R302Q 57 M sim/MP sim* sim sim pronunciado não não não 25,84 33,64 28,49 31,21
8 PRKAG2 R302Q 55 M sim/MP sim* sim (RF) persistente sim sim pronunciado slim leve não não 28,38 29,70 25,15 40,31
9 PRKAG2 R302Q 52 M sim/MP sim* sim sim pronunciado não não não 17,71 42,42 29,70 24,85
10 PRKAG2 R302Q 32 M sim sim sim sim pronunciado não não não 25,08 32,43 30,00 33,34
11 PRKAG2 R302Q 34 M sim/MP sim sim (RF) sim sim pronunciado não não não 26,09 24,85 22,12 38,49
12 PRKAG2 R302Q 36 M sim/MP sim* paroxístico sim sim pronunciado não não não 21,33 39,09 29,40 20,30
13 PRKAG2 R302Q 46 F sim sim paroxístico sim (RF) sim sim pronunciado não não não 18,24 29,70 24,85 34,85
14 PRKAG2 R302Q 39 M sim sim paroxístico sim sim pronunciado slim leve não não x 51,22 31,52 10,00
15 PRKAG2 R302Q 30 M sim/MP sim persistente sim sim pronunciado não não não 23,00 32,43 21,52 39,09
16 PRKAG2 H401Q 19 F sim sim paroxístico sim sim pronunciado não não não 21,68 45,76 30,91 15,46
17 PRKAG2 H401Q 18 F sim sim sim sim pronunciado não não não 21,35 42,12 36,37 10,31
18 PRKAG2 R302Q 22 M sim sim sim sim pronunciado não não não 21,97 34,25 20,61 33,03
19 transplante 24 64 M não não não não não não slim leve 13,95 54,58 28,05 13,11
20 transplante 31 53 M não não não sim leve não não não 16,28 55,46 25,76 9,70
21 transplante 29 55 M não não não não slim leve não não 13,03 55,28 32,83 2,78
22 transplante 18 52 M não não não não não não não 16,51 59,88 28,65 5,95
23 transplante 26 61 F não não não não não não não 16,42 61,79 29,45 4,24
24 transplante 24 56 M não não não não não não não 17,49 58,79 31,05 3,99
25 transplante 33 33 F não não não sim leve slim leve não não 12,77 x x x
26 transplante 30 62 M não não sim não não não não 18,24 x x x
27 transplante 15 45 M não não sim não slim leve não slim leve 21,15 x x x
28 transplante 20 68 F não não sim não não não não 18,18 58,71 30,73 3,97
29 transplante 47 55 M não não sim não não não não 21,21 49,70 40,30 2,73

*: indica que a pré-excitação desapareceu após o bloqueio atrioventricular; F: feminino; M: masculino; ECG: eletrocardiograma; VE: ventrículo esquerdo; HE: Hematoxilina eosina; MP: marcapasso; RF: ablação por radiofrequência.

 Avaliação da biópsia endomiocárdica Análise histológica

Pacientes com cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2 apresentaram aumento acentuado dos cardiomiócitos, vacuolização pronunciada e ausência de fibrose intersticial, exceto em dois casos (pacientes 8 e 14) com fibrose leve (Tabelas 1 e 2). Não foi observada infiltração de células inflamatórias (Figura 1). Em contraste, as amostras de controle mostraram infiltrado inflamatório leve em 2 de 11 casos (18,1%), arquitetura normal dos cardiomiócitos, fibrose intersticial leve em 3 casos (27,2%) e vacúolos citosólicos em uma minoria de miócitos em 2 casos (18,1%) (Figura 2). Receptores de transplante cujos doadores apresentavam hipertensão sistêmica exibiram cardiomiócitos maiores do que aqueles cujos doadores eram normotensos (15,2 ± 1,9 µm vs. 19,7 ± 1,7 µm; p = 0,0037).

– Achados histopatológicos do tecido cardíaco
Transplante de coração (n= 11) Cardiomiopatia PRKAG2 (n= 17) Valor p
Fibrose 2/11 (18%) 2/17 (12%) 0,3697a
Inflamação 2/11 (18%) 0/17 (0%) 0,1967a
Vacuolização 2/11 (18%) 17/17 (100%) <0,0001a
Glicogênio (MET) 0/8 (0%) 17/17 (100%) <0,0001a
Diâmetro dos cardiomiócitos (µm)# 16,84 ± 2,86 21,50 ± 3,23 0,0018b

#Dados apresentados como médias de 12 a 100 cardiomiócitos/paciente; a: Teste exato de Fisher; b: Teste t de Student para amostras independentes; MET: Microscopia eletrônica de transmissão.

– Achados histopatológicos em um paciente com cardiomiopatia PRKAG2. Cortes histológicos corados com tricrômico de Masson (A, C) revelam arquitetura miocárdica normal, densidade mitocondrial normal, ausência de fibrose ou inflamação e vacuolização pronunciada dos miócitos. Em pontos selecionados, a vacuolização não foi observada (inserção B), em contraste com a maioria das áreas com intensa vacuolização dos cardiomiócitos (inserção C). Micrografias eletrônicas de transmissão (painéis D, G) exibiram grandes quantidades de glicogênio perinuclear (D) e/ou intermiofibrilar (E, F). Os painéis F e G mostram partículas β de glicogênio como pontos pretos com 30 nm; *: vacuolização; Gly: glicogênio; Lp: lipofuscina; Mf: miofibrila; Mit: mitocôndria.

– Achados histopatológicos de biópsia endomiocárdica de um paciente transplantado cardíaco. Cortes corados com A coloração tricrômica de Masson (A, D) revelou arquitetura miocárdica normal, sem fibrose, vacuolização ou inflamação, e densidade mitocondrial normal. Alguns pacientes apresentaram infiltrados inflamatórios (setas) (B) e algumas pequenas áreas com vacuolização (C, D). Apesar da presença desta última, as micrografias eletrônicas de transmissão não revelaram depósitos de glicogênio (E, F). *: vacuolização; Gly: glicogênio; Mf: miofibrila; Mit: mitocôndria.

Microscopia eletrônica de transmissão

Os cardiomiócitos PRKAG2 apresentaram extenso acúmulo de glicogênio, predominantemente na região perinuclear, com depósitos adicionais nas áreas intermiofibrilares e subsarcolemáticas. Mitocôndrias e sarcômeros pareceram preservados na maioria dos miócitos (Figura 1D-G). Alguns cardiomiócitos continham partículas de β-glicogênio dispersas entre as mitocôndrias. Grânulos de lipofuscina, correspondentes a resíduos lisossômicos, foram observados tanto nas amostras PRKAG2 quanto nas amostras controle. Pacientes com a mutação H401Q exibiram achados histológicos e ultraestruturais idênticos aos da variante R302Q. Notavelmente, nenhuma das amostras controle apresentou acúmulo de glicogênio, mesmo nos casos com leve vacuolização (Figura 2).

A análise quantitativa por MET revelou um aumento de 6 vezes na densidade de glicogênio (p < 0,0001) em pacientes com PRKAG2, uma diminuição de aproximadamente 35% na densidade miofibrilar (p < 0,0001) e nenhuma diferença na densidade mitocondrial entre os grupos (Figura 3). Os valores individuais de densidade volumétrica (Vv) mostraram um limiar claro separando PRKAG2 dos controles. Os casos de PRKAG2 apresentaram pelo menos uma imagem de MET com Vv miofibrilas < 30% e Vv glicogênio > 22%. Os casos controle não atingiram esses limiares. Observou-se uma correlação positiva entre o diâmetro do cardiomiócito e o acúmulo de glicogênio, enquanto o conteúdo miofibrilar apresentou uma correlação negativa. A densidade volumétrica mitocondrial não apresentou correlação com o diâmetro do cardiomiócito (Tabela 3).

– Densidades volumétricas (Gráfico de densidade óptica (Vv) de miofibrilas (A, B), mitocôndrias (C, D) e glicogênio (E, F) de pacientes com PRKAG2 (barras/círculos brancos) e controles (barras/pontos pretos). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (A, C, E) (número de pacientes descrito acima da barra, teste t de Student não pareado) ou valores individuais de cada paciente (B, D, F) (10 campos por paciente); a linha vermelha indica um limiar nos parâmetros entre os pacientes com PRKAG2 e os controles.

– Correlação de Pearson entre o diâmetro dos cardiomiócitos e as densidades volumétricas obtidas por MET
Diâmetro dos cardiomiócitos (µm) Vv Miofibrilas (%) Vv Mitocôndrias (%) Vv Glicogênio (%)
Person r Valor-p Person r Valor-p Person r Valor-p Person r Valor-p
Diâmetro dos cardiomiócitos (µm) -0,757 < 0,0001 -0,217 0,309 0,706 < 0,001
Vv Miofibrilas (%) 0,338 0,099 -0,924 < 0,0001
Vv Mitocôndrias (%) -0,616 < 0,001
Vv Glicogênio (%)

Dados ausentes

Problemas técnicos durante o processamento por MET impediram uma avaliação confiável em 1 dos 18 pacientes com PRKAG2. A análise por microscopia óptica não foi possível para um paciente com PRKAG2. Cada paciente teve dois conjuntos de amostras: um para microscopia óptica e outro para MET. No total, 5 dos 58 conjuntos de dados (8,6%) estavam incompletos (Tabela 1).

 Discussão

As características patológicas da cardiomiopatiaPRKAG2 foi descrita em um número limitado de casos, principalmente por meio de BEM, autópsia de vítimas de morte súbita ou exame de corações explantados de receptores de transplante. Esses relatos sugerem que os achados histopatológicos podem variar dependendo do contexto clínico, com alterações mais pronunciadas observadas em corações explantados e em casos de morte súbita.

Dados anatomopatológicos da literatura (Tabela Suplementar 1) indicam que achados morfológicos foram descritos em apenas 22 de 314 pacientes (7%) com cardiomiopatia PRKAG2. Ao considerar apenas os casos submetidos a BEM percutânea do VD para fins diagnósticos, esse número é ainda menor, totalizando 14 pacientes (4,5%). O presente estudo é a primeira análise sistemática da BEM do VD em uma grande coorte de pacientes com cardiomiopatia PRKAG2, avaliando sua utilidade diagnóstica e a especificidade dos achados em comparação a um grupo controle de receptores de transplante cardíaco cujos doadores não apresentavam a doença.

Os principais resultados do estudo demonstraram que a BEM apresentou alta acurácia diagnóstica em nossa coorte: todos os pacientes com PRKAG2 positivo (18/18, 100%) exibiram as características morfológicas típicas, incluindo cardiomiócitos aumentados sem desarranjo arquitetônico, vacuolização acentuada e um aumento de 6 vezes na densidade de glicogênio (p < 0,0001). Em contraste, nenhum dos controles apresentou acúmulo de glicogênio e apenas 2/11 exibiram vacuolização focal. Esses resultados indicam que a BEM diferenciou de forma confiável a cardiomiopatia associada ao PRKAG2 dos controles nesta população estudada.

A vacuolização pronunciada dos cardiomiócitos é uma característica bem documentada da cardiomiopatia PRKAG2,9-14,18 conforme observado em estudos anteriores utilizando coloração H&E ou tricrômico de Masson, tipicamente associada a grânulos PAS-positivos e grandes quantidades de partículas de glicogênio citosólico em MET. Embora a vacuolização também tenha sido observada em dois casos controle, ela foi focal e limitada a uma minoria de cardiomiócitos, provavelmente devido a artefatos de fixação ou processamento (Figura 2). Em contraste, os pacientes com PRKAG2 exibiram vacuolização generalizada na maioria dos cardiomiócitos.

A explicação predominante para a presença de vacúolos os considera como imagens negativas, um achado indireto resultante da lavagem do glicogênio durante a preparação da lâmina. No entanto, essa suposição não explica completamente a presença de vacúolos em alguns membros do grupo controle. Em um caso controle (caso 20), a MET mostrou claramente a ausência de acúmulo de glicogênio no citosol (Tabela 1). Vale ressaltar que alguns indivíduos normais podem apresentar maior densidade volumétrica de glicogênio (Figura 3F), porém, não demonstram o acúmulo de glicogênio observado em pacientes com PRKAG2 (Figura 1D-G vs. Figura 2EF).

A hipertrofia cardíaca é uma característica marcante da cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2. Recentemente, relatamos a utilidade diagnóstica da ecocardiografia transtorácica, que identificou hipertrofia ventricular esquerda em 25/30 (86%) e hipertrofia ventricular direita em 26/30 (90%) portadores de variantes patogênicas do PRKAG2.27 No entanto, em nível celular, a hipertrofia é tipicamente caracterizada por um aumento no número de unidades sarcoméricas dentro dos cardiomiócitos. O aumento do diâmetro dos cardiomiócitos, por si só, não é diagnóstico de hipertrofia, visto que a expansão celular pode resultar de diversos fatores, incluindo o armazenamento excessivo de substâncias intracelulares como glicogênio, lipídios e água, que podem se manifestar como hipertrofia ventricular em exames de imagem cardíaca.

Estudos recentes utilizando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC-CMs)28,29 mostraram que mutações no gene PRKAG2 (R302Q e N488I) induzem o aumento do tamanho celular devido ao acúmulo de glicogênio, impulsionado por um aumento persistente e inadequado na atividade da AMPK. Notavelmente, a inibição da atividade da AMPK com o composto C reduziu o armazenamento de glicogênio e reverteu a hipertrofia detectada por imagem.29 A subunidade β da AMPK contém um domínio regulatório de ligação ao glicogênio, permitindo que a AMPK do tipo selvagem funcione como um sensor de glicogênio,30 enquanto a microscopia de imunogold mostrou que as subunidades da AMPK se co-localizam com partículas de glicogênio, com a subunidade β1 posicionada na periferia das rosetas de glicogênio.31

Em nosso estudo, observamos uma correlação positiva entre o aumento do tamanho dos cardiomiócitos e o acúmulo intracelular de glicogênio, juntamente com uma correlação inversa entre a densidade volumétrica das miofibrilas e o diâmetro dos cardiomiócitos. Como a densidade volumétrica é uma medida relativa, não podemos descartar um possível aumento no conteúdo de miofibrilas no contexto de cardiomiócitos maiores. Curiosamente, um estudo utilizando um modelo de camundongo transgênico com superexpressão cardíaca do mutante N488I PRKAG2, combinado com uma mutação de inserção no gene do glicogênio sintase muscular (GYS1) – que inibe a atividade do glicogênio sintase estimulada pela glicose-6-fosfatase – conseguiu resgatar o fenótipo de armazenamento de glicogênio e a pré-excitação ventricular. No entanto, isso não afetou a hipertrofia cardíaca ou o aumento do tamanho dos cardiomiócitos, sugerindo que mecanismos além do acúmulo de glicogênio contribuem para a hipertrofia na cardiomiopatia PRKAG2.32

Uma descoberta importante do nosso estudo foi que mesmo pacientes com PRKAG2 sem hipertrofia cardíaca aparente apresentaram alterações morfológicas, incluindo aumento do conteúdo de glicogênio, ausência de inflamação e fibrose mínima ou ausente (Tabela 1). Embora a vacuolização dos cardiomiócitos ocorra em corações normais e em outras doenças, ela é muito mais pronunciada e disseminada na cardiomiopatia associada à PRKAG2 (Figura 1). Além disso, os grandes depósitos de glicogênio identificados na MET foram altamente específicos para PRKAG2 e ausentes nos controles. Exceções incluem casos com fibrose intersticial e desarranjo arquitetônico, relatados em variantes raras do PRKAG2, como K485E e E506K.3,6 Os achados em corações explantados ou autopsiados em doença avançada também diferem, mostrando mais fibrose,7,8,14,16-19desarranjo arquitetônico16,17e degeneração ocasional de miócitos.14,17 Essas características de “estágio final” também foram relatadas em variantes comuns do PRKAG2, como R302Q e N488I.16,17

Neste estudo, a correlação genótipo-fenótipo foi consistente em nossa coorte. Todos os membros da família de um probando com uma variante no gene PRKAG2 e características clínicas típicas também eram portadores da mesma variante, em consonância com relatos anteriores que descrevem a forte associação entre mutações no PRKAG2 e esse fenótipo. Essa concordância completa em nossa série reforça a robustez da associação genético-clínica, evitando generalizações excessivas para além da população estudada.

Outras condições precisam ser diferenciadas da cardiomiopatia PRKAG2. A cardiotoxicidade induzida pela hidroxicloroquina, tipicamente resultante do uso prolongado para doenças do tecido conjuntivo, também se apresenta com vacuolização pronunciada dos miócitos, que se estende ao músculo esquelético. A BEM nesse contexto mostra fibrose intersticial focal sem inflamação. A microscopia eletrônica revela extensas inclusões lisossômicas, corpos mieloides e inclusões curvilíneas, mas sem acúmulo de glicogênio.33 A doença de Danon (mutação LAMP2), que exibe um fenótipo cardíaco grave predominante em homens jovens (geralmente abaixo de 20 anos),34 met um perfil microscópico distinto. O exame post-mortem de dois corações mostrou hipertrofia maciça, desarranjo substancial dos miócitos e fibrose, com aglomerados proeminentes de miócitos vacuolizados e inclusões de material granular amorfo em algumas células dentro das regiões cicatriciais. A doença de Anderson-Fabry, que pode apresentar um fenótipo cardíaco dominante, está associada ao envolvimento multissistêmico.35 Histologicamente, apresenta extensa vacuolização dos cardiomiócitos, fibrose e desarranjo dos miócitos, particularmente no VD, com necrose ocasional de miócitos e substituição por macrófagos espumosos. No entanto, não se observa acúmulo de glicogênio. Além disso, as cardiomiopatias mitocondriais, como as associadas à mutação 3243A>G, podem apresentar um fenótipo semelhante ao da cardiomiopatia hipertrófica (CMH), frequentemente diagnosticadas erroneamente como cardiomiopatia isolada. Esses pacientes podem não apresentar episódios semelhantes a acidente vascular cerebral (síndrome MELAS), e a MET tipicamente revela proliferação mitocondrial.36

Limitações

O grupo de controle consistiu em pacientes transplantados cardíacos cujos corações doadores eram significativamente mais jovens do que aqueles com cardiomiopatia PRKAG2. No entanto, não se espera que as alterações patológicas características da cardiomiopatia PRKAG2 surjam do envelhecimento normal. Alguns dados foram perdidos devido a problemas durante a fixação ou o processamento das amostras (para MET: três casos no grupo controle e um no grupo com cardiomiopatia PRKAG2; para microscopia óptica: um caso no grupo com cardiomiopatia PRKAG2). Considerando que havia apenas 2/36 conjuntos de dados faltantes (5,5%) no grupo com cardiomiopatia PRKAG2, é improvável que isso tenha tido um impacto significativo em nossos resultados.

 Conclusão

Os achados da BEM percutânea do VD revelam alterações morfológicas características, diagnósticas da cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2, em todos os genótipos dos pacientes positivos. A MET desempenha um papel importante na detecção do acúmulo substancial de glicogênio nos cardiomiócitos. As anormalidades histopatológicas e ultraestruturais descritas neste estudo não foram observadas nas amostras de controle. Nossos achados sugerem que a BEM, associada à microscopia óptica e eletrônica, pode auxiliar no diagnóstico da cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2. Estudos adicionais são necessários para validar a microscopia como ferramenta diagnóstica para essa condição.

 Material suplementar Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Centro de Microscopia da Universidade Federal de Minas Gerais (http://www.microscopia.ufmg.br) pelo fornecimento de equipamentos e suporte técnico para experimentos envolvendo microscopia eletrônica, e Kinulpe Honorato Sampaio é beneficiário do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (303206/2022-5).

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Kim M Hunter RW Garcia-Menendez L Gong G Yang YY Kolwicz SC Jr et al Mutation in the ?2-Subunit of AMP-Activated Protein Kinase Stimulates Cardiomyocyte Proliferation and Hypertrophy Independent of Glycogen Storage Circ Res 2014 114 6 966 975 10.1161/CIRCRESAHA.114.302364 33. Nadeem U, Raafey M, Kim G, Treger J, Pytel P, Husain AN, et al. Chloroquine- and Hydroxychloroquine-Induced Cardiomyopathy: A Case Report and Brief Literature Review. Am J Clin Pathol. 2021;155(6):793-801. doi: 10.1093/ajcp/aqaa253. Nadeem U Raafey M Kim G Treger J Pytel P Husain AN et al Chloroquine- and Hydroxychloroquine-Induced Cardiomyopathy: A Case Report and Brief Literature Review Am J Clin Pathol 2021 155 6 793 801 10.1093/ajcp/aqaa253 34. Maron BJ, Roberts WC, Arad M, Haas TS, Spirito P, Wright GB, et al. Clinical Outcome and Phenotypic Expression in LAMP2 Cardiomyopathy. JAMA. 2009;301(12):1253-9. doi: 10.1001/jama.2009.371. 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Este artigo é parte de dissertação de mestrado de Carla de Oliveira pela Faculdade de Ciências Médicas de Minas Gerais.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de Minas Gerais sob o número de protocolo SISNEP CAAE: 0511.0.203.418-11. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.

Os autores não utilizaram ferramentas de inteligência artificial no desenvolvimento deste trabalho.

Os conteúdos subjacentes ao texto da pesquisa estão contidos no manuscrito.

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Para informação adicional, por favor, clique aqui.

 10.36660/abc.20240616i Original Article PRKAG2 Cardiomyopathy: A Case-Control Study on the Diagnostic Yield Of Histopathology and Ultrastructural Analysis from Endomyocardial Biopsy 0000-0002-8154-9606 Honorato-Sampaio Kinulpe Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 Oliveira Carla de Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript 2 0000-0001-9996-4405 Araújo Stanley de Almeida Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 3 Correa Frederico Soares Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for content 4 0000-0002-7221-1515 Dias Glauber Monteiro Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for content 5 Bahia Antônio Fernandino de Castro Neto Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for content 6 Cantuária Vinícius Lopes Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for content 3 Yavari Arash Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 7 Moreira Maria da Consolação Vieira Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for content 8 Pena José Luiz Barros Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for content 10 Brasileiro Geraldo Filho Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 9 0000-0003-3249-3711 Sternick Eduardo Back Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 4 Brazil Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Vale do Jequitinhonha e Mucuri, Diamantina, MG – Brazil Brazil Faculdade de Ciências Médicas, Belo Horizonte, MG – Brazil Brazil Hospital das Clínicas - Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG – Brazil Brazil Hospital Biocor, Rede D’Or São Luiz, Nova Lima, MG – Brazil Brazil Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Centro de Biociências e Biotecnologia - Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, RJ – Brazil Brazil Departamento de Cardiologia - Hospital Nossa Senhora das Graças, Sete Lagoas, MG – Brazil United Kingdom Experimental Therapeutics and Division of Cardiovascular Medicine, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, Oxford – United Kingdom Brazil Departamento de Clínica Médica - Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG – Brazil Brazil Departamento de Anatomia Patológica, Faculdade de Medicina - Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG – Brazil Brazil Hospital Felício Rocho, Belo Horizonte, MG – Brazil Eduardo Sternick Alameda do Morro, 85, T-4, suite 1900. Postal Code 34006-083, Vila da Serra, Nova Lima, MG - Brazil E-mail: eduardosternick@gmail.com

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Natália Olivetti

 Abstract Background

The histopathological features of PRKAG2 cardiomyopathy have been reported in a fragmentary manner.

 Objective

We aimed to systematically evaluate the cardiac pathological features of PRKAG2 cardiomyopathy in a large patient cohort and assess their diagnostic potential compared to genetic sequencing.

 Methods

We conducted an observational, cross-sectional, case-control study including 18 patients with PRKAG2 cardiomyopathy and 11 heart transplant recipients as controls. All patients underwent percutaneous right ventricular endomyocardial biopsy. Tissue samples were analyzed using H&E staining, Periodic Acid-Schiff staining for glycogen, Masson’s trichrome for fibrosis, and ultrastructural assessment by transmission electron microscopy. Statistical significance was set at p < 0.05 for all analyses.

 Results

PRKAG2 cardiomyopathy hearts exhibited significant cardiomyocyte enlargement, normal-appearing mitochondria, extensive vacuolization of most myofibers, minimal interstitial fibrosis (only two patients had mild fibrosis), and no inflammatory cell infiltration. Transmission electron microscopy revealed abundant cytosolic glycogen, primarily in the perinuclear region, with additional deposits in intermyofibrillar and subsarcolemmal areas. This pronounced glycogen accumulation, consistently observed in all PRKAG2 patients, was absent in controls.

 Conclusion

Histological and ultrastructural examination of right ventricular endomyocardial biopsy samples reveals a distinct set of features that strongly suggest PRKAG2 cardiomyopathy.

PRKAG2 Cardiomyopathy: A Case-Control Study on the Diagnostic Yield Of Histopathology and Ultrastructural Analysis from Endomyocardial Biopsy Histological and ultrastructural analysis of right ventricular endomyocardial biopsy reveals a consistent set of features suggestive of PRKAG2 cardiomyopathy, including cardiomyocyte enlargement, pronounced vacuolization, absence of interstitial fibrosis, substantial glycogen accumulation, and preserved mitochondrial volumetric density.

Keywords AMP-Activated Protein Kinases Cardiomegaly Microscopy, Electron, Transmission Introduction

Mutations in the PRKAG2 gene, which encodes the regulatory γ2 subunit of AMP-activated protein kinase, lead to a highly penetrant phenotype of ventricular hypertrophy, pre-excitation, atrial tachyarrhythmias, progressive sinus bradycardia, and cardiac conduction abnormalities.1 The hallmark pathological feature – abnormal cardiomyocyte glycogen accumulation – initially led to its classification as a glycogen storage cardiomyopathy and a phenocopy of sarcomeric hypertrophic cardiomyopathy.2

Since its first descriptions, the morphological characteristics of PRKAG2 cardiomyopathy have been primarily reported using right ventricular septal endomyocardial biopsy (EMB) samples,2-15 a limited number of autopsies from patients who died suddenly,2,14,16,17,18 and explanted hearts from transplant recipients.7,19 Pathological findings appear to depend on the timing of the biopsy within the disease’s natural history, with more pronounced abnormalities observed in patients with severe clinical manifestations.1-19For instance, explanted hearts from transplant recipients with end-stage heart failure often exhibit distinct features compared to those of young patients who succumbed to sudden cardiac death.

Since the identification of the PRKAG2 gene,20,21 genetic sequencing has become the gold standard for diagnosis. However, the potential role of cardiac pathology assessment has never been systematically evaluated. Right ventricular (RV) EMB is a safe diagnostic tool that was widely used in the evaluation of suspected glycogen storage cardiomyopathies before genetic testing became widely available.22,23 In Brazil and other lower-income countries, access to genetic testing remains limited, whereas EMB is covered by the public healthcare system. It is unclear, however, whether EMB provides diagnostic accuracy comparable to genetic sequencing, which has a reported yield of 100%.

Accordingly, we conducted a cross-sectional case-control study to systematically assess the histological and ultrastructural features of PRKAG2 cardiomyopathy using: (1) a cohort of 18 patients from five families carrying the R302Q (the most frequently reported pathogenic variant) and H401Q variants of the PRKAG2 gene; (2) a control group of 11 structurally normal transplanted hearts. Histological and ultrastructural analysis of RV-EMB revealed a set of features suggestive of PRKAG2 cardiomyopathy, including cardiomyocyte enlargement, pronounced vacuolization, absence of interstitial fibrosis, substantial glycogen accumulation, and preserved mitochondrial volumetric density (Central Illustration).

 Methods Study design

This prospective observational case-control study was approved by the Scientific Ethics Committee of Universidade Federal de Minas Gerais (SISNEP CAAE: 0511.0.203.418-11). Written informed consent for EMB was obtained from all participants. The study was designed to assess the diagnostic performance of EMB in patients with genetically confirmed PRKAG2 cardiomyopathy, using transplant recipients as controls.

 Study population

The case group comprised 18 patients with pathogenic PRKAG2 variants (16 with the R302Q mutation and two with the H401Q mutation, recently reported by our group12). The control group consisted of 11 heart transplant recipients with no clinical evidence of graft rejection who underwent routine EMB within 10 days post-transplant for rejection surveillance. Transplanted hearts were structurally and electrocardiographically normal based on echocardiography and electrocardiography.

 Genetic analysis

Genomic DNA from PRKAG2 cardiomyopathy patients, isolated from whole blood leukocytes, underwent sequencing using a 52-gene cardiomyopathy panel. A genomic library was prepared with an AmpliSeq custom panel and sequenced using a PGM Ion Torrent system. Sequences were aligned to the hg19 reference genome, and nucleotide variants were filtered following the American College of Medical Genetics and Genomics and Association for Molecular Pathology guidelines.24,25 Family members underwent mutation-specific screening by Sanger sequencing using an ABI 3500XL genetic analyzer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

 Endomyocardial biopsy

Under local anesthesia, an experienced operator performed EMB using a Cook® myocardial biopsy forceps (Bloomington, IN, USA), targeting the right interventricular septum to obtain five tissue samples. Three fragments were fixed in 10% formalin for 12 hours at room temperature for light microscopy. The remaining two were fixed in Karnovsky’s solution (2.5% glutaraldehyde and 2% paraformaldehyde in 0.1M cacodylate buffer, pH 7.4) overnight at 4°C for electron microscopy. No patient experienced complications.

 Light microscopy

Formalin-fixed EMB fragments were embedded in paraffin, sectioned (2 µm), and stained with hematoxylin-eosin (H&E), periodic acid-Schiff (PAS), and Masson’s trichrome. Cardiomyocyte diameter (≥12 myocytes per patient) was measured using ImageJ software v1.49 (National Institutes of Health, USA). Photomicrographs were taken at ×400 magnification using an Axio Imager Z2 - Apotome 2 microscope (Zeiss, USA).

 Transmission electron microscopy

Samples were post-fixed in 1% OsO4, stained overnight with 2% uranyl acetate, dehydrated in ethanol, and embedded in Epon 812 (EMS, USA). Ultrathin sections (50 nm) were cut using an ultramicrotome with a diamond knife, mounted on copper grids, and stained with Reynolds lead citrate. Transmission electron microscopy (TEM) was performed at 80 kV using a FEI Tecnai G2-12 Spirit, equipped with a SIS-MegaView 3 CCD camera. Micrographs were taken at ×9,900 magnification. Images were randomly selected from central cardiomyocyte regions and analyzed using ImageJ software. Volume densities (Vv) of glycogen, mitochondria, and myofibrils were determined using the classic point counting method with a 165-point grid (500 × 500 nm) projected onto each image, following Lopes Cantuária et al.26 At least 10 cardiomyocytes per patient underwent morphometric analysis.

 Statistical analysis

As PRKAG2 cardiomyopathy is an extremely rare disease, the study sample was defined by convenience, including all eligible patients available during the study period. Microscopy images were analyzed in a blinded manner by two investigators. Any discrepancies were resolved by consensus with a third investigator. Data were analyzed using GraphPad Prism v6.1 (GraphPad Software, USA) and presented as mean ± standard deviation (SD). Categorical variables were presented as absolute and relative frequencies. Morphometric data were normally distributed (Shapiro-Wilk test). Pearson’s correlation assessed the relationship between cardiomyocyte diameter and Vv from TEM analysis. Group comparisons were performed using two-tailed Fisher’s exact test and Student’s unpaired t-test. Statistical significance was set at p < 0.05.

 Results Patients

The study included 18 patients with PRKAG2 cardiomyopathy from five unrelated families (Table 1): 10 males (55.5%), mean age 38.5 ± 11.8 years. Ventricular pre-excitation was highly prevalent (15/18; 83.3%), consistently associated with a fasciculo-ventricular pathway, and no atrioventricular accessory pathway was identified. Atrial arrhythmias occurred in 11 patients (61.1%), comprising atrial tachycardia in six (33.3%), atrial flutter in three (16.7%), and atrial fibrillation in two (11.1%). The control group comprised 11 heart transplant recipients, 8 males (72.7%), with a mean age of 54.9 ± 9.6 years (donor mean age: 27 ± 8.7 years, significantly younger than the PRKAG2 group, p = 0.043). Four donors had systemic hypertension, were on antihypertensive therapy, and showed mild hypertrophy on echocardiography. Together, these findings highlight ventricular pre-excitation and atrial arrhythmias as defining clinical features of PRKAG2 cardiomyopathy.

– Clinical characteristics of patients and histopathological profile of endomyocardial biopsy
Cases Diagnosis Variant Age - donor Age - cases Gender ECG Delta wave Fasciculo ventricular pathway Atrial tachycardia Atrial flutter Atrial fibrillation Echocardiogram LV Hypertrophy vacuoles (HE/Masson) vacuoles qualitative Interstitial fibrosis Myocyte disarray Inflammation Myocyte diameter (um2) Vv Myofibrils (%) Vv Mitochondria (%) Vv Glycogen (%)
1 PRKAG2 R302Q 47 F yes/ PM yes* no yes pronounced no no no 19.20 48.18 27.58 14.85
2 PRKAG2 R302Q 32 F yes yes no yes pronounced no no no 20.16 29.09 33.03 31.82
3 PRKAG2 R302Q 48 F no no no yes pronounced no no no 18.85 x x x
4 PRKAG2 R302Q 38 F yes yes paroxysmal no yes pronounced no no no 20.18 39.40 38.18 13.64
5 PRKAG2 R302Q 50 M yes/ PM yes* paroxysmal no yes pronounced no no no 17.20 45.10 29.21 16.89
6 PRKAG2 R302Q 39 F no no no yes pronounced no no no 19.32 41.52 27.88 21.21
7 PRKAG2 R302Q 57 M yes/ PM yes* yes yes pronounced no no no 25.84 33.64 28.49 31.21
8 PRKAG2 R302Q 55 M yes/ PM yes* yes (RF) persistent yes yes pronounced yes mild no no 28.38 29.70 25.15 40.31
9 PRKAG2 R302Q 52 M yes/ PM yes* yes yes pronounced no no no 17.71 42.42 29.70 24.85
10 PRKAG2 R302Q 32 M yes yes yes yes pronounced no no no 25.08 32.43 30.00 33.34
11 PRKAG2 R302Q 34 M yes/ PM yes yes (RF) yes yes pronounced no no no 26.09 24.85 22.12 38.49
12 PRKAG2 R302Q 36 M yes/ PM yes* paroxysmal yes yes pronounced no no no 21.33 39.09 29.40 20.30
13 PRKAG2 R302Q 46 F yes yes paroxysmal yes (RF) yes yes pronounced no no no 18.24 29.70 24.85 34.85
14 PRKAG2 R302Q 39 M yes yes paroxysmal yes yes pronounced yes mild no no x 51.22 31.52 10.00
15 PRKAG2 R302Q 30 M yes/ PM yes persistent yes yes pronounced no no no 23.00 32.43 21.52 39.09
16 PRKAG2 H401Q 19 F yes yes paroxysmal yes yes pronounced no no no 21.68 45.76 30.91 15.46
17 PRKAG2 H401Q 18 F yes yes yes yes pronounced no no no 21.35 42.12 36.37 10.31
18 PRKAG2 R302Q 22 M yes yes yes yes pronounced no no no 21.97 34.25 20.61 33.03
19 transplant 24 64 M no no no no no no yes mild 13.95 54.58 28.05 13.11
20 transplant 31 53 M no no no yes mild no no no 16.28 55.46 25.76 9.70
21 transplant 29 55 M no no no no yes mild no no 13.03 55.28 32.83 2.78
22 transplant 18 52 M no no no no no no no 16.51 59.88 28.65 5.95
23 transplant 26 61 F no no no no no no no 16.42 61.79 29.45 4.24
24 transplant 24 56 M no no no no no no no 17.49 58.79 31.05 3.99
25 transplant 33 33 F no no no yes mild yes mild no no 12.77 x x x
26 transplant 30 62 M no no yes no no no no 18.24 x x x
27 transplant 15 45 M no no yes no yes mild no yes mild 21.15 x x x
28 transplant 20 68 F no no yes no no no no 18.18 58.71 30.73 3.97
29 transplant 47 55 M no no yes no no no no 21.21 49.70 40.30 2.73

*: indicates that pre-excitation disappeared after atrioventricular block. F: female; M: male; ECG: electrocardiogram; LV: left ventricle; HE: Hematoxylin eosin; PM: pacemaker; RF: radiofrequency ablation.

 Endomyocardial biopsy assessment Histological analysis

Patients with PRKAG2 cardiomyopathy exhibited marked cardiomyocyte enlargement, pronounced vacuolization, and absence of interstitial fibrosis, except for two cases (patients 8 and 14) with mild fibrosis (Tables 1 and 2). No inflammatory cell infiltration was observed (Figure 1). In contrast, control samples showed mild inflammatory infiltrate in 2 of 11 cases (18.1%), normal cardiomyocyte architecture, mild interstitial fibrosis in 3 cases (27.2%), and cytosolic vacuoles in a minority of myocytes in 2 cases (18.1%) (Figure 2). Transplant recipients whose donors had systemic hypertension exhibited larger cardiomyocytes than those whose donors were normotensive (15.2 ± 1.9 µm vs. 19.7 ± 1.7 µm; p = 0.0037).

– Histopathological findings of cardiac tissue
Heart Transplant (n= 11) PRKAG2 cardiomyopathy (n= 17) p-value
Fibrosis 2/11 (18%) 2/17 (12%) 0.3697a
Inflammation 2/11 (18%) 0/17 (0%) 0.1967a
Vacuolization 2/11 (18%) 17/17 (100%) <0.0001a
Glycogen (TEM) 0/8 (0%) 17/17 (100%) <0.0001a
Cardiomyocyte diameter m)# 16.84 ± 2.86 21.50 ± 3.23 0.0018b

#: Data presented as means of 12-100 cardiomyocytes/patient; a: Fisher’s exact test; b: Student’s unpaired t-test; TEM: Transmission electron microscopy.

– Histopathological findings in a patient with PRKAG2 cardiomyopathy. Histological sections stained with Masson’s trichrome (A, C) reveal normal myocardial architecture, normal density of mitochondria, absence of fibrosis or inflammation, and pronounced vacuolization of myocytes. In selected spots, vacuolization was not seen (insert B), in contrast with most areas with intense vacuolization of cardiomyocytes (insert C). Transmission electron micrographs (panels D, G) exhibited large amounts of perinuclear (D) and/or intermyofibrillar glycogen (E, F). Panels F and G show β-particles of glycogen as black dots with 30 nm; *: vacuolization; Gly: glycogen; Lp: lipofuscin; Mf: myofibril; Mit: mitochondria.

– Histopathological findings from endomyocardial biopsy of a heart transplant recipient. Sections stained with Masson’s trichrome (A, D) revealed normal myocardial architecture without fibrosis, vacuolization, or inflammation, and normal density of mitochondria. A few patients exhibited inflammatory infiltrates (arrows) (B) and some small areas with vacuolization (C, D). Despite the presence of the latter, transmission electron micrographs do not reveal any glycogen deposits (E, F). *: vacuolization; Gly: glycogen; Mf: myofibril; Mit: mitochondria.

Transmission electron microscopy

PRKAG2 cardiomyocytes displayed extensive glycogen accumulation, predominantly in the perinuclear region, with additional deposits in intermyofibrillar and subsarcolemmal areas. Mitochondria and sarcomeres appeared preserved in most myocytes (Figure 1D-G). Some cardiomyocytes contained β-glycogen particles interspersed among mitochondria. Lipofuscin granules, corresponding to lysosomal residues, were observed in both PRKAG2 and control samples. Patients with the H401Q mutation exhibited identical histological and ultrastructural findings as those with the R302Q variant. Notably, none of the control samples showed glycogen accumulation, even in cases with mild vacuolization (Figure 2).

Quantitative TEM analysis revealed a 6-fold increase in glycogen density (p < 0.0001) in PRKAG2 patients, ~35% decrease in myofibrillar density (p < 0.0001), and no difference in mitochondrial density between groups (Figure 3). Individual volumetric density (Vv) values showed a clear threshold separating PRKAG2 from controls. PRKAG2 cases had at least one TEM image with Vv myofibrils < 30% and Vv glycogen > 22%. Control cases did not meet these thresholds. A positive correlation was observed between cardiomyocyte diameter and glycogen accumulation, while myofibril content showed a negative correlation. Mitochondrial volume density showed no correlation with cardiomyocyte diameter (Table 3).

– Volumetric densities (Vv) of myofibrils (A, B), mitochondria (C, D), and glycogen (E, F) from PRKAG2 (white bars/circles) and controls (black bars/dots) patients. Data presented as means ± standard deviation (A, C, E) (Number of patients described above bar, Student’s unpaired t-test) or individual values of each patient (B, D, F) (10 fields per patient); Red line indicates a threshold in the parameters between PRKAG2 and control patients.

– Pearson correlation between cardiomyocyte diameter and volumetric densities obtained by TEM
Cardiomyocyte diameter (µm) Vv myofibrils (%) Vv mitochondria (%) Vv glycogen (%)
Person r p-value Person r p-value Person r p-value Person r p-value
Cardiomyocyte diameter (µm) -0,757 < 0.0001 -0,217 0,309 0,706 < 0.001
Vv myofibrils (%) 0,338 0,099 -0,924 < 0.0001
Vv mitochondria (%) -0,616 < 0.001
Vv glycogen (%)

Missing data

Technical issues during TEM processing prevented a reliable assessment in 1 of 18 PRKAG2 patients. Light microscopy analysis was not possible for one PRKAG2 patient. Each patient had two sets of samples: one for light microscopy and one for TEM. In total, 5 of 58 datasets (8.6%) were incomplete (Table 1).

 Discussion

The pathological features of PRKAG2 cardiomyopathy have been described in a limited number of cases, primarily through EMB, autopsy of sudden death victims, or examination of explanted hearts from transplant recipients. These reports suggest that histopathological findings may vary depending on the clinical context, with more pronounced changes observed in explanted hearts and sudden death cases.

Anatomopathological data from the literature (Supplementary Table 1) indicate that morphological findings have been described in only 22 out of 314 patients (7%) with PRKAG2 cardiomyopathy. When considering only cases that underwent percutaneous right ventricular EMB for diagnostic purposes, this number is even lower, totaling 14 patients (4.5%). The present study is the first systematic analysis of right ventricular EMB in a large cohort of PRKAG2 cardiomyopathy patients, assessing its diagnostic utility and the specificity of findings compared to a control group of heart transplant recipients whose donors did not have the disease.

The study’s main findings demonstrated that EMB had a high diagnostic yield in our cohort: all PRKAG2-positive patients (18/18, 100%) exhibited the characteristic morphological features, including enlarged cardiomyocytes without architectural disarray, marked vacuolization, and a 6-fold increase in glycogen density (p < 0.0001). In contrast, none of the controls showed glycogen accumulation, and only 2/11 displayed focal vacuolization. These results indicate that EMB reliably distinguished PRKAG2 cardiomyopathy from controls in this study population.

Pronounced cardiomyocyte vacuolization is a well-documented feature of PRKAG2 cardiomyopathy,9-14,18 as observed in previous studies using H&E or Masson’s trichrome staining, typically associated with PAS-positive granules and large amounts of cytosolic glycogen particles in TEM. Although vacuolization was also observed in two control cases, it was focal and limited to a minority of cardiomyocytes, likely due to fixation or processing artifacts (Figure 2). In contrast, PRKAG2 patients exhibited widespread vacuolization in most cardiomyocytes.

The prevailing explanation for the presence of vacuoles considers them as negative images, an indirect finding resulting from glycogen washout during slide preparation. However, this assumption does not fully account for the presence of vacuoles in some control group members. In one control case (case 20), TEM clearly showed no accumulation of glycogen in the cytosol (Table 1). It is worth noting that a few normal individuals may exhibit higher volumetric density of glycogen (Figure 3F), however, they show no accumulation of glycogen as seen in PRKAG2 patients (Figure 1D-G vs. Figure 2 E-F).

Cardiac hypertrophy is a hallmark of PRKAG2 cardiomyopathy. We recently reported the diagnostic utility of transthoracic echocardiography, identifying left ventricular hypertrophy in 25/30 (86%) and right ventricular hypertrophy in 26/30 (90%) carriers of pathogenic PRKAG2 variants.27 However, at the cellular level, hypertrophy is typically characterized by an increased number of sarcomeric units within cardiomyocytes. Cardiomyocyte diameter enlargement alone is not diagnostic of hypertrophy, as cellular expansion can result from various factors, including excessive storage of intracellular substances such as glycogen, lipids, and water, which can manifest as ventricular hypertrophy on cardiac imaging.

Recent studies using cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CMs)28,29 have shown that PRKAG2 mutations (R302Q and N488I) induce cell enlargement due to glycogen accumulation, driven by a persistent and inappropriate increase in AMPK activity. Notably, inhibition of AMPK activity using compound C reduced glycogen storage and reversed imaging-detected hypertrophy.29 The β subunit of AMPK contains a regulatory glycogen-binding domain, allowing wild-type AMPK to function as a glycogen sensor,30 while immunogold microscopy has shown AMPK subunits co-localized with glycogen particles, with the β1 subunit positioned at the periphery of glycogen rosettes.31

In our study, we observed a positive correlation between cardiomyocyte enlargement and intracellular glycogen accumulation, alongside an inverse correlation between myofibril volumetric density and cardiomyocyte diameter. Since volumetric density is a relative measure, we cannot rule out a potential increase in myofibril content in the context of larger cardiomyocytes. Interestingly, a study using a transgenic mouse model with cardiac overexpression of the N488I PRKAG2 mutant, combined with a knock-in mutation in the muscle form of glycogen synthase (GYS1)–which inhibits glucose-6-phosphatase-stimulated glycogen synthase activity–successfully rescued the glycogen storage phenotype and ventricular pre-excitation. However, it did not affect cardiac hypertrophy or cardiomyocyte enlargement, suggesting that mechanisms beyond glycogen accumulation contribute to hypertrophy in PRKAG2 cardiomyopathy.32

An important finding of our study was that even PRKAG2 patients without apparent cardiac hypertrophy exhibited morphological changes, including increased glycogen content, absence of inflammation, and minimal or no fibrosis (Table 1). While cardiomyocyte vacuolization occurs in normal hearts and other diseases, it is far more pronounced and widespread in PRKAG2 cardiomyopathy (Figure 1). Moreover, large glycogen deposits identified on TEM were highly specific to PRKAG2 and absent in controls. Exceptions include cases with interstitial fibrosis and architectural disarray, reported in rare PRKAG2 variants such as K485E and E506K.3,6 Findings from explanted or autopsied hearts in advanced disease also differ, showing more fibrosis,7,8,14,16-19architectural disarray,16,17 and occasional myocyte degeneration.14,17 These “end-stage” features have also been reported in common PRKAG2 variants like R302Q and N488I.16,17

In this study, genotype-phenotype correlation was consistent within our cohort. All family members of a proband with a PRKAG2 variant and characteristic clinical features were also carriers of the same variant, in line with previous reports describing the strong association between PRKAG2 mutations and this phenotype. This complete concordance in our series reinforces the robustness of the genetic-clinical association, while avoiding overgeneralization beyond the studied population.

Other conditions need to be differentiated from PRKAG2 cardiomyopathy. Hydroxychloroquine-induced cardiotoxicity, typically resulting from long-term use for connective tissue diseases, also presents with pronounced myocyte vacuolization, which extends to skeletal muscle. EMB in this context shows focal interstitial fibrosis without inflammation. Electron microscopy reveals extensive lysosomal inclusions, myeloid bodies, and curvilinear inclusions but no glycogen accumulation.33Danon disease (LAMP2 mutation), which exhibits a predominant severe cardiac phenotype in young males (usually below 20 years),34 has a distinct microscopic profile. Post-mortem examination of 2 hearts showed massive hypertrophy, substantial myocyte disarray, and fibrosis, with prominent clusters of vacuolated myocytes and inclusion and inclusions of amorphous granular material in some cells inside scarring regions. Anderson-Fabry disease, which may have a dominant cardiac phenotype, is associated with multisystem involvement.35 Histologically, it shows extensive cardiomyocyte vacuolation, fibrosis, and myocyte disarray, particularly in the right ventricle, with occasional myocyte necrosis and foamy macrophage replacement. However, no glycogen accumulation is observed. Additionally, mitochondrial cardiomyopathies, such as those associated with the 3243A>G mutation, can present with an HCM-like phenotype, often misdiagnosed as isolated cardiomyopathy. These patients may lack stroke-like episodes (MELAS syndrome), and TEM typically reveals mitochondrial proliferation.36

Limitations

The control group consisted of cardiac transplant patients whose donor hearts were significantly younger than those with PRKAG2 cardiomyopathy. However, the pathological changes characteristic of PRKAG2 cardiomyopathy are not expected to arise from normal aging. Some data were lost because of problems during fixation or sample processing (for TEM: three cases in the control group and one in the PRKAG2 cardiomyopathy group; for light microscopy: one case in the PRKAG2 cardiomyopathy group). Given there were only 2/36 missing sets (5.5%) in the PRKAG2 cardiomyopathy group, it is unlikely that this had a significant impact on our findings.

 Conclusion

Percutaneous right ventricular EMB findings reveal hallmark morphological changes diagnostic of PRKAG2 cardiomyopathy in all genotypes of positive patients. TEM plays an important role in detecting substantial cardiomyocyte glycogen accumulation. The histopathological and ultrastructural abnormalities described in this study were not observed in control samples. Our findings suggest that EMB, coupled with light and electron microscopy, can aid in diagnosing PRKAG2 cardiomyopathy. Further studies are needed to validate microscopy as a diagnostic tool for PRKAG2 cardiomyopathy.

 Supplemental Materials Acknowledgement

The authors would like to acknowledge the Center of Microscopy at Universidade Federal de Minas Gerais (http://www.microscopia.ufmg.br) for providing the equipment and technical support for experiments involving electron microscopy, and Kinulpe Honorato Sampaio is a recipient of Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (303206/2022-5).

This article is part of the thesis of master submitted by Carla de Oliveira, from Faculdade de Ciências Médicas de Minas Gerais.

This study was approved by the Ethics Committee of the Universidade Federal de Minas Gerais under the protocol number SISNEP CAAE: 0511.0.203.418-11. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.

The authors did not use any artificial intelligence tools in the development of this work.

The underlying content of the research text is contained within the manuscript.

There were no external funding sources for this study.

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