Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCz8yFkFM8WqPz8c4rxmc8rTQS0066-782X20250009003010030110.36660/abc.20240847Artigo OriginalAnálise Transcriptômica por Sequenciamento de Alto Rendimento da Expressão de lncRNAs e mRNAs em Pacientes com Fluxo Lento Coronário0009-0000-3242-9619JiangHaibingConcepção e desenho da pesquisa e Análise estatística1YangYiRedação do manuscritoRevisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo1ZhaiXueqinAnálise e interpretação dos dadosRedação do manuscrito1ZhangLijingObtenção de dados1KahaerjiangAerziyaObtenção de dados2Hospital of Traditional Chinese MedicineXinjiang Medical UniversityUrumqiChinaHospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi– ChinaXin Jiang Medical UniversityUrumqiXinjiangChinaXin Jiang Medical University, Urumqi, Xinjiang – China Haibing Jiang • Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Xinjiang Medical University, 116, Huanghe Road, Urumqi, 830041 – China E-mail: jianghaibing1017@163.com
Marina Okoshi
Não há conflito com o presente artigo
290920250820251229e20240847070120251605202521052025Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da licença de atribuição pelo Creative CommonsResumoFundamento
Os RNAs longos não codificantes (lncRNAs) e os microRNAs (miRNAs) são considerados elementos-chave na fisiopatologia do fluxo lento coronário (FLC).
Objetivos
Este estudo teve como objetivo explorar as redes biológicas complexas envolvidas no FLC por meio do sequenciamento do transcriptoma completo, visando identificar potenciais biomarcadores diagnósticos e alvos terapêuticos.
Métodos
O sequenciamento do transcriptoma completo foi realizado em amostras de três pacientes com FLC e três indivíduos controle pareados. Foi considerado estatisticamente significativo o valor de p < 0,05.
Resultados
Foram identificados 854 lncRNAs diferencialmente expressos, sendo 425 com expressão reduzida e 429 com expressão aumentada. A análise de vias do KEGG mostrou enriquecimento significativo de lncRNAs em vias associadas a doenças cardiovasculares, distúrbios endócrinos e metabólicos, e progressão de doenças neurodegenerativas. Além disso, foram identificados 1.999 mRNAs diferencialmente expressos, dos quais 990 estavam regulados negativamente e 1.009, positivamente. A análise de função molecular revelou participação em ligação a proteínas, regulação da atividade de quinases, atividade de transferase de ubiquitina-proteína e ligação a RNA. A análise de vias KEGG indicou que os mRNAs diferencialmente expressos estavam principalmente envolvidos em autofagia, sarampo, proteólise mediada por ubiquitina, via de sinalização por receptores do tipo NOD, via de sinalização do fator de necrose tumoral (TNF), via de sinalização por receptores do tipo Toll (TLR) e via de sinalização NF-κB.
Conclusões
Os mRNAs diferencialmente expressos apresentaram enriquecimento significativo em vias KEGG relacionadas à autofagia, sarampo e degradação mediada por ubiquitina, além de cascatas de sinalização envolvendo receptores do tipo NOD, TNF, TLR e NF-κB. Novos estudos são necessários para validar esses achados.
Análise Transcriptômica por Sequenciamento de Alto Rendimento da Expressão de lncRNAs e mRNAs em Pacientes com Fluxo Lento Coronário
Palavras-chaveSequenciamento de Nucleotídeos em Larga EscalaRNA MensageiroRNA Longo não CodificanteInflamaçãoTianshan Talents” Medical and Health High – Level Personal Training ProgramTSYc202301B053Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado por “Tianshan Talents” Medical and Health High – Level Personal Training Program, number: TSYc202301B053.Introdução
O fluxo lento coronário (FLC) está intimamente associado ao surgimento de diversas manifestações clínicas do fenômeno do FLC.1-5 Essa condição tem sido relacionada a diversos fatores contribuintes, incluindo transtornos psiquiátricos, níveis séricos de salusina-β, homocisteína, cistatina C, índice de massa corporal e inflamação imune sistêmica.2,3,6,7 A resposta inflamatória pode desempenhar um papel central em múltiplos processos fisiopatológicos, como a obstrução microvascular e a formação de microtrombos, considerados elementos-chave na patogênese da disfunção da microcirculação coronariana.8-11
Estudos recentes demonstraram que determinados RNAs longos não codificantes (lncRNAs) podem regular fatores inflamatórios a jusante, influenciando assim o desenvolvimento do FLC.9,12 Danaii et al. propuseram que os microRNAs (miRNAs) podem atuar como potenciais biomarcadores para o diagnóstico do FLC e o monitoramento da progressão da doença arterial coronariana (DAC) em pacientes acometidos.13 Com base nesses achados, os lncRNAs e miRNAs parecem desempenhar papéis significativos na fisiopatologia do FLC. No entanto, considerando a complexidade da condição e as diversas funções dos RNAs não codificantes no sistema cardiovascular, focar em apenas algumas moléculas pode não proporcionar uma compreensão abrangente dos mecanismos subjacentes.
A análise do transcriptoma completo oferece uma perspectiva mais ampla, permitindo a identificação dos principais lncRNAs e miRNAs envolvidos no FLC, bem como suas possíveis interações. Essa abordagem pode contribuir para uma compreensão mais profunda da base molecular do FLC e apoiar futuras aplicações clínicas.
O sequenciamento de RNA (RNA-seq) tem sido amplamente utilizado para investigar perfis de expressão gênica em tecidos e células cardíacas, oferecendo subsídios para a compreensão das alterações moleculares associadas a condições como o FLC e a síndrome de Takotsubo, uma forma de doença microvascular coronariana.14,15 Um estudo transcriptômico do FLC, utilizando RNA extraído de monócitos do sangue periférico, revelou padrões diferenciais de expressão gênica e uma associação com a inflamação.16 No entanto, a patogênese do FLC permanece complexa e pouco compreendida, e até o momento apenas alguns estudos aplicaram o sequenciamento do transcriptoma especificamente ao FLC.
Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo investigar o panorama transcriptômico de pacientes com FLC por meio do sequenciamento de alto rendimento de leucócitos do sangue periférico, a fim de identificar genes e vias potencialmente envolvidas no desenvolvimento do FLC.
MétodosParticipantes
Este estudo, apoiado pelo financiamento nº 2016XE0113, foi conduzido de acordo com os princípios éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque. Todos os participantes foram plenamente informados sobre os objetivos do estudo e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa, garantindo a proteção dos direitos e do bem-estar dos participantes.
Foram incluídos três pacientes diagnosticados com FLC com base em angiografia coronariana, além de três indivíduos com achados coronarianos normais nesse exame, recrutados no Hospital de Medicina Tradicional Chinesa da Região Autônoma Uigur de Xinjiang. Esses indivíduos foram alocados, respectivamente, nos grupos caso e controle. Todos os participantes foram inicialmente suspeitos de apresentar DAC não complicada e não possuíam histórico de diabetes, miocardiopatia, vasculite, doenças do tecido conjuntivo ou doenças endócrinas.
Critérios diagnósticos
O FLC foi definido como a perfusão tardia de qualquer vaso coronário distal principal, excedendo três ciclos cardíacos, conforme observado durante a angiografia coronariana.
Critérios de exclusão
Os participantes foram selecionados com base em critérios rigorosos de inclusão e exclusão, a fim de garantir a confiabilidade e validade dos achados do estudo. Foram excluídos pacientes que apresentavam hipotensão (pressão arterial sistólica ≤ 90 mmHg no momento da angiografia) na ausência de uso de medicamentos vasodilatadores, ou frequência cardíaca < 60 batimentos por minuto sem influência de fármacos que modulam a frequência cardíaca. Também foram excluídos indivíduos que haviam apresentado infarto agudo do miocárdio ou síndrome coronariana aguda — incluindo angina instável — no mês anterior. Além disso, pacientes com qualquer estenose de artéria coronária > 50% não foram considerados elegíveis para inclusão. Dados clínicos, índices laboratoriais e amostras de sangue foram coletados e analisados de todos os participantes.
Métodos experimentaisConstrução do banco de dados e processo de sequenciamento
O RNA total foi extraído das amostras de sangue após centrifugação, lise e precipitação. A integridade do RNA isolado foi avaliada por meio de procedimentos analíticos padrão, seguida por uma análise de qualidade. Em seguida, os RNAs ribossômicos (rRNAs) foram removidos para o enriquecimento de mRNAs e RNAs não codificantes. O RNA restante foi fragmentado e transcrito reversamente em DNA complementar (cDNA). Em seguida, os cDNAs com extremidades cegas passaram por ligação de adaptadores e adição de caudas. A biblioteca de cDNA resultante foi submetida à separação por eletroforese em gel de agarose, sendo recortada a faixa correspondente ao tamanho-alvo. Os fragmentos de cDNA selecionados foram então amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR) e submetidos ao sequenciamento de alto rendimento utilizando uma plataforma automatizada.
Coleta de amostras e processamento de sangue total
A etapa inicial consistiu no registro e identificação precisos de amostras de 4 ml de sangue total coletadas de pacientes diagnosticados, com cada amostra rotulada de acordo com o prontuário do paciente. Após a centrifugação, os componentes plasmáticos e celulares foram separados. O plasma, localizado na camada superior após a centrifugação, foi transferido para tubos Eppendorf de 1,5 ml, sendo adicionados 400 μl de plasma em cada tubo. Os tubos foram então selados e armazenados em ultrafreezer a –80 °C para preservação.
A centrifugação foi realizada a 3.000 rpm durante 10 minutos, garantindo a separação eficiente do plasma. O pellet celular resultante foi ressuspenso em Tampão de Lise ACK (amônio-cloreto-potássio) (Bioseth, Zhenjiang, China) e transferido para tubos Eppendorf novos de 1,5 ml. O pellet de cada paciente foi dividido igualmente em dois grupos para análises posteriores, assegurando a integridade das amostras para os procedimentos subsequentes.
Os tubos Eppendorf contendo as células ressuspensas foram incubados à temperatura ambiente por 5 minutos para promover a lise celular. Em seguida, foi realizada a centrifugação para separação dos componentes. Para melhorar a eficiência da lise, o tratamento com Tampão de Lise ACK foi repetido duas a três vezes, garantindo a ruptura completa das células. Após a etapa final de lise, as amostras foram lavadas com solução salina fisiológica para remover resíduos do tampão.
Para a extração de RNA, os leucócitos de um dos conjuntos de tubos Eppendorf de 1,5 ml foram processados utilizando um protocolo de ressuspensão e precipitação à base de TRIzol, com o reagente TRIzol (Invitrogen, EUA). Outro conjunto de tubos contendo leucócitos foi mantido sem tratamento e armazenado a –80 °C para uso futuro.
Teste das amostras de RNA
A integridade e a pureza das amostras de RNA foram avaliadas por meio de um processo de controle de qualidade (CQ) em múltiplas etapas. Inicialmente, foi realizada eletroforese em gel de agarose para detectar degradação e contaminação. Esse método separa fragmentos de ácidos nucleicos por tamanho, permitindo uma avaliação visual da integridade do RNA. Em seguida, foi realizada análise espectrofotométrica para determinar a pureza do RNA, utilizando-se a razão A260/A280 como indicador padrão. A quantificação de alta precisão da concentração de RNA foi então realizada com o fluorímetro Qubit® 3.0, assegurando uma medição precisa do rendimento de RNA. Por fim, foi utilizado o sistema Agilent 2100 Bioanalyzer com o kit RNA Nano 6000 Assay para avaliação da integridade do RNA. Essa análise gerou um número de integridade de RNA (RIN), que fornece uma medida quantitativa da qualidade do RNA.
Construção e teste da biblioteca
Para a construção da biblioteca de lncRNAs, foi selecionada uma amostra de 3 microgramas de RNA total como material de partida. Os RNAs ribossômicos foram posteriormente removidos com precisão, utilizando o kit Ribo-Zero™ Gold (Human/Mouse/Rat, Illumina, EUA). Diferentes identificadores (índices) foram escolhidos para a construção das bibliotecas, conforme as instruções operacionais do kit NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep para Illumina (NEB, Ipswich, EUA). De forma simplificada, o processo de construção da biblioteca foi dividido em quatro etapas principais. Primeiramente, após a remoção dos rRNAs, selecionaram-se os reagentes apropriados. Uma vez obtido o mRNA, aplicou-se o tampão de fragmentação para gerar os fragmentos desejados. Em seguida, esses fragmentos foram utilizados como moldes para a síntese da primeira fita de cDNA. A síntese da segunda fita de cDNA foi realizada com a adição de RNase H e dNTPs (dUTP). Na terceira etapa, após a eliminação inicial dos rRNAs, foi utilizado um kit de purificação para realizar a limpeza das amostras. A etapa seguinte envolveu uma sequência detalhada de procedimentos, incluindo a integração do Grupo Básico A e o reparo das extremidades. Por fim, o fragmento-alvo obtido por eletroforese em gel de agarose foi recuperado, e a amplificação por PCR (Qiagen, Alemanha) foi realizada para completar a construção da biblioteca.
Após a conclusão da construção da biblioteca, foi realizada a diluição quantitativa utilizando o fluorímetro Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific, EUA), ajustando-se a concentração da biblioteca para 1 ng/μl. Com a fase de construção finalizada, o equipamento Agilent 2100 (Agilent, EUA) foi utilizado para medir o tamanho do inserto. A PCR quantitativa (qPCR) foi realizada com o equipamento CFX96 (Bio-Rad, EUA) e o kit fluorescente iQ SYBR GRN (Bio-Rad, EUA). A concentração efetiva da biblioteca foi quantificada com precisão (concentração efetiva > 10 nM) para assegurar a qualidade da biblioteca. Após a detecção e validação da biblioteca, diferentes bibliotecas foram agrupadas no flow cell de acordo com os requisitos de concentração efetiva e volume de dados-alvo. A geração de clusters no cBot foi seguida do sequenciamento em plataforma de alto rendimento Illumina (NovaSeq 6000, Illumina, EUA), com obtenção de leituras pareadas de 150 pb. Em seguida, foi realizada uma série de procedimentos, incluindo a aplicação do Grupo Básico A e a finalização do reparo das extremidades. A biblioteca foi então submetida à qPCR, desde que o tamanho do inserto estivesse dentro dos parâmetros esperados, sendo exigida uma concentração efetiva superior a 10 nM para garantir sua qualidade.
Sequenciamento em máquina
Após a finalização da construção das bibliotecas, as bibliotecas qualificadas foram agrupadas no flow cell de forma adequada, conforme a concentração efetiva estabelecida e os objetivos definidos para o sequenciamento. Em seguida, após a formação bem-sucedida dos clusters, as amostras foram submetidas à análise transcriptômica por sequenciamento de alto rendimento.
Análise transcriptômica por sequenciamento de alto rendimentoPré-processamento dos dados e CQ:
As leituras brutas geradas pelo sequenciamento de alto rendimento foram fornecidas no formato FASTQ. Para obter leituras de alta qualidade adequadas às análises posteriores, foi realizado um processo de filtragem de qualidade. Inicialmente, utilizou-se o software fastp17 para CQ e remoção de adaptadores. Bases de baixa qualidade foram filtradas, resultando em um conjunto de leituras limpas de alta qualidade (clean reads). Em seguida, essas leituras limpas foram comparadas com sequências de rRNA utilizando o software SortMeRNA,18 sendo removidas aquelas que apresentaram correspondência. As leituras restantes foram mantidas para as análises subsequentes.
Alinhamento genômico e processamento dos transcritos:
O software Hisat219 (http://www.psc.edu/user-resources/software/hisat2) foi utilizado para alinhar as clean reads ao genoma de referência, com os parâmetros padrão aplicados. A montagem dos transcritos foi realizada por meio do software StringTie, gerando novos isoformas de transcritos. Esses isoformas foram comparados com a anotação do genoma de referência utilizando o Cuffcompare, a fim de identificar transcritos conhecidos e novos.
Predição de lncRNAs:
A maioria dos lncRNAs não possui potencial codificador de proteínas. Foram selecionados transcritos com dois ou mais éxons e comprimento superior a 200 pb. Os lncRNAs candidatos foram identificados por meio da predição do potencial codificador utilizando as ferramentas CPC, CNCI, Pfam e PLEK.
Quantificação transcricional, análise de expressão diferencial, enriquecimento funcional e análise de agrupamento:
As clean reads com os rRNAs removidos foram alinhadas aos transcritos de referência (mRNAs e lncRNAs) utilizando o software Bowtie2,20 e os resultados foram armazenados em arquivos binários de alinhamento (formato BAM). O software eXpress foi utilizado para quantificar a abundância dos transcritos, fornecendo tanto a contagem de leituras quanto os valores de fragments per kilobase of transcript per million (FPKM).
Para experimentos com réplicas biológicas, a normalização dos dados foi realizada por meio da função estimateSizeFactors do pacote DESeq (2012) no R.21 A expressão diferencial foi avaliada com a função nbinomTest, que calcula os valores de p e as razões de mudança (fold change). Para experimentos sem réplicas biológicas, a análise de expressão diferencial foi conduzida com base no pacote edgeR (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html),22 utilizando o teste de distribuição binomial negativa (NB). As contagens de leitura foram avaliadas quanto à significância estatística por meio desse teste, e os valores de CPM (counts per million) foram utilizados para estimar os níveis de expressão gênica.
Os genes diferencialmente expressos com valor de p inferior a 0,05 foram selecionados, e um teste de distribuição hipergeométrica foi realizado no software R para conduzir as análises de enriquecimento em ontologia gênica (gene ontology, GO) e na Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Essas análises permitiram identificar as funções biológicas e vias mais impactadas pelos genes diferencialmente expressos (differentially expressed genes, DEGs).
Análise de splicing alternativo, polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) e INDELs:
A análise de splicing alternativo foi realizada utilizando o software ASprofile.23 Os programas Samtools24 e BCFtools25 foram utilizados para identificar os sítios de SNPs e INDELs. Para detalhes sobre o procedimento específico, consulte o site do Samtools website (http://samtools.sourceforge.net/mpileup.shtml). Todos os softwares foram executados com os parâmetros padrão.
Identificação, quantificação e análise diferencial de circRNAs:
Com base no banco de dados circBase,26 os dados de sequenciamento foram inicialmente analisados utilizando o software CIRI27 para a predição de circRNAs. Os resultados preditos foram então comparados com o banco de dados para identificar tanto circRNAs conhecidos quanto novos. Os genes sobrepostos foram extraídos e anotados com base nas posições cromossômicas dos circRNAs.
A abundância de circRNAs foi quantificada utilizando RPM (leituras em junção por milhão de leituras). Para experimentos com replicação biológica, a normalização dos dados foi realizada por meio da função estimateSizeFactors do pacote DESeq (2012) no R, e os valores p e de mudança na expressão (fold change) foram calculados com a função nbinomTest. Para experimentos sem replicação, a expressão diferencial foi determinada utilizando o pacote edgeR (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html), com base na distribuição NB.
CircRNAs com valores de p < 0,05 foram considerados diferencialmente expressos de forma significativa. As análises de enriquecimento funcional em GO e KEGG foram conduzidas com base nos genes sobrepostos, a fim de identificar as funções biológicas e vias mais afetadas pelos circRNAs diferencialmente expressos. Além disso, foi realizado o agrupamento hierárquico não supervisionado, e os padrões de expressão de circRNAs entre as amostras foram visualizados por meio de um mapa de calor (heatmap).
Predição de interações entre circRNAs e miRNAs:
Como os circRNAs contêm múltiplos sítios de ligação para miRNAs, suas interações com miRNAs podem ser previstas utilizando ferramentas consolidadas de predição de genes-alvo de miRNAs. A função de um determinado circRNA pode, então, ser inferida com base na anotação funcional dos genes-alvo associados aos seus miRNAs correspondentes. Para espécies animais, as predições foram realizadas com o software miRanda.28,29 Para espécies vegetais, utilizou-se o software psRNATarget.30
Tamanho amostral
Como este estudo se encontra em fase exploratória, adotou-se um tamanho amostral de n = 3, após cuidadosa consideração de custo-benefício e potencial de descoberta.
Análise estatística
A expressão diferencial de um mesmo transcrito entre diferentes amostras foi calculada com base nos dados de RNA-seq. Para avaliar a variação na expressão, utilizou-se o valor de FoldChange como medida da alteração nos níveis de expressão de um transcrito entre dois grupos, enquanto o valor de p ou a false discovery rate (FDR — taxa de descoberta falsa, ou p-valor ajustado) foi utilizado para determinar a significância estatística. O valor de p de cada transcrito foi calculado e ajustado para múltiplas comparações. Transcritos foram considerados diferencialmente expressos de forma significativa quando o FoldChange foi superior a 2 e o valor de p foi inferior a 0,05.
Para comparações com replicações biológicas, os níveis diferenciais de expressão gênica foram calculados utilizando o teste de distribuição NB no pacote DESeq. A significância das diferenças nas contagens de leitura foi avaliada por meio do teste de distribuição NB. O valor de basemean foi utilizado para estimar os níveis de expressão gênica.31 Para comparações sem replicações biológicas, utilizou-se o pacote edgeR para análise e cálculo dos níveis de expressão gênica. A significância das diferenças nas contagens foi testada com base na distribuição NB, e os níveis de expressão gênica foram estimados por meio dos valores de CPM.
Para identificar variações entre diferentes amostras, a análise de expressão gênica diferencial é fundamental, uma vez que as principais diferenças se refletem no nível do transcrito. Portanto, a identificação de transcritos com expressão diferencial deve ser priorizada. Em seguida, devem ser realizadas análises abrangentes de enriquecimento funcional em KEGG e GO, a fim de investigar as vias biológicas e funções afetadas. A análise de enriquecimento em GO classifica os genes em três categorias: componente celular (CC), função molecular (MF) e processo biológico (BP), identificando funções biológicas significativamente associadas aos DEGs, por meio do teste exato de Fisher, considerando-se p < 0,05 como estatisticamente significativo. Da mesma forma, a análise de enriquecimento em KEGG utiliza dados genômicos para identificar vias enriquecidas e é realizada com o pacote clusterProfiler no RStudio (versão 4.3.1; R Foundation for Statistical Computing, Viena, Áustria), com um limiar de FDR < 0,05.
Resultados
A Figura Central apresenta os dados mais relevantes deste estudo. Dois grupos experimentais foram analisados, cada um composto por três indivíduos (uma mulher e dois homens). A média de idade foi de 56 anos para o grupo caso e 54 anos para o grupo controle. Nenhuma comorbidade relevante foi identificada em ambos os grupos. O nível de expressão diferencial de cada transcrito foi avaliado utilizando o software DESeq, e a significância das diferenças nas contagens de leitura foi determinada por meio do teste de distribuição NB. Os níveis de expressão gênica foram estimados com base no valor de basemean.
Análise dos transcritos com expressão diferencial de lncRNAs
Dentre os 854 lncRNAs que apresentaram níveis de expressão alterados, 425 estavam regulados negativamente e 429, regulados positivamente. A Figura 1 e a Figura 2 apresentam, respectivamente, o gráfico de média móvel e o volcano plot, que visualizam os padrões de expressão diferencial dos transcritos de lncRNAs.
– Gráfico de média móvel dos transcritos com lncRNAs diferencialmente expressos.
– Gráfico de vulcão dos transcritos com lncRNAs diferencialmente expressos. O gráfico exibe o log2 (razão de mudança) no eixo x e o –log10(p) no eixo y. Os pontos vermelhos indicam transcritos com expressão diferencial significativa, enquanto os pontos azuis e cinzas representam diferenças não significativas.
Mapa de calor da expressão diferencial de lncRNAs
O mapa de calor, gerado com o pacote pheatmap no R, demonstrou alta similaridade entre as amostras de um mesmo grupo, ao passo que foi observada expressão diferencial significativa entre os grupos. Os resultados são apresentados na Figura 3.
– Mapa de calor da expressão diferencial dos lncRNAs. (C: grupo controle; M: grupo com fluxo lento coronário).
Análise de enriquecimento funcional dos genes-alvo
Foi realizada uma análise de correlação entre lncRNAs e mRNAs com o objetivo de identificar transcritos de mRNAs associados aos lncRNAs. As correlações foram consideradas significativas quando o valor absoluto do coeficiente de correlação excedeu 0,8 e o valor de p foi inferior a 0,05. A anotação funcional, incluindo as análises de enriquecimento em GO e KEGG, foi conduzida com os mRNAs associados a cada lncRNA diferencialmente expresso. Os cálculos e os gráficos foram gerados para cada entrada gênica nos níveis 2 das categorias GO e KEGG, com base no status de regulação positiva ou negativa. Ver Figura 4 e Figura 5, nas quais R se refere ao ambiente gráfico utilizado.
– Gráfico de barras de enriquecimento GO (48 principais termos). Os nomes dos termos GO estão representados no eixo x; o número de genes associados é indicado no eixo y à direita.
– Gráfico de enriquecimento KEGG. Os nomes das vias KEGG são exibidos no eixo y, e a porcentagem de genes associados é mostrada no eixo x.
A análise de enriquecimento funcional foi empregada para predizer os genes-alvo, identificando 48 entradas relevantes em GO. Os achados incluíram processos metabólicos e processos metabólicos celulares na categoria de BP; organelas intracelulares e citoplasma na categoria de CC; e atividade antioxidante, atividade reguladora de enzimas e atividade catalítica na categoria de MF. Para aprofundar a investigação sobre as possíveis funções desses lncRNAs, a análise de vias do KEGG revelou que sua expressão diferencial estava significativamente enriquecida em vias relacionadas a doenças cardiovasculares, distúrbios endócrinos, doenças metabólicas e doenças neurodegenerativas. Os 20 lncRNAs diferencialmente expressos mais relevantes estão apresentados na Tabela 1.
– Top 20 lncRNAs diferencialmente expressos em pacientes com FLC
lncRNA
Regulação
Fold change
Valor de p
lnc-SLC46A2
Aumentado
307,6339927
8,16 × 10-13
lnc-DCAF4L1
Aumentado
301,9088015
2,37× 10-23
lnc-RAB23
Aumentado
293,4177516
1,72 × 10-8
lnc-LIPI
Aumentado
270,2219717
0,03287567
lnc-IGF2BP3
Aumentado
199,1040392
2,15 × 10-7
lnc-IFNGAS1
Aumentado
139,3191716
0,013423961
lnc-METTL2B
Aumentado
98,3100766
0,018769756
lnc-POLR3K
Aumentado
95,02233003
0,001041257
lnc-SOWAHB
Aumentado
84,70402792
0,000120964
lnc-PRKAB2
Aumentado
81,24009487
0,023770486
GAS5
Aumentado
81,15583069
0,000277837
LINC01949
Reduzido
0,019016197
5,39 × 10-6
lnc-CTSV
Reduzido
0,01855816
0,003755983
lnc-KCNE1B
Reduzido
0,016836927
0,013494903
lnc-WDR73
Reduzido
0,016808486
0,012120027
LINC00535
Reduzido
0,016156596
0,002651937
LINC00205
Reduzido
0,012744693
0,000840344
TUG1
Reduzido
0,012376483
0,014487006
lnc-SNRPN
Reduzido
0,009096652
0,003332174
lnc-PIGBOS1
Reduzido
0,008201513
0,001535038
lnc-SPI1
Reduzido
0,004864076
1,29 × 10-6
Resultados dos transcritos com expressão diferencial de mRNAs
Um total de 1.999 mRNAs apresentou expressão diferencial, dos quais 990 estavam regulados negativamente e 1.009 regulados positivamente. A Figura 6 e a Figura 7 exibem, respectivamente, o gráfico de média móvel e o volcano plot, os quais ilustram os perfis de expressão diferencial dos transcritos de mRNAs.
– Gráfico de média móvel dos transcritos com mRNAs diferencialmente expressos.
– Gráfico de vulcão dos transcritos com mRNAs diferencialmente expressos. O gráfico exibe o log2 da alteração de expressão (fold change) no eixo x e o –log10(p) no eixo y. Os pontos vermelhos e verdes indicam diferenças significativas; os pontos azuis e cinza representam diferenças não significativas.
Análise funcional dos transcritos com expressão diferencialAnálise de enriquecimento em GO dos transcritos diferencialmente expressos:
A triagem das entradas de GO para transcritos com FoldChange superior a 2 resultou na identificação de 1.985 entradas significativamente enriquecidas entre os mRNAs diferencialmente expressos. A análise de agrupamento das 10 principais entradas, classificadas em ordem decrescente de –log10(p), envolveu predominantemente processos biológicos como defesa contra invasão viral, inibição da expressão do genoma viral, via de sinalização do interferon tipo I, disrupção da polarização mitocondrial e aumento da função de proteases.
Os mRNAs diferencialmente expressos também apresentaram enriquecimento significativo em 271 componentes celulares. As 10 principais entradas, com base na ordem decrescente de –log10(p), incluíram componentes como citoplasma, nucleoplasma, complexo quinase Atg1/ULK1, núcleo e locais de montagem de fagos, conforme identificado na análise de agrupamento.
Além disso, foram identificadas 531 funções moleculares com enriquecimento significativo. As 10 principais, classificadas por ordem decrescente de –log10(p), revelaram funções como ligação a proteínas, modulação da atividade de proteína quinase, atividade de transferase de ubiquitina-proteína e ligação a ácido ribonucleico.
A Figura 8 apresenta o gráfico de barras com os 30 principais resultados de enriquecimento em GO. As entradas de GO com FoldChange transcricional superior a 2 foram filtradas separadamente para as três categorias, priorizando-se as 10 principais de cada uma com base nos respectivos valores de –log10(p) em ordem decrescente.
– Gráfico de barras do enriquecimento GO (30 principais termos). As barras vermelhas representam os 10 principais termos de processo biológico, as barras verdes os 10 principais termos de componente celular, e as barras azuis os 10 principais termos de função molecular. Os nomes dos termos GO estão no eixo x; o eixo y mostra os valores de –log10(p).
Análise de enriquecimento em KEGG e mapeamento das vias dos DEGs:
Após a triagem de 20 vias com FoldChange transcricional superior a 2, observou-se que os mRNAs diferencialmente expressos estavam significativamente enriquecidos em vias relacionadas à autofagia, sarampo, sistema ubiquitina–proteassoma, sinalização por receptores do tipo NOD, sinalização do fator de necrose tumoral (TNF), sinalização por receptores do tipo Toll (TLR) e via de sinalização NF-κB. A Figura 9 apresenta um bubble plot com os 20 principais resultados de enriquecimento em KEGG, com as vias classificadas em ordem decrescente de acordo com os respectivos valores de –log10(p).
– Gráfico de bolhas do enriquecimento KEGG (20 principais termos). Os nomes das vias KEGG estão representados no eixo y; os valores de p são mostrados no eixo x. O tamanho das bolhas reflete o número de genes associados.
Top 20 mRNAs diferencialmente expressos:
A Tabela 2 apresenta os 20 mRNAs com maior expressão diferencial.
– Top 20 mRNAs diferencialmente expressos em pacientes com FLC
Gene
Regulação
Fold change
Valor de p
SIRPB1
Aumentado
1424,292887
8,76 × 10-5
OTOF
Aumentado
749,2769265
0,033541446
CDC27
Aumentado
372,4377459
0,000308112
FCGR1B
Aumentado
293,4635502
0,002402462
HLA-DRB4
Aumentado
288,483249
0,000897273
MEF2C
Aumentado
279,7159676
7,28 × 10-9
ATG13
Aumentado
241,9462662
0,001107754
EPB41
Aumentado
173,0302956
0,004740905
ZNF45
Aumentado
140,5873565
0,000840983
SLC39A9
Aumentado
136,1707782
5,10 × 10-5
PBRM1
Reduzido
0,007401108
6,99 × 10-5
P2RX5
Reduzido
0,006490159
0,001694951
EPB41
Reduzido
0,006205606
0,033667873
SRRM1
Reduzido
0,006097372
1,07 × 10-11
ZNF445
Reduzido
0,006009509
0,005438717
CCR3
Reduzido
0,005964356
0,004797579
ALG13
Reduzido
0,004730269
6,94 × 10-7
ABCA7
Reduzido
0,004689293
0,019145994
KHSRP
Reduzido
0,004116791
0,00809256
MAP4K4
Reduzido
0,00314662
4,34 × 10-6
Discussão
O sequenciamento transcriptômico de alto rendimento realizado neste estudo revelou um total de 854 lncRNAs diferencialmente expressos, dos quais 425 estavam regulados negativamente e 429 regulados positivamente. A análise de enriquecimento funcional identificou 48 entradas principais em GO. As predições de coexpressão e colocalização destacaram processos metabólicos e metabolismo celular na categoria de BP, bem como atividade antioxidante, regulação da atividade enzimática e atividade catalítica na categoria de MF. Na categoria de CC, componentes como junções celulares, organelas da matriz extracelular e organelas intracelulares foram associados ao citoplasma. A análise de vias do KEGG demonstrou que os lncRNAs diferencialmente expressos estavam significativamente enriquecidos em vias relacionadas a doenças cardiovasculares, distúrbios endócrinos, doenças metabólicas e doenças neurodegenerativas.
Os lncRNAs são reconhecidos por sua participação em processos fisiológicos e patológicos, exercendo funções regulatórias e estruturais em diversas atividades biológicas, como imprinting genético, controle epigenético, proliferação celular, processos de desenvolvimento, envelhecimento e apoptose, emergindo, assim, como moduladores-chave em diversas condições cardiovasculares.12,32 Além disso, os lncRNAs têm sido implicados na regulação do FLC e de suas complicações associadas.12,32,33
Em estudos relacionados ao DCAF4L1, gene codificador adjacente que é um componente chave do complexo de ubiquitina ligase CUL4-DDB1, foi demonstrado que esse gene influencia a progressão tumoral por meio da modulação de pontos de controle do ciclo celular e de vias de sinalização apoptótica. Um lncRNA possivelmente transcrito nesse lócus, referido como lnc-DCAF4L1 (ainda não oficialmente anotado), é hipoteticamente capaz de regular a inflamação imune. No entanto, seu mecanismo preciso requer validação experimental, por exemplo, por meio de técnicas como o chromatin conformation capture (4C-seq).34
É importante destacar que o lncRNA clássico GAS5 (growth arrest-specific 5) desempenha papéis distintos em diferentes redes patológicas. Ele regula fatores imunes, como a IL-10, por meio do mecanismo de RNA endógeno competidor (ceRNA) em doenças autoimunes, modula a via de sinalização da insulina em distúrbios metabólicos e contribui para processos neuroinflamatórios ao influenciar a ativação de micróglias em condições neurodegenerativas. Essa multifuncionalidade posiciona o GAS5 como um importante núcleo molecular para pesquisas interligadas entre diferentes doenças. Embora variações na expressão de genes codificadores de proteínas sejam reconhecidas, investigações adicionais são necessárias para elucidar suas implicações funcionais.35,36
Estudos demonstraram que lncRNAs como MALAT1 e NEAT1 desempenham um papel na promoção de respostas inflamatórias no FLC por meio de diferentes vias moleculares.4,12,18 O MALAT1 foi identificado como um biomarcador para a predição do fenômeno de não reperfusão durante a intervenção coronariana percutânea (pPCI) e como um potencial alvo terapêutico para o FLC.37,38 Adicionalmente, a correlação entre os níveis do lncRNA AF131217.1 e o FLC tem sido investigada, sugerindo um papel regulador desse lncRNA na inflamação induzida pelo FLC por meio da modulação do fator semelhante ao Krüppel 4 (KLF4).38 No entanto, no presente estudo, MALAT1 e NEAT1 não foram identificados como tendo funções regulatórias em pacientes com FLC.
Outros lncRNAs diferencialmente expressos identificados neste estudo — incluindo lnc-SLC46A2, lnc-RAB23 e lnc-LIPI (Tabela 1), com exceção de lnc-DCAF4L1 e GAS5 — ainda não foram previamente descritos na literatura. A relação entre esses lncRNAs e o FLC permanece indefinida e requer investigações adicionais para ser validada. Mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos específicos pelos quais os lncRNAs contribuem para o FLC e para explorar seu potencial como alvos terapêuticos.
Dentre os 1.999 mRNAs diferencialmente expressos, 990 estavam regulados negativamente e 1.009 regulados positivamente. De acordo com a análise de agrupamento em GO das 10 principais entradas, classificadas por –log10(p), os principais processos biológicos incluíram resposta à infecção viral, regulação negativa da expressão do genoma viral, via de sinalização do interferon tipo I, despolarização mitocondrial e ativação da atividade de proteases. Os principais componentes celulares envolvidos foram o citoplasma, nucleoplasma, complexo quinase Atg1/ULK1, núcleo e local de montagem de fagos. As funções moleculares estavam predominantemente relacionadas à ligação a proteínas, regulação da atividade de proteína quinase, atividade de transferase de ubiquitina-proteína e ligação a RNA. A análise de KEGG mostrou que os mRNAs diferencialmente expressos estavam significativamente enriquecidos nas vias de sinalização dos TLR e na via de sinalização NF-κB.
O estudo conduzido por Coto et al.37 identificou que a variação em NFKBIZ é um fator de risco independente para DAC de início precoce. A pesquisa incluiu 609 homens com DAC de início precoce e 423 homens saudáveis no grupo controle. Nenhuma diferença significativa entre os grupos foi observada nas frequências alélicas ou genotípicas de NFKB1 rs28362491 (−94 delATTG) ou NFKBIA rs8904; no entanto, a frequência da deleção NFKBIZ rs3217713 foi significativamente maior no grupo com DAC em comparação ao grupo controle.37 Em nosso estudo, a análise KEGG indicou que a via de sinalização NF-κB desempenha um papel na variação da expressão de mRNAs, sugerindo que a inflamação pode ser um dos mecanismos patológicos subjacentes ao FLC. No entanto, as pesquisas sobre a relação entre NFKBIZ e FLC ainda estão em estágio inicial. Os mRNAs regulados positivamente e negativamente identificados neste estudo (Tabela 2) ainda não foram previamente associados ao FLC na literatura existente. São necessários mais estudos para elucidar os mecanismos específicos que vinculam esses mRNAs ao FLC.
Diferentemente de pesquisas anteriores, que frequentemente se concentraram em lncRNAs ou miRNAs isoladamente, este estudo oferece uma perspectiva mais abrangente ao integrar os perfis de expressão de lncRNAs e mRNAs, bem como suas interações no contexto do FLC. Embora estudos anteriores já tenham sugerido a participação de lncRNAs como MALAT1 em respostas inflamatórias e na disfunção endotelial, nossos achados destacam especificamente a desregulação de lncRNAs como ANRIL, MALAT1 e LINC00305 em pacientes com FLC, oferecendo novas perspectivas sobre potenciais alvos terapêuticos e biomarcadores.
Limitações do estudo
A principal limitação deste estudo é o pequeno tamanho amostral, com apenas três indivíduos em cada grupo. Esse número limitado pode não capturar adequadamente a variabilidade biológica, reduzindo o poder estatístico e, consequentemente, comprometendo a generalização dos achados. Além disso, o estudo não incluiu outros tipos de RNAs não codificantes, como os microRNAs, que também podem ser relevantes. Essas limitações indicam que estudos futuros com coortes maiores e mais diversas são essenciais para validar os resultados obtidos e para elucidar de forma mais completa os mecanismos subjacentes ao FLC.
Conclusão
Em conclusão, este estudo confirma que os lncRNAs — definidos como transcritos com mais de 200 pares de bases — desempenham papéis cruciais no FLC, com mecanismos potenciais envolvendo, principalmente, a modulação de vias inflamatórias e a regulação da função endotelial. No entanto, os lncRNAs e mRNAs regulados positiva e negativamente identificados neste estudo ainda não foram previamente associados ao FLC na literatura. São necessárias pesquisas adicionais para esclarecer os mecanismos específicos que sustentam a relação entre esses transcritos e o FLC.
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Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital of Traditional Chinese Medicine affiliated to Xinjiang Medical University sob o número de protocolo IACUE-20210301-18. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.
Os autores não utilizaram ferramentas de inteligência artificial no desenvolvimento deste trabalho.
Todo o conjunto de dados que dá suporte aos resultados deste estudo está disponível mediante solicitação ao autor correspondente.
O presente estudo foi financiado por “Tianshan Talents” Medical and Health High – Level Personal Training Program, number: TSYc202301B053.
10.36660/abc.20240847iOriginal ArticleTranscriptome High-Throughput Sequencing Analysis of lncRNA and mRNA Expression in Patients with Coronary Slow Flow0009-0000-3242-9619JiangHaibingConception and design of the research and Statistical analysis1YangYiWriting of the manuscriptCritical revision of the manuscript for content1ZhaiXueqinAnalysis and interpretation of the dataWriting of the manuscript1ZhangLijingAcquisition of data1KahaerjiangAerziyaAcquisition of dataWriting of the manuscript2ChinaHospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi – ChinaChinaXin Jiang Medical University, Urumqi, Xinjiang – China Haibing Jiang • Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Xinjiang Medical University, 116, Huanghe Road, Urumqi, 830041 – China E-mail: jianghaibing1017@163.com
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
Marina Okoshi
AbstractBackground
Long non-coding RNAs (lncRNAs) and microRNAs (miRNAs) are believed to play key roles in the pathophysiology of coronary slow flow (CSF).
Objectives
This study aimed to explore the complex biological networks involved in CSF using whole-transcriptome sequencing, with the goal of identifying potential diagnostic biomarkers and therapeutic targets.
Methods
Whole-transcriptome sequencing was performed on samples from three patients with CSF and three matched control subjects. A p-value < 0.05 was considered statistically significant.
Results
A total of 854 lncRNAs were differentially expressed, with 425 downregulated and 429 upregulated. KEGG pathway analysis showed significant enrichment of lncRNAs in pathways associated with cardiovascular diseases, endocrine and metabolic disorders, and neurodegenerative disease progression. Additionally, 1,999 mRNAs were differentially expressed, including 990 downregulated and 1,009 upregulated. Molecular function analysis identified roles in protein binding, regulation of kinase activity, ubiquitin-protein transferase activity, and RNA binding. KEGG analysis indicated that the differentially expressed mRNAs were primarily involved in autophagy, measles, ubiquitin-mediated proteolysis, the NOD-like receptor signaling pathway, the tumor necrosis factor (TNF) signaling pathway, the toll-like receptor (TLR) signaling pathway, and the NF-κB signaling pathway.
Conclusions
Differentially expressed mRNAs were significantly enriched in KEGG pathways related to autophagy, measles, and ubiquitin-mediated degradation, as well as in signaling cascades involving NOD-like receptors, TNF, TLR, and NF-κB. Further studies are required to validate these findings.
Transcriptome High-Throughput Sequencing Analysis of lncRNA and mRNA Expression in Patients with Coronary Slow Flow
Coronary slow flow (CSF) is thought to be closely associated with the onset of various manifestations of the CSF phenomenon.1-5 This condition has been linked to several contributing factors, including psychiatric disorders, serum salusin-β levels, homocysteine, cystatin C, body mass index, and systemic immune-inflammation.2,3,6,7 The inflammatory response may play a central role in multiple pathophysiological processes, such as microvascular obstruction and microthrombus formation, which are considered key elements in the pathogenesis of coronary microcirculatory dysfunction.8-11
Recent studies have shown that certain long non-coding RNAs (lncRNAs) can regulate downstream inflammatory factors, thereby influencing the development of CSF.9,12 Danaii et al. proposed that microRNAs (miRNAs) may serve as potential biomarkers for diagnosing CSF and monitoring the progression of coronary artery disease (CAD) in affected patients.13 Based on these findings, lncRNAs and miRNAs appear to play significant roles in the pathophysiology of CSF. However, given the complexity of the condition and the diverse functions of non-coding RNAs in the cardiovascular system, focusing on only a few molecules may not provide a comprehensive understanding of the underlying mechanisms.
Whole-transcriptome analysis offers a broader perspective by enabling the identification of key lncRNAs and miRNAs involved in CSF and their potential interactions. This approach may contribute to a deeper understanding of the molecular basis of CSF and support future clinical applications.
RNA sequencing (RNA-seq) has been widely used to investigate gene expression profiles in cardiac tissues and cells, providing insights into molecular changes associated with conditions such as CSF and Takotsubo syndrome, a form of coronary microvascular disease.14,15 A transcriptomic study of CSF using RNA extracted from peripheral blood monocytes revealed differential gene expression patterns and an association with inflammation.16 However, the pathogenesis of CSF remains complex and poorly understood, and only a few studies to date have applied transcriptome sequencing specifically to CSF.
Therefore, the present study aimed to investigate the transcriptomic landscape of patients with CSF through high-throughput sequencing of peripheral blood leukocytes in order to identify genes and pathways potentially involved in the development of CSF.
MethodsSubjects
This study, supported by grant number 2016XE0113, was conducted in accordance with the ethical principles outlined in the Declaration of Helsinki. All participants were fully informed about the study objectives and provided written informed consent. The study protocol was approved by the Research Ethics Committee, ensuring the protection of participants’ rights and welfare.
Three patients diagnosed with CSF based on coronary angiography, along with three individuals with normal coronary angiography findings, were enrolled at the Traditional Chinese Medical Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region. These individuals were assigned to the case group and control group, respectively. All participants were initially suspected of having uncomplicated coronary heart disease and had no history of diabetes, cardiomyopathy, vasculitis, connective tissue disorders, or endocrine diseases.
Diagnostic criteria
CSF was defined as a delayed perfusion of any major distal coronary vessel exceeding three cardiac cycles, as observed during coronary angiography.
Exclusion criteria
Participants were selected according to strict inclusion and exclusion criteria to ensure the reliability and validity of the study findings. Patients were excluded if they presented with hypotension (systolic blood pressure ≤ 90 mmHg at the time of angiography) in the absence of vasodilator medication use, or if they had a heart rate < 60 beats per minute without the influence of heart rate–modifying drugs. Individuals who had experienced an acute myocardial infarction or acute coronary syndrome — including unstable angina pectoris — within the previous month were also excluded. In addition, patients with any coronary artery stenosis > 50% were not eligible for inclusion. Clinical data, laboratory indices, and blood samples were collected and analyzed from all participants.
Experimental methodsDatabase construction and sequencing process
Total RNA was extracted from blood samples following centrifugation, lysis, and precipitation. The integrity of the isolated RNA was evaluated using standard analytical procedures, followed by a quality assessment. Ribosomal RNAs (rRNAs) were subsequently removed to enrich for mRNAs and non-coding RNAs. The remaining RNA was fragmented and reverse-transcribed into complementary DNA (cDNA). Next, blunt-ended cDNAs underwent adaptor ligation and tailing. The resulting cDNA library was size-selected using agarose gel electrophoresis, and the band corresponding to the target size was excised. The selected cDNA fragments were then amplified by polymerase chain reaction (PCR) and subjected to high-throughput sequencing using an automated sequencing platform.
Sample collection and processing of whole blood specimens
The initial step involved accurate documentation and identification of 4 mL whole blood samples collected from diagnosed patients, with each sample labeled according to the patient registry. Following centrifugation, plasma and cellular components were separated. The plasma, located in the upper layer after centrifugation, was transferred into 1.5 mL Eppendorf tubes, with each tube receiving 400 μL of plasma. The tubes were then sealed and stored in an ultra-low temperature freezer at –80°C for preservation.
Centrifugation was performed at 3,000 rpm for 10 minutes to ensure effective separation of plasma. The resulting cellular pellet was resuspended in ammonium-chloride-potassium (ACK) Lysis Buffer (Bioseth, Zhenjiang, China) and transferred into fresh 1.5 mL Eppendorf tubes. Each patient’s pellet was evenly divided into two groups for further analysis, ensuring sample integrity for subsequent procedures.
The Eppendorf tubes containing the resuspended cells were incubated at room temperature for 5 minutes to promote lysis. Centrifugation was then carried out to separate the components. To improve lysis efficiency, treatment with ACK Lysis Buffer was repeated two to three times, ensuring thorough cell disruption. After the final lysis step, the samples were rinsed with physiological saline to remove residual buffer.
For RNA extraction, leukocytes in one set of 1.5 mL Eppendorf tubes were processed using a TRIzol-based resuspension–precipitation protocol with TRIzol reagent (Invitrogen, USA). Another set of leukocyte-containing tubes was left untreated and stored at –80°C for future use.
RNA sample testing
The integrity and purity of the RNA samples were evaluated through a multi-step quality control (QC) process. Initially, agarose gel electrophoresis was used to detect degradation and contamination. This method separates nucleic acid fragments by size, allowing for the visual assessment of RNA integrity. Next, spectrophotometric analysis was performed to determine RNA purity, with the A260/A280 ratio used as a standard indicator. High-precision quantification of RNA concentration was then conducted using the Qubit® 3.0 Fluorometer, ensuring accurate measurement of RNA yield. Finally, the Agilent 2100 Bioanalyzer with the RNA Nano 6000 Assay Kit was employed to assess RNA integrity. This analysis generated an RNA integrity number (RIN), which provides a quantitative measure of RNA quality.
Construction and testing of the library
For the lncRNA library construction, a 3-microgram sample of total RNA was chosen as the starting material. The ribosomal RNAs were subsequently removed from the samples with precision, facilitated by the Ribo-Zero™ Gold Kit (Human/Mouse/Rat, Illumina, USA). Different index labels were selected respectively for library construction based on the operating instructions of the NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, Ipswich, USA). In simpler terms, the whole process of the library construction consisted of four parts. Firstly, starting with the essential step of rRNA removal, one should then proceed to select the pertinent reagent kits. After securing the mRNA, the application of a fragmentation buffer yields the desired mRNA fragments. Secondly, fragments were used as templates, then the first-strand cDNA was synthesized. The second-strand cDNA synthesis was completed by adding RNase H and dNTPs (dUTP). Thirdly, the rRNAs were initially eliminated, after which a purification kit was employed to carry out the purification. This was followed by a cascade of detailed operations, including the integration of Basic Group A and the subsequent end repair. Finally, the target fragment in the agarose gel electrophoresis was recovered, and PCR amplification (Qiagen, Germany) was performed to complete the construction of the library.
Upon the culmination of library construction, quantitative dilution utilizing the Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, USA) was conducted, resulting in a library concentration adjusted to 1 ng/μL. With the library construction phase concluded, the Agilent 2100 (Agilent, USA) was engaged to measure the insert size. Quantitative PCR (qPCR) was performed using the Bio-RAD CFX96 (Bio-Rad, USA) fluorescent quantitative PCR instrument and the Bio-RAD iQ SYBR GRN Kit (Bio-Rad, USA). The effective concentration of the library was accurately quantified (effective concentration > 10 nM) to ensure the quality of the library. After qualified library detection, different libraries were pooled to the flow cell according to the requirements of effective concentration and target data volume. cBot clusters were sequenced using the Illumina high-throughput sequencing platform (NovaSeq 6000, Illumina, USA), and 150 bp paired-end reads were obtained. Subsequently, a chain of operations was implemented, such as the application of Basic Group A and the finalization of end repair. The library was then positioned for qPCR, provided the insert size aligned with expectations, with the library’s effective concentration required to surpass 10 nM to ensure its quality.
Machine sequencing
Once the library construction reached its final stage, the qualified libraries were adeptly pooled onto the flow cell, conforming to the designated effective concentration and the set sequencing goals. Thereafter, the samples underwent comprehensive transcriptome high-throughput sequencing analysis once the clusters were successfully established.
Transcriptome high-throughput sequencing analysisData preprocessing and QC:
The raw reads generated from high-throughput sequencing were provided in FASTQ format. To obtain high-quality reads suitable for downstream analysis, quality filtering was performed. First, the fastp software17 was used for QC and adapter removal. Low-quality bases were filtered out, resulting in a set of high-quality clean reads. The clean reads were then compared against rRNA sequences using SortMeRNA software,18 and any matched reads were removed. The remaining reads were retained for subsequent analyses.
Genome alignment and transcript splicing:
Hisat219 (http://www.psc.edu/user-resources/software/hisat2) was used to align the clean reads to the reference genome, with default parameters applied. Transcript assembly was performed using StringTie software, generating new transcript isoforms. These were compared against the reference genome annotation using Cuffcompare to identify known and novel transcripts.
Prediction of lncRNAs:
Most lncRNAs lack protein-coding potential. Transcripts with two or more exons and a length greater than 200 bp were selected. Candidate lncRNAs were identified through coding potential prediction using CPC, CNCI, Pfam, and PLEK.
Transcriptional quantification, differential expression analysis, functional enrichment, and cluster analysis:
Clean reads with rRNA removed were aligned to reference transcripts (mRNA and lncRNA) using Bowtie2,20 and the results were stored in binary alignment (BAM) files. eXpress was used to quantify transcript abundance, providing both read counts and fragments per kilobase of transcript per million (FPKM) values.
For experiments with biological replicates, data normalization was performed using the estimateSizeFactors function in the DESeq (2012) R package.21 Differential expression was assessed using the nbinomTest function to calculate p-values and fold changes. For experiments without biological replicates, differential expression analysis was conducted based on the edgeR package (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html),22 using the negative binomial distribution test. Read counts were evaluated for statistical significance using a negative binomial (NB) test, and counts per million (CPM) values were used to estimate gene expression levels.
Differential genes with a p-value less than 0.05 were selected, and a hypergeometric distribution test was performed in R to conduct gene ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses. These analyses were used to identify the biological functions and pathways most affected by the differentially expressed genes (DEGs). Additionally, the pheatmap function in R was employed to perform unsupervised hierarchical clustering of the DEGs, and a heatmap was generated to visualize their expression patterns across different samples.
Alternative splicing, single nucleotide polymorphism (SNP), and INDEL analysis:
Alternative splicing analysis was conducted using ASprofile software.23 Samtools24 and BCFtools25 were used to identify SNP and INDEL sites. For details on the specific procedure, please refer to the Samtools website (http://samtools.sourceforge.net/mpileup.shtml). All software was run using default parameters.
circRNA identification, quantification, and differential analysis:
Based on the circBase database,26 sequencing data were first analyzed using CIRI software27 to predict circRNAs. The predicted results were then compared with the database to identify both known and novel circRNAs. Overlapping genes were extracted and annotated based on the chromosomal positions of circRNAs.
CircRNA abundance was quantified using RPM (spliced reads per million reads). For experiments with biological replication, data normalization was performed using the estimateSizeFactors function in the DESeq (2012) R package, and p-values and fold change values were calculated using the nbinomTest function. For experiments without replication, differential expression was determined using the edgeR package (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html), based on the negative binomial distribution.
CircRNAs with p-values < 0.05 were considered significantly differentially expressed. GO and KEGG enrichment analyses were conducted based on overlapping genes to identify the biological functions and pathways most affected by the differentially expressed circRNAs. In addition, unsupervised hierarchical clustering was performed, and circRNA expression patterns across samples were visualized using a heat map.
Prediction of circRNA–miRNA target interactions:
Since circRNAs contain multiple miRNA binding sites, their interactions with miRNAs can be predicted using established miRNA target gene prediction tools. The function of a given circRNA can then be inferred based on the functional annotation of its associated miRNA target genes. For animal species, predictions were performed using miRanda software.28,29 For plant species, predictions were carried out using psRNATarget software.30
Sample size
As this study was in the exploratory phase, a sample size of n = 3 was adopted after careful consideration of cost-effectiveness and discovery potential.
Statistical analysis
Differential expression of the same transcript among different samples was calculated using RNA-seq data. To assess expression variation, FoldChange was used to measure the change in expression levels of a given transcript between two samples, while the p-value or false discovery rate (FDR) (adjusted p-value) was used to evaluate statistical significance. Each transcript’s p-value was calculated and adjusted for multiple testing. Transcripts were considered significantly differentially expressed if the FoldChange was greater than 2 and the p-value was less than 0.05.
For comparisons with biological replication, gene differential expression levels were calculated using the negative binomial distribution test in the DESeq software package. The significance of read count differences was assessed using the NB distribution test. The basemean value was used to estimate gene expression levels.31 For comparisons without biological replication, the edgeR software package was used to analyze and calculate gene expression levels. The significance of read differences was tested using the NB distribution, and gene expression levels were estimated using the CPM value.
To discern variations among different samples, gene differential expression analysis is pivotal, as differences are primarily reflected at the transcript level. Therefore, identifying transcripts with differential gene expression should be prioritized. Subsequently, comprehensive KEGG pathway enrichment and GO functional enrichment analyses should be performed to investigate the biological pathways and functions affected. GO enrichment analysis categorizes genes into cellular component (CC), molecular function (MF), and biological process (BP), identifying significant biological functions associated with DEGs using Fisher’s exact test, with p < 0.05 indicating statistical significance. Similarly, KEGG enrichment analysis uses genomic data to identify enriched pathways, and is performed using the clusterProfiler package in RStudio (version 4.3.1; R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria), with an FDR < 0.05 threshold.
Results
Central Illustration presents the most important data from this study. There were two experimental groups, each consisting of three individuals (one female and two males). The mean age was 56 years for the case group and 54 years for the control group. No notable comorbidities were identified in either group. The level of differential gene expression for each transcript was assessed using the DESeq software, and the significance of read count differences was evaluated using the NB test. Gene expression levels were estimated based on the basemean value.
Analysis of transcripts with differential expression of lncRNA
Among the 854 lncRNAs that displayed altered expression levels, 425 were downregulated, while 429 were upregulated. Figure 1 and Figure 2 present the moving average chart and the volcano plot, respectively, which visualize the differential expression patterns of the lncRNA transcripts.
– Moving average chart of transcripts with differentially expressed lncRNAs.
– Volcano plot of transcripts with differentially expressed lncRNAs. The plot displays log2(fold change) on the x-axis and –log10(p-value) on the y-axis. Red dots indicate significantly differentially expressed transcripts, while blue and grey dots represent non-significant differences.
Heat map of differential expression of lncRNA
The heat map, generated using the pheatmap package in R, demonstrated high similarity between samples within the same group, while significant inter-group differential expression was observed. Results are shown in Figure 3.
– Heat map of differentially expressed lncRNAs (C: control group; M: coronary slow flow group).
Functional enrichment analysis of target genes
A correlation analysis between lncRNAs and mRNAs was conducted to identify lncRNA-associated mRNA transcripts. Correlations were considered significant if the absolute value of the correlation coefficient exceeded 0.8 and the p-value was less than 0.05. Functional annotation, including GO and KEGG enrichment analyses, was performed on the mRNAs associated with each differentially expressed lncRNA. Calculations and plots were generated for each gene entry at the GO and KEGG level 2 categories, based on upregulation and downregulation status. See Figure 4 and Figure 5, where R refers to the plotting environment.
– GO enrichment bar plot (top 48 terms). GO term names are shown on the x-axis; the number of associated genes is indicated on the right y-axis.
– KEGG enrichment plot. KEGG pathway names are displayed on the y-axis, and the percentage of associated genes is shown on the x-axis.
Functional enrichment analysis was used to predict the target genes, identifying 48 key GO entries. The findings included metabolic processes and cellular metabolic processes in the BP category; intracellular organelles and cytoplasm within the CC category; and antioxidant activity, enzyme regulatory activity, and catalytic activity in the MF category. To further explore the potential functions of these lncRNAs, KEGG pathway analysis revealed that their differential expression was significantly enriched in pathways related to cardiovascular diseases, endocrine disorders, metabolic diseases, and neurodegenerative diseases. Top 20 differentially expressed lncRNAs are presented in Table 1.
– Top 20 differentially expressed lncRNAs in patients with CSF
lncRNA
Regulation
Fold change
p-value
lnc-SLC46A2
Up
307.6339927
8.16 × 10-13
lnc-DCAF4L1
Up
301.9088015
2.37× 10-23
lnc-RAB23
Up
293.4177516
1.72 × 10-8
lnc-LIPI
Up
270.2219717
0.03287567
lnc-IGF2BP3
Up
199.1040392
2.15 × 10-7
lnc-IFNGAS1
Up
139.3191716
0.013423961
lnc-METTL2B
Up
98.3100766
0.018769756
lnc-POLR3K
Up
95.02233003
0.001041257
lnc-SOWAHB
Up
84.70402792
0.000120964
lnc-PRKAB2
Up
81.24009487
0.023770486
GAS5
Up
81.15583069
0.000277837
LINC01949
Down
0.019016197
5.39 × 10-6
lnc-CTSV
Down
0.01855816
0.003755983
lnc-KCNE1B
Down
0.016836927
0.013494903
lnc-WDR73
Down
0.016808486
0.012120027
LINC00535
Down
0.016156596
0.002651937
LINC00205
Down
0.012744693
0.000840344
TUG1
Down
0.012376483
0.014487006
lnc-SNRPN
Down
0.009096652
0.003332174
lnc-PIGBOS1
Down
0.008201513
0.001535038
lnc-SPI1
Down
0.004864076
1.29 × 10-6
Results of transcripts with differential mRNA expression
A total of 1,999 mRNAs were found to be differentially expressed, including 990 that were downregulated and 1,009 that were upregulated. Figure 6 and Figure 7 display the moving average chart and the volcano plot, respectively, which illustrate the differential expression profiles of the mRNA transcripts.
– Moving average chart of transcripts with differentially expressed mRNAs.
– Volcano plot of transcripts with differentially expressed mRNAs. The plot displays log2(fold change) on the x-axis and –log10(p-value) on the y-axis. Red and green dots indicate significant differences; blue and gray dots represent non-significant differences.
Functional analysis on transcripts with differential expressionGO enrichment analysis of differentially expressed transcripts:
The screening of GO entries for transcripts with a FoldChange greater than 2 resulted in the identification of 1,985 entries significantly enriched among the differentially expressed mRNAs. Clustering analysis of the top 10 entries, ranked by decreasing –log10(p-values), primarily involved biological processes such as defense against viral invasion, inhibition of viral genome expression, type I interferon signaling pathway, disruption of mitochondrial polarization, and enhancement of protease function.
The differentially expressed mRNAs were also significantly enriched in 271 cellular components. The top 10 entries, based on decreasing –log10(p-values), included components such as the cytoplasm, nucleoplasm, Atg1/ULK1 kinase complex, nucleus, and phage assembly sites, as identified through clustering analysis.
Additionally, 531 molecular functions were found to be significantly enriched. The top 10 entries, ranked by decreasing –log10(p-values), revealed molecular functions such as protein binding, modulation of protein kinase activity, ubiquitin-protein transferase activity, and ribonucleic acid binding.
Refer to Figure 8 for the bar plot illustrating the top 30 GO enrichment results. GO entries with transcriptional FoldChange greater than 2 were filtered separately for the three categories, with the top 10 entries from each category prioritized based on their –log10(p-values) in descending order.
– GO enrichment bar plot (top 30 terms). Red bars represent the top 10 biological process terms, green bars the top 10 cellular component terms, and blue bars the top 10 molecular function terms. GO term names are on the x-axis; –log10(p-value) is on the y-axis.
KEGG enrichment analysis and pathway network plotting of DEGs:
Following the screening of 20 pathway entries with a transcriptional FoldChange greater than 2, differentially expressed mRNAs were found to be significantly enriched in pathways related to autophagy, measles, the ubiquitin–proteasome system, NOD-like receptor signaling, tumor necrosis factor (TNF) signaling, toll-like (TLR) signaling, and the NF-κB signaling pathway. Figure 9 presents a bubble plot of the top 20 KEGG enrichment results, with pathway entries ranked in descending order based on their corresponding –log10(p-values).
– KEGG enrichment bubble plot (top 20 terms). KEGG pathway names are shown on the y-axis; p-values are displayed on the x-axis. Bubble size reflects the number of associated genes.
Top 20 differentially expressed mRNAs:
Table 2 displays the top 20 mRNAs with differential expression.
– Top 20 differentially expressed mRNAs in patients with CSF
Gene
Regulation
Fold change
p-value
SIRPB1
Up
1424.292887
8.76 × 10-5
OTOF
Up
749.2769265
0.033541446
CDC27
Up
372.4377459
0.000308112
FCGR1B
Up
293.4635502
0.002402462
HLA-DRB4
Up
288.483249
0.000897273
MEF2C
Up
279.7159676
7.28 × 10-9
ATG13
Up
241.9462662
0.001107754
EPB41
Up
173.0302956
0.004740905
ZNF45
Up
140.5873565
0.000840983
SLC39A9
Up
136.1707782
5.10 × 10-5
PBRM1
Down
0.007401108
6.99 × 10-5
P2RX5
Down
0.006490159
0.001694951
EPB41
Down
0.006205606
0.033667873
SRRM1
Down
0.006097372
1.07 × 10-11
ZNF445
Down
0.006009509
0.005438717
CCR3
Down
0.005964356
0.004797579
ALG13
Down
0.004730269
6.94 × 10-7
ABCA7
Down
0.004689293
0.019145994
KHSRP
Down
0.004116791
0.00809256
MAP4K4
Down
0.00314662
4.34 × 10-6
Discussion
Transcriptome high-throughput sequencing in this study revealed that a total of 854 lncRNAs were differentially expressed, with 425 downregulated and 429 upregulated. Functional enrichment analysis identified 48 core GO entries. Co-expression and co-localization predictions highlighted metabolic processes and cellular metabolism under BP, and antioxidant activity, regulation of enzymatic activity, and catalytic activity under MF. Within the CC category, components such as cell junctions, extracellular matrix organelles, and intracellular organelles were correlated with the cytoplasm. KEGG analysis showed that differentially expressed lncRNAs were significantly enriched in pathways related to cardiovascular diseases, endocrine disorders, metabolic diseases, and neurodegenerative diseases.
LncRNAs are recognized for their involvement in both physiological and pathological processes, serving regulatory and structural functions in diverse biological activities, including genetic imprinting, epigenetic control, cellular proliferation, developmental processes, aging, and apoptosis, thus emerging as key modulators in numerous cardiovascular conditions.12,32 LncRNAs have been implicated in regulating CSF and its associated complications.12,32,33
In studies concerning DCAF4L1, the adjacent coding gene, which is a key component of the CUL4-DDB1 ubiquitin ligase complex, has been shown to influence tumor progression by modulating cell cycle checkpoints and apoptotic signaling pathways. A lncRNA potentially transcribed at this locus, referred to as lnc-DCAF4L1 (not yet officially annotated), is hypothesized to regulate immune inflammation. However, its precise mechanism requires experimental validation, such as through chromatin conformation capture (4C-seq).34
Notably, the classical lncRNA growth arrest-specific 5 (GAS5) plays distinct roles within disease networks. It regulates immune factors such as IL-10 via the competing endogenous RNA (ceRNA) mechanism in autoimmune diseases, modulates the insulin signaling pathway in metabolic disorders, and contributes to neuroinflammatory processes by influencing microglial activation in neurodegenerative conditions. This multifunctionality positions GAS5 as a central molecular hub for cross-disease research. While variations in the expression of protein-coding genes are acknowledged, further investigation is needed to elucidate their functional implications.35,36
Studies have shown that lncRNAs such as MALAT1 and NEAT1 play a role in promoting inflammatory responses in CSF through various molecular pathways.4,12,18 MALAT1 has been identified as a biomarker for predicting the no-reflow phenomenon during percutaneous coronary intervention (pPCI) and as a potential therapeutic target for CSF.37,38 Additionally, the correlation between lncRNA AF131217.1 levels and CSF has been investigated, suggesting a regulatory role for this lncRNA in CSF-induced inflammation through modulation of Krüppel-like factor 4 (KLF4).38 However, in the present study, MALAT1 and NEAT1 were not identified as having regulatory functions in patients with CSF.
Other differentially expressed lncRNAs identified in this study — including lnc-SLC46A2, lnc-RAB23, lnc-LIPI (Table 1), excluding lnc-DCAF4L1 and GAS5 — have not been previously reported in the literature. The relationship between these lncRNAs and CSF remains unclear and requires further investigation to be validated. Additional research is needed to clarify the specific mechanisms by which lncRNAs contribute to CSF and to explore their potential as therapeutic targets.
Among the 1,999 differentially expressed mRNAs, 990 were downregulated and 1,009 were upregulated. According to the GO clustering analysis of the top 10 entries, ranked by –log10(p-value), the main biological processes included response to viral infection, negative regulation of viral genome expression, type I interferon signaling pathway, mitochondrial depolarization, and activation of protease activity. The primary cellular components involved were the cytoplasm, nucleoplasm, Atg1/ULK1 kinase complex, nucleus, and phage assembly site. Molecular functions were predominantly related to protein binding, regulation of protein kinase activity, ubiquitin-protein transferase activity, and RNA binding. KEGG analysis showed that differentially expressed mRNAs were significantly enriched in the TLR signaling pathway and NF-κB signaling pathway.
The study by Coto et al.37 found that variation in NFKBIZ is an independent risk factor for early-onset CAD. Their research included 609 males with early-onset CAD and 423 healthy males in the control group. No significant inter-group differences were observed in the allele or genotype frequencies of NFKB1 rs28362491 (−94 delATTG) or NFKBIA rs8904; however, the frequency of the NFKBIZ rs3217713 deletion was significantly higher in the CAD group compared to controls.37 In our study, KEGG analysis indicated the NF-κB signaling pathway plays a role in the variation of mRNA expression, suggesting inflammation may be one of the underlying pathological mechanisms in CSF. However, research on the relationship between NFKBIZ and CSF is still in its early stages. The upregulated and downregulated mRNAs identified in this study (Table 2) have not been previously reported as being associated with CSF in the existing literature. Further research is needed to elucidate the specific mechanisms linking mRNAs to CSF.
Unlike previous research that often focused on individual lncRNAs or miRNAs, this study offers a more comprehensive perspective by integrating both lncRNA and mRNA expression profiles, as well as their interactions in the context of CSF. While earlier studies have suggested the involvement of lncRNAs such as MALAT1 in inflammatory responses and endothelial dysfunction, our findings specifically highlight the dysregulation of lncRNAs including ANRIL, MALAT1, and LINC00305 in patients with CSF, providing new insights into potential therapeutic targets and biomarkers.
Limitations of study
The main limitation of this study is the small sample size, with only three individuals in each group. This limited number may not adequately capture biological variability, thereby reducing statistical power and potentially compromising the generalizability of the findings. Additionally, the study did not include other types of non-coding RNAs, such as microRNAs, which may also be relevant. These limitations suggest that future studies with larger and more diverse cohorts are essential to validate these results and to fully elucidate the mechanisms underlying CSF.
Conclusion
In conclusion, this study confirms that lncRNAs — defined as transcripts longer than 200 base pairs — play crucial roles in CSF, with potential mechanisms primarily involving the modulation of inflammatory pathways and regulation of endothelial function. However, the upregulated and downregulated lncRNAs and mRNAs identified in this study have not been previously reported to be associated with CSF in literature. Further research is needed to clarify the specific mechanisms underlying the relationship between these transcripts and CSF.
This study is not associated with any thesis or dissertation work.
The authors did not use any artificial intelligence tools in the development of this work.
All datasets supporting the results of this study are available upon request from the corresponding author.
This study was partially funded by “Tianshan Talents” Medical and Health High – Level Personal Training Program, number: TSYc202301B053.