Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC tGHRNtGzh3zjrmjCNRJtJqN S0066-782X2025000800308 00308 10.36660/abc.20240685 abc.20240685 Artigo Original Tratamento Crônico com Panax ginseng e Angelica keiskei Reduz a Pressão Arterial e Melhora a Função Endotelial em Ratas Ovariectomizadas Silva Nayara Formenton da 1 Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito 0000-0002-3728-2131 Moraes Luis Henrique Oliveira de 1 Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Sabadini Camila Pereira 1 Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Alcântara Rita Cristina Cotta 1 Concepção e desenho da pesquisa Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Dias Patrícia Corrêa 1 Concepção e desenho da pesquisa Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 0000-0002-1896-9536 Rodrigues Gerson Jhonatan 1 Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados Obtenção de financiamento Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Universidade Federal de São Carlos São Carlos SP Brasil Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), São Carlos, SP – Brasil Gerson Jhonatan Rodrigues • Universidade Federal de São Carlos Centro de Ciências Biológicas e da Saúde - Departamento de Ciências Fisiológicas – Rod. Washington Luís km 235 – SP-310 – CEP 13565-905, São Carlos, SP – Brasil E-mail: gerson@ufscar.br

A pesquisadora Patrícia Corrêa Dias, pós-doutoranda regularmente inscrita no programa de Pós-doutorado da UFSCar, atuou como coautora neste estudo. Declaramos que a referida coautora recebeu apoio financeiro da empresa Florien Fitoterápicos para ministrar palestra e colaborar no desenvolvimento de produtos, em temas distintos do tema abordado no artigo científico a ser publicado. A empresa Florien Fitoterápicos comercializa o produto testado nesta pesquisa, composto por Panax ginseng e Angelica keiskei, sob o nome comercial Mitochondrin®. Esclarecemos que a participação da coautora restringiu-se ao auxílio no desenho experimental e no auxílio da redação deste artigo, não havendo qualquer influência na quantificação ou acesso aos dados coletados.

Marina Okoshi

 19 09 2025 2025 122 8 e20240685 22 10 2024 04 04 2025 07 05 2025 This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License Resumo Fundamento:

A menopausa é um processo fisiológico natural que pode afetar diversos sistemas e órgãos, frequentemente levando ao aumento da pressão arterial. A combinação de Panax ginseng e Angelica keiskei (Pg + Ak) é uma formulação conhecida por melhorar a função vascular.

 Objetivo:

Este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos in vivo dessas plantas combinadas sobre os parâmetros cardiovasculares em ratas em menopausa induzida por ovariectomia.

 Métodos:

Vinte e quatro ratas Wistar com 70 dias de vida foram distribuídas aleatoriamente em três grupos: falso-operadas (Sham), ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas tratadas com Pg + Ak (OVX + Pg + Ak). As ratas do grupo tratado com Pg + Ak receberam injeção intraperitoneal de 100 mg/kg/dia por duas semanas. A pressão arterial foi medida por pletismografia de cauda, e a função endotelial foi avaliada por meio de testes de reatividade vascular.

 Resultados:

Ao final do tratamento, a pressão arterial média no grupo Sham foi menor do que no grupo controle (OVX), e o tratamento com Pg + Ak melhorou a disfunção endotelial causada pela ovariectomia. Isso ficou evidente na restauração da vasodilatação dependente do endotélio nos anéis aórticos das ratas OVX tratadas com Pg + Ak, em comparação com as ratas OVX não tratadas.

 Conclusões:

Nossos achados sugerem que a combinação Pg + Ak reduz efetivamente a pressão arterial e reverte a disfunção endotelial em ratas ovariectomizadas.

Tratamento Crônico com Panax ginseng e Angelica keiskei Reduz a Pressão Arterial e Melhora a Função Endotelial em Ratas Ovariectomizadas Representação cronológica de três grupos experimentais, A: SHAM (SH), B: ovariectomizada (OVX) e C: ovariectomizada tratada com Panax ginseng + Angelica keiskei (OVX+Pg+Ak). PAS: pressão arterial sistólica; FE: função endothelial; [NO]: concentração sérica. A seta para cima (↑) indica aumento, a seta para baixo (↓) indica diminuição e as setas para cima e para baixo (↑↓) indicam nenhuma alteração.

Palavras-chave Ovariectomia Menopausa Hipertensão Fitoterapia Panax Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo 2022/01093-1 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – Brasil 140181/2020-2 O presente estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP: 2022/01093-1 projeto regular). Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – Brasil (bolsas CNPq: 140181/2020-2) – bolsa da aluna Introdução

A menopausa é um processo fisiológico natural caracterizado pela cessação permanente da menstruação por 12 meses, geralmente relacionado à deficiência de estrogênio associada à idade e não vinculada a patologias. A idade mediana da menopausa é em torno de 51 anos. Embora a maioria das mulheres apresente sintomas vasomotores, a menopausa também afeta diversos sistemas do corpo, incluindo os sistemas urogenital, psicogênico e cardiovascular.1-4 A redução dos níveis de estrogênio prejudica o eixo hipotálamo-hipófise-ovário, levando à falha no desenvolvimento endometrial, o que resulta em ciclos menstruais irregulares que, por fim, cessam completamente.5

O estrogênio desempenha um papel crucial na manutenção da função endotelial ao aumentar a síntese de óxido nítrico (NO) no endotélio vascular. O NO difunde-se nas células musculares lisas vasculares, promovendo o relaxamento – um processo conhecido como vasodilatação dependente do endotélio (VDE). O estrogênio também contribui para a manutenção da função endotelial ao reduzir a síntese de endotelina-1, um potente vasoconstritor, nas células endoteliais. Durante a menopausa, a VDE diminui, enquanto a síntese de Endotelina-1 aumenta, ambos os fatores contribuindo para maior vasoconstrição.6

Além disso, a deficiência de estrogênio pode afetar diversos órgãos e sistemas, incluindo o sistema cardiovascular, aumentando o risco de doenças como a hipertensão. Segundo dados do Global Burden of Disease, a hipertensão é o principal fator de risco mortal entre mulheres em todo o mundo.7 A incidência de doenças cardiovasculares em mulheres pós-menopáusicas é de duas a seis vezes maior do que em mulheres pré-menopáusicas da mesma faixa etária.8 Para o manejo desses sintomas, a terapia de reposição hormonal (TRH) é frequentemente recomendada como forma de mitigar a deficiência de estrogênio, melhorando assim a qualidade de vida nos aspectos físicos, emocionais e sexuais.9 No entanto, devido aos efeitos colaterais conhecidos e às potenciais contraindicações da TRH, terapias botânicas alternativas têm sido cada vez mais reconhecidas como benéficas para essa população.10

Uma das espécies de ginseng mais amplamente utilizadas atualmente é o Panax ginseng, cultivado principalmente na Coreia e na China, responsável por uma parcela significativa da produção global de ginseng.11 Os principais compostos ativos do Panax ginseng são os ginsenosídeos, que são saponinas triterpênicas. Grande parte das pesquisas sobre as propriedades farmacológicas e medicinais do Panax ginseng concentra-se nos ginsenosídeos, incluindo Rb1, Rg1, Rg3, Re e Rd.12

O ginseng demonstrou diversas atividades biológicas, incluindo propriedades anticancerígenas,13,14 antidiabéticos,15,16 e benefícios cardiovasculares, como auxiliar no tratamento da hipertensão.17-19 Os ginsenosídeos Rb1 e Rg1 apresentam efeitos anti-inflamatórios ao inibir a produção de antioxidantes e promover a síntese de NO20,21 Além disso, esses ginsenosídeos possuem propriedades antioxidantes, prevenindo a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) por meio da estimulação do NO. O ginsenosídeo Rb1 e outros ginsenosídeos também combatem a disfunção endotelial ao ativar a via de sinalização SIRT1/AMPK, inibir a produção de EROs, ativar o receptor de estrogênio beta (ER-β) e aumentar a expressão da enzima superóxido dismutase (SOD).23,24

Angelica keiskei, comumente conhecida como ashitaba ou "folha do amanhã", é uma planta perene resistente, nativa da costa pacífica do Japão.25 Essa planta tem ganhado atenção por suas propriedades medicinais, incluindo efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios, hipoglicemiantes, antimicrobianos, antitumorais, hipotensivos, antifibróticos, laxativos, estimulantes e galactagogos.25-29 Embora os componentes ativos específicos da Angelica keiskei ainda não tenham sido identificados, mais de 100 compostos já foram isolados dela, incluindo chalconas, cumarinas e flavanonas.29

Um produto conhecido como Mitochondrin® combina Panax ginseng e Angelica keiskei, apresentando uma tripla padronização de 8% de chalconas, 10% de flavanonas e 0,9% de ginsenosídeos Rb1, Rg1 e Rg3, proporcionando uma ação multialvo em diversos mecanismos epigenéticos. Esses componentes promovem a biogênese mitocondrial, essencial para a produção de energia e envelhecimento saudável, além de estimular o gasto calórico, reduzir o armazenamento de gordura e minimizar a inflamação por meio de efeitos antioxidantes.30

Essas plantas são amplamente utilizadas na medicina tradicional chinesa por seus benefícios fisiológicos, que incluem a redução de radicais livres,31,32 controle da inflamação,33,34 regulação da coagulação,35 promoção da produção de NO,36 melhora do metabolismo da glicose,37 e redução da disfunção mitocondrial.23,38 As terapias complementares têm ganhado destaque como uma opção segura para o manejo dos sintomas da menopausa. Neste estudo, investigamos se a combinação única de Panax ginseng e Angelica keiskei pode melhorar os parâmetros vasculares em ratas ovariectomizadas.

 Materiais e Métodos Animais e delineamento experimental

Vinte e quatro ratas Wistar fêmeas, com peso entre 200 g e 250 g, foram divididas aleatoriamente (cada animal recebeu um número e os grupos foram determinados por meio de um gerador de números aleatórios, evitando viés de seleção) em três grupos: ovariectomizadas (OVX) (n = 8), ovariectomizadas tratadas com extrato padronizado de Panax ginseng + Angelica keiskei (OVX + Pg + Ak) (n = 8) e falso-operadas (Sham) (n = 8). Todos os procedimentos com as ratas descritos neste trabalho foram realizados após uma semana de aclimatação. Os animais foram mantidos em ciclo claro-escuro com alimento e água disponíveis ad libitum até o dia do experimento. Todos os animais foram pesados a cada duas semanas.

 Indução da menopausa

Todos os animais dos grupos OVX foram submetidos à ovariectomia na 12ª semana de vida, devido à boa resposta à cirurgia evidenciada na literatura.38 A técnica utilizada seguiu o protocolo de Zarrow,39 e a anestesia foi realizada com uma associação de 13 mg/kg de xilazina e 33 mg/kg de base de cetamina por administração parenteral (intramuscular). Primeiramente, uma pequena incisão bilateral (1,0 – 1,5 cm) foi feita através da pele e da camada muscular, utilizando tesoura e pinça, aproximadamente 1 cm abaixo da última costela, perpendicular ao corpo do animal.

Para o procedimento, a cavidade peritoneal foi aberta, os ovários foram expostos e removidos, e uma sutura de náilon foi realizada logo abaixo da fímbria. Após a remoção dos ovários, uma incisão foi feita na musculatura e na pele com o fio de náilon. Os animais do grupo falso-operado (sham) foram submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico, com os ovários sendo apenas exteriorizados da cavidade abdominal e depois recolocados, sem serem removidos. Após a cirurgia, foi respeitado um período de duas semanas de recuperação antes do início dos procedimentos com o protocolo de administração do extrato padronizado.

 Medida da pressão arterial

Ao longo do tratamento, a pressão arterial sistólica dos animais foi medida por pletismografia em animmais não anestasiados de cauda — antes da indução da menopausa, seis semanas após a indução e após o tratamento. As ratas foram colocadas em um aparato de contenção e aclimatação, em um ambiente calmo e silencioso, por uma hora. Esse procedimento foi repetido algumas vezes para que os ratos se familiarizassem com o teste.

O pletismógrafo possui uma braçadeira de borracha e um sensor fotoelétrico de pulso que foi colocado ao redor da cauda do animal (modelo Power Lab 8/35, AD Instruments, Pty Ltda, Colorado Springs, CO). Foram realizadas três medições consecutivas, considerando a média aritmética desses resultados como o valor da pressão.

 Administração dos extratos padronizados de <italic>Panax ginseng</italic> + <italic>Angelica keiskei</italic>

Os animais dos grupos que receberam o tratamento com extrato padronizado foram tratados com 100 mg/kg/dia por duas semanas, e o extrato padronizado foi administrado por via intraperitoneal.²³ Todos os animais foram pesados para que a dose do extrato padronizado fosse adequada. Os animais dos grupos que não receberam o tratamento com o extrato padronizado foram manuseados com a mesma frequência que os tratados. Os extratos padronizados da associação de Panax ginseng + Angelica keiskei (1:1) compõem a formulação de um produto registrado sob o nome comercial Mitochondrin®. Este produto apresenta tripla padronização: 8% de chalconas, 10% de flavanonas e 0,9% de ginsenosídeos Rb1, Rg1 e Rg3. Os extratos foram solubilizados em solução fisiológica (cloreto de sódio a 0,9%) imediatamente antes da administração.

 Eutanásia e coleta de material biológico

Os animais, anestesiados com isofluorano, foram sacrificados por decapitação e alguns tecidos foram coletados para análises posteriores. A artéria torácica da aorta foi removida, isolada e cortada em anéis de aproximadamente 4 mm de comprimento, sendo mantida em solução de Krebs para o experimento de reatividade vascular. O útero foi coletado e fotografado para análises adicionais. O sucesso da cirurgia foi verificado por meio da atrofia uterina observada nos grupos ovariectomizadas, em comparação ao grupo falso-operado, conforme pode ser verificado na Figura Central e no material suplementar (Imagem 1A). O sangue foi coletado em tubos Falcon logo após a eutanásia, para posterior obtenção de alíquotas de soro destinadas a testes bioquímicos.

 Reatividade vascular

Os anéis aórticos dissecados após a eutanásia foram colocados em um banho de órgão isolado contendo 5 mL de solução de Krebs a 37 °C, pH 7,4, borbulhada continuamente com 95% de O2 e 5% de CO2, em um miógrafo isométrico (modelo Mulvany-Halpern 610 DMT-USA, Marietta, GA) e registrados por um sistema de aquisição de dados PowerLab8/SP (ADInstruments Pty Ltd., Colorado Springs, CO).

Primeiramente, os anéis aórticos foram submetidos a uma tensão de 1,5 g por trinta minutos para permitir a estabilização. Em seguida, a integridade endotelial foi avaliada utilizando a EC50 da fenilefrina (0,1 µmol/L) para contrair o vaso, seguida do relaxamento induzido por 1 µmol/L de acetilcolina. Os anéis foram descartados quando o relaxamento foi inferior a 80%, conforme o padrão estabelecido para ratos hipertensos com disfunção endotelial.40

Os anéis aórticos íntegros foram submetidos a uma segunda contração com 0,1 µmol/L de fenilefrina e, então, foram construídas curvas concentração-resposta à acetilcolina (0,1 nmol/L a 0,1 mmol/L). A potência (pD2) e o efeito relaxante máximo foram avaliados.

 Medida do óxido nítrico

Para a avaliação dos níveis de NO, foi medida a concentração sérica dos produtos estáveis do NO, nitrito (NO2–) e nitrato (NO3–), conhecidos como NOx, conforme descrito anteriormente,41 utilizando o NO Analyzer 280i (Sievers, Boulder, CO, EUA).

 Análise estatística

As análises estatísticas dos resultados foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism (versão 8.0.1). A distribuição dos dados foi avaliada quanto à normalidade por meio do teste de Shapiro-Wilk. Como os dados apresentaram distribuição normal, eles foram apresentados como média ± erro padrão da média (EP). As comparações entre todos os grupos foram realizadas utilizando ANOVA de uma via com o pós-teste de Newman-Keuls. Adotou-se um nível de significância de 95% (α = 0,05) para todas as análises estatísticas, garantindo que a probabilidade de erro tipo I permanecesse dentro de um limite aceitável para inferências robustas e confiáveis.

 Resultados

A ovariectomia induziu elevação da pressão arterial sistólica, como pode ser observado no grupo OVX (141,62 ± 6,0 mmHg, n = 8) e no grupo OVX + Pg + Ak antes do tratamento (143,77 ± 5,79 mmHg, n = 8), em comparação ao grupo Sham (123,77 ± 4,16 mmHg, n = 8). O tratamento por duas semanas com a associação de Panax ginseng + Angelica keiskei induziu redução da pressão arterial sistólica em ratas OVX (OVX + Pg + Ak: 118,22 ± 4,8 mmHg, n = 8), em comparação ao grupo OVX sem tratamento (139,12 ± 7,1 mmHg, n = 8) (Figura 1).

Pressão arterial sistólica antes e após o tratamento de duas semanas. Cada ponto representa a média e o erro padrão da média (EP) dos dados obtidos a partir de determinações independentes. *Indica diferença (p < 0,05) nos valores de pressão arterial sistólica entre Sham vs. OVX e Sham vs. OVX + Pg + Ak antes do tratamento com Pg + Ak (tempo = 0). Indica a diferença (p < 0,05) entre os valores de pressão arterial sistólica dos grupos OVX vs. OVX + Pg + Ak após duas semanas de tratamento com Pg + Ak (tempo = 2); OVX: ratas ovariectomizadas; OVX + Pg + Ak: ratas ovariectomizadas tratadas com extrato padronizado de Panax ginseng + Angelica keiskei.

O relaxamento dependente do endotélio induzido por acetilcolina está prejudicado nos anéis aórticos de ratas OVX (pD2: 6,17 ± 0,16, n = 8; EM: 72,46 ± 4,03%, n = 8), em comparação ao grupo controle Sham (pD2: 6,91 ± 0,19, n = 8; EM: 90,84 ± 1,78%, n = 8). O tratamento crônico com Panax ginseng + Angelica keiskei (Pg + Ak) melhorou a VDE nos anéis aórticos de ratas OVX (pD2: 6,83 ± 0,20, n = 8; EM: 89,75 ± 2,29%, n = 8), em comparação ao grupo OVX (pD2: 6,17 ± 0,16, n = 8; EM: 72,46 ± 4,03%, n = 8), sem diferença entre OVX + Pg + Ak e Sham (Figuras 2A, 2B e 2C). Além disso, o tratamento crônico com Panax ginseng + Angelica keiskei (Pg + Ak) induziu aumento nos níveis sanguíneos de NO em ratas OVX (OVX + Pg + Ak: 50,69 ± 2,82 µM, n = 5), em comparação ao grupo OVX (31,45 ± 2,98 µM, n = 5) e ao grupo Sham (31,79 ± 2,11 µM, n = 5) (Figura 3).

Estudo da função endotelial em anéis de aorta isolados dos grupos Sham, OVX e OVX + Pg + Ak. Curvas concentração-efeito cumulativas foram realizadas para a acetilcolina em aortas pré-contraídas com fenilefrina. Cada ponto representa a média e o erro padrão da média (EP) dos dados obtidos a partir de determinações independentes. 2A e 2B; * Indicam diferença (p < 0,05) nos valores de pD2 entre as aortas dos grupos Sham vs OVX e OVX vs OVX + Pg + Ak; 2A e 2C ** Indicam diferença (p < 0,01) nos valores de Emax entre Sham vs OVX e OVX vs OVX + Pg + Ak; OVX: ratas ovariectomizadas; OVX + Pg + Ak: ratas ovariectomizadas tratadas com extrato padronizado de Panax ginseng + Angelica keiskei. Níveis de óxido nítrico (NO) no sangue de ratas ovariectomizadas (OVX) em comparação com os grupos OVX + Pg + Ak e Sham. *Indica diferença (p < 0,05) nos níveis de NO em OVX + Pg + Ak vs. OVX. Indica diferença (p < 0,05) nos níveis de NO no grupo OVX + Pg + Ak vs. Sham. OVX: ratas ovariectomizadas; OVX + Pg + Ak: ratas ovariectomizadas tratadas com extrato padronizado de Panax ginseng + Angelica keiskei. Discussão

Neste estudo, observamos que o tratamento com Panax ginseng e Angelica keiskei por duas semanas resultou em redução da pressão arterial, melhora da função endotelial e aumento nos níveis circulantes de NO. A ovariectomia induziu efetivamente disfunção endotelial e elevação da pressão arterial.

O Panax ginseng é uma planta antiga com usos medicinais enraizada na medicina tradicional chinesa. Seus efeitos anti-hipertensivos, especialmente no sistema cardiovascular, são atribuídos, em parte, ao aumento de NO circulante derivado do endotélio. Essa planta ativa a enzima eNOS (óxido nítrico sintase endotelial), que converte a L-arginina em L-citrulina e NO, levando à ativação da enzima guanilato ciclase solúvel nas células musculares lisas, induzindo vasorrelaxamento e, consequentemente, redução da pressão arterial.19,42 Em nosso estudo, observamos esse efeito em ratas OVX. Os principais agentes responsáveis por esse mecanismo são os ginsenosídeos Rb1, Rg1 e Rg3, que estimulam a produção endotelial de NO.36,43

Além disso, o Rg3 é reconhecido como o mais potente vasodilatador entre os ginsenosídeos. Sua ação envolve a inibição do tônus da musculatura lisa vascular por meio da prevenção do influxo de Ca²+ e estímulo ao efluxo de K+.44 Este estudo confirmou os efeitos hipotensores do Panax ginseng em ratas.44 O ginsenosídeo Rg3 também promove o aumento da expressão de eNOS, intensificando a produção de NO e levando à vasodilatação.45

Em relação aos extratos de Angelica keiskei, estudos indicam que eles exercem efeitos protetores vasculares contra a vasoconstrição induzida por fenilefrina por meio de mecanismos mediados por NO e fator relaxante derivado do endotélio.46 Pesquisas também demonstraram que compostos como Xantoangelol (XAG) e 4-hidroxidericina (4-HD) influenciam a função plaquetária, podendo prevenir doenças trombóticas.47,48 A capacidade de Angelica keiskei em reduzir o tempo de sangramento na cauda de camundongos sugere um efeito sobre a agregação plaquetária in vivo.47

Uma revisão concluiu que o XAG pode inibir diretamente as funções da musculatura lisa ao reduzir o cálcio intracelular livre (Ca²+), enquanto a 4-hidroxidericina suprime a elevação de Ca²+induzida por fenilefrina.29 Flavonoides presentes na Angelica keiskei possuem uma estrutura complexa que inibe a enzima conversora de angiotensina, uma enzima-chave na regulação da pressão arterial. Esses compostos flavonoides atuam como agentes anti-hipertensivos, reduzem o estresse e inibem a atividade oxidativa da enzima conversora de angiotensina.49

Embora alguns estudos tenham examinado os efeitos biológicos combinados de Panax ginseng e Angelica keiskei, nenhum deles focou em seus efeitos cardiovasculares. Muitos dos componentes individuais dessas plantas são conhecidos por beneficiar a saúde cardiovascular. Assim, a combinação desses extratos parece uma opção promissora para o tratamento de doenças cardiometabólicas.

Nossos achados sugerem que a combinação de Panax ginseng e Angelica keiskei pode promover melhorias de longo prazo na função vascular. O Panax ginseng, por meio de seus ginsenosídeos, ativa vias-chave de vasodilatação, enquanto a Angelica keiskei demonstrou diversos efeitos benéficos em distúrbios metabólicos e doenças associadas à inflamação, sendo os xantoangelóis seus principais compostos ativos.

Uma limitação do estudo é que o grupo Sham foi submetido apenas à simulação cirúrgica sem receber solução salina, que foi utilizada como veículo para os tratamentos com plantas. Portanto, o grupo Sham não recebeu nenhum tratamento, o que pode limitar a interpretação das diferenças observadas entre os grupos tratados com as plantas e o grupo Sham. Além disso, os tratamentos com as plantas foram administrados por injeção intraperitoneal, o que, embora eficaz para o protocolo experimental, não reproduz totalmente a administração oral, que seria mais representativa do uso humano no dia a dia. Essa diferença na via de administração pode afetar a farmacocinética e a aplicabilidade geral dos achados para o tratamento em humanos.

Neste estudo, observamos melhora do relaxamento dependente do endotélio nos anéis aórticos do grupo OVX + Pg + Ak, sugerindo que a disfunção endotelial induzida pela ovariectomia pode ser revertida por meio do tratamento com Panax ginseng e Angelica keiskei. Nossos resultados indicam que esse tratamento combinado melhora a função endotelial e eleva os níveis circulantes de NO, o que provavelmente contribui para a redução observada da pressão arterial nas ratas OVX.

 Conclusão

Em conjunto, nossos resultados mostram que a ovariectomia pode induzir elevação da pressão arterial sistólica e disfunção endotelial, as quais foram reduzidas após duas semanas de tratamento com a associação de Panax ginseng e Angelica keiskei.

O presente estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP: 2022/01093-1 projeto regular). Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – Brasil (bolsas CNPq: 140181/2020-2) – bolsa da aluna

Este artigo é parte de tese de doutorado de Nayara Formenton da Silva pelo Programa Interinstitucional de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas Associação Ampla.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais sob o número de protocolo 6449201120. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.

Os autores não utilizaram ferramentas de inteligência artificial no desenvolvimento deste trabalho.

Os conteúdos subjacentes ao texto da pesquisa estão contidos no manuscrito.

 Agradecimentos

Agradecimentos especiais à Professora Evelin Capellari Cárnio do Departamento de Enfermagem Geral e Especializada da Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, USP, Ribeirão Preto, SP, Brasil, pelos experimentos auxiliares de quantificação de nitrito e nitrato séricos com o equipamento NO Analyzer 280i.

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 10.36660/abc.20240685i Original Article Chronic Treatment with Panax ginseng and Angelica keiskei Decreases Blood Pressure and Improves Endothelial Function in Ovariectomized Rats Silva Nayara Formenton da 1 Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript 0000-0002-3728-2131 Moraes Luis Henrique Oliveira de 1 Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for content Sabadini Camila Pereira 1 Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for content Alcântara Rita Cristina Cotta 1 Conception and design of the research Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content Dias Patrícia Corrêa 1 Conception and design of the research Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 0000-0002-1896-9536 Rodrigues Gerson Jhonatan 1 Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data Obtaining financing Critical revision of the manuscript for content São Carlos SP Brazil Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), São Carlos, SP – Brazil Gerson Jhonatan Rodrigues • Universidade Federal de São Carlos Centro de Ciências Biológicas e da Saúde – Departamento de Ciências Fisiológicas – Rod. Washington Luís km 235 – SP-310 – Postal Code 13565-905, São Carlos, SP – Brazil E-mail: gerson@ufscar.br

Researcher Patrícia Corrêa Dias, a postdoctoral fellow regularly enrolled in the UFSCar Postdoctoral Program, acted as a co-author in this study. We declare that the aforementioned co-author received financial support from the company Florien Fitoterápicos to give a lecture and collaborate in the development of products, on topics different from those addressed in the scientific article to be published. The company Florien Fitoterápicos markets the product tested in this research, composed of Panax ginseng and Angelica keiskei, under the trade name Mitochondrin®. We clarify that the co-author's participation was limited to assisting in the experimental design and in assisting in the writing of this article, with no influence on the quantification or access to the collected data.

Marina Okoshi

 Abstract Background

Menopause is a natural physiological process that can impact various systems and organs, often leading to increased blood pressure. The combination of Panax ginseng and Angelica keiskei (Pg + Ak) is a formulation known to improve vascular function.

 Objective

This study aimed to evaluate the in vivo effects of these combined plants on cardiovascular parameters in female rats experiencing menopause induced by ovariectomy.

 Methods

Twenty-four 70-day-old female Wistar rats were randomly assigned to three groups: sham-operated (Sham), ovariectomized (OVX), and ovariectomized with Pg + Ak treatment (OVX + Pg + Ak). The rats in the Pg + Ak treatment group received an intraperitoneal injection of 100 mg/kg/day for two weeks. Blood pressure was measured using tail plethysmography, and endothelial function was assessed through vascular reactivity tests.

 Results

At the end of the treatment, mean blood pressure in the SH group was lower than in the control group (OVX), and the Pg + Ak treatment improved the endothelial dysfunction caused by ovariectomy. This was evident in the restored endothelium-dependent vasodilation in the aortic rings of the OVX rats treated with Pg + Ak compared to untreated OVX rats.

 Conclusions

Our findings suggest that the Pg + Ak combination effectively reduces blood pressure and reverses endothelial dysfunction in ovariectomized rats.

Chronic Treatment with Panax ginseng and Angelica keiskei Decreases Blood Pressure and Improves Endothelial Function in Ovariectomized Rats Timeline representation of three experimental groups, A: sham (SH), B: ovariectomized (OVX), and C: ovariectomized treated with Panax ginseng + Angelica keiskei (OVX+Pg+Ak). SAP: systolic arterial pressure; EF: endothelial function, [NO]: Serum nitric oxide concentration.Up arrow (↑) indicates increase, down arrow (↓) indicates decrease and up and down arrow (↑↓) indicates no change.

Keywords Ovariectomy Menopause Hypertension Herbal Medicine Panax São Paulo Research Foundation 2022/01093-1 National Council for Scientific and Technological Development – Brazil 140181/2020-2 This study was funded by grants from the São Paulo Research Foundation (FAPESP grants: 2022/01093-1 regular project). National Council for Scientific and Technological Development – Brazil (CNPq grants: 140181/2020-2) – student grant Introduction

Menopause is a natural physiological process marked by the permanent cessation of menstruation for 12 months, typically related to age-related estrogen deficiency and not linked to pathology. The median age for menopause is around 51 years. Although most women experience vasomotor symptoms, menopause also affects various body systems, including the urogenital, psychogenic, and cardiovascular systems.1-4 A decrease in estrogen levels disrupts the hypothalamic-pituitary-ovarian axis, leading to the failure of endometrial development, which results in irregular menstrual cycles that ultimately stop altogether.5

Estrogen plays a critical role in maintaining endothelial function by increasing nitric oxide (NO) synthesis in the vascular endothelium. NO diffuses into vascular smooth muscle cells, causing relaxation – a process known as endothelium-dependent vasodilation (EDV). Estrogen also helps maintain endothelial function by reducing the synthesis of endothelin-1, a potent vasoconstrictor, in endothelial cells. During menopause, EDV decreases, while endothelin-1 synthesis rises, both contributing to increased vasoconstriction.6

Additionally, estrogen deficiency can impact various organs and systems, including the cardiovascular system, increasing the risk of diseases like hypertension. According to Global Burden of Disease data, hypertension is the leading deadly risk factor for women worldwide.7 The incidence of cardiovascular disease in postmenopausal women is two to six times higher than in premenopausal women of the same age group.8 To address these symptoms, hormone replacement therapy (HRT) is often recommended as a means of mitigating estrogen deficiency, thereby enhancing quality of life across physical, emotional, and sexual health dimensions.9 However, due to the known side effects and potential contraindications of HRT, alternative botanical therapies are increasingly recognized as beneficial for this population.10

One of the most widely used ginseng species today is Panax ginseng, primarily grown in Korea and China, which accounts for a significant portion of global ginseng production.11 The primary active compounds in Panax ginseng are ginsenosides, which are triterpene saponins. Much research on the pharmacological and medicinal properties of Panax ginseng focuses on ginsenosides, including Rb1, Rg1, Rg3, Re, and Rd.12

Ginseng has demonstrated several biological activities, including anticancer properties,13,14 antidiabetic effects,15,16 and cardiovascular benefits, such as aiding in hypertension treatment.17-19 Ginsenosides Rb1 and Rg1 exhibit anti-inflammatory effects by inhibiting antioxidant production and promoting NO synthesis.20,21 Additionally, these ginsenosides have antioxidant properties, preventing reactive oxygen species (ROS) production through NO stimulation. Ginsenoside Rb1 and other ginsenosides also counter endothelial dysfunction by activating the SIRT1/AMPK signaling pathway, inhibiting ROS production, activating estrogen receptor beta (ER-β), and upregulating superoxide dismutase (SOD).23,24

Angelica keiskei, commonly known as ashitaba or "tomorrow's leaf," is a hardy perennial plant native to Japan's Pacific coast.25 This plant has gained attention for its medicinal properties, including antioxidative, anti-inflammatory, hypoglycemic, antimicrobial, antitumor, hypotensive, antifibrotic, laxative, stimulant, and galactagogue effects.25-29 While the specific active components of Angelica keiskei remain unidentified, over 100 compounds have been isolated from it, including chalcones, coumarins, and flavanones.29

A product known as Mitochondrin® combines Panax ginseng and Angelica keiskei, featuring a triple standardization of 8% chalcones, 10% flavanones, and 0.9% ginsenosides Rb1, Rg1, and Rg3, providing a multi-targeted action on several epigenetic mechanisms. These components enhance mitochondrial biogenesis, vital for energy production and healthy aging, while promoting caloric expenditure, reducing fat storage, and minimizing inflammation through antioxidant effects.30

These plants are widely used in traditional Chinese medicine for their physiological benefits, which include reducing free radicals,31,32 controlling inflammation,33,34 regulating coagulation,35 promoting NO production,36 enhancing glucose metabolism,37 and reducing mitochondrial dysfunction.23,38 Complementary therapies are increasingly prominent as a safe option for managing menopausal symptoms. In this study, we investigate whether the unique combination of Panax ginseng and Angelica keiskei can improve vascular parameters in ovariectomized rats.

 Material and Methods Animals and experimental design

Twenty-four female Wistar rats with 200 g to 250 g were divided randomly (each animal was assigned a number, and groups were determined using a random number generator, preventing selection bias) into three groups: ovariectomized (OVX) (n = 8), ovariectomized rats treated with standardized extract of Panax ginseng + Angelica keiskei (OVX + Pg + Ak) (n = 8), and sham (Sham) (n = 8). All the procedures with rats that will be described in this work were conducted after one week of acclimatization. The animals were kept in the light-dark cycle with food and water ad libitum until the experiment day. All animals were weighed every two weeks.

 Menopause induction

All animals in the OVX groups underwent ovariectomy in the 12th week of life, due to the good response to surgery evidenced in the literature.38 The technique used followed the Zarrow protocol,39 and anesthesia was performed with an association of 13 mg/Kg of xylazine and 33 mg/Kg of ketamine base by parenteral administration (intramuscular). First, a small bilateral incision (1.0-1.5 cm) was made through the skin and muscle layer using scissors and tweezers, approximately 1 cm below the last rib, perpendicular to the animal's body.

For the procedure, the peritoneal cavity was opened, the ovaries exposed and removed, and a nylon suture ligated just below the fimbria. After removing the ovaries, an incision was made in the musculature and skin with the nylon thread. The animals in the sham groups underwent the same surgical procedure, had the ovaries externalized to the abdominal cavity and returned, without removing them. After the surgery, a period of two weeks of recovery was respected to start the procedures with the standardized extract administration protocol.

 Blood pressure measurement

Throughout the treatment, systolic blood pressure was measured in the animals using tail-cuff plethysmography in non-anesthetized animals, prior to menopause induction, six weeks after induction, and following treatment. The rats were placed in a restraint and acclimatization apparatus within a quiet and calm environment for one hour. This procedure was repeated a few times before the analysis, with the concern of making them familiar with the test.

The plethysmograph has a rubberized cuff and a photoelectric pulse sensor that was placed around the animal's tail (model Power Lab 8/35, AD Instruments, Pty Ltda, Colorado Springs, CO). Three consecutive measurements were performed, considering the arithmetic mean of these results as the pressure value.

 Administration of standardized extracts of <italic>Panax ginseng</italic> + <italic>Angelica keiskei</italic>

The animals in the groups that received the standardized extract treatment were treated with 100 mg/kg/day for two weeks and the standardized extract was administered intraperitoneally.23 All animals were weighed so that the dose of the standardized extract was adequate. The animals in the groups that did not receive treatment with the standardized extract were handled with the same frequency as the treated ones. The standardized extracts of Panax ginseng + Angelica keiskei association (1:1). These standardized extracts make up the formulation of a product registered under the name Mitochondrin®. This product has a triple standardization of 8% chalcones, 10% flavanones, and 0.9% ginsenosides Rb1, Rg1, Rg3. The extracts were solubilized in physiological saline (sodium chloride 0.9%), just before treatment.

 Euthanasia and biological material collect

The animal, anesthetized with isoflurane, were sacrificed by decapitation and some tissues were collected for further analysis. The aortic thoracic artery was removed, isolated and cut into rings of approximately 4 mm in length and kept in Krebs solution to vascular reactivity experiment. The uterus was collected and photographed for further analysis. The success of the surgery was verified by the uterine atrophy observed in the ovariectomized groups when compared to the sham group, as can be verified at the Central Illustration and supplementary material (Image 1A). Blood was collected in falcon tubes shortly after euthanasia for subsequent serum aliquots for biochemical tests.

 Vascular reactivity

The aortic rings dissected after euthanasia were placed in an isolated organ bath containing 5 mL of Krebs solution at 37 °C, pH 7.4, continuously bubbled with 95% O2 and 5% CO2 in an isometric myograph (Mulvany-Halpern-model 610 DMT-USA, Marietta, GA) and recorded by a PowerLab8/SP data acquisition system (ADInstruments Pty Ltd., Colorado Springs, CO).

Firstly, the aortic rings were submitted to a tension of 1.5 g for thirty minutes to allow for stabilization. Then, the endothelial integrity was assessed using the EC50 of phenylephrine (0.1 µmol/L) to contract the vessel, followed by the relaxation induced by 1 µmol/L acetylcholine. Rings were discarded when the relaxation was lower than 80 %, assuming what has been standardized for the hypertensive endothelial dysfunctional rats.40

The intact aortic rings were submitted to a second contraction with 0.1 µmol/L phenylephrine and then were constructed concentration-effect curves to acetylcholine (0.1 nmol/L to 0.1 mmol/L). The potency (pD2) and the maximal relaxant effect were evaluated.

 Nitric oxide measurement

For nitric oxide (NO) measurement levels, serum concentration of NO stable product was measured, nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-), known as NOx, as described previously,41 by using NO Analyzer 280i (Sievers, Boulder, CO, USA).

 Statistical analysis

The statistical analyses of the results were performed using GraphPad Prism software (version 8.0.1). Data distribution was assessed for normality using the Shapiro-Wilk test. Since the data followed a normal distribution, they were presented as mean ± standard error of the mean (SEM). Comparisons among all groups were made using one-way ANOVA with the Newman-Keuls post-test. A significance level of 95% (α = 0.05) was adopted for all statistical analyses, ensuring that the probability of Type I error remained within an acceptable threshold for robust and reliable inference.

 Results

Ovariectomy induced elevation in systolic blood pressure, as can be observed in the group OVX (141.62 ± 6.0 mmHg, n = 8) and OVX + Pg + Ak before the treatment (143.77 ± 5.79 mmHg, n = 8) compared to Sham (123.77 ± 4.16 mmHg, n = 8). Two-week treatment with association of Panax ginseng + Angelica keiskei induced a decrease in systolic blood pressure in OVX rats (OVX + Pg + Ak: 118.22 ± 4.8 mmHg, n = 8), compared to the OVX group with no treatment (139.12 ± 7.1 mmHg, n = 8) (Figure 1).

Systolic blood pressure before and after two-week treatment. Each dot represents the mean and mean standard error (SEM) of data obtained from independent determinations.; *difference (p < 0.05) in systolic blood pressure values in Sham vs. OVX and Sham vs. OVX + Pg + Ak before Pg + Ak treatment (time = 0). **Indicates the difference (p < 0.05) in values between systolic blood pressure from OVX vs OVX+ Pg + Ak after two-week treatment with Pg + Ak (time = 2); OVX: ovariectomized rats; OVX + Pg + Ak: ovariectomized rats treated with standardized extract of Panax ginseng + Angelica keiskei.

The endothelium-dependent relaxation induced by acetylcholine is impaired in aortic rings in OVX rats (pD2: 6.17 ± 0.16, n = 8; ME: 72.46 ± 4.03%, n = 8), compared to control Sham (pD2: 6.91 ± 0.19, n = 8; ME: 90.84 ± 1.78%, n = 8). The chronic treatment with Panax ginseng + Angelica keiskei (Pg + Ak) improved the endothelium-dependent vasodilation in aortic rings in OVX rats (pD2: 6.83 ± 0.20, n = 8; ME: 89.75 ± 2.29%, n = 8) compared to OVX (pD2: 6.17 ± 0.16, n = 8; ME: 72.46 ± 4.03%, n = 8), with no difference between OVX + Pg + Ak and Sham (Figures 2A, 2B and 2C). In addition, chronic treatment with Panax ginseng + Angelica keiskei (Pg + Ak) induced an increase in NO blood levels in OVX rats (OVX + Pg + Ak: 50.69 ± 2.82 µM, n = 5) compared to OVX (31.45 ± 2.98 µM, n = 5) and with Sham (31.79 ± 2.11 µM, n = 5) (Figure 3).

Study of the endothelium function in isolated aortic rings vessels from Sham, OVX and OVX + Pg + Ak rats. Cumulative concentration-effect curves performed for the acetylcholine in aortas pre-contracted with phenylephrine. Each dot represents the mean and mean standard error (SEM) of data obtained from independent determinations. 2A and 2B * Indicates the difference (p < 0.05) in pD2 values between aortas from Sham vs OVX and OVX vs OVX + Pg + Ak. 2A and 2C ** Indicates the difference (p < 0.01) in Emax values between Sham vs OVX and OVX vs OVX + Pg + Ak; OVX: ovariectomized rats; OVX + Pg + Ak: ovariectomized rats treated with standardized extract of Panax ginseng + Angelica keiskei. Nitric oxide blood levels from ovariectomized (OVX) rats compared to OVX + Pg + Ak and with Sham. *Indicates the difference (p < 0.05) in NO levels in OVX + Pg + Ak vs. OVX. **Indicates the difference (p<0.05) in NO levels in OVX + Pg + Ak vs. SHAM; OVX: ovariectomized rats; OVX + Pg + Ak: ovariectomized rats treated with standardized extract of Panax ginseng + Angelica keiskei. Discussion

In this study, we found that treatment with Panax ginseng and Angelica keiskei for two weeks resulted in a reduction in blood pressure, improved endothelial function, and increased circulating NO levels. Ovariectomy effectively induced endothelial dysfunction and blood pressure elevation.

Panax ginseng is an ancient plant with medicinal uses rooted in traditional Chinese medicine. Its antihypertensive effects, particularly on the cardiovascular system, are partly attributed to increased circulating NO derived from the endothelium. This plant activates the enzyme eNOS (endothelial nitric oxide synthase), which converts L-arginine into L-citrulline and NO, leading to activation of the soluble guanylate cyclase enzyme in smooth muscle, inducing vasorelaxation and, consequently, a decrease in blood pressure.19,42 In our study, we observed this effect in OVX rats. The primary agents responsible for this mechanism are the ginsenosides Rb1, Rg1, and Rg3, which stimulate endothelial NO production.36,43

Additionally, Rg3 is recognized as the most potent vasodilator among the ginsenosides. Its action involves inhibiting vascular smooth muscle tone by preventing Ca²+ influx and stimulating K+ efflux.44 This study confirmed the hypotensive effects of Panax ginseng in rats.44 Ginsenoside Rg3 also promotes increased eNOS expression, enhancing NO production and leading to vasorelaxation.45

Regarding Angelica keiskei extracts, studies indicate that they exert vascular protective effects against phenylephrine-induced vasoconstriction through NO and endothelium-derived relaxing factor (EDRF) mechanisms.46 Research has also shown that compounds such as Xanthoangelol (XAG) and 4-hydroxyderricin (4-HD) influence platelet function, potentially preventing thrombotic diseases.47,48 The ability of Angelica keiskei to reduce tail bleeding duration in mice suggests an effect on platelet aggregation in vivo.47

A review concluded that XAG can directly inhibit smooth muscle functions by reducing intracellular free calcium (Ca²+), while 4-hydroxyderricin suppresses phenylephrine-induced Ca²+ elevation.29 Flavonoids in Angelica keiskei possess a complex structure that inhibits angiotensin-converting enzyme, a key enzyme in regulating blood pressure. These flavonoid compounds serve as antihypertensive agents, reduce stress, and inhibit angiotensin-converting enzyme oxidative activity.49

Although a few studies have examined the combined biological effects of Panax ginseng and Angelica keiskei, none has focused on their cardiovascular effects. Many individual components of these plants are known to benefit cardiovascular health. Thus, combining these extracts appears to be a promising option for treating cardiometabolic diseases.

Our findings suggest that the combination of Panax ginseng and Angelica keiskei may yield long-term improvements in vascular function. Panax ginseng, with its ginsenosides, activates key vasorelaxation pathways, while Angelica keiskei has demonstrated various beneficial effects in metabolic disorders and other diseases associated with inflammation, with xanthoangelols being the primary active compounds.

One limitation of the study is that the Sham group underwent only the surgical simulation without receiving saline, which was used as the vehicle for the plant treatments. Therefore, the Sham group did not receive any treatment, and this may limit the interpretation of the differences observed between the plant-treated groups and the Sham group. Additionally, the plant treatments were administered via intraperitoneal injection, which, although effective for the experimental protocol, does not fully replicate the oral administration that would be more representative of human usage in daily life. This difference in administration route could affect the pharmacokinetics and overall applicability of the findings to human treatment.

In this study, we observed improved endothelium-dependent relaxation in aortic rings from the OVX + Pg + Ak group, suggesting that ovariectomy-induced endothelial dysfunction can be reversed through treatment with Panax ginseng and Angelica keiskei. Our results indicate that this combined treatment enhances endothelial function and raises circulating NO levels, which is likely to contribute to the observed reduction in blood pressure in OVX rats.

 Conclusion

Taken together, our results show that ovariectomy can induce elevation of systolic blood pressure and endothelial dysfunction, which were reduced by two-week treatment with the Panax ginseng and Angelica keiskei association.

This study was funded by grants from the São Paulo Research Foundation (FAPESP grants: 2022/01093-1 regular project). National Council for Scientific and Technological Development – Brazil (CNPq grants: 140181/2020-2) – student grant

This article is part of the thesis of doctoral submitted by Nayara Formenton da Silva, from Programa Interinstitucional de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas Associação Ampla.

This study was approved by the Animal Use Ethics Committee under the protocol number 6449201120. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.

The authors did not use any artificial intelligence tools in the development of this work.

The underlying content of the research text is contained within the manuscript.

 Acknowledgements

Special thanks to Professor Evelin Capellari Cárnio from the Department of Nursing, general and specialized, Nursing School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil, for the auxiliary experiments of serum nitrite and nitrate quantification with the equipment NO Analyzer 280i.

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