Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC rKNrnhRwNb7kgHyWFSxLX5J S0066-782X2025000700306 00306 10.36660/abc.20240825 Artigo Original Triagem de Deficiência de Lipase Ácida Lisossômica em uma Unidade Clínica de Dislipidemias 0000-0001-7338-1180 Brasil Zenia Concepção e desenho da pesquisa Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados 1 Fonseca Francisco Antonio H. 1 2 0000-0002-2383-1793 Curiati Marco Antonio Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados 3 Kyosen Sandra Obikawa Obtenção de dados 3 Pereira Vanessa Gonçalves Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados 4 0000-0002-8317-297X Fonzar Waleria Toledo Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados 1 Pesquero João Bosco Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados 5 Patrício Francy Reis da Silva Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados 6 0009-0005-0178-2168 Yamamoto Marcelo Hideki Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados 3 Yamamoto Joyce Umbelino Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados 1 4 D’Almeida Vania Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados 3 Martins Ana Maria Concepção e desenho da pesquisa Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 3 0000-0002-5738-2623 Izar Maria Cristina Concepção e desenho da pesquisa Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística e Obtenção de financiamento 1 2 Departamento de Medicina Universidade Federal de São Paulo São Paulo SP Brasil Disciplina de Cardiologia, Departamento de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, SP – Brasil Hypertri Brazil Network Casa dos Raros Porto Alegre, RS Brasil Brazilian Network of Collaboration and Knowledge Advancement on Severe Hypertriglyceridemia – Hypertri Brazil Network, Casa dos Raros, Porto Alegre, RS – Brasil Centro de Referência em Erros Inatos do Metabolismo Departamento de Pediatria Universidade Federal de São Paulo São Paulo SP Brasil Centro de Referência em Erros Inatos do Metabolismo (CREIM), Departamento de Pediatria, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, SP – Brasil Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo Universidade Federal de São Paulo São Paulo SP Brasil Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, SP – Brasil Departamento de Biofísica Universidade Federal de São Paulo São Paulo SP Brasil Departamento de Biofísica, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP – Brasil Departamento de Patologia Universidade Federal de São Paulo São Paulo SP Brasil Departamento de Patologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, SP – Brasil : Maria Cristina Izar • Rua José de Magalhães, 340, Vila Clementino, São Paulo, SP – Brasil E-mail: mcoizar@terra.com.br; mcoizar@cardiol.br

Gláucia Maria Moraes de Oliveira

Não há conflito com o presente artigo

 15 08 2025 07 2025 122 7 e20250825 10 12 2024 05 04 2025 07 05 2025 Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da licença de atribuição pelo Creative Commons Resumo Fundamento

A deficiência da lipase ácida lisossômica (D-LAL) é uma doença autossômica recessiva rara, caracterizada pelo acúmulo maciço de ésteres de colesterol e triglicerídeos em vários órgãos, levando à hepatosplenomegalia, esteatose microvesicular, cirrose e morte prematura. O reconhecimento precoce é crucial para a realização da terapia de reposição enzimática em tempo hábil.

 Objetivos

Rastrear a D-LAL em indivíduos com dislipidemias e/ou doença hepática em uma unidade clínica de dislipidemias.

 Métodos

Avaliamos retrospectivamente registros de 2018 adultos e crianças utilizando um algoritmo de rastreamento que incluía elevação de ALT/AST >1,5x o limite superior da normalidade, LDL-C >160 mg/dL, HDL-C <40 mg/dL (homens) ou <50 mg/dL (mulheres) em adultos, e LDL-C >130 mg/dL, HDL-C <45 mg/dL em crianças. Pacientes de alto risco para D-LAL foram selecionados para ensaio de atividade enzimática da LAL em amostras de sangue seco, utilizando o inibidor de LAL, Lalistat-2.

 Resultados

Entre 2018 pacientes rastreados, 21 (0,92%) foram selecionados para avaliação da atividade de LAL, mas apenas oito apresentaram resultados normais no teste [atividade média de LAL 0,077 ± 0,03 nmol/punção/h (valor de referência >0,024 nmol/punção/h)]. Uma criança cuja mãe não realizou o teste teve atividade de LAL indetectável em exame post-mortem. Posteriormente, a mãe e três meio-irmãos tiveram a confirmação de D-LAL. O sequenciamento genético (NGS) do gene LIPA não identificou variantes patogênicas, o que não permite descartar alterações na região não codificante do gene analisado.

 Conclusões

A identificação da D-LAL continua sendo um desafio, e um algoritmo baseado em critérios clínicos e laboratoriais pode auxiliar na seleção de pacientes para rastreamento da D-LAL. Dada a sua raridade e características comuns a outras dislipidemias genéticas, a D-LAL é, principalmente, um diagnóstico de exclusão, frequentemente considerado quando outras condições tenham sido descartadas.

Triagem de Deficiência de Lipase Ácida Lisossômica em uma Unidade Clínica de Dislipidemias

Algoritmo proposto para triagem de D-LAL utilizando atividade enzimática, de acordo com anormalidades hepáticas e/ou lipídicas, adicionando a trajetória do paciente até o diagnóstico. Critérios de inclusão: i) Adulto, não obeso (IMC <30 kg/m2), com LDL-C >160 mg/dL, colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C) <40 mg/dL em homens e <50 mg/dL em mulheres, e com níveis persistentemente elevados de Alanina Aminotransferase (ALT) e/ou Aspartato Aminotransferase (AST), >1,5 vezes o limite superior da normalidade, com ou sem hepatomegalia; ii) Pacientes com esteatose detectada por ultrassonografia ou esteatose mista ou microvesicular observada em biópsia hepática; iii) Pacientes com suspeita de HF utilizando os critérios da Dutch Lipid Clinic Network, sem confirmação de variantes causadoras de HF no sequenciamento, ou com variantes no gene LIPA, com ALT e/ou AST >1,5 vezes o limite superior da normalidade; iv) pacientes pediátricos (<18 anos) com hepatomegalia detectada por exame físico ou exames de imagem (com ou sem esplenomegalia), LDL-C elevado (>130 mg/dL), HDL-C baixo (<40 mg/dL), ou níveis persistentemente elevados de ALT e/ou AST (>1,5x o limite superior da normalidade), e/ou sinais de fibrose, cirrose ou evidência de doença de armazenamento em biópsia hepática; v) Pacientes com suspeita de Doença de Wilson sem envolvimento neurológico; HFC: hiperlipidemia familiar combinada; HF: hipercolesterolemia familiar; EHNA: esteatose hepática não alcoólica; DHGNA: doença hepática gordurosa não alcoólica.

 Lipase Dislipidemias Hepatomegalia Esplenomegalia Introdução

A lipase ácida lisossômica (LAL) é a enzima responsável pela hidrólise intracelular de ésteres de colesterol e triglicerídeos.1 A deficiência da LAL (D-LAL) é caracterizada pelo acúmulo de ésteres de colesterol e triglicerídeos, mas também leva ao aumento da síntese de colesterol.2 A D-LAL (OMIM #278000) é uma doença rara de armazenamento lisossômico autossômica recessiva, decorrente de variantes no gene LIPA (OMIM 613497), mapeado no cromossomo 10q23.2, com 10 éxons e aproximadamente 45 kb de comprimento.3 Os indivíduos afetados são normalmente homozigotos ou heterozigotos compostos para variantes do gene LIPA.

A D-LAL manifesta-se em duas formas distintas. A doença de Wolman,4 em lactentes, apresenta sintomas e sinais agressivos, como acúmulo maciço de ésteres de colesterol e triglicerídeos no fígado, baço, medula óssea, glândulas suprarrenais, linfonodos, vilosidades intestinais, além de infiltração no endotélio vascular e no músculo esquelético. A calcificação nas glândulas suprarrenais é uma característica comum da LAL-D e pode ocorrer em 50% dos lactentes.5,6 Falha no crescimento decorrente de má absorção, hepatomegalia e esplenomegalia, além da insuficiência hepática devido a fibrose e cirrose, podem estar presentes. Sem tratamento, essas complicações contribuem para o óbito no primeiro ano de vida.7,8 Estudos de prevalência que avaliam esse fenótipo grave são escassos e variam de acordo com etnia e localização geográfica, indo de 1:350.000 a 1:528.000 em crianças, com atividade LAL ausente ou inferior a 1%, sendo geralmente indivíduos homozigotos para variantes patogênicas do gene LIPA.9

Outro fenótipo da LAL-D é a Doença de Depósito de Ésteres de Colesterol (CESD, do inglês cholesteryl ester storage disease),10 que apresenta uma variação na manifestação clínica, dependendo da atividade da LAL, variando de 1 a 12% do valor normal.11 Esse subtipo é menos reconhecido, com progressão lenta, e pode ser confundido com outras doenças que apresentam achados clínicos e laboratoriais semelhantes, como hipercolesterolemia familiar (HF), hiperlipidemia familiar combinada (HFC), Esteato-Hepatite Associada à Disfunção Metabólica (MASH, do inglês metabolic dysfunction-associated steatohepatitis), doença hepática gordurosa associada ao metabolismo (DHGAM) ou cirrose criptogênica.12 Esse fenótipo geralmente ocorre devido a variantes patogênicas homozigóticas ou heterozigóticas compostas, ou pode ser atribuído a um alto escore poligênico; os indivíduos afetados não apresentam sinais de CESD até a infância ou idade adulta.13 As principais características da CESD incluem distensão abdominal, varizes esofágicas, hepatosplenomegalia, doença arterial coronariana, diarreia, acidente vascular cerebral, desnutrição e falha no crescimento.5 Bernstein et al.6 descobriram que a disfunção hepática e a dislipidemia foram os sinais mais frequentes em todas as idades na CESD, sendo a hepatomegalia e a hepatosplenomegalia os sinais mais comuns da doença.

Em relação ao tratamento, a terapia de redução de lipídios com estatinas parece ineficaz para pacientes com distúrbios hepáticos, pois aumenta o fornecimento de ésteres de colesterol para os hepatócitos,13,14 agravando, assim, a doença.15 No entanto, trata-se d melhor opção para reduzir as concentrações de colesterol de Lipoproteína de Baixa Densidade (LDL-C), a síntese de colesterol e o risco cardiovascular.16 Além disso, na LAL-D, há uma regulação deficiente do gene ABCA1, levando à redução nas concentrações de HDL-C.17 A terapia de reposição enzimática com sebelipase alfa permite que os pacientes atinjam níveis fisiológicos de LAL e pode prevenir o acúmulo de ésteres de colesterol e triglicerídeos.4,18

Alguns países desenvolveram diretrizes para aumentar a conscientização e o diagnóstico da D-LAL.19 Em nosso país,19 a D-LAL foi incluída como uma doença lisossômica, e nós seguimos um algoritmo de diagnóstico (Figura Central), previamente utilizado como ferramenta de rastreio.20 Neste artigo, descrevemos os métodos de rastreamento para detectar D-LAL em crianças e adultos em uma clínica terciária para tratamento de dislipidemias. Buscamos sinais de doença hepática, disfunção hepática associada à dislipidemia ou alterações lipídicas isoladas. Esse método de rastreamento foi baseado em diagnósticos anteriores de pacientes com D-LAL confirmada, selecionados a partir de um caso índice pós-morte com familiares afetados no Centro de Referência em Erros Inatos do Metabolismo (CREIM), da Universidade Federal de São Paulo.20

O objetivo deste estudo foi investigar a prevalência de D-LAL em uma população de pacientes com dislipidemias, disfunção hepática, ou ambos, em tratamento ambulatorial, com base em casos prévios confirmados pelo mesmo método de rastreamento.

 Métodos Delineamento do estudo

Este é um estudo retrospectivo transversal, com dados obtidos a partir de registros médicos (em papel e/ou eletrônicos) de pacientes adultos e pediátricos das unidades clínicas de dislipidemias, Aterosclerose e Biologia Vascular, Divisão de Cardiologia, da Universidade Federal de São Paulo. O protocolo do estudo foi aprovado pelo nosso comitê de ética local (Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP, CAAE: 51989915.2.00005505), e os dados foram coletados ao longo de 18 meses.

Revisamos 2000 registros médicos consecutivos de pacientes adultos e 18 pacientes pediátricos entre agosto de 2017 e fevereiro de 2019. Entre eles, havia 92 pacientes com diagnóstico definitivo/provável de HF (Dutch Lipid Clinic Network), mas com resultados negativos para um painel de genes relacionados à HF (LDLR, APOB, PCSK9, LDLRAP-1), além do gene LIPA,21 e 168 pacientes com doença hepática. Dados clínicos e laboratoriais desses pacientes foram obtidos para rastreamento seletivo de D-LAL.

Critérios de inclusão

Adultos, não obesos (Índice de Massa Corporal, IMC <30 Kg/m2), com LDL-C >160 mg/dL, lipoproteína de alta densidade (HDL-C) <40 mg/dL em homens e <50 mg/dL em mulheres, e com níveis de alanina aminotransferase (ALT) e/ou aspartato aminotransferase (AST) persistentemente elevados (>1,5 vezes o limite superior da normalidade), com ou sem hepatomegalia.

Pacientes com esteatose detectada por ultrassonografia ou esteatose mista ou microvesicular observada em biópsia hepática.

Pacientes com suspeita de HF usando os critérios da Dutch Lipid Clinic Network,22 sem confirmação de variantes causadoras de HF na análise genética, ou com variantes no gene LIPA, e níveis de ALT e/ou AST >1,5 vezes o limite superior da normalidade.

Pacientes pediátricos (<18 anos) com hepatomegalia detectada no exame físico ou por exames de imagem (com ou sem esplenomegalia), LDL-C elevado (>130 mg/dL), HDL-C baixo (<40 mg/dL), ou níveis persistentemente elevados de ALT e/ou AST (>1,5 vezes o limite superior da normalidade), e/ou sinais de fibrose, cirrose ou evidência de doença de armazenamento em biópsia hepática.

Pacientes com suspeita de doença de Wilson sem envolvimento neurológico.

Critérios de exclusão

Pacientes adultos com esteatose ou cirrose de etiologia conhecida;

Pacientes com hepatite viral e/ou doença hepática alcoólica;

Pacientes com toxicidade conhecida por medicamentos.

 Organização do banco de dados

Os dados coletados incluíram identificação dos pacientes, dados demográficos, presença de fatores de risco cardiovascular, incluindo dislipidemia, hábitos, história de doença cardiovascular, doenças hepáticas, síndrome metabólica e outras comorbidades. Foram registrados parâmetros clínicos e antropométricos. As variáveis laboratoriais incluíram colesterol total, HDL-C, LDL-C, não-HDL-C, Triglicerídeos (TG), ALT, AST, glicemia, Hormônio Estimulante da Tireoide (TSH) e Tiroxina Livre (T4L). Nos indivíduos em uso de estatinas, o LDL-C foi corrigido conforme a intensidade da estatina, conforme descrito abaixo.23 Ultrassonografias de fígado e baço, assim como biópsias hepáticas, foram registradas para identificação de anormalidades, quando disponíveis. Testes laboratoriais prévios ou confirmação genética de LAL-D também foram registrados, quando disponíveis. Para pacientes pediátricos, foi criado um banco de dados separado.

 Tratamento com estatinas

Os valores de colesterol total e LDL-C dos pacientes adultos foram corrigidos de acordo com a intensidade do tratamento com estatinas, multiplicando-se os valores de colesterol total e LDL-C por um fator: alta intensidade, redução do LDL-C >50% (x 2,00); intensidade moderada, redução do LDL-C entre 30-50% (x 1,65); e baixa intensidade, redução do LDL-C ~30% (x1,43).23O tratamento de alta intensidade foi definido como atorvastatina 40/80 mg, rosuvastatina 20/40 mg, sinvastatina 20/40 mg mais ezetimiba. O tratamento de intensidade moderada como atorvastatina 10/20 mg, rosuvastatina 5/10 mg, sinvastatina 10/40 mg, e o tratamento de baixa intensidade definido como outras estatinas ou doses menores.

 Diagnóstico bioquímico

Os indivíduos que preencheram os critérios de inclusão/exclusão foram convidados a coletar amostras de sangue para determinação da atividade da LAL (Figura 1). Esses pacientes assinaram o termo de consentimento informado por escrito antes da coleta de sangue.

– Perfil de pacientes com dislipidemia a partir de prontuários médicos, de acordo com a intensidade do tratamento com estatinas (a) e aqueles com critérios de inclusão para LAL-D (b). Alta intensidade: atorvastatina 40/80 mg, rosuvastatina 20/40 mg, sinvastatina 20/40 mg + ezetimiba 10 mg; intensidade moderada: atorvastatina 10/20 mg, rosuvastatina 5/10 mg, sinvastatina 10/40 mg; baixa intensidade: outras estatinas ou doses menores.

O ensaio de atividade enzimática da LAL foi realizado a partir de amostras de sangue seco, seguindo-se a técnica fluorimétrica descrita por Hamilton et al.,24 no Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo (LEIM) – UNIFESP. Foi utilizado o intervalo de referência de >0,024 nmol/punção/h. O ensaio foi realizado em duplicata, com controles positivos e negativos.

 Estudo genético para detecção de hipercolesterolemia familiar

A extração do DNA, o sequenciamento de nova geração (NGS, do inglês next generation sequencing) e as análises de detecção de variantes foram realizados de acordo com Fonzar et al.21

 Análise dos dados

Neste estudo, utilizou-se a estatística descritiva. As variáveis categóricas foram descritas como frequências e percentuais; os dados numéricos foram apresentados como médias ± desvio padrão (DP) ou mediana e intervalo interquartil (IQR), conforme apropriado. A normalidade foi testada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. A significância foi estabelecida com um valor de p < 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, Chicago, IL), versão 22.

 Resultados Análise descritiva da população adulta

As características da população adulta estão apresentadas na Tabela 1 e incluíram a coorte de adultos com HF. Dos 2000 registros de pacientes avaliados, 893 indivíduos (44,6%) estavam recebendo tratamento de alta intensidade, 529 (26,4%) tratamento de intensidade moderada, quatro (0,2%) tratamento de baixa intensidade, e 574 (28,8%) não estavam tomando estatinas. Desses, 21 pacientes atenderam aos critérios de inclusão para a avaliação da atividade de LAL (Figura 1), sendo 14 em tratamento de alta intensidade, quatro em tratamento de intensidade moderada e três sem uso de estatinas.

– Características clínicas e laboratoriais dos pacientes adultos
Características N=2000
Idade, anos 67 (60-74)
Sexo masculino/feminino, % 613 (30,65) / 1387 (69,35)
Raça, %
Caucasiana 1022 (51,10)
Preta 197 (9,85)
Mista 781 (39,05)
Hipertensão, % 1528 (76,4)
Dislipidemia, % 1615 (80,75)
Diabetes, % 778 (38,9)
Síndrome metabólica, % 595 (29,75)
Intensidade da estatina, %
Alta intensidade 893 (44,6)
Intensidade moderada 529 (26,4)
Baixa intensidade 4 (0,2)
Sem estatina 574 (28,8)
Infarto do miocárdio 215 (10,75)
Tabagismo, %
Atual 110 (5,50)
Prévio 467 (23,25)
IMC, kg/m2 30,88 (24,65-40,00)
Colesterol total, mg/dL 227 (152-279)
HDL-C, mg/dL 49 (40-59)
LDL-C, mg/dL 156 (115-204)
Não HDL-c, mg/dL 121 (96-155)
Triglicerídeos, mg/dL 124 (99-177)
AST, U/L 48 (48-60)
ALT, U/L 49 (49-61)
Glicose, mg/dL 102 (94-118)
HbA1c, % 6,10 (5,70-6,70)
TSH, mUI/L 2,65 (1,76-4,21)
T4, ng/dL 1,30 (1,14-1,51)

As variáveis categóricas são expressas como frequências (%); as variáveis numéricas são expressas como mediana (IQR); a correção para a intensidade do tratamento foi feita multiplicando o colesterol total ou LDL-C por 1,43 (baixa intensidade), 1,65 (intensidade moderada) e 2,00 (alta intensidade); HDL-C: lipoproteína de alta densidade; LDL-C: lipoproteína de baixa densidade; ALT: alanina aminotransferase; AST: aspartato aminotransferase; IQR: intervalo interquartil; TSH: hormônio estimulante da tireoide; T4L: tiroxina livre; IMC: índice de massa corporal.

A coorte de 92 pacientes com diagnóstico definitivo ou provável de HF (Dutch Lipid Clinic Network) também foi selecionada.22 Entre esses, encontramos dois pacientes com variantes de significado incerto no gene LIPA, enzimas hepáticas normais e sem sinais de esteatose hepática. Esses pacientes não foram rastreados quanto a atividade de LAL.

 Análise descritiva dos pacientes pediátricos com critérios para D-LAL

Dezoito pacientes foram identificados nos prontuários médicos da nossa unidade clínica de dislipidemias e do CREIM (Tabela 2). Desses, oito (44%) tinham LDL-C acima do alvo, e três (17%) apresentavam HDL-C <40 mg/dL; nove pacientes apresentaram níveis elevados de AST e/ou ALT. Todos os critérios estavam presentes em cinco (28%) pacientes. Um desses pacientes teve confirmação genética para a doença de Niemann-Pick, outro possuía uma doença mitocondrial hereditária e não foram selecionados para o rastreamento de D-LAL.

– Características das crianças rastreadas para deficiência de lipase ácida lisossômica
Variável Total (N=18)
Idade, anos 12 (7-18)
Masculino/feminino, % 12 (67)/6 (33)
Raça, %
Caucasiana 10 (55)
Preta 1 (6)
Mista 7 (39)
Terapia hipoglicemiante, %
Alta intensidade 0 (0)
Intensidade moderada 1 (5)
Baixa intensidade / nenhuma terapia 1 (5)
Sem estatina 16 (90)
Peso corporal, kg 38 (26-48)
IMC, Kg/m2 18 (17-19)
Frequência cardíaca, bpm 70 (67-76)
Colesterol total, mg/dL 213 (135-329)
HDL-C, mg/dL 44 (21-64)
LDL-C, mg/dL 152 (67-250)
Não HDL-C, mg/dL 170 (82-265)
Triglicerídeos, mg/dL 91 (52-167)
Glicemia de jejum, mg/dL 88 (77-103)
HbA1c, % 5,5 (4,8-6,3)
AST (U/L) 27 (18-66)
ALT (U/L) 19 (10-62)
CK (U/L) 135 (110-241)
TSH (µIU/L) 3,30 (1,24-6,12)

As variáveis categóricas são expressas como frequências (%); as variáveis numéricas são expressas como mediana (IQR); ALT: alanina aminotransferase; AST: aspartato aminotransferase; IMC: índice de massa corporal; HDL: lipoproteína de alta densidade; IQR: intervalo interquartil; LDL: lipoproteína de baixa densidade; DP: desvio padrão; TSH: hormônio estimulante da tireoide; CK: creatinofosfoquinase.

 Análise descritiva dos pacientes com esteatose hepática

A Tabela 3 apresenta as características de 168 pacientes com esteatose hepática, detectada por ultrassonografia ou biópsia hepática. Cento e cinquenta e cinco (92,26%) pacientes apresentaram esteatose na ultrassonografia, hepatopatia parenquimatosa foi encontrada em 12 (7,14%), e nódulo hepático em 1 (0,59%). A partir desses achados, selecionamos pacientes com LDL-C corrigido >160 mg/dL e HDL-C <40 mg/dL em homens ou <50 mg/dL em mulheres, AST ou ALT >1,5x o limite superior da normalidade ou esteatose hepática detectada por métodos de imagem.

– Distribuição dos achados da ultrassonografia e/ou da biópsia hepática nos participantes do estudo
Variável N=168
Esteatose (%) 155 (92,26)
Hepatopatia parenquimatosa (%) 12 (7,14)
Nódulo hepático (%) 1 (0,59)

Variáveis categóricas expressas em frequências (%).

A análise de pacientes com doença de Wilson sem envolvimento neurológico não foi realizada, pois não havia indivíduos com esse critério.

 Atividade da LAL

Dos bancos de dados selecionados, 21 (0,92%) pacientes atenderam aos critérios de inclusão para o rastreamento de D-LAL com atividade de LAL (três crianças e 18 adultos); as médias de ALT/AST foram, respectivamente, 83,7 e 96,7 U/L; a média do colesterol total foi 248 mg/dL, do LDL-C 222 mg/dL, e quatro apresentaram esteatose hepática documentada. Desses, dois indivíduos não concordaram em participar, três foram a óbito, e não foi possível contatar oito pacientes, incluindo as crianças. Oito pacientes assinaram o termo de consentimento informado e coletaram sangue para o ensaio. Seis eram mulheres e dois homens com idades entre 58-82 anos; em 100% dos casos, os níveis de ALT estavam acima de 1,5 vezes o limite superior da normalidade, dois apresentavam esteatose hepática e todos estavam em tratamento com estatinas de alta intensidade. Não foram encontradas diferenças significativas entre os pacientes selecionados e triados para LAL-D (Tabela Suplementar S1).

O ensaio da atividade de LAL foi realizado em duplicata, além de dois controles positivos e dois controles negativos. A atividade média de LAL foi normal [0,077 (± 0,03) nmol/punção/h, valor de referência >0,024 nmol/punção/h]. Os controles negativos apresentaram 0,096 nmol/punção/h e os controles positivos mostraram atividade de LAL indetectável (Tabela 4).

– Resultados da atividade da lipase ácida lisossômica no teste enzimático utilizando o inibidor Lalistat-2
Amostra Poço Valores Média DP V% Sem - Com pmol/punção/L Linha reta 4/11
01 C2 D2 2698,469 2714,956 2706,713 11,658 0,4 332,211 40,991 45,558
02 C3 D3 2794,832 2643,668 2719,250 106,889 3,9 488,673 62,988 73,908
03 C4 D4 2835,840 2881,884 2858,862 32,558 1,1 702,193 92,940 112,511
04 C5 D5 2867,881 2931,860 2899,871 45,240 1,6 651,496 85,885 103,418
05 C6 D6 2707,930 2725,490 2716,710 12,417 0,5 546,769 71,117 84,385
06 C7 D7 2781,802 2832,713 2807,258 36,000 1,3 602,909 78,958 94,490
07 C8 D8 2782,242 2791,745 2786,994 6,720 0,2 608,951 79,848 95,638
08 C9 D9 2824,358 2847,077 2835,718 16,065 0,6 776,723 103,405 125,998
+ Controle G10 H10 2693,484 2824,164 2758,824 92,405 3,3 -40,715 -11,371 -21,928
- Controle G9 H9 2806,659 2734,641 2770,650 50,924 1,8 729,464 96,769 117,446

Os testes foram realizados em duplicata para cada paciente, incluindo um controle positivo (+ Controle) e um controle negativo (- Controle); a atividade de lipase ácida lisossômica foi avaliada com o inibidor Lalistat-2, e os resultados foram expressos em nmol/punção/h (valor de referência >0,024 nmol/punção/h).

Tentamos obter mais detalhes sobre esses pacientes, e uma mulher de 41 anos, cuja atividade de LAL era previamente normal, repetiu o teste de atividade de LAL após a morte de um de seus filhos. A atividade de LAL era 0,00 nmol/punção/h em dois testes posteriores. A paciente apresentou hepatomegalia e esteatose hepática, confirmando o diagnóstico de D-LAL. Sua filha de nove anos tinha hepatosplenomegalia e esteatose hepática, com níveis de AST de 55 e ALT 35 U/L, colesterol total e LDL-C de 212 mg/dL e 148 mg/dL, respectivamente; HDL-C de 12 mg/dL, não-HDL-C de 200 mg/dL e triglicerídeos de 256 mg/dL. Os sintomas começaram aos três anos de idade, com episódios intermitentes de diarreia e falha no crescimento. Aos quatro anos, seu peso corporal era de 16 kg (z score de −0,56) e sua altura era de 93 cm (z score de −3,0). A biópsia hepática mostrou esteatose difusa macro e microvesicular de grau 3 em 60% dos hepatócitos, aumento dos espaços portais com macrófagos microvacuolizados aumentados e hepatócitos. Aos nove anos, ela desenvolveu hepatosplenomegalia progressiva e piora dos episódios de diarreia. Foi hospitalizada várias vezes devido a insuficiência respiratória secundária à hepatosplenomegalia grave e faleceu aos nove anos devido a pneumonia e choque séptico.

O diagnóstico diferencial de D-LAL da criança incluiu a análise de amostras de sangue e biópsias hepáticas. Três biópsias hepáticas realizadas em diferentes hospitais mostraram esteatose macro e microvesicular, com um padrão semelhante ao da doença de Niemann-Pick tipo C.

Amostras de sangue foram coletadas, mas analisadas post-mortem. Os testes foram desenvolvidos para avaliar a atividade enzimática associada a diversas doenças de armazenamento lisossômico. A atividade da quitotriosidase foi medida no plasma utilizando um ensaio imunoenzimático (ELISA); a atividade da esfingomielinase foi avaliada em leucócitos para excluir a doença de Niemann-Pick; a atividade da beta-glicosidase foi medida em leucócitos para avaliar a doença de Gaucher; um painel abrangente obtido a partir de amostras de sangue seco testou quitotriosidase, esfingomielinase, beta-glicosidase e LAL, fornecendo uma avaliação mais ampla para doenças de armazenamento lisossômico. Todos os testes, exceto para D-LAL, estavam dentro da faixa de normalidade. Foi observada atividade enzimática indetectável (0 nmol/punção/h) (faixa de referência >0,024 nmol/punção/h), confirmando o diagnóstico de deficiência de LAL. Esses ensaios enzimáticos foram essenciais para diferenciar LAL-D de outras doenças de armazenamento lisossômico com características clínicas sobrepostas.

A autópsia revelou acúmulo disseminado de lipídios e cristais de colesterol no fígado, baço, medula óssea e trato gastrointestinal, além de esteatose grave com histiócitos preenchidos por lipídios. Não foi observada calcificação adrenal. Este foi o caso índice de sua família, sendo a segunda de cinco irmãos da mesma mãe, que teve um filho (não afetado) e uma filha (essa paciente) de seu primeiro casamento, e três outros filhos (todos afetados) de seu segundo casamento. Ambos os casamentos foram uniões não consanguíneas, e os pais não possuem parentesco entre si.

Os três meio-irmãos do sexo masculino foram avaliados, e eles apresentaram atividade de LAL de 0,0087 nmol/punção/h, 0,00 nmol/punção/h e 0,00 nmol/punção/h, confirmando o diagnóstico de D-LAL. Seus relatos de caso foram publicados anteriormente.20Além disso, realizamos testes genéticos da mãe e dos três meio-irmãos do caso índice, obtendo DNA extraído da saliva. O sequenciamento genético (NGS), utilizando um painel que incluía o gene LIPA, não encontrou variantes patogênicas, o que não permitiu descartar alterações na região não codificante dos genes analisados, como regiões regulatórias, sequências intergênicas e intrônicas distantes dos éxons.

 Discussão

Neste estudo, investigamos a prevalência de D-LAL em uma população de pacientes com dislipidemias em seguimento ambulatorial, e utilizamos um algoritmo baseado em casos clínicos previamente confirmados, diagnosticados por meio do ensaio enzimático para atividade da LAL.

A doença é considerada muito rara, com acúmulo de ésteres de colesterol em tecidos como fígado, baço, medula óssea, glândulas suprarrenais, linfonodos, vilosidades intestinais, parede vascular e músculos esqueléticos.5,6 Uma forma mais grave é reconhecida em crianças, e manifestações menos pronunciadas podem ser observadas em adultos, dependendo da atividade enzimática da LAL.4Em nosso estudo, na clínica de lípides, entre 2.018 indivíduos, identificamos 21 (0,92%) com alto risco para LAL-D. Dos oito inicialmente testados para atividade da LAL, nenhum caso foi confirmado. No entanto, um teste post-mortem positivo em uma criança (caso índice) permitiu confirmar a mãe e três meio-irmãos afetados.

A Atualização das Diretrizes Brasileiras para Dislipidemia e Prevenção da Aterosclerose19 reconhece a lacuna no diagnóstico da doença e sugere um algoritmo para triagem da D-LAL (Figura Central). Indivíduos com D-LAL enfrentam uma grande carga da doença e, segundo seus relatos, os sintomas são constantes, incluindo dor abdominal, hepatosplenomegalia, cefaleia, fraqueza, prurido e lesões cutâneas.20 Em crianças, o fenótipo pode estar presente nos primeiros meses de vida, com aumento abdominal, falha no crescimento, hepatomegalia ou hepatosplenomegalia, esteatose hepática e calcificação adrenal.20,25

Existe um amplo espectro de manifestações da doença de início tardio. Os sintomas podem ser leves e não percebidos, levando ao subdiagnóstico. Por outro lado, nos casos mais graves, as alterações hepáticas podem resultar em cirrose hepática e morte.5 Além disso, pode existir um risco cardiovascular aumentado, com histórico de doença cardiovascular aterosclerótica ou acidente vascular cerebral isquêmico.26

As anormalidades lipídicas são uma característica comum nas dislipidemias de diferentes etiologias, sejam genéticas ou secundárias ao uso de medicamentos ou a comorbidades, como diabetes, obesidade e síndrome metabólica.16,17A hipercolesterolemia que não responde à terapia hipolipemiante convencional, acompanhada de uma leve elevação das enzimas hepáticas, pode levantar suspeita de D-LAL.27Na HF, com critérios definitivos ou prováveis, nos quais variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas são detectadas, fenocópias, como D-LAL, devem ser descartadas, uma vez que um diagnóstico adequado e um tratamento oportuno podem restaurar ou prevenir alterações hepáticas. Chora et al.27 descreveram casos de D-LAL em uma coorte de pacientes com suspeita de HF (n=492), apresentando dislipidemia grave, com diagnóstico genético negativo para genes de HF ou com variantes de significado incerto. As análises de suas famílias também foram realizadas. Nesse estudo, os autores identificaram quatro crianças com D-LAL.27

Outra forma de triagem para D-LAL é pela presença de síndrome metabólica com anormalidades hepáticas detectadas por biópsia hepática28 ou ultrassonografia sugestiva de MASH ou DHGAM e, raramente, na doença de Wilson sem sinais neurológicos.

Neste estudo, buscamos D-LAL em pacientes adultos (2000 indivíduos) atendidos em um centro de referência para dislipidemias, incluindo pacientes com suspeita de HF (N=92), aqueles com doença hepática (N=168) e em 18 crianças.

O diagnóstico precoce e preciso de D-LAL é crucial para instituir um tratamento adequado e em tempo hábil. Ensaios específicos para D-LAL devem estar disponíveis não apenas para pesquisa, mas também no sistema público de saúde.

Alguns países da América Latina desenvolveram algoritmos para diagnosticar D-LAL,29,30 e o Brasil incluiu a pesquisa por D-LAL na Atualização das Diretrizes Brasileiras para Dislipidemia e Prevenção da Aterosclerose.19 No entanto, a implementação dessa medida ainda é ausente.

O mapeamento dos genes humanos abriu novas perspectivas para o diagnóstico de doenças hereditárias e permitiu o desenvolvimento de estratégias preventivas e terapêuticas.

Ainda há muitas questões a serem respondidas sobre o diagnóstico de D-LAL. A conscientização sobre a doença, o diagnóstico precoce e o tratamento adequado podem impedir a progressão da aterosclerose e da disfunção hepática. Em relatos de casos de indivíduos afetados, a experiência com a terapia de reposição enzimática demonstrou uma melhora considerável nos sintomas e na qualidade de vida, com poucos eventos adversos e um impacto positivo para os pacientes e cuidadores. O maior benefício, porém, foi o aumento da expectativa de vida.31,32

Até o momento, não há estudos suficientes sobre a prevalência da D-LAL no Brasil, e a doença continua subdiagnosticada. A D-LAL apresenta sinais e sintomas que são comuns a de outras doenças que afetam o fígado, baço e perfil lipídico. A atividade da LAL é variável, e os diferentes fenótipos, doença de Wolman e CESD, possuem apresentações distintas, progressão da doença e mortalidade.

Pontos fortes e limitações do estudo

Pontos fortes: este estudo foi conduzido em um centro de referência para dislipidemias, utilizou um algoritmo de triagem previamente descrito, e incluiu 2018 pacientes. A D-LAL é uma doença rara, mas apresenta manifestações comuns, como LDL-C elevado, HDL-C baixo, níveis aumentados de AST/ALT e esteatose hepática, características frequentemente observadas em centros de tratamento de dislipidemias.

Limitações: O estudo foi retrospectivo, as enzimas hepáticas foram obtidas sob tratamento com estatinas e a atividade da LAL não foi avaliada em leucócitos. Não testamos a discriminação ou precisão do algoritmo. Na verdade, a D-LAL é muito mais um diagnóstico de exclusão, na investigação de HF ou outras dislipidemias genéticas.

 Conclusão

A triagem de D-LAL em um centro de referência para dislipidemias, utilizando um algoritmo que inclui medidas clínicas e laboratoriais, selecionou 21 pacientes de alto risco. No entanto, a atividade enzimática da LAL não confirmou a doença em oito indivíduos testados. A partir de uma mãe suspeita, uma criança teve a confirmação post-mortem de D-LAL, o que possibilitou o diagnóstico da mãe e de três meio-irmãos afetados.

Identificar a LAL-D continua sendo um desafio, e esse algoritmo pode auxiliar na seleção de pacientes de alto risco para triagem da doença. No entanto, esse algoritmo não foi validado quanto à precisão ou capacidade discriminatória. Dada sua raridade e características sobrepostas com outras dislipidemias genéticas, a LAL-D é, principalmente, um diagnóstico de exclusão, frequentemente considerado quando outras condições tenham sido descartadas.

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Benevides GN Miura IK Person NC Pugliese RPS Danesi VLB Lima FR et al Lysosomal Acid Lipase Deficiency in Brazilian Children: A Case Series J Pediatr 2019 95 5 552 558 10.1016/j.jped.2018.05.016

Este artigo é parte de dissertação de mestrado de Zenia Brasil pela Universidade Federal de São Paulo.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de São Paulo sob o número de protocolo 58743616.8.0000.5505. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.

Os autores não utilizaram ferramentas de inteligência artificial no desenvolvimento deste trabalho.

Os dados poderão ser disponibilizados mediante solicitação.

Para informação adicional, por favor, clique aqui

O presente estudo foi parcialmente financiado por Alexion Pharmaceuticals.

 10.36660/abc.20240825i Original Article Screening for Lysosomal Acid Lipase Deficiency in a Lipid Clinic 0000-0001-7338-1180 Brasil Zenia Conception and design of the research Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content Acquisition of data Analysis and interpretation of the data 1 Fonseca Francisco Antonio H. Conception and design of the research Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 2 0000-0002-2383-1793 Curiati Marco Antonio Acquisition of data Analysis and interpretation of the data 3 Kyosen Sandra Obikawa Acquisition of data Analysis and interpretation of the data 3 Pereira Vanessa Gonçalves Acquisition of data Analysis and interpretation of the data 4 0000-0002-8317-297X Fonzar Waleria Toledo Acquisition of data Analysis and interpretation of the data 1 Pesquero João Bosco Acquisition of data Analysis and interpretation of the data 5 Patrício Francy Reis da Silva Acquisition of data Analysis and interpretation of the data 6 0009-0005-0178-2168 Yamamoto Marcelo Hideki Acquisition of data Analysis and interpretation of the data 3 Yamamoto Joyce Umbelino Acquisition of data Analysis and interpretation of the data 1 4 D’Almeida Vania Acquisition of data Analysis and interpretation of the data 3 Martins Ana Maria Conception and design of the research Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 3 0000-0002-5738-2623 Izar Maria Cristina Conception and design of the research Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis and Obtaining financing 1 2 Brazil Disciplina de Cardiologia, Departamento de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, SP – Brazil Brazil Brazilian Network of Collaboration and Knowledge Advancement on Severe Hypertriglyceridemia – Hypertri Brazil Network, Casa dos Raros, Porto Alegre, RS – Brazil Brazil Centro de Referência em Erros Inatos do Metabolismo (CREIM), Departamento de Pediatria, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, SP – Brazil Brazil Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, SP – Brazil Brazil Departamento de Biofísica, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP – Brazil Brazil Departamento de Patologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, SP – Brazil Maria Cristina Izar •: Rua José de Magalhães, 340, Vila Clementino, São Paulo, SP – Brazil E-mail: mcoizar@terra.com.br; mcoizar@cardiol.br

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Gláucia Maria Moraes de Oliveira

 Abstract Background

Lysosomal acid lipase deficiency (LAL-D) is a rare autosomal recessive disease, with massive accumulation of cholesteryl esters and triglycerides in many organs, leading to hepatosplenomegaly, microvesicular steatosis, cirrhosis and premature death. Early recognition is crucial for timely enzyme replacement therapy.

 Objectives

To screen for LAL-D in subjects with dyslipidemias and/or liver disease at an outpatient lipid clinic.

 Methods

We retrospectively assessed records from 2,018 adults and children using a screening algorithm including ALT/AST elevation >1.5 x upper limit of normality, LDL-C>160 mg/dL, HDL-C<40 (males) or <50 mg/dL (females) in adults, and LDL-C>130 mg/dL, HDL-C<45 mg/dL, in children. High-risk patients for LAL-D were selected for LAL enzymatic activity assay in dried blood spots using LAL inhibitor, Lalistat-2.

 Results

Among 2,018 screened patients, 21 (0.92%) were selected for LAL activity test, but only eight performed the test with normal results [mean LAL activity 0.077 ± 0.03 nmol/punch/h (reference value >0.024 nmol/punch/h)]. A child whose mother did not perform the test, had a post-mortem undetectable LAL activity. Further, the mother and three half-brothers confirmed LAL-D. Sequencing (NGS) of LIPA gene did not find pathogenic variants, not allowing to discard changes in non-coding region of the gene analyzed.

 Conclusions

Identifying LAL-D remains a challenge, and an algorithm based on clinical and laboratory criteria may assist in selecting patients for LAL-D screening. Given its rarity and overlapping features with other genetic dyslipidemias, LAL-D is primarily a diagnosis of exclusion, often considered when other conditions have been ruled out.

Screening for Lysosomal Acid Lipase Deficiency in a Lipid Clinic

Algorhithm proposed for LAL-D screening using enzyme activity, according to hepatic and/or lipid abnormalities, adding the patient’s journey until diagnosis. Inclusion criteria: i) Adult, non-obese (BMI<30 kg/m2), with LDL-C >160mg/dL, high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) <40 mg/dL in men and <50 mg/dL in women, and with persistently high alanine aminotransferase (ALT), and/or aspartate aminotransferase (AST), >1,5 x the upper limit of normality, with or without hepatomegaly; ii) Patients with steatosis by ultrasound or mixed or microvesicular steatosis, observed on liver biopsy; iii) Patients with suspected familial hypercholesterolemia (FH) using the Dutch Lipid Clinic Network criteria without confirmation of FH causing variants on sequencing, or with variants in LIPA gene, with ALT and/or AST >1.5x ULN; iv) pediatric patients (<18 years-old) with hepatomegaly on physical examination or imaging tests (with or without splenomegaly), high LDL-C (>130 mg/dL), low HDL-C (<40 mg/dL), or persistently elevated ALT and/or AST (>1.5x ULN), and/or signs of fibrosis, cirrhosis, or evidence of storage disease on liver biopsy; v) Patients with suspicion of Wilson Disease without neurological involvement. ALT: alanine aminotransferase; AST: aspartate aminotransferase; FCH: familial combined hyperlipidemia; FH: familial hypercholesterolemia; ULN: upper limit of normality; NAFLD: nonalcoholic fatty liver disease; NASH non-alcoholic steatohepatitis.

 Lipase Dyslipidemias Hepatomegaly Splenomegaly Introduction

Lysosomal acid lipase (LAL) is the enzyme responsible for intracelular hydrolysis of cholesteryl esters and triglycerides. Deficiency of LAL (LAL-D)1 is characterized by accumulation of cholesteryl esters and triglycerides, but it also leads to increase in cholesterol synthesis.2 LAL-D (OMIM # 278000) is a rare autosomal recessive lysosomal storage disease, arising from variants in the LIPA gene (OMIM 613497), mapped to chromosome 10q23.2, with 10 exons and approximately 45 kb in length.3 Affected individuals are typically either homozygous or compound heterozygous for LIPA variants.

The disease manifests in two different forms. Wolman disease,4 in infants, evolves with aggressive symptoms and signs, such as massive accumulation of cholesteryl esters and triglycerides in the liver, spleen, bone marrow, adrenal glands, lymph nodes, intestinal villi, and infiltration of the vascular endothelial, and skeletal muscle. Calcification in the adrenal glands is a common feature of LAL-D and can occur in 50% of infants.5,6 Failure to thrive, due to malabsorption, hepatosplenomegaly, and hepatic failure, due to fibrosis and cirrhosis can be present. Untreated, these complications contribute to the death in the first year of life.7,8Prevalence studies evaluating this severe phenotype are scarce and vary according to ethnicity and geographic localization from 1:350,000 to 1:528,000 in children, with absent or <1% LAL activity, and usually the individuals are homozygous for pathogenic LIPA variants.9

Another phenotype of LAL-D is the cholesteryl ester storage disease (CESD)10 with a varying presentation, depending on LAL activity, ranging from 1-12% of the normal value.11 This subtype is less recognized, with a slow progression and can be confounded with other disorders with similar clinical and laboratory findings, such as familial hypercholesterolemia (FH), familial combined hyperlipidemia (FCH), metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH), metabolic-associated fatty liver disease (MAFLD), or cryptogenic cirrhosis.12 This phenotype is usually due to double or compound heterozygous pathogenic variants, or attributed to a high polygenic score; affected individuals do not present signs of CESD until childhood or adulthood.13 Main features of CESD are abdominal distension, esophageal varices, hepatosplenomegaly, coronary artery disease, diarrhea, stroke, malnutrition, and failure to thrive.5Bernstein et al.6 found that hepatic dysfunction and dyslipidemia were the most frequent signs at all ages in CESD, and hepatomegaly and hepatosplenomegaly are the most frequent signs of disease.

Regarding treatment, lipid-lowering therapy with statins seems ineffective for patients with hepatic disorder, as it increases the cholesteryl ester supply to hepatocytes,13,14 thus worsening the disease.15 However, it is the best option to reduce low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) concentrations, cholesterol synthesis and cardiovascular risk.16 In addition, in LAL-D there is an impaired regulation of ABCA1 gene, thus leading to low concentrations of HDL-C.17 Enzyme replacement therapy with sebelipase alpha enables patients to achieve physiological levels of LAL and can prevent cholesteryl ester and triglycerides accumulation.4,18

Some countries developed guidelines to increase awareness and diagnosis of LAL-D.19 In our country,19 LAL-D was included as lysosomal disease and we follow a diagnostic algorithm (Central Illustration), previously used as a screening tool.20 In this article, we describe the screening methods to detect LAL-D in children and adults in a tertiary lipid clinic. We searched for liver disease, hepatic dysfunction plus dyslipidemia, or lipid changes alone. This screening method was based on previous diagnosis of patients with confirmed LAL-D, selected from a postmortem index case with affected family members at the Reference Center for Inborn Errors of Metabolism (CREIM), Universidade Federal de São Paulo.20

The aim of this study was to investigate the prevalence of LAL-D in an outpatient population of patients with dyslipidemias, hepatic dysfunction or both based on previous confirmed cases that used this screening method.

 Methods Study design

This is a retrospective cross-sectional study, with data obtained from medical records (paper and/or electronic records) of adult and pediatric patients from the outpatient clinics of the Lipids, Atherosclerosis and Vascular Biology Section, Cardiology Division, Universidade Federal de São Paulo. The study protocol was approved by our local ethics committee (research ethics committee of UNIFESP, CAAE: 51989915.2.00005505), and data were collected for 18 months.

We reviewed 2,000 consecutive medical records from adult patients and 18 pediatric patients between August 2017 and February 2019. Among those, there were 92 patients with definite/probable diagnosis of familial hypercholesterolemia (Dutch Lipid Clinic Network), but with negative results for a panel of genes for FH (LDLR, APOB, PCSK9, LDLRAP-1) plus the LIPA gene,21 and 168 patients with liver disease. Clinical and laboratory data from these patients were obtained to selectively screen for LAL-D.

 Inclusion criteria

Adult, non-obese (body mass index, BMI<30 Kg/m2), with LDL-C >160mg/dL, high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) <40 mg/dL in men and <50 mg/dL in women, and with persistently high alanine aminotransferase (ALT) and/or aspartate aminotransferase (AST) (>1.5 x the upper limit of normality), with or without hepatomegaly.

Patients with steatosis by ultrasound or mixed or microvesicular steatosis observed on liver biopsy.

Patients with suspected familial hypercholesterolemia (FH) using the Dutch Lipid Clinic Network criteria22 without confirmation of FH causing variants on sequencing, or with variants in LIPA gene, with ALT and/or AST >1.5x ULN.

Pediatric patients (<18 years-old) with hepatomegaly on physical examination or imaging tests (with or without splenomegaly), high LDL-C (>130 mg/dL), low HDL-C (<40 mg/dL), or persistently elevated ALT and/or AST (>1.5x upper limit of normality), and/or signs of fibrosis, cirrhosis, or evidence of storage disease on liver biopsy.

Patients with suspicion of Wilson Disease without neurological involvement.

Exclusion criteria

Adult patients with steatosis or cirrhosis of known etiology;

Patients with viral hepatitis and/or alcoholic liver disease;

Patients with known drug toxicity.

 Database organization

The data collected included patient identification, demography, presence of cardiovascular risk factors, including dyslipidemia, habits, history of cardiovascular disease, liver diseases, metabolic syndrome, and other comorbidities. Clinical and anthropometric parameters were recorded. Laboratory variables included total cholesterol, HDL-C, LDL-C, non-HDL-C, triglycerides (TG), ALT, AST, blood glucose, thyroid-stimulating hormone (TSH), and free thyroxin (T4). In subjects taking statins, LDL-C was corrected by the statin intensity, as described below.23 Liver and spleen ultrasounds, as well as hepatic biopsies were recorded for abnormalities, when available. Previous laboratory tests or genetic confirmation for LAL-D were also recorded when available. For pediatric patients a separate database was made.

 Treatment with statins

The values of total- and LDL-C of adult patients were corrected by the intensity of statin treatment, multiplying the total- and LDL-C value by a factor: high-intensity, LDL-C reduction >50% (x 2.00); moderate-intensity, LDL-C reduction between 30-50% (x 1.65), and low-intensity, LDL-C reduction ~ 30% (x1.43).23 High intensity treatment was defined as atorvastatin 40/80 mg, rosuvastatin 20/40mg, simvastatin 20/40 mg plus ezetimibe; moderate intensity, atorvastatin 10/20 mg, rosuvastatin 5/10 mg, simvastatin 10/40 mg; low-intensity as other statins or lower doses.

 Biochemical diagnosis

Subjects who met the inclusion/exclusion criteria were invited to collect blood samples for determination of LAL activity (Figure 1). These patients signed the written informed consent form prior to blood collection.

– Profile of patients with dyslipidemia from medical records according to intensity of statin treatment (a) and those with inclusion criteria for LAL-D (b). High intensity: atorvastatin 40/80 mg, rosuvastatin 20/40mg, simvastatin 20/40 mg + ezetimibe 10 mg; moderate intensity: atorvastatin 10/20 mg, rosuvastatin 5/10 mg, simvastatin 10/40 mg; low-intensity: other statins or lower doses.

LAL enzymatic activity assay was obtained from dried blood spot (DBS) samples according to the fluorimetric technique described by Hamilton et al.24 and performed at Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo (LEIM) – UNIFESP, which used the reference range of >0.024 nmol/punch/h. The assay was performed in duplicates, with positive and negative controls.

 Genetic study for detection of familial hypercholesterolemia

DNA extraction, next-generation sequencing and variant detection analyses were performed according to Fonzar et al.21

 Data analysis

Descriptive statistics were used in this research. Categorical variables were described as frequencies and percentages; numerical data were presented as means ± standard deviation (SD) or median and interquartile range (IQR) as appropriate. Normality was tested by Kolmogorov-Smirnov test. Significance was established at a P-value < 0.05. All statistical analyses were performed using the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, Chicago, IL) version 22.

 Results Descriptive analysis of the adult population

Characteristics of the adult population are presented in Table 1 and included the FH adult cohort. Of the 2,000 patient records evaluated, 893 individuals (44.6%) were receiving high-intensity treatment, 529 (26.4%), moderate intensity, four (0.2%), low-intensity, and 574 (28.8%) were not taking statins. Of those, 21 patients had the inclusion criteria for LAL activity screening (Figure 1), 14 in high-intensity treatment, four in moderate-intensity, and three not taking statins.

– Clinical and laboratory characteristics of the adult population
Characteristic N=2,000
Age, years 67 (60-74)
Sex Male/Female, % 613 (30.65) / 1387 (69.35)
Race, %
Caucasian 1022 (51.10)
Black 197 (9.85)
Mixed 781 (39.05)
Hypertension, % 1528 (76.4)
Dyslipidemia, % 1615 (80.75)
Diabetes, % 778 (38.9)
Metabolic syndrome, % 595 (29.75)
Statin intensity, %
High-intensity 893 (44.6)
Moderate-intensity 529 (26.4)
Low-intensity 4 (0.2)
No statin 574 (28.8)
Myocardial infarction 215 (10.75)
Smoking, %
Current 110 (5.50)
Former 467 (23.25)
BMI, kg/m2 30.88 (24.65-40.00)
Total cholesterol, mg/dL 227 (152-279)
HDL-C, mg/dL 49 (40-59)
LDL-C, mg/dL 156 (115-204)
Non-HDL-c, mg/dL 121 (96-155)
Triglycerides, mg/dL 124 (99-177)
AST, U/L 48 (48-60)
ALT, U/L 49 (49-61)
Glucose, mg/dL 102 (94-118)
HbA1c, % 6.10 (5.70-6.70)
TSH, mUI/L 2.65 (1.76-4.21)
T4, ng/dL 1.30 (1.14-1.51)

Categorical variables are expressed as frequencies (%); numerical variables expressed as median (IQR); correction for intensity of treatment was made multiplying total cholesterol or LDL-C by 1.43 (low-intensity), 1.65 (moderate intensity) and 2.00 (high intensity). HDL-c: high-density lipoprotein cholesterol; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol; ALT: alanine aminotransferase; AST: aspartate aminotransferase; IQR: interquartile range; BMI: body mass index; TSH: thyroid-stimulating hormone; T4: free thyroxin.

The cohort of 92 patients with definite or probable diagnosis of FH (Dutch Lipid Clinic Network) was also selected.22 Among those, we found two patients with variants of uncertain significance (VUS) on LIPA gene, normal liver enzymes and no signs of hepatic steatosis. These patients were not screened for LAL activity.

 Descriptive analysis of pediatric patients with criteria for LAL-D

Eighteen patients were retrieved from the medical records of our lipid outpatient clinic and the CREIM (Table 2). Of those, eight (44%) had LDL-C above target, and three (17%) had HDL-C <40 mg/dL; in nine patients, AST and/or ALT were high. All criteria were present in five (28%) patients. One of these patients had genetic confirmation for Niemann-Pick disease, another had an inherited mitochondrial disease and were not selected for LAL-D screening.

– Characteristics of children screened for lysosomal acid lipase deficiency
Variable Total (N=18)
Age, years 12 (7-18)
Male/female, % 12 (67)/6 (33)
Race, %
Caucasian 10 (55)
Black 1 (6)
Mixed 7 (39)
Lipid-lowering therapy, %
High-intensity 0 (0)
Moderate-intensity 1 (5)
Low-intensity / no therapy 1 (5)
No statins 16 (90)
Body weight, Kg 38 (26-48)
BMI, Kg/m2 18 (17-19)
Heart rate, bpm 70 (67-76)
Total cholesterol, mg/dL 213 (135-329)
HDL-C, mg/dL 44 (21-64)
LDL-C, mg/dL 152 (67-250)
Non-HDL-C, mg/dL 170 (82-265)
Triglycerides, mg/dL 91 (52-167)
Fasting glucose, mg/dL 88 (77-103)
HbA1c, % 5.5 (4.8-6.3)
AST (U/L) 27 (18-66)
ALT (U/L) 19 (10-62)
CK (U/L) 135 (110-241)
TSH (µIU/L) 3.30 (1.24-6.12)

Categorical variables are expressed as frequencies (%); numerical variables expressed as median (IQR). ALT: alanine aminotransferase; AST: aspartate aminotransferase; BMI: body mass index; HDL: high-density lipoprotein; IQR: interquartile range; LDL: low-density lipoprotein; SD: standard deviation; CK: creatine phosphokinase; TSH: thyroid-stimulating hormone.

 Descriptive analysis of patients with hepatic steatosis

Table 3 presents the characteristics of 168 patients with hepatic steatosis, either by ultrasound or hepatic biopsy. One-hundred and fifty-five (92.26%) patients presented steatosis at ultrasound, parenchymal hepatopathy was found in 12 (7.14%), and hepatic nodule in 1 (0.59%). From these findings we selected patients with corrected LDL-C >160 mg/dL and HDL-C <40 mg/dL in males or <50 mg/dL in females, AST or ALT >1.5x the ULN or hepatic steatosis by imaging methods.

– Distribution of ultrasound findings and/or hepatic biopsy in the participants of the study
Variable N=168
Steatosis (%) 155 (92.26)
Parenchimal hepatopathy (%) 12 (7.14)
Hepatic nodule (%) 1 (0.59)

Categorical variables are expressed as frequencies (%).

Analysis of patients with Wilson Disease without neurological involvement was not performed because there were no subjects with this criterion.

 LAL-activity

From the selected databases, 21 (0.92%) patients had the inclusion criteria for LAL-D screening with LAL activity (three children and 18 adults); mean ALT/AST were, respectively, 83.7 and 96.7 U/L, mean total cholesterol was 248 mg/dL, LDL-C 222 mg/dL, and four had documented hepatic steatosis. Of those, two subjects did not agree to participate, three died, and it was not possible to contact eight patients, including the children. Eight patients signed the written informed consent and collected blood for the assay. Six were women, and two men aging 58-82 years; in 100% ALT was above 1.5 x upper limit of normality, two had hepatic steatosis, and all were taking high-intensity statins. No significant differences were found for patients selected and screened for LAL-D (Supplemental Table S1).

The assay for LAL activity was performed in duplicates plus two positive and two negative controls. Mean LAL activity was normal (0.077 [± 0.03] nmol/punch/h, reference value >0.024 nmol/punch/h). Negative controls presented 0.096 nmol/punch/h and positive controls showed undetectable LAL activity (Table 4).

– Results of lysosomal acid lipase (LAL) activity in enzimatic assay with the Lalistat-2 inhibitor
Sample Well Values Mean SD V% Without - with pmol/punch/L Straight Line 4/11
01 C2 D2 2698.469 2714.956 2706.713 11.658 0.4 332.211 40.991 45.558
02 C3 D3 2794.832 2643.668 2719.250 106.889 3.9 488.673 62.988 73.908
03 C4 D4 2835.840 2881.884 2858.862 32.558 1.1 702.193 92.940 112.511
04 C5 D5 2867.881 2931.860 2899.871 45.240 1.6 651.496 85.885 103.418
05 C6 D6 2707.930 2725.490 2716.710 12.417 0.5 546.769 71.117 84.385
06 C7 D7 2781.802 2832.713 2807.258 36.000 1.3 602.909 78.958 94.490
07 C8 D8 2782.242 2791.745 2786.994 6.720 0.2 608.951 79.848 95.638
08 C9 D9 2824.358 2847.077 2835.718 16.065 0.6 776.723 103.405 125.998
+ Control G10 H10 2693.484 2824.164 2758.824 92.405 3.3 -40.715 -11.371 -21.928
- Control G9 H9 2806.659 2734.641 2770.650 50.924 1.8 729.464 96.769 117.446

Tests were performed in duplicates for each patient and a positive (+ Control) and negative controls (- Control); LAL-activity performed with the inhibitor lalistat-2; Results shown in nmol/punch/h (reference value >0.024 nmol/punch/h).

We tried to find more details of these patients, and a 41-year-old woman, whose LAL activity was previously normal, repeated the test for LAL activity after one of her children had died. LAL activity was 0.00 nmol/punch/h in two further tests. She presented hepatomegaly, hepatic steatosis, confirming LAL-D. Her nine-year-old daughter had hepatosplenomegaly and hepatic steatosis, AST and ALT levels of 55 and 35 U/L, respectively, total cholesterol and LDL-C of 212 mg/dL and 148 mg/dL, respectively; HDL-C 12 mg/dL, non-HDL-C 200 mg/dL, and TG 256 mg/dL. The onset of symptoms occurred at three years old; she presented with intermittent diarrhea, and failure to thrive. At the age of four, her body weight was 16 Kg (z score of −0.56), and her height was 93 cm (z score of −3.0). Liver biopsy showed grade 3 macro- and micro- vesicular diffuse steatosis in 60% of the hepatocytes, enlargement of portal spaces with enlarged micro vacuolized macrophages and hepatocytes. By age nine, she developed progressive hepatosplenomegaly and worsening of diarrheic episodes. She underwent several hospitalizations due to respiratory distress secondary to severe hepatosplenomegaly and died at age nine due to pneumonia and septic shock.

Differential diagnosis of LAL-D for the deceased child included analyzing blood samples and liver biopsies. Three liver biopsies at different hospitals showed macro- and micro-vesicular steatosis, with a pattern similar to that of Niemann-Pick C disease.

Blood samples were collected but were analyzed post-mortem. The tests were designed to assess enzyme activity associated with various lysosomal storage disorders. Chitotriosidase activity was measured in plasma, using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); sphingomyelinase activity was assessed in leukocytes to rule out Niemann-Pick disease; beta-glucosidase activity was measured in leukocytes to evaluate for Gaucher disease; a comprehensive panel obtained by dried blood spots tested for chitotriosidase, sphingomyelinase, beta-glucosidase, and lysosomal acid lipase activity, providing a broader assessment for lysosomal storage diseases. All the tests, except for LAL-D were within the normal range. Undetectable enzymatic activity (0 nmol/punch/h) was observed (reference range >0.024 nmol/punch/h), confirming the diagnosis of LAL deficiency. These enzyme assays were essential in differentiating LAL-D from other lysosomal storage disorders with overlapping clinical features.

Her autopsy revealed disseminated lipid and cholesterol crystal accumulation in the liver, spleen, bone marrow, and gastrointestinal tract, and severe steatosis with lipid-filled histiocytes. No adrenal calcification was observed. This girl was the index case of her family, second of five siblings from the same mother, who has a son (unaffected) and a daughter (this patient) from her first marriage, and three other sons (all affected), from her second marriage. Both marriages were nonconsanguineous unions, and both fathers are not related.

Screening of the three male half-brothers was performed, and they presented LAL activity of 0.0087 nmol/punch/h, 0.00 nmol/punch/h, and 0.00 nmol/punch/h, confirming the diagnosis of LAL-D. Their case reports have been previously published.20 We further performed genetic tests of the mother and three half-brothers of the index case obtaining DNA extracted from saliva. Genetic sequencing (NGS) using a panel that included the LIPA gene did not find any pathogenic variants, not allowing to discard changes in the non-coding region of the genes analyzed, such as regulatory regions, intergenic and intronic sequences distant from the exons.

 Discussion

In this study we investigated the prevalence of LAL-D in an outpatient population of subjects with dyslipidemias, and used an algorithm based on previously confirmed clinical cases that were diagnosed using the enzymatic assay for LAL activity.

The disease is reported to be very rare, with cholesteryl ester accumulation in tissues like liver, spleen, bone marrow, adrenal glands, lymph nodes, intestinal villi, vascular wall, and skeletal muscles.5,6 A more severe form is recognized in children, and less pronounced manifestations can be seen in adults, depending on LAL enzymatic activity.4 In our study, in the lipid clinic, in 2,018 individuals we found 21 (0.92%) at high-risk for LAL-D, and among the eight that were initially tested for LAL activity, we could not confirm any case. However, a post-mortem positive test in a child (index case) confirmed the mother and three affected half-brothers.

The Update of Brazilian Guidelines for Dyslipidemia and Atherosclerosis Prevention19 recognize the gap in the diagnosis of the disease and suggests an algorithm to screen for LAL-D (Central Illustration). Individuals with LAL-D experience great burden of disease, and according to their reports, symptoms are constant, including abdominal pain, hepatosplenomegaly, headache, weakness, pruritus, skin lesions.20In children, the phenotype can be present in the first months of life, with abdominal enlargement, failure to thrive, hepatomegaly or hepatosplenomegaly, hepatic steatosis, and adrenal calcification.20,25

There is a huge spectrum of manifestations of the disease of late onset. Symptoms can be mild and not be perceived, leading to underdiagnosis. On the other hand, in the most severe cases, liver alterations can lead to hepatic cirrhosis and death.5 A higher cardiovascular risk, with history of atherosclerotic cardiovascular disease or ischemic stroke can be present.26

Lipid abnormalities are a common feature in dyslipidemias of different etiologies, either genetic or secondary to certain drugs or comorbidities, such as diabetes, obesity, metabolic syndrome.16,17 Hypercholesterolemia that does not respond to conventional lipid-lowering therapy, with mild elevation of liver function enzymes, can raise suspicion of LAL-D.27In FH, with definite or probable criteria, in whom pathogenic or probably pathogenic variants are detected, phenocopies, such as LAL-D must be ruled out, because appropriate diagnosis and timely treatment can restore or prevent liver alterations. Chora et al.27 described cases of LAL-D in a cohort of patients with suspected FH (n=492), presenting severe dyslipidemia, with negative genetic diagnosis for FH genes, or with VUS. The analyses of their families were also performed. In that study the authors identified four children with LAL-D.27

Another way to screen LAL-D is by the presence of metabolic syndrome with liver abnormalities in hepatic biopsy28 or ultrasound suggestive of MASH or MAFLD and, rarely, in Wilson’s disease without neurological signs.

In this study we searched for LAL-D in adult patients (2,000 subjects) assisted in a reference center for dyslipidemias, including patients with suspected FH (N=92), those with hepatic disease (N=168), and in 18 children.

Early and accurate diagnosis of LAL-D is crucial to institute appropriate and timely treatment. Specific assays for LAL-D should be available not only for research, but also in the public health system.

Some countries in Latin America developed algorithms to diagnose LAL-D,29,30 and Brazil has included the search for LAL-D in the Update of Brazilian Guidelines for Dyslipidemia and Atherosclerosis Prevention.19 However, implementation of this measure is lacking.

Mapping human genes opened new perspectives for the diagnosis of inherited diseases and allowed preventive and therapeutic strategies.

There remain many questions to be answered regarding diagnosis of LAL-D. Disease awareness, early diagnosis and treatment can refrain atherosclerosis and hepatic dysfunction progression. In case reports of affected individuals, the experience with enzyme replacement therapy has shown considerable improvement in symptoms and quality of life, with few adverse events and a positive effect for patients and care givers. The greatest achievement was the increase in life expectancy.31,32

To date there are not sufficient studies on prevalence of LAL-D in Brazil, and the disease remains underdiagnosed. LAL-D has signs and symptoms that are seen in other diseases that affect the liver, spleen, and the lipid profile. LAL activity is variable and the different phenotypes, Wolman disease and CESD, have distinct presentation, disease progression and mortality.

 Study strengths and limitations

Strenghts: this study was performed in a reference center for dyslipidemias, used a previously described screening algorithm, and included 2,018 patients. LAL-D is a rare disease, but presents common manifestations, such as high LDL-C, low HDL-C, increased leves of AST/ALT, and hepatic steatosis, which are common features in a lipid clinic.

Limitations: the study was retrospective, liver enzymes were obtained under statin treatment, and LAL activity was not performed in leukocytes. We did not test discrimination or accuracy of the algorithm. In fact, LAL-D is much more an exclusionary diagnosis, when testing for FH or other genetic dyslipidemias.

 Conclusion

Screening for LAL-D in a reference center for dyslipidemias using an algorithm including clinical and laboratory measures, selected 21 high-risk patients. However, enzymatic LAL activity did not confirm the disease in eight tested subjects. From a suspected mother, a child had a post-mortem confirmation of LAL-D, that further enabled the diagnosis of the mother and three affected half-brothers.

Identifying LAL-D remains a challenge, and this algorithm may assist in selecting high-risk patients for LAL-D screening. Nevertheless, this algorithm has not been validated for accuracy or discriminatory ability. Given its rarity and overlapping features with other genetic dyslipidemias, LAL-D is primarily a diagnosis of exclusion, often considered when other conditions have been ruled out.

This article is part of the thesis of master submitted by Zenia Brasil, from Universidade Federal de São Paulo.

This study was approved by the Ethics Committee of the Universidade Federal de São Paulo under the protocol number 58743616.8.0000.5505. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.

The authors did not use any artificial intelligence tools in the development of this work.

Data can be available upon request.

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This study was partially funded by Alexion Pharmaceuticals.