: Atividade Anti-Inflamatória In Vivo do D-Limoneno em um Modelo de Hipertensão Pulmonar Induzida por Monocrotalina em Ratos: Implicações à Função Cardíaca

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Arquivos Brasileiros de Cardiologia

Arq. Bras. Cardiol.

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Artigo Original

Atividade Anti-Inflamatória In Vivo do D-Limoneno em um Modelo de Hipertensão Pulmonar Induzida por Monocrotalina em Ratos: Implicações à Função Cardíaca

Teixeira-Fonseca

Jorge Lucas

Concepção e desenho da pesquisa e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados e Análise estatística Redação do manuscrito ¹ Orts

Diego Jose Belato y

Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados e Análise estatística Redação do manuscrito ¹

0000-0002-1787-4535

Silva

Polyana Leal da

Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados e Análise estatística ¹ Conceição

Michael Ramon de Lima

Obtenção de dados ¹

0000-0001-8972-749X

Hermes

Hernan

Obtenção de dados ² ³ Prudencio

Carlos R.

Obtenção de dados ² ³

0000-0002-2690-912X

Roman-Campos

Danilo

Concepção e desenho da pesquisa e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Análise e interpretação dos dados e Análise estatística Obtenção de financiamento Redação do manuscrito ¹

1 Universidade Federal de São Paulo

São Paulo

Brasil Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP – Brasil 2 Instituto Adolfo Lutz

São Paulo

Brasil Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, SP – Brasil 3 Universidade São Paulo

São Paulo

Brasil Universidade São Paulo, São Paulo, SP – Brasil

Correspondência: Danilo Roman-Campos • Universidade Federal de São Paulo – Rua Botucatu, 862, ECB, 7º andar. CEP 04023-062, São Paulo, SP – Brasil; E-mail: drcampos@unifesp.br Editor responsável pela revisão:

Marina Okoshi

Potencial conflito de interesse:

Não há conflito com o presente artigo.

13 12 2024

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121 12

e20240195

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Figura Central : Atividade Anti-Inflamatória In Vivo do D-Limoneno em um Modelo de Hipertensão Pulmonar Induzida por Monocrotalina em Ratos: Implicações à Função Cardíaca A hipertensão pulmonar causa inflamação no coração e leva a um remodelamento funcional e estrutural do tecido. O componente natural D-limoneno administrado in vivo atenuou a resposta inflamatória no coração dos ratos no modelo de hipertensão pulmonar induzida por monocrotalina e melhorou a função e a estrutura do coração.

Resumo Fundamento

O D-Limoneno (D-L) é o principal monoterpeno monocíclico com propriedades anti-inflamatórias encontrado em plantas citrus. A Hipertensão pulmonar (HP) pode causar disfunção cardíaca direita e aumentar o risco de morte, em parte devido à resposta inflamatória no coração.

Objetivo

Avaliar o possível efeito protetor do D-L sobre a função cardíaca em um modelo de HP induzida por Monocrotalina (MCT) (HP-MCT) em ratos.

Métodos

Monitoramento eletrocardiográfico in vivo. A técnica de coloração tricromo de Masson foi empregada para verificar fibrose no coração. A função de contratilidade do tecido atrial foi estudada usando o banho de órgãos isolados. O PCR quantitativo em tempo real foi aplicado para quantificar inflamação no ventrículo direito.

Resultados

O grupo HP-MCT mostrou remodelamento estrutural e elétrico do coração, com a presença de fibrose no tecido cardíaco e alterações eletrocardiográficas in vivo. O tratamento com D-L preveniu em parte o desenvolvimento de fibrose tecidual e o aumento na duração da onda P no grupo HP-MCT. As velocidades de contração e de relaxamento do átrio direito e do átrio esquerdo isolado foram aceleradas nos animais CTR e HP-MCT tratados com D-L. Finalmente, o D-L foi capaz de prevenir a expressão anormal das citocinas inflamatórias chave, interleucina 1-β, interleucina 6 e fator de necrose tumoral α, no ventrículo direito dos animais do modelo HP-MCT. D-L foi capaz de aumentar a produção da citocina anti-inflamatória interleucina-10.

Conclusão

Nossos resultados mostraram que a administração in vivo de D-L preveniu em parte o remodelamento molecular, estrutural e funcional do coração no modelo HP-MCT com atenuação da reposta inflamatória no coração.

Hipertensão Pulmonar Anti-Inflamatórios Produtos Biológicos

Fundação do Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo

2021/05584-7

Fundação do Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo

2020/14635-1

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

304257/2020-6

FAPESP

# 2022/14133-1

FAPESP

# 2023/04603-03

FAPESP

# 2022/07256-0

Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado por FAPESP, projetos números 2021/05584-7, 2020/14635-1 e CNPq, projeto número 304257/2020-6 e parcialmente financiado pela FAPESP, projeto número 2023/04603-03 e 2022/07256-0.

Introdução

A Hipertensão pulmonar (HP) é uma doença crônica e multifatorial, caracterizada por um remodelamento progressivo do leito arterial pulmonar, resultando em disfunção da célula endotelial, proliferação anormal das células do músculo liso da artéria pulmonar, e presença de células inflamatórias na túnica adventícia.¹ Essas alterações levam a um aumento da resistência vascular pulmonar e na pressão arterial pulmonar média.² Em estágios mais avançados da HP, pode ocorrer uma sobrecarga de pressão sobre o ventrículo direito, contribuindo para hipertrofia e dilatação do coração direito e, eventualmente, a uma dificuldade de se manter o débito cardíaco.³

A HP induzida por Monocrotalina (MCT) (HP-MCT) em ratos é o principal modelo pré-clínico usado para se compreender a fisiopatologia da HP em humanos.⁴ A HP-MCT reproduz várias características do coração direito observadas em pacientes com comprometimento da função cardíaca secundário à HP, incluindo remodelamento elétrico e estrutural do miocárdio.^1,5,6

Ao longo do curso da HP, lesões no miocárdio podem comprometer o sistema de condução elétrica, com o risco de desenvolvimento de arritmias, tanto em humanos como no modelo de HP-MCT em ratos.^7-10 Estudos prévios sugeriram que vias apoptóticas, oxidativas e inflamatórias exercem um importante papel na patogênese da doença cardíaca atrial e ventricular observada na HP-MCT.^11-16 Apesar de avanços significativos nas terapias farmacológicas¹⁷ e no manejo clínico das doenças, a probabilidade de sobrevivência dos pacientes com HP continua baixa.¹⁸ Portanto, é importante o desenvolvimento de novas terapias farmacológicas que visem reduzir o remodelamento eletromecânico do coração secundário à HP.

O D-Limoneno (4-isopropenil-1-metilciclo-hexeno), ou D-L, é um monoterpeno monocíclico encontrado predominantemente em óleos extraídos da casca de frutas cítricas, tais como limão, laranja e tangerina.¹⁹ Estudos mostraram que o D-L possui propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes.^20-22 Além disso, o D-L foi capaz de atenuar parte do remodelamento morfológico do coração no modelo de HP-MCT em ratos,²³ embora os autores não tenham avaliado a função cardíaca nem o possível mecanismo cardioprotetor envolvido. Nesse sentido, especulamos que o D-L poderia reduzir a resposta inflamatória no coração e prevenir o desenvolvimento de remodelamento funcional e estrutural do tecido cardíaco após a administração de MCT em ratos.

Métodos Animais

Todos os procedimentos de manipulação animal foram aprovados pela CEUA (Comissão de Ética no Uso de Animais) da Universidade Federal de São Paulo (#5438060923). Ratos pesando em torno de 100 g foram obtidos do CEDEME (Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia) e alojados em instalações para cuidado animal em um ciclo claro/escuro de 12 horas, com alimento e água ad libitum.

Delineamento experimental

Os ratos foram separados aleatoriamente em quatro grupos: 1) grupo controle (CTR): os ratos foram tratados com 1mL/Kg/dia de óleo de milho (veículo); 2) grupo MCT: os ratos receberem uma dose única de MCT 50mg/Kg (SIGMA Chemical Co. St. Louis, MO. EUA), via intraperitoneal (i.p.);^7-10 3) CTR+D-L: os ratos receberam 300 mg/Kg dia de D-L (SIGMA Chemical Co. St. Louis, MO, USA) diluído em óleo de milho; 4) MCT+D-L: após o tratamento com MCT (50mg/Kg, i.p.), os ratos receberam 300 mg/Kg/dia de D-L diluído em óleo de milho. Tratamentos com veículo e D-L foram administrados oralmente (gavagem) por 18-20 dias consecutivos, dois dias após a administração de MCT. Para evitar interferência com metabolismo do MCT, o tratamento com D-L foi iniciado dois dias após a injeção do MCT.²⁴

Experimentos nos átrios direitos e esquerdos isolados

Os átrios direitos e esquerdos foram cortados perpendicularmente e foram colocados em uma cuba para órgãos isolados contendo solução de Tyrode (em mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl₂, 1,0 MgCl₂, 0,33 NaH₂PO₄, 11 Dextrose e 5 HEPES que foi continuamente gaseificado com O₂ 99,9% O₂. As extremidades dos átrios foram suspensas horizontalmente por ganchos de aço inoxidável e equilibrados sob uma tensão de repouso de 0,5 gf (4,9 mN) por no mínimo 40 minutos. Somente o átrio esquerdo foi submetido a estímulo em campo elétrico (3 Hz, 100 V, 0,5 ms). A contração atrial foi normalizada usando o programa OriginLab.

Exame histopatológico

Os corações foram removidos da cavidade torácica e lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em seguida, foram fixados com paraformaldeído 4% por 24 horas, desidratado com etanol, lavados com xileno e embebidos em parafina. Os blocos de tecido fixados em parafina foram seccionados a uma espessura de 5 μm e desparafinizados por submersão em xileno, seguido de reidratação com álcool. As secções foram coradas com tricromo de Masson, seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, as imagens foram adquiridas por um microscópio ótico (Leica DM4000B; Leica Microsystems). A área de fibrose do miocárdio foi quantificada usando o programa Image J (NIH, Bethesda, MD, USA).⁸

Eletrocardiograma de superfície

Os ratos foram sedados com isoflurano 1,5-2,0% (Isoforine®, Cristália). Os exames eletrocardiográficos foram realizados em um aparelho ECG-PC versão 2,07 ^®-TEB antes do início dos tratamentos e no último dia. A derivação II foi usada para calcular a duração da onda P, o complexo QRS, intervalos PR, intervalo QT e frequência cardíaca. Valore do intervalo QT foram corrigidos usando a fórmula QTc=QT/√RR. Todos os traçados eletrocardiográficos foram analisados offline. Para cada traço, as medidas foram tomadas em um minuto (média) de registro.

Extração de RNA e análise de PCR Quantitativo em Tempo Real (RT-qPCR)

O RNA total foi extraído do tecido do ventrículo direito usando o reagente TRIzol LS (Life Technologies, Paisley, Reino Unido). O cDNA foi sintetizado usando GoScript Reverse Transcription System (Promega, Dübendorf, Suíça) de acordo com as instruções do fabricante. Quatro animais de cada grupo (CTR, MCT, CTR + D-L e MCT + D-L) foram usados para a análise da expressão celular de interleucina-1β (IL-1β), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), e o fator de crescimento transformador beta (TGF-β) por PCR quantitativo em Tempo Real (RT-qPCR) usando primers específicos¹² e o kit GoTaq qPCR Master Mix (Promega). A expressão genética relativa foi normalizada para a expressão endógena de mRNA de β-actina por cada controle representativo.

RT-qPCR foi realizado em um sistema de PCR em tempo real ABI 7500 Fast real-time PCR (Applied Biosystems, Waltham, MA) com as seguinte condições: desnaturação inicial (5 min 95°C); desnaturação por 40 ciclos × 15 segundos à 95°C, anelamento/extensão do primer por 60 segundos a 60°C. A fluorescência foi registrada durante a etapa de anelamento/extensão em cada ciclo. Realizamos duas repetições técnicas para cada citoquina por grupo para avaliar a Quantificação Relativa (QR).²⁵

A QR de um gene alvo em comparação a um gene de referência foi calculada de acordo com a equação QR = Eficiênciaalvo∆Ct alvo (controle - amostraEficiênciareferência∆Ct referência (controle - amostra).

Análise estatística

Todos os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média. A normalidade da variável dependente foi testada com o teste de Shapiro-Wilk test. Comparações entre os grupos foram realizadas usando a análise de variância de uma via ou de duas vias, e o teste de Tukey para comparação múltipla. O nível de significância para rejeitar a hipótese nula foi p<0,05. O número de animais foi representado por (N). Os dados foram analisados no Excel ® (Microsoft, EUA) e Origin 8,0^® (OriginLab, EUA).

Resultados Administração <italic>in vivo</italic> de D-L não impede o comprometimento no ganho de peso induzido pelo MCT em ratos jovens

A administração de MCT causa alterações no ganho de peso em ratos.⁸ Assim, os animais foram pesados no início e no final do experimento. Um aumento no peso corporal foi observado em todos os grupos no dia 20 em comparação ao basal (Figura 1) (p<0,05). Contudo, 20 dias após a administração de MCT, o peso corporal dos animais dos grupos MCT e MCT+D-L estava reduzido em comparação aos grupos CTR e CTR+D-L, respectivamente.

Figura 1 – Evolução do peso corporal ao longo do tempo. O peso corporal foi medido nos animais Controle (CTR), animais tratados com Monocrotalina (MCT), CTR + 300 mg/Kg/dia de D-Limoneno (D-L), e MCT + 300 mg/kg/dia de D-L no dia 0 e no dia 20. Dados são expressos em média ± erro padrão da média; p<0,05, ANOVA de duas vias (two way) para medidas repetidas seguido do pós-teste de Tukey, %comparando dia 0 e dia 20 com seu respectivo controle, *comparando CTR com MCT no dia 20, &comparando CTR 300 mg D-L com MCT 300 mg D-L no dia 20; N=4-6.

Remodelamento estrutural e elétrico cardíaco causado pelo MCT é parcialmente prevenido pela administração de D-L em ratos jovens

O remodelamento estrutural do coração é um marcador de HP-MCT em ratos.^7-10 As medidas do peso do coração, do ventrículo direito, do átrio direito, do átrio esquerdo, da razão entre ventrículo direito e do comprimento da tíbia, e do índice de Fulton mostrou aumentos significativos no grupo MCT em comparação ao CTR (Figura 2A-F). Ainda, o peso médio do átrio esquerdo e o índice de Fulton foram mais altos nos animais MCT+D-L em comparação aos animais CTR+D-L (Figuras 2D e 2F).

Figura 2 – Alterações morfológicas no coração. Grupos experimentais são Controle (CTR), Monocrotalina (MCT), CTR + 300 mg/Kg/dia de D-Limoneno (D-L), e animais tratados com MCT + 300 mg/Kg/dia de D-L. (A) Peso do coração. (B) Peso do Ventrículo Direito. (C) Peso do átrio direito. (D) Peso do átrio esquerdo. (E) Peso do ventrículo direito normalizado pelo comprimento da tíbia. (F) Índice de Fulton. Dados expressos em média ± erro padrão da média p<0,05, ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Tukey *comparando CTR a MCT e & comparando CTR+D-L a MCT + D-L; N=4-5.

Já está bem documentado que um aumento na fibrose cardíaca é comumente observado nos animais tratados com MCT.^11-16Assim, foram realizadas análises histológicas e os resultados para o ventrículo direito e esquerdo são ilustrados na Figura 3A. Os animais MCT apresentaram aumento na fibrose (Figuras 3B e 3C) em ambos os ventrículos, enquanto o tratamento com D-L atenuou a fibrose em ambos.

Figura 3 – D-Limoneno (D-L) atenua fibrose no coração. Grupos experimentais são Controle (CTR), Monocrotalina (MCT), CTR + 300 mg/Kg/dia de D-L, e animais tratados com MCT + 300 mg/Kg/dia de D-L. no dia 0 e no dia 20 (A) Seção representativa do ventrículo direito e do ventrículo esquerdo; (B) Fibrose no coração direito; (C) fibrose no ventrículo esquerdo. Dados são expressos em média ± erro padrão da média p<0,05, ANOVA de uma via seguido do teste de Tukey, @ comparando MCT a todos os outros grupos.

Em seguida, exploramos o perfil eletrocardiográfico dos animais, que está resumido na Figura 4. Na (Figura 4A, i-iv) mostra traçados eletrocardiográficos representativos dos quatro grupos experimentais no dia 20. Como mostrado na (Figura 4B), não foram observadas mudanças na frequência cardíaca, medido como o intervalo RR, nem no complexo QRS (Figura 4D). A administração de MCT causou um aumento na duração da onda P (Figura 4C), e o tratamento in vivo com D-L preveniu o fenótipo (grupo MCT+D-L). Além disso, o intervalo Qt aumentou no grupo MCT em comparação ao grupo CTR (Figura 4D), e o tratamento in vivo com D-L não preveniu o alongamento do intervalo QT.

Figura 4 – Mudanças eletrocardiográficas. (A) Traços representativos do eletrocardiograma na derivação DII para Controle (CTR (i), Monocrotalina (MCT) (ii), CTR + 300 mg/Kg/dia de D-Limoneno (D-L) (iii), e animais tratados com MCT + 300 mg/kg/dia de D-L no dia 0 e no dia 20 (iv). (B) intervalo RR. (C) duração da onda P. (D) Complexo QRS. (E) intervalo QT; dados expressos em média ± erro padrão p<0,05, teste ANOVA de uma via seguido do teste de Tukey, @ comparando grupo MCT a todos os grupos, * comparando CTR a MCT e & comparando CTR+D-L a MCT+D-L. N=4-5.

D-L modula a função atrial direita e esquerda

Uma vez que o tratamento com D-L evitou o remodelamento da onda P, decidimos explorar a função mecânica do átrio direito e do átrio esquerdo. As (Figuras 5A-5E) resume nossos achados dos experimentos sobre contração atrial direita em uma frequência espontânea de batimento. Traçados representativos das contrações espontâneas do átrio direito em todos os grupos são apresentados na (Figura 5A, (i-iv). Uma curva de contração normalizada e sobreposta para todos os grupos está apresentada na (Figura 5A, v). A frequência de batimentos espontâneos mostrou uma tendência de redução no grupo MCT em comparação ao CTR (p=0,07). Um resultado interessante foi que a frequência no grupo MCT foi diferente que a observada no grupo MCT +D-L.

Figura 5 – Mudanças na contração atrial direita. (A) Traços representativos de contração espontânea do átrio direito para o grupo Controle (CTR) (i), animais tratados com Monocrotalina (MCT) (ii) animais CTR tratados com 300 mg/Kg/dia de D-Limoneno (D-L) (iii) e animais MCT tratados com 300 mg/Kg/dia de D-L (iv). Traçados normalizados sobrepostos para todos os grupos experimentais (v). (B) Frequência de batimentos. (C) Pico de amplitude. (D) Tempo para o pico de contração medido como o intervalo entre 10 e 90% para o desenvolvimento da contração. (E) Tempo para o relaxamento medido como o intervalo entre 10 e 90% para o desenvolvimento do relaxamento. Dados expressos como média ± erro padrão da média; p<0,05, ANOVA de uma via seguido do teste de Tukey, #MCT em comparação a MCT+D-L, ++ CTR em comparação a CTR+D-L, N=4.

Não foi observada diferença no pico de amplitude nos grupos MCT e MCT+D-L em comparação a CTR e CTR+D-L. No entanto, ao se comparar CTR com CTR+D-L, houve uma atenuação significativa do pico de amplitude (p<0,05), e uma tendência similar, mas não significativa, ao se comparar MCT com MCT+D-L. Ainda, tecido do átrio direito de ratos tratados com MCT apresentou uma tendência não significativa para um tempo mais lento para o pico de contração em comparação ao CTR (Figura 5C). Por outro lado, o tratamento in vivo com D-L causou uma aceleração significativa (p<0,05) no tempo para o pico e para o relaxamento das curvas de contração do átrio direito em comparação entre CTR e CTR+D-L e entre MCT e MCT+D-L. Ainda, o tempo para o relaxamento foi mais lento no grupo MCT em comparação ao CTR (Figura 5E).

A frequência de batimentos espontâneos do tecido atrial direito estava na faixa de 3Hz; assim, decidimos estudar as propriedades da contração do átrio esquerdo usando uma frequência de estimulação de 3Hz (Figura 6). Uma curva normalizada sobreposta está apresentada na (Figura 6A) para todos os grupos experimentais. A contração atrial esquerda nos ratos MCT mostrou um tempo mais rápido para o pico de contração em comparação ao CTR (Figura 6C), mas não se observou diferença no tempo de relaxamento (Figura 6D). Ainda, os tempos para o pico de contração e relaxamento não foram diferentes entre os grupos CTR+D-L e MCT+D-L. Contudo, tanto o tempo para contração como o tempo para relaxamento foram significativamente mais rápidos nos grupos CTR+D-L e MCT+D-L quando comparados aos grupos CTR e MCT, respectivamente, indicando que a administração in vivo de D-L modula a função atrial esquerda.

Figura 6 – Mudanças na contração atrial esquerda. (A) Traçados normalizados sobrepostos do átrio esquerdo sob frequência de estimulação de 3Hz para o grupo Controle (CTR), animais tratados com Monocrotalina (MCT) animais CTR tratados com 300 mg/Kg/dia de D-Limoneno (D-L) e animais MCT tratados com 300 mg/Kg/dia de D-L. (B) Pico de amplitude. (C) Tempo para o pico de contração medido como o intervalo entre 10 e 90% para o desenvolvimento da contração. (D) Tempo para o relaxamento medido como o intervalo entre 10 e 90% para o desenvolvimento do relaxamento. Dados expressos como média ± erro padrão da média; p<0,05, ANOVA de uma via seguido do teste de Tukey, @ comparando grupo MCT a todos os grupos, #comparando CTR a MCT+D-L, ++comparando CTR a CTR+D-L, N=4.

D-L exerce efeito anti-inflamatório no modelo de rato HP-MCT

O MCT é conhecido por induzir inflamação no coração,¹² o que pode ter um impacto na função e na estrutura do coração.²⁶ Por isso, decidimos avaliar citoquinas inflamatórias chaves que estão alteradas na HP-MCT em ratos. A análise por RT-qPCR do tecido ventricular direito revelou que o grupo MCT apresentou uma expressão mais alta de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF-α) (Figuras 7A-7C) em comparação ao CTR, e o tratamento com D-L preveniu a expressão exacerbada de todas as citocinas pró-inflamatórias testadas, restaurando seus níveis normais de expressão em comparação ao grupo CTR. Em contraste, a expressão das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e TGF-β (Figuras 7D e 7E) estava atenuada no grupo MCT em comparação aos grupos CTR, CTR+D-L e MCT+D-L, e a administração in vivo de D-L melhorou seus níveis na HP-MCT.

Figura 7 – Efeito do D-Limoneno (D-L) sobre a expressão de mRNA de citocinas pró-inflamatórias e citocinas anti-inflamatórias no tecido ventricular direito de ratos no modelo HP-MCT. As expressões de mRNA (100ng) de IL-1β (A), IL-6 (B), TNF-α (C), IL-10 (D) e TGF-β (G) foram analisadas por PCR quantitativo em Tempo real (RT-qPCR). Os resultados são expressos em média ± erro padrão da média; p<0,05, ANOVA de uma via seguido do teste de Tukey, @ comparando grupo MCT a todos os grupos, #comparando MCT a MCT+D-L, &comparando CTR+D-L a MCT-D+L, ++ comparando CTR a CTR+D-L (N = 4 animais por grupo em duplicata).

Discussão

No presente estudo, a administração de MCT (50 mg/Kg) em ratos jovens causou remodelamento mecânico elétrico e estrutural grave do coração, avaliado por achados histológicos, eletrocardiográficos e achados isolados de contração dos átrios. Isso é consistente com estudos prévios usando o modelo HP-MCT.^7-11 Resultados de estudo prévio²³ descreveram que a administração in vivo de D-L melhorou alguns aspectos fibróticos do remodelamento no modelo HP-MCT.

Na HP, a lesão às pequenas artérias pulmonares inclui danos às células endoteliais, espasmo arterial, fibrose e oclusão, e a inflamação é o principal contribuinte.^11,12 Os danos vasculares podem levar à disfunção ventricular direita e à insuficiência cardíaca.²⁶ À medida que a doença progride, a contratilidade anormal no lado direito do coração leva a uma superprodução de espécies reativas de oxigênio e de mediadores inflamatórios no coração.^12,13 Assim, é intuitivo assumir que a administração de moléculas antioxidantes e anti-inflamatórias pode melhorar a função cardíaca na HP. Acredita-se que os processos inflamatórios exerçam um papel relevante na HP no homem e em experimentos.^1-3,12

Pesquisa prévia mostrou que o tratamento oral com D-L (400 mg/Kg/dia) por três semanas consecutivas após a administração de MCT (60 mg/Kg) reduziu o remodelamento estrutural do coração, conforme avaliado pelo índice de Fulton.²³ No entanto, há uma divergência nos resultados do índice de Fulton em nosso estudo, o que pode ser explicado em parte por: I) as linhagens dos animais eram diferentes entre os estudos. Ratos Wistar e Sprague-Dawley respondem de maneira diferente à lesão cardiovascular;²⁷ II) ratos jovens e doses mais baixas de MCT influenciam a evolução do remodelamento cardíaco neste modelo experimental.^28,29

Em nosso estudo, observamos que a administração de D-L atenuou o peso do ventrículo direito normalizado pelo comprimento da tíbia, indicando que a reversão não observada do índice de Fulton pode ser atribuído a um efeito distinto sobre o ventrículo direito e esquerdo (septo). Além disso, o D-L atenuou a fibrose cardíaca atenuada em ambos os ventrículos, o que contribui para a melhora da função ventricular in vivo.

Isso é corroborado pela observação de que o peso dos átrios direitos, que geralmente encontra-se aumentado neste modelo, foi revertido pela administração de D-L, o que não ocorreu com o peso dos átrios esquerdos. O remodelamento dos átrios direitos e esquerdos contribui para a arritmia atrial neste modelo experimental^7-10 e, sendo assim, o D-L tem um efeito benéfico nesse aspecto. Tal fato é sustentado pela análise eletrocardiográfica. Ainda, observou-se que o remodelamento significativo no intervalo Qt não foi revertido pelo D-L, sugerindo que o monoterpeno pode exercer uma habilidade única de modular regiões distintas do coração.

A inflamação é um processo patológico essencial no remodelamento do coração que ocorre no modelo de HP-MCT em ratos.^11,12 Assim, medimos a expressão das principais citocinas envolvidas na fisiopatologia de doenças cardíacas.^11,12 Consistente com estudos prévios,^11,12 nós demonstramos que a expressão de citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF-α) está aumentada no grupo MCT, ao passo que a de citocinas anti-inflamatórias IL-10 e TGF-β está reduzida. D-L exerceu atividade anti-inflamatória ao restaurar os níveis de expressão de citocinas inflamatórias, aumentando o nível de IL-10 e restaurando a expressão de TGF-β.

A IL-10 é uma citocina anti-inflamatória versátil que exerce um papel crucial na regulação de vários aspectos da resposta imune, inflamação, propriedades vasculoprotetoras, e do remodelamento do tecido. A IL-10 é produzida principalmente por linfócitos Th2 durante a inflamação, em que atua suprimindo a produção de várias citocinas pró-inflamatórias.³⁰ A IL-10 ganhou atenção significativa por sua capacidade de suprimir vasculopatia proliferativa e inflamatória.³⁰ A IL-10 inibe inflamação diminuindo a produção das citocinas inflamatórias, exercendo, assim, feitos anti-inflamatórios. Além disso, ativa vias de sinalização que melhoram a expressão de genes anti-inflamatórios.³¹

O processo patológico da HP é caracterizado por níveis séricos anormais de citocinas pró-inflamatórias como IL-1 e IL-6.³² Pacientes com HP geralmente exibem níveis séricos basais elevados de IL-10, sugerindo uma resposta anti-inflamatória protetora à lesão presente.³³ Dessa forma, a IL-10 tornou-se um ponto central em terapias potenciais cujo objetivo é combater fibrose associada à inflamação.³⁴

A IL-10 exerce um papel indireto, mas crucial, em limitar a lesão cardíaca e fibrose. Sua via de sinalização, particularmente por meio de STAT3, promove o recrutamento e a retenção de células progenitoras endoteliais derivadas da medula óssea no local da lesão cardíaca, influenciando, assim, o reparo e a regeneração.^35,36 Muitos dados da literatura sugerem um papel benéfico da IL-10 na HP. Por exemplo, no modelo de HP-MCT em ratos, a administração endovenosa de IL-10 via vetor adenoviral melhorou significativamente as taxas de sobrevida e reduziu a média de pressão arterial pulmonar.³⁰ Ainda, a administração de IL-10 recombinante melhorou a função ventricular, reduziu o remodelamento hipertrófico, atenuou a fibrose cardíaca e a vasculopatia proliferativa, e diminuiu a taxa de mortalidade.³⁷

A expressão sistêmica de IL-10 também melhorou a sobrevida de ratos no modelo HP-MCT, preveniu o desenvolvimento de hipertrofia ventricular direita, hipertrofia medial da artéria pulmonar, reduziu o acúmulo de macrófagos, a proliferação celular vascular, e reduziu os níveis de TGF-β1 e IL-6 no tecido pulmonar, o que é crítico na progressão de HP.³⁸ Consistente com estudos prévios usando modelo de HP-MCT em ratos, um aumento nos níveis de IL-10, induzido por administração específica de IL-10, inibiu significativamente a expressão de IL-1β, IL-6 e TNF-α no ventrículo direito, e atenuou fibrose em ambos os ventrículos direito e esquerdo.³⁰ Em geral, a IL-10 modula a dinâmica da rede de citocinas envolvida no remodelamento cardíaco induzido por HP, exercendo potencialmente seus efeitos em vários locais.

Nossos resultados evidenciaram que o D-L aumentou a expressão de IL-10 no tecido do ventrículo direito. A IL-10 pode estimular a síntese de anticitocinas endógenas e inibir receptores de citocinas pró-inflamatórias, e apresenta propriedades anti-inflamatórias potentes, reprimindo a expressão de IL-1β, IL-6 e TNF-α por macrófagos ativados.³⁹ Um estudo prévio demonstrou que a IL-10, administrada por injeção intramuscular de um vetor viral adeno-associado, exerce vários efeitos preventivos sobre o remodelamento vascular proliferativo e inflamatório na HP, tais como diminuindo o acúmulo de macrófagos, a proliferação celular vascular, e os níveis de TGF-1 e IL-6 no tecido pulmonar.³⁰ Por fim, já foi descrita a capacidade de o D-L modular a reposta inflamatória no coração.⁴⁰

Em concordância com nossos resultados, um estudo prévio¹² relatou que a inflamação esteve presente na evolução da HP e os níveis de mediadores inflamatórios estão aumentados durante a progressão da fase aguda à fase crônica da doença.¹² A IL-1β é uma das primeiras citocinas a se elevarem no modelo experimental de MCT em ratos, e ela está relacionada a arritmias atriais e ventriculares em várias doenças cardíacas.^41,42

O D-L pode aliviar a lesão cardíaca induzida por intoxicação por CCl₄ por meio de seu potencial antioxidante e anti-inflamatório.⁴⁰Além disso, as propriedades anti-inflamatórias do D-L foram demonstradas anteriormente por meio da inibição de NF-κB dependente de redox e de outras citocinas presentes na cascata inflamatória.⁴⁰

Nesse contexto, outros estudos já relataram que o D-L modula a resposta inflamatória do coração.⁴⁰ Em nosso estudo, apresentamos, pela primeira vez, uma análise mais específica e detalhada mostrando que a administração in vivo de D-L é capaz de modular especificamente o status inflamatório do ventrículo direito, que é afetado no remodelamento cardíaco induzido por HP-MCT.

Conclusão

Com base nos resultados, pode-se concluir que a administração in vivo de D-L pode reduzir a formação de fibrose tecidual no modelo de PH-MCT em ratos jovens, como resumido na Figura Central. Além disso, o D-L restaura as mudanças eletrocardiográficas, e aumenta a expressão de citocinas anti-inflamatórias. No geral, o D-L pode ser um promissor agente anti-inflamatório contra a HP e a disfunção cardíaca.

Agradecimentos

Danilo Roman Campos à Fundação do Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, projeto número 2021/05584-7 e 2020/14635-1). Danilo Roman Campos ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, projeto número 304257/2020-6). Jorge Lucas Teixeira da Fonseca é bolsista da FAPESP (# 2022/14133-1). Polyana Leal da Silva é bolsista da FAPESP (# 2023/04603-03). Diego Jose Belato y Orts é bolsista da FAPESP (# 2022/07256-0).

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37. Verma SK, Krishnamurthy P, Barefield D, Singh N, Gupta R, Lambers E, et al. Interleukin-10 Treatment Attenuates Pressure Overload-induced Hypertrophic Remodeling and Improves Heart Function via Signal Transducers and Activators of Transcription 3-dependent Inhibition of Nuclear factor-?B. Circulation. 2012;126(4):418-29. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.112.112185.

Verma

Krishnamurthy

Barefield

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Gupta

Lambers

et al

Interleukin-10 Treatment Attenuates Pressure Overload-induced Hypertrophic Remodeling and Improves Heart Function via Signal Transducers and Activators of Transcription 3-dependent Inhibition of Nuclear factor-?B

Circulation 2012 126 4 418 429

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38. Chen S, Kapturczak MH, Wasserfall C, Glushakova OY, Campbell-Thompson M, Deshane JS, et al. Interleukin 10 Attenuates Neointimal Proliferation and Inflammation in Aortic Allografts by a Heme Oxygenase-dependent Pathway. Proc Natl Acad Sci USA. 2005;102(20):7251-6. doi: 10.1073/pnas.0502407102.

Chen

Kapturczak

Wasserfall

Glushakova

Campbell-Thompson

Deshane

et al

Interleukin 10 Attenuates Neointimal Proliferation and Inflammation in Aortic Allografts by a Heme Oxygenase-dependent Pathway

Proc Natl Acad Sci USA 2005 102 20 7251 7256

10.1073/pnas.0502407102

39. Zhang JM, An J. Cytokines, Inflammation, and Pain. Int Anesthesiol Clin. 2007;45(2):27-37. doi: 10.1097/AIA.0b013e318034194e.

Zhang

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AlSaffar

Rashid

Ahmad

Rehman

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Ahmad

et al

D-limonene (5 (one-methyl-four-[1-methylethenyl]) cyclohexane) Diminishes CCl4-induced Cardiac Toxicity by Alleviating Oxidative Stress, Inflammatory and Cardiac Markers

Redox Rep 2022 27 1 92 99

10.1080/13510002.2022.2062947

41. Monnerat G, Alarcón ML, Vasconcellos LR, Hochman-Mendez C, Brasil G, Bassani RA, et al. Macrophage-dependent IL-1ß Production Induces Cardiac Arrhythmias in Diabetic Mice. Nat Commun. 2016;7:13344. doi: 10.1038/ncomms13344.

Monnerat

Alarcón

Vasconcellos

Hochman-Mendez

Brasil

Bassani

et al

Macrophage-dependent IL-1ß Production Induces Cardiac Arrhythmias in Diabetic Mice

Nat Commun 2016 7 13344

10.1038/ncomms13344

42. Matsushita N, Ishida N, Ibi M, Saito M, Takahashi M, Taniguchi S, et al. IL-1ß Plays an Important Role in Pressure Overload-Induced Atrial Fibrillation in Mice. Biol Pharm Bull. 2019;42(4):543-6. doi: 10.1248/bpb.b18-00363.

Matsushita

Ishida

Ibi

Saito

Takahashi

Taniguchi

et al

IL-1ß Plays an Important Role in Pressure Overload-Induced Atrial Fibrillation in Mice

Biol Pharm Bull 2019 42 4 543 546

10.1248/bpb.b18-00363

Vinculação acadêmica:

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Aprovação ética e consentimento informado:

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de São Paulo (CEUA/UNIFESP) sob o número de protocolo 5438060923. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.

Fontes de financiamento:

O presente estudo foi financiado por FAPESP, projetos números 2021/05584-7, 2020/14635-1 e CNPq, projeto número 304257/2020-6 e parcialmente financiado pela FAPESP, projeto número 2023/04603-03 e 2022/07256-0.

10.36660/abc.20240195i

Original Article

In Vivo Anti-Inflammatory Activity of D-Limonene in a Rat Model of Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension: Implications to the Heart Function

Teixeira-Fonseca

Jorge Lucas

Conception and design of the research and Critical revision of the manuscript for content Acquisition of data Analysis and interpretation of the data and Statistical analysis Writing of the manuscript ¹ Orts

Diego Jose Belato y

Acquisition of data Analysis and interpretation of the data and Statistical analysis Writing of the manuscript ¹

0000-0002-1787-4535

Silva

Polyana Leal da

Acquisition of data Analysis and interpretation of the data and Statistical analysis ¹ Conceição

Michael Ramon de Lima

Acquisition of data ¹

0000-0001-8972-749X

Hermes

Hernan

Acquisition of data ² ³ Prudencio

Carlos R.

Acquisition of data ² ³

0000-0002-2690-912X

Roman-Campos

Danilo

Conception and design of the research and Critical revision of the manuscript for content Analysis and interpretation of the data and Statistical analysis Obtaining financing Writing of the manuscript ¹

1 Brazil Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP – Brazil 2 Brazil Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, SP – Brazil 3 Brazil Universidade São Paulo, São Paulo, SP – Brazil

Mailing Address: Danilo Roman-Campos • Universidade Federal de São Paulo – Rua Botucatu, 862, ECB, 7º andar. Postal Code 04023-062, São Paulo, SP – Brazil E-mail: drcampos@unifesp.br Potential conflict of interest:

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Editor responsible for the review:

Marina Okoshi

Central Illustration : In Vivo Anti-Inflammatory Activity of D-Limonene in a Rat Model of Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension: Implications to the Heart Function Pulmonary hypertension causes inflammation in the heart and leads to structural and functional remodeling of the tissue. The natural compound D-Limonene administered in vivo attenuated inflammatory response in the heart of rats in the monocrotaline-induced pulmonary hypertension model and improved cardiac function and structure.

Abstract Background

D-limonene (D-L) is the major monocyclic monoterpene in citrus plants with anti-inflammatory properties. Pulmonary hypertension (PH) can cause right heart dysfunction and increases the risk of death, partially due to inflammatory response in the heart.

Objective

To evaluate the possible protective effect of D-L on cardiac function in a rat model of monocrotaline-induced PH (MCT-PH).

Methods

Electrocardiogram was monitored in vivo. Masson Trichrome technique was deployed to verify fibrosis in the heart. Contractility function of isolated atrial tissue was studied using organ bath chamber. Real-time quantitative PCR was applied to quantify inflammation in the right ventricle.

Results

The MCT-PH group showed electrical and structural heart remodeling, with the presence of fibrosis in the cardiac tissue and in vivo electrocardiographic changes. Treatment with D-L partially prevented the development of tissue fibrosis and the increase in P wave duration in the MCT-PH group. The contraction and relaxation velocity of isolated right and left atrium were accelerated in CTR and MCT-PH animals treated with D-L. Finally, D-L was able to prevent the abnormal expression of the key inflammatory cytokines (interleukin 1-β, interleukin 6 and tumor necrosis factor-α) in the right ventricle of MCT-PH animals. D-L was able to enhance the production of the anti-inflammatory cytokine Interleukin-10.

Conclusion

Our results showed that in vivo administration of D-L partially prevented the molecular, structural and functional remodeling of the heart in the MCT-PH model with attenuation of the inflammatory response in the heart.

Pulmonary Hypertension Anti-Inflammatory Agents Biological Products

Introduction

Pulmonary hypertension (PH) is a chronic and multifactorial disease, characterized by progressive pulmonary arterial bed remodeling, resulting in endothelial cell dysfunction, abnormal proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells and the presence of inflammatory cells in the tunica adventitia.¹ These changes together lead to an increase in pulmonary vascular resistance and mean pulmonary arterial pressure.² In more advanced stages of the PH, pressure overload in the right ventricle may occur, contributing to hypertrophy and dilation of the right heart and, eventually failure to maintain cardiac output.³

Monocrotaline (MCT)-induced PH (MCT-PH) in rats is the main preclinical model used in understanding the pathophysiology of human PH.⁴ MCT-PH recapitulates several right heart features observed in patients with compromised cardiac function secondary to PH, including electrical and structural remodeling of the myocardium.^1,5,6

During the time course of PH, injuries to the myocardium compromise the electrical conduction system, with a risk for the emergence of arrhythmias, both in humans^5,6 and in the MCT-PH model in rats.^7-10 Previous studies suggested that apoptotic, oxidative and inflammatory pathways are important players in the pathogenesis of atrial and ventricular heart disease observed in the MCT-PH.^11-16 Despite significant advances in pharmacological therapies¹⁷ and clinical management of the disease, the survivability of patients with PH remains low.¹⁸ Therefore, it is important to develop new pharmacological therapies that aim to reduce electromechanical remodeling of the heart secondary to PH.

The D-Limonene (4-isopropenyl-1-methylcyclohexene), or D-L, is a monocyclic monoterpene, predominantly found in oils extracted from the peel of citrus fruits, such as lemon, orange and mandarin.¹⁹ Studies have shown that D-L has anti-inflammatory and antioxidant therapeutic properties.^20-22 Furthermore, D-L was able to attenuate some morphological remodeling of the heart in the rat model of MCT-PH,²³ but the authors did not evaluate cardiac function or the possible cardioprotective mechanism involved. In this sense, we speculate that D-L could reduce cardiac tissue damage and altered heart function induced by MCT-PH.

Thus, the objective of this study was to verify whether in vivo administration of D-L can reduce the inflammatory response in the heart and prevent the development of functional and structural remodeling of the cardiac tissue after administration of MCT in rats.

Methods Animals

All animal handling procedures were approved by the Ethics Committee for Animal Use (CEUA) of the Federal University of São Paulo (#5438060923). The rats weighing ~100g were obtained from the Center for Development of Experimental Models of Biology and Medicine (CEDEME) and housed in institutional animal care facilities on a 12-hour light/dark cycle with food and water ad libitum.

Experimental design

The rats were randomly divided into four groups, as follows: 1) control group (CTR): the rats were treated with 1ml/Kg/day of corn oil (vehicle); 2) MCT group: rats received a single dose of MCT 50 mg/Kg (SIGMA Chemical Co. St. Louis, MO, USA), via intraperitoneal injection (i.p.);^7-10 3) CTR+D-L: rats received 300 mg/Kg/day of D-L (SIGMA Chemical Co. St. Louis, MO. USA) diluted in corn oil; 4) MCT+D-L: after treatment with MCT (50mg/Kg, i.p.), rats received 300 mg/Kg/day of D-L diluted in corn oil. Vehicle and D-L treatments were administered orally (gavage) during 18 to 20 consecutive days, two days after MCT administration. To avoid interference with MCT metabolism, D-L treatment was started two days after MCT injection.²⁴

Experiments in isolated right and left atria

The right and left atria were cut perpendicularly and mounted in a tank for isolated organs containing Tyrode’s solution (in mM): 140 NaCl, 5.4 KCl, 1.8 CaCl₂, 1.0 MgCl₂, 0.33 NaH₂PO₄, 11 Dextrose and 5 HEPES that was continuously gasified with 99.9% O₂. The ends of the atrial were suspended horizontally by stainless steel hooks and equilibrated under a resting tension of 0.5 gf (4.9 mN) for at least 40 minutes. Only the left atrium was subjected to electrical field stimulation (3 Hz, 100 V, 0.5 ms). Atrial contraction was normalized using OriginLab software.

Histopathological examination

The hearts were removed from the thoracic cavity and washed with phosphate-buffered saline (PBS). Afterwards they were fixed with 4% paraformaldehyde for 24 hours, and then dehydrated in ethanol, cleared in xylene and embedded in paraffin. Paraffin-embedded tissue blocks were sectioned at 5 μm thickness and deparaffinized by submersion in xylene, followed by rehydration with alcohol. The sections were stained with Masson Trichrome, according to the manufacturer’s instructions. After staining, images were acquired using an optical microscope (Leica DM4000B; Leica Microsystems). The area of myocardial fibrosis was quantified using Image J software (NIH, Bethesda, MD, USA).⁸

Surface Electrocardiography

The rats were sedated with 1.5-2.0% isoflurane (Isoforine®, Cristália). The electrocardiographic examination was performed on ECG-PC version 2.07 ®-TEB before the treatments were started and on the last day. The lead II electrocardiogram was used to calculate P wave duration, QRS complex, PR intervals, QT interval and heart rate. QT interval values were corrected using the Bazett formula QTc=QT/√RR. All ECG tracings were analyzed offline. For each trait, measurements were taken from an average of 1 min of ECG recording.

RNA extraction and Real-Time Quantitative PCR (RT-qPCR) analysis

Total RNA was extracted from rat right ventricular tissue using TRIzol LS reagent (Life Technologies, Paisley, UK) and cDNA was synthesized using the GoScript Reverse Transcription System (Promega, Dübendorf, Switzerland) according to the manufacturer’s instructions. Four animals from each group (CTR, MCT, CTR + D-L and MCT + D-L) were used for analysis of the cellular expression of interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), and the transforming growth factor beta (TGF-β) by real-time quantitative PCR (RT-qPCR) using specific primers¹² and GoTaq qPCR Master Mix kit (Promega). Relative gene expression was normalized to endogenous expression of β-actin mRNA per each representative control.

RT-qPCR was performed on an ABI 7500 Fast real-time PCR system (Applied Biosystems, Waltham, MA) with the following conditions: initial denaturation (5 min 95°C); denaturation by 40 cycles × 15 sec 95°C, 60 sec 60°C primer annealing/elongation. The fluorescence was recorded during the annealing/elongation step in each cycle. We performed two technical replicates for each of the cytokines per group to evaluate the relative quantification (RQ).²⁵

The RQ of a target gene in comparison with a reference gene was calculated according to the equation RQ = Efficiencytarget∆Ct target (control - sampleEfficiencyreference∆Ct reference (control - sample).

Statistical analysis

All data are presented as mean ± standard error of the mean (S.E.M.). The normality of the dependent variable was tested with the Shapiro-Wilk test. Comparisons between groups were performed using One-way or Two-way analysis of variance, and the multiple comparison Tukey post-test. The level of significance to reject the null hypothesis was p <0.05. The number of animals was represented by (N). Data were analyzed in Excel ® (Microsoft, USA) and Origin 8.0^® (OriginLab, USA).

Results

In vivo D-L administration does not impede MCT-induced compromised body weight gain in young rats

MCT administration causes changes in the body weight gain in rats.⁸ Thus, the animals were weighted at the beginning and at the end of the experiment. An increase in body weight was observed in all groups at 20 days as compared with baseline (Figure 1) (p<0.05). However, at 20 days after MCT administration, the body weight of the MCT animals and the MCT+D-L animals were reduced compared to CTR and CTR+D-L, respectively.

Figure 1 – Time course of body weight. Body weight was measured in control (CTR), monocrotaline (MCT), CTR + 300 mg/kg/day of D-limonene (D-L), and MCT treated animals + 300 mg/kg/day of D-L on day 0 and on day 20. Data are expressed as mean ± S.E.M.; p<0.05, two way-ANOVA for repeated measurements followed by Tukey test, %comparing 0 days to 20 days within your respective control, *comparing CTR to MCT at 20 days, &comparing CTR 300 mg D-L to MCT 300 mg D-L at 20 days; N=4-6.

Structural and electrical heart remodeling caused by MCT is partially prevented by D-L administration in young rats

Structural remodeling of the heart is a marker of MCT-PH in rats.^7-10 Measurement of the weight of the heart, right ventricle, right atrium, left atrium, ratio between right ventricle and tibial length, and Fulton index showed significant increases in the MCT group when compared to the CTR (Figures 2A-2F). Also, the average weight of the left atrium and the Fulton index were higher in the MCT+D-L animals when compared to the CTR+D-L (Figures 2D and 2F).

Figure 2 – Morphological changes in the heart. Experimental groups are control (CTR), monocrotaline (MCT), CTR + 300 mg/kg/day of D-limonene (D-L), and MCT treated animals + 300 mg/kg/day of D-L. (A) Heart weight. (B) Right ventricle weight. (C) Right atrium weight. (D) Left atrium weight. (E) Normalized right ventricle weight by tibial length. (F) Fulton index. Data are expressed as mean ± S.E.M. p<0.05, One Way-ANOVA followed by Tukey test *comparing CTR to MCT and &comparing CTR+D-L to MCT + D-L. N=4-5.

It is well documented that increased heart fibrosis is commonly found in MCT treated animals.^11-16 Thus, histological analyses were performed and the results for the right and left ventricles are illustrated in (Figure 3A). The MCT animals displayed enhanced fibrosis (Figures 3B and 3C) in both ventricles, while treatment with D-L attenuated fibrosis in both.

Figure 3 – D-limonene (D-L) attenuate fibrosis in the heart. Experimental groups are control (CTR), monocrotaline (MCT), CTR + 300 mg/kg/day of D-L, and MCT treated animals + 300 mg/kg/day of D-L on day 0 and on day 20. (A) representative section of the right ventricle and left ventricle. (B) Fibrosis in the right ventricle. (C) Fibrosis in the left ventricle. Data are expressed as mean ± S.E.M. p<0.05, one way-ANOVA followed by Tukey test, @comparing MCT to all other groups.

Next, we explored the ECG profile of the animals, which is summarized in (Figure 4). In (Figure 4A), i-iv show representative ECG tracings of the four experimental groups on day 20. As shown in (Figure 4B), no changes in the heart rate, measured as the RR interval, nor in the QRS complex were observed (Figure 4D). MCT administration caused increased P wave duration (Figure 4C), and in vivo D-L treatment prevented the phenotype (MCT+D-L group). Moreover, the QT interval increased in the MCT group when compared to the CTR group (Figure 4D), and in vivo D-L treatment did not prevent the lengthening in the QT interval.

Figure 4 – Electrocardiographic changes. (A) Representative traces of electrocardiogram lead II for controls (CTR) (i), and monocrotaline (MCT) (ii), CTR + 300 mg/kg/day of D-limonene (D-L) (iii), and MCT treated animals + 300 mg/kg/day of D-L on day 0 and on day 20 (iv). (B) RR interval. (C) P wave duration. (D) QRS Complex. (E) QT interval. Data are expressed as mean ± S.E.M. p<0.05, One Way-ANOVA followed by Tukey test, @comparing MCT to all groups, *comparing CTR to MCT and & comparing CTR+D-L to MCT+D-L. N=4-5.

D-L modulates left atrial and right atrial function

Since D-L prevented the P wave remodeling we decided to explore the right atrial and left atrial mechanical function. Figures 5A-5E summarize our findings from the right atrial contraction experiments at spontaneous beating frequency. Representative traces of spontaneous contractions of the right atrium in all groups are shown in (Figure 5A, (i-iv), and a superimposed and normalized contraction curve for all groups is shown in (Figure 5A, v). Spontaneous beating frequency had a trend toward reduction in the MCT group compared to CTR (p=0.07). Interestingly, the frequency in the MCT was different from that in the MCT +D-L.

Figure 5 – Right atrial (RA) contraction changes. (A) Representative traces of RA spontaneous contraction for the CTR (i), monocrotaline (MCT) (ii) treated animals, CTR administered 300 mg/kg/day of D-L (iii) and MCT administered 300 mg/kg/day of D-limonene (iv). Superimposed normalized traces for all experimental groups (v). (B) Beating frequency. (C) Peak amplitude. (D) Time to peak of contraction measured as the interval between 10 and 90% to development of contraction. (E) Time to relaxation measured as the interval between 10 and 90% to development of relaxation. Data are expressed as mean ± S.E.M. p<0.05, One Way-ANOVA followed by Tukey test, #MCT compared with MCT+D-L, ++CTR compared with CTR+D-L; N=4.

There was no difference in the peak amplitude when comparing CTR to MCT and CTR+D-L to MCT+D-L (Figure 5C). However, when comparing CTR to CTR+D-L a significant attenuation of peak amplitude was found (p<0.05), and a similar trend, but not significant when comparing MCT to MCT+D-L. Also, right atrial tissue from MCT rats showed a non-significant trend towards a slower time to peak contraction when compared to CTR (Figure 5D). On contrary, in vivo treatment with D-L caused a significant speeding (p<0.05) in the time to peak and relaxation of right atrial contraction curves, when comparing CTR to CTR+D-L and MCT to MCT+D-L group. Also, the time to relaxation was slower in the MCT group when compared to the CTR (Figure 5E).

The spontaneous beating frequency of right atrial tissue was in the range of 3 Hz, thus we decided to further study the left atrial contraction properties using a pacing frequency of 3 Hz (Figure 6). A superimposed normalized curve is shown in (Figure 6A) for all experimental groups. There was no difference in the peak amplitude among all groups, (Figure 6B). Interestingly, left atrial contraction in MCT rats showed faster time to peak contraction when compared to CTR (Figure 6C), but no difference in the relaxation time was found, (Figure 6D). Also, the times to peak contraction and relaxation were not different between CTR+D-L and MCT+D-L. However, both time to contraction and time to relaxation were significantly faster in the CTR+D-L and in the MCT+D-L groups when compared to CTR and MCT, respectively, indicating that in vivo D-L administration modulates left atrial function.

Figure 6 – Left atrial (LA) contraction changes. (A) Representative superimposed normalized traces of LA paced at 3 Hz for the controls (CTR), monocrotaline (MCT) treated animals, CTR administered 300 mg/kg/day of D-limonene (D-L) and MCT administered 300 mg/Kg/day of D-L. (B) Peak amplitude. (C) Time to peak of contraction measured as the interval between 10 and 90% to development of contraction. (D) Time to relaxation measured as the interval between 10 and 90% to development of relaxation. Data are expressed as mean ± S.E.M. p<0.05, one Way-ANOVA followed by Tukey post-test, @comparing MCT to all other groups, #comparing MCT to MCT+D-L, ++comparing CTR to CTR+D-L, N=4|Z|.

D-L display anti-inflammatory effect in MCT-PH rat model

MCT is known to induce heart inflammation,¹² which may impact the function and structure of the heart.²⁶ Thus, we decided to evaluate key inflammatory cytokines known to be altered in the course of MCT-PH in rats. The RT-qPCR analysis of the right ventricular tissue revealed that MCT group had a higher expression of pro-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6 and TNF-α) (Figures 7A-7C), in comparison to CTR, and treatment with D-L prevented the overexpression of all pro-inflammatory cytokines tested, restoring their normal expression levels when comparing to CTR group. On the contrary, the expression of anti-inflammatory cytokines IL-10 and TGF-β (Figures 7D and 7E) was found attenuated in the MCT group when compared to CTR, CTR+D-L and MCT+D-L groups, and in vivo D-L administration improved their levels in the MCT-PH.

Figure 7 – Effect of D-limonene (D-L) on the mRNA expression of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in right ventricular tissue of MCT-PH model rats. The mRNA (100 ng) expressions of IL-1β (A), IL-6 (B), TNF-α (C), IL-10 (D) and TGF-β (G) were analyzed by real time-qPCR. The results are reported as the mean ± S.E.M. p<0.05, One Way-ANOVA followed by Tukey post-test. @comparing MCT to all other groups, #comparing MCT to MCT+D-L, &comparing CTR+D-L to MCT-D+L, ++ comparing CTR to CTR+D-L (N = 4 animals per group in duplicate).

Discussion

In the present study, the administration of MCT (50 mg/kg) in young rats caused severe structural, electrical and mechanical remodeling of the heart, assessed through histological, electrocardiographic and isolated atria contraction findings. This is consistent with previous studies using the MCT-PH model.^7-11 Previous findings²³ described that in vivo D-L administration improved some fibrotic aspects of tissue remodeling in the MCT-PH model.

In PH, damage to the small pulmonary arteries includes impairment of endothelial cells, artery spasm, fibrosis and occlusion, and inflammation is the major contributor.^11,12 The vascular changes can lead to right ventricular dysfunction and heart failure.²⁶ As the disease progress, abnormal contractility in the right side of the heart leads to an overproduction of reactive oxygen species and inflammatory mediators in the heart.^12,13 Thus, it is intuitive to assume that the administration of antioxidant and anti-inflammatory molecules can improve cardiac function in PH. It is believed that inflammatory processes play a relevant role in human and experimental PH.^1-3,12

Previous research has shown that oral treatment with D-L (400 mg/Kg/day) for three consecutive weeks after MCT administration (60 mg/kg) reduced the structural remodeling of the heart, as assessed by the Fulton index.²³ However, there is a divergence in the results of the Fulton index observed in our study, which can be explained in part by: I) the animal strains were different between studies. Wistar and Sprague-Dawley rats are known to have distinct responses to cardiovascular injury;²⁷ II) Young rats and lower doses of MCT influence the course of heart remodeling in this experimental model.^28,29

In our study we observed that D-L administration attenuated right ventricular weight normalized by tibial length, indicating that the unobserved reversal of the Fulton index may be due to a distinct effect on the right and left ventricle (septum). Furthermore, D-L attenuated the heart fibrosis observed in both the right and left ventricles, which contributes to the improvement of ventricular function in vivo.

This is supported by the observation that the weight of the right atria, which is usually increased in this model, was reversed by D-L administration, but not the left atria weight gain. Remodeling of both, right and left atria contributes to atrial arrhythmia in this experimental model,^7-10 thus D-L is beneficial in this regards. This aspect is further supported by the ECG analysis. Also, it was found that the significant remodeling observed in the QT interval was not reversed by D-L, suggesting that the monoterpene may have a unique ability to modulate distinct regions of the heart.

Inflammation is an essential pathological process involved in heart remodeling in the MCT-PH rat model.^11,12 Thus, we measured the expression of the main cytokines involved in the pathophysiology of heart diseases.^11,12 Consistent with previous studies,^11,12 we demonstrated that the expression level of inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6 and TNF-α) is enhanced in the MCT group, while the anti-inflammatory cytokines IL-10 and TGF-β are down-regulated. D-L displayed anti-inflammatory activity through restoring the expression levels of inflammatory cytokines, increasing the level of IL-10 and restoring the TGF-β expression.

Il-10 is a versatile anti-inflammatory cytokine that plays a crucial role in regulating various aspects of the immune response, inflammation, vasculoprotective properties, and tissue remodeling. It is primarily produced by type-2 helper T (Th2) lymphocytes during inflammation, where it acts to suppress the production of several proinflammatory cytokines.³⁰ IL-10 has gained significant attention due to its ability to suppress inflammatory and proliferative vasculopathy.³⁰ IL-10 inhibits inflammation by decreasing the production of the inflammatory cytokines, thus exerting anti-inflammatory effects. Additionally, IL-10 activates signaling pathways that enhance the expression of anti-inflammatory genes.³¹

The pathological process of PH is characterized by abnormal serum levels of proinflammatory cytokines such as IL-1 and IL-6.³² Patients with PH often exhibit elevated baseline serum levels of IL-10, suggesting a protective anti-inflammatory response to the ongoing injury.³³ Therefore, IL-10 has become a focal point in potential therapies aimed at combating fibrosis linked to inflammation.³⁴

IL-10 plays an indirect yet crucial role in limiting cardiac injury and fibrosis. Its signaling pathways, particularly through STAT3, promote the recruitment and retaining bone marrow-derived endothelial progenitor cells at the site of heart injury, thereby influencing repair and regeneration.^35,36 Much of the experimental data in the literature suggest a beneficial role for IL-10 in PH. For instance, in the MCT-PH rat model, intravenous administration of IL-10 via adenoviral vector significantly improved survival rates and reduced mean pulmonary artery pressures.³⁰ Similarly, recombinant IL-10 administration improved ventricular function, reduced hypertrophic remodeling, attenuated cardiac fibrosis and proliferative vasculopathy, and lowered mortality rate.³⁷

Systemic expression of IL-10 also enhanced survival in MCT-PH rats, prevented the development of right ventricular hypertrophy, medial hypertrophy of the pulmonary artery, reduced macrophage accumulation, vascular cell proliferation, and lowered pulmonary tissue levels of TGF-β1 and IL-6, which are critical in PH progression.³⁸ Consistent with previous studies using MCT-PH rat model, increased IL-10 induced by specific administration of IL-10 significantly inhibited the expression of IL-1β, IL-6 and TNF-α in the right ventricle, and attenuated fibrosis in both the right and left ventricles.³⁰ Overall, IL-10 modulates the dynamics of cytokine networks involved in PH-induced heart remodeling, potentially exerting its effects at various sites.

Our results evidenced that D-L augmented the expression of IL-10 in right ventricular tissue. IL-10 can up-regulate endogenous anti-cytokines and down-regulate pro-inflammatory cytokine receptors, and shows potent anti-inflammatory properties, repressing the expression of IL-1β, IL-6 and TNF-α by activated macrophages.³⁹ A previous study has demonstrated that IL-10, delivered by an intramuscular injection of an adeno-associated virus vector, exerts multiple preventive effects on inflammatory and proliferative vascular remodeling in PH, such as reduced macrophage accumulation, vascular cell proliferation, and pulmonary tissue levels of TGF-1 and IL-6.³⁰ Lastly, D-L was already described to modulate inflammatory response in the heart.⁴⁰

In line with our result, in a previous study¹² it was found that inflammation covered almost the entire course of PH and inflammatory mediator levels are increased during the progression from acute and chronic inflammatory phase.¹² The IL-1β is one of the first cytokines to be elevated in the course of the experimental MCT model in rats, and it has been shown to be related to atrial and ventricular arrhythmias observed in a range of heart disease.^41,42

D-L can ameliorate cardiac injury induced by CCl₄ intoxication through its antioxidant and anti-inflammatory potential.⁴⁰Moreover, D-L anti-inflammatory properties have previously been proven through the inhibition of redox-dependent NF-κB and other downstream inflammatory cytokines which are key players in exhibition of inflammation.⁴⁰

In line with this concept, D-L was already described to modulate inflammatory response in the heart.⁴⁰ In our study, we provide for the first time a more specific and detailed analysis showing that in vivo D-L administration is able to specifically modulate the inflammatory status of the right ventricle, which is severely affected in the MCT-PH- induced heart remodeling.

Conclusion

Based on the findings, it can be concluded that in vivo administration of D-L can reduce the formation of tissue fibrosis in the MCT-PH model in young rats, as summarized in Central Figure. Moreover, D-L restores electrocardiographic changes and increase the expression of anti-inflammatory cytokines. Overall, D-L may be a promising anti-inflammatory and antioxidant agent against PH and cardiac dysfunction.

Acknowledgement

Danilo Roman Campos to Fundação do Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, project number 2021/05584-7 and 2020/14635-1). Danilo Roman Campos to Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, project number 304257/2020-6). Jorge Lucas Teixeira da Fonseca holds a fellowship from FAPESP (# 2022/14133-1). Polyana Leal da Silva holds a fellowship from FAPESP (# 2023/04603-03). Diego Jose Belato y Orts holds a fellowship from FAPESP (# 2022/07256-0).

Study association:

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Ethics approval and consent to participate:

This study was approved by the Ethics Committee of the Universidade Federal de São Paulo (CEUA/UNIFESP) under the protocol number 5438060923. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.

Sources of funding:

This study was funded by FAPESP, project numbers 2021/05584-7, 2020/14635-1 and CNPq, project number 304257/2020-6 and partially funded by FAPESP, project number 2023/04603-03 and 2022/07256-0.