Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC 5MQdkGkzPprF53T5v9jdTPw S0066-782X2024001200307 00307 10.36660/abc.20230783 Artigo Original A Administração Oral de Nitrito a Curto Prazo Diminui a Rigidez Arterial em Ratos Wistar Treinados e Sedentários 0000-0002-5411-5095 Souza Thiago Pereira Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Obtenção de financiamento Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Tardelli Lidieli Pazin Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 2 Nicoletti Rafael Antunes Análise e interpretação dos dados Análise estatística Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 0000-0002-5445-429X Jacomini André Mourão Concepção e desenho da pesquisa Análise estatística Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Martins Gabriel Francisco de Mello Obtenção de dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Pinheiro Lucas Cézar Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 3 0000-0002-9945-9633 Tanus-Santos José Eduardo Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 4 Amaral Sandra Lia do Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Obtenção de financiamento Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Zago Anderson Saranz Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Obtenção de financiamento Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Universidade Estadual Paulista Departamento de Educação Física Bauru SP Brasil Universidade Estadual Paulista (UNESP) - Departamento de Educação Física, Bauru, SP – Brasil Universidade Federal de São Carlos Programa Interinstitucional de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas São Carlos SP Brasil Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) - Programa Interinstitucional de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, PIPGCF UFSCar/UNESP, São Carlos, SP – Brasil Universidade Federal de Santa Catarina Departamento de Farmacologia Florianópolis SC Brasil Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) - Departamento de Farmacologia, Florianópolis, SC – Brasil Universidade de São Paulo Departamento de Farmacologia Ribeirão Preto SP Brasil Universidade de São Paulo - Departamento de Farmacologia, Ribeirão Preto, SP – Brasil Thiago Pereira Souza • UNESP Câmpus de Bauru - Departamento de Educação Física - Av. Eng. Luís Edmundo Carrijo Coube, 2085. CEP 17033-360, Bauru, SP - Brasil E-mail: thiago.pereira@unesp.br

Marina Okoshi

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 13 12 2024 11 2024 121 12 e20230783 12 11 2023 02 08 2024 16 10 2024 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

: A Administração Oral de Nitrito a Curto Prazo Diminui a Rigidez Arterial em Ratos Wistar Treinados e Sedentários

Resumo Fundamento

O óxido nítrico (NO) desempenha um papel importante na regulação da pressão arterial (PA), atuando diretamente na resistência vascular periférica por meio da vasodilatação. O treinamento físico (via eNOS/NO) e a ingestão de nitrito foram considerados os principais estímulos para o aumento do NO.

 Objetivo

No presente estudo, examinamos os efeitos da administração oral de nitrito e do treinamento com exercícios aeróbicos sobre a PA e rigidez arterial de ratos Wistar.

 Métodos

Trinta e nove (39) ratos Wistar machos jovens foram divididos nos seguintes grupos (n=9 ou 10 por grupo): Sedentário-Controle (SC), Sedentário-Nitrito (SN), Treinado-Controle (TC) e Treinado-Nitrito (TN). Eles foram submetidos a treinamento físico aeróbico em esteiras por 8 semanas (50-60% da capacidade física, 1h/dia, 5 dias/semana) ou mantidos sedentários. Nos últimos 6 dias de treinamento, nitrito foi administrado oralmente (15 mg/Kg por gavagem). A PA, a rigidez arterial e as concentrações plasmáticas e teciduais de nitrito foram avaliadas após o treinamento e o período de administração oral de nitrito. O nível de significância foi definido como p < 0,05.

 Resultados

A administração oral de nitrito foi eficaz na redução dos valores de rigidez arterial (TN, -23%; e SN, -15%). Ambos os grupos que tiveram apenas um tipo de intervenção apresentaram PA sistólica menor em comparação com o controle (TC vs. SC, -14,23; e SN vs. SC, - 12,46).

 Conclusão

Assim, concluímos que a administração oral de curta duração (6 dias), associada a um programa de treinamento físico aeróbico promovem diversos benefícios hemodinâmicos em ratos Wistar machos, como melhorias na rigidez arterial e na PA. Essas respostas sugerem que o treinamento físico e a suplementação de nitrito de sódio podem ser alternativas satisfatórias para a prevenção e tratamento da hipertensão.

 Óxido Nítrico Nitritos Exercício Físico Análise de Onda de Pulso Hipertensão Introdução

A literatura científica afirma que a pressão arterial (PA) deve estar próxima de 110-115 mmHg para pressão arterial sistólica (PAS) e 70-75 mmHg para pressão arterial diastólica em indivíduos saudáveis. Valores acima destes estão relacionados a uma alta incidência de eventos cardiovasculares e mortalidade, como acidente vascular encefálico, infarto agudo do miocárdio, entre outros.1-4 Múltiplos fatores estão envolvidos na regulação da PA, incluindo a rigidez arterial, que é caracterizada pela perda de complacência das paredes arteriais.5,6 Atualmente, devido às suas consequências, ela tem sido associada como um preditor de risco de mortalidade cardiovascular, mesmo na população em geral,7,8 uma vez que artérias mais rígidas promovem um suprimento sanguíneo menos eficiente através dos vasos para os tecidos e órgãos, colocando demandas crescentes sobre o coração.9

Por outro lado, o treinamento físico é recomendado para neutralizar esses efeitos, prevenindo a HT, diminuindo o tônus simpático, melhorando a resistência vascular periférica e a rigidez arterial.10-12 O exercício físico é capaz de melhorar muitos mecanismos relacionados à regulação dos níveis de PA, como a produção de óxido nítrico (NO) e sua biodisponibilidade.13-15

Considerado um potente vasodilatador, o NO pode ser produzido por meio de duas vias metabólicas principais: a) via eNOS/NO, a produção de NO via eNOS ocorre a partir da clivagem da L-arginina em NO e L-citrulina. No treinamento de exercícios aeróbicos, isso ocorre por meio de estimulação física devido ao aumento do débito cardíaco e consequente promoção de estresse de cisalhamento sobre as células endoteliais vasculares.16 Essa via recebe grande influência do treinamento físico;17,18 e b) Via Nitrato/Nitrito/NO, na qual a concentração de NO é aumentada por meio da administração oral de nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-).19,20 Inicialmente, o nitrito ingerido é convertido em NO sob as condições ácidas do estômago, enquanto o restante entra na circulação sanguínea. Nos tecidos, o nitrito restante é ainda mais reduzido sob as condições de pH baixo e hipóxia por proteínas redutase, convertendo nitrito em NO, sendo considerado uma boa fonte de NO independente da eNOS.21-23

Conforme mencionado anteriormente, a prática de exercício físico e a ingestão de nitrato e nitrito são considerados grandes estímulos para o aumento da concentração de NO. No geral, independentemente da fonte de produção (vias eNOS/NO/GMPc ou Nitrato/Nitrito/NO), o NO desempenha um papel importante no controle da PA, atuando diretamente sobre a resistência vascular periférica por meio da vasodilatação.24 Entretanto, ainda não está claro quais seriam os efeitos da combinação das duas intervenções no aumento da concentração de NO e seu impacto sobre a rigidez arterial.

Portanto, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da administração oral de nitrito e do treinamento com exercícios aeróbicos sobre a PA e a rigidez arterial de ratos Wistar. No presente estudo, levantamos a hipótese de que a administração oral de nitrito, associada ao treinamento físico, promove efeitos adicionais na regulação da PA e na rigidez arterial do que intervenções isoladas.

 Métodos Animais

Quarenta ratos Wistar (8 semanas de idade/machos/250-300g) foram obtidos do Biotério do Hospital das Clínicas da Faculdade Estadual de Medicina de São Paulo (UNESP-Botucatu, SP, Brasil). Os animais foram alojados no Biotério da UNESP-Faculdade de Ciências (Bauru, SP, Brasil), em gaiolas de até cinco animais, em ciclo claro/escuro de 12 horas e temperatura controlada (22 °C). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética para Uso de Animais (CEUA) da Universidade Estadual Paulista, Bauru, Brasil (protocolo n.º 003/2018).

 Grupos experimentais, treinamento físico e tratamento farmacológico

Inicialmente, todos os animais passaram por um período de adaptação de 10 dias em esteira rolante (5-10 m/min, 5 minutos), sendo submetidos ao teste de capacidade máxima (Tmáx), que consiste em correr em esteira rolante progressiva com incrementos de 5 m/min a cada 3 minutos, até a exaustão, conforme descrito anteriormente. O Tmáx foi repetido no final da 4ª semana, com o objetivo de ajustar a velocidade para manter a intensidade do treinamento, e ao final do protocolo experimental, para verificar os efeitos do treinamento na capacidade física.25,26Após os testes iniciais, todos os ratos foram separados em quatro grupos com peso corporal, velocidade da onda de pulso e valores basais de desempenho do Tmáx semelhantes. Então, esses grupos foram selecionados aleatoriamente para compor os seguintes grupos (n = 9 ou 10 por grupo): (1) Sedentário-Controle (SC), (2) Sedentário-Nitrito (SN), (3) Treinado-Controle (TC) e (4) Treinado-Nitrito (TN). O método de randomização escolhido foi a randomização simples. O tamanho da amostra foi baseado em estudos anteriores presentes.27,28 Os grupos de treinamento realizaram treinamento físico aeróbico em esteira ergométrica (Inbramed, Millenium, Brasil), com intensidade moderada, a 50-60% do Tmáx, durante 1h/dia, 5 dias por semana, por 8 semanas, enquanto os grupos sem exercícios exercitados permaneceram sedentários. Nos últimos 6 dias de treinamento, o nitrito foi administrado.

Nitrito de sódio (15 mg/kg de peso corporal - Dinâmica®) ou veículo (água) foram administrados por gavagem uma hora antes do treinamento físico (às 9h). A concentração de nitrito de sódio foi determinada em conformidade com a literatura, que demonstra os efeitos anti-hipertensivos e antioxidantes do composto.29-31

Velocidade da onda de pulso (VOP)

O método da velocidade da onda de pulso (VOP) tem sido amplamente utilizado para a avaliação da rigidez arterial, sendo considerado o padrão ouro para a complacência arterial.32,33

Para avaliar a VOP, os animais foram anestesiados com cloridrato de cetamina e xilazina (50 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente, IP) e colocados em decúbito ventral sobre uma mesa aquecida. Dois sensores pOpet ® (Axelife SAS, Saint Nicolas de Redon, França) foram colocados no membro anterior e posterior direito. A distância percorrida (D, m) estimou a distância entre as duas sondas e o tempo de trânsito (TT, ms), medido pelo software pOpet 1.0, foram usados para calcular a VOP pela seguinte fórmula: VOP(m/s) = D(m)/TT(s). Este método teve como objetivo avaliar a rigidez arterial, tendo recentemente demonstrado boa validação.32 A média de dez medições foi considerada como resultado. Esta avaliação ocorreu em dois momentos, no início do experimento e ao final do período de treinamento físico e tratamento.

 Avaliação não invasiva da pressão arterial

O sistema de pletismografia de manguito de cauda foi usado para determinar a PA indireta (PanLab LE5001, Barcelona, Espanha). Todos os animais foram adaptados por 5 dias ao tubo cilíndrico de acrílico, que os manteve em repouso. Os animais foram mantidos em tubo cilíndrico de acrílico, pré-aquecido (37 °C), para promover a vasodilatação da artéria caudal, e então aguardaram por 5-10 minutos para garantir que estivessem em repouso. O manguito foi colocado na porção proximal da cauda e conectado ao esfigmomanômetro para inflar. A medida foi analisada pelo transdutor de pressão (IITC Inc. Life Science - MRBP-r). A avaliação ocorreu 1 hora após a última ingestão de nitrito e a média de cinco medidas (intervalo de 1 minuto entre elas) foi considerada como resultado.33

Procedimentos de eutanásia

Os animais foram eutanasiados por excesso de anestésicos, com cloridrato de xilazina (ANASEDAN®, 40mg/kg) e cloridrato de cetamina (DOPALEN®, 160mg/kg), VETEBRANDS Brasil (proporção 1:1, 0,1mg/100g de peso corporal), e então, decapitados. A eutanásia ocorreu 2 horas após a última ingestão de nitrito. Plasma, músculo cardíaco, tibial anterior e músculo sóleo foram coletados dos animais.

 Medição das concentrações de nitrito no plasma e tecidos

O plasma, o tecido cardíaco e muscular (~125 mg) foram homogeneizados em um tampão de fosfato. Após a centrifugação, a solução contendo os tecidos ou alíquotas de plasma foi analisada em duplicata para concentrações de nitrito usando o método de quimioluminescência redutiva baseado em ozônio e posteriormente avaliada por um analisador de NO de quimioluminescência em fase gasosa (analisador Sievers Modelo 280 NO; Boulder, CO, EUA), conforme descrito anteriormente.20,34

Análise estatística

Estatísticas descritivas são apresentadas como média ± desvio padrão (DP). O teste de Shapiro-Wilk foi usado para testar a distribuição normal dos dados. Uma ANOVA bidirecional foi usada para identificar diferenças estatísticas na PAS e nas concentrações plasmáticas, musculares e cardíacas de nitrito entre os grupos (SC, SN, TC e TN). Na presença de interações, foi utilizado o teste post hoc de Tukey, e o nível significativo foi definido como p < 0,05.

Para comparação PRÉ e PÓS na VOP dentro dos grupos (SC, SN, TC e TN), uma ANOVA de medidas repetidas foi adotada. Os dados foram analisados usando o pacote estatístico SigmaPlot 12.0 (Systac Software, Inc., San Jose, CA, EUA).

 Resultados

Na imagem central, apresentamos os principais resultados do nosso estudo. Todos os grupos apresentaram resultados semelhantes para VOP no início do estudo, demonstrando a homogeneidade dos grupos nesse aspecto. Ambos os grupos tratados apresentaram valores de VOP mais baixos em comparação com os grupos não tratados (-19% SN vs. SC; -24% TN vs. TC). A Figura 1 também mostra a comparação entre os momentos pré e pós-intervenção. Não foram encontradas diferenças significativas para os grupos SC e TC para VOP. No entanto, os grupos TN (-23%) e SN (-15%) apresentaram reduções significativas na VOP após o período de treinamento ou tratamento.

– Velocidade da onda de pulso (VOP) antes (pré) e depois (pós), em SC (Sedentário-Controle, n=10), SN (Sedentário-Nitrito, n=10), TC (Treinado-Controle, n=10) e TN (Treinado-Nitrito, n=9). *Diferenças estatísticas vs. controle respectivo e - (SN vs. SC, p=0,003; e TN vs. TC, p=<0,001); # diferenças estatísticas entre PRÉ e PÓS-intervenção – (TN, p=0,007; SN, 0,011); nível de significância p<0,05.

A Figura 2 apresenta menor PAS em SN e TC em comparação com o grupo SC. Essa diferença chegou a 12,46 mmHg para o grupo SN (p=<0,001) e 14,23 mmHg para o grupo TC (p=<0,001). No entanto, a combinação de treinamento físico e administração oral de nitrito não apresentou benefícios adicionais àqueles encontrados isoladamente.

– Valores de pressão arterial sistólica (PAS) em SC (Sedentário-Controle, n=10), SN (Sedentário-Nitrito, n=10), TC (Treinado-Controle, n=10) e TN (Treinado-Nitrito, n=9). *Diferenças estatísticas, TC vs. SC, p=<0,001; SN vs. SC, p=<0,001; nível de significância p<0,05.

A Figura 3 apresenta as concentrações de nitrito nos diferentes tecidos. É possível observar que ambos os grupos tratados (SN e TN) apresentaram valores maiores em comparação com os grupos não tratados (SC e TC) no plasma (Figura 3A), coração (Figura 3B) e músculo sóleo (Figura 3C), exceto para o músculo tibial anterior (Figura 3D).

– Concentrações de nitrito no plasma nitrito (A), coração (B), músculo sóleo (C) e músculo esquelético tibial anterior (D) em SC (Sedentário-Controle, n=10), SN (Sedentário-Nitrito, n=10), TC (Treinado-Controle, n=10) e TN (Treinado-Nitrito, n=9). *Diferenças estatísticas, Plasma – SN vs. SC, p=0,006;TN vs. TC, p=<0,001; Coração – SN vs. SC, p=0,002; TN vs. TC, p=<0,001; Sóleo – SN vs. SC, p=0,005; TN vs. TC, p=0,003; Tibial Anterior – SN vs. SC, p=0,019; nível de significância p<0,05.

Não foi encontrada diferença estatística entre os grupos SC e TC para a concentração plasmática de nitrito. No entanto, o tratamento com nitrito induziu um aumento no grupo SN (p=0,006) e no grupo TN (p=<0,001) em comparação com seus respectivos grupos de controle.

A magnitude do aumento na concentração de nitrito no músculo cardíaco e esquelético (sóleo) foi menor em comparação com a concentração plasmática de nitrito, no entanto, a mesma tendência foi encontrada. Não foi encontrada diferença entre os grupos SC e TC para concentração cardíaca de nitrito. No entanto, o tratamento com nitrito induziu um aumento no grupo SN (aproximadamente quatro vezes) e no grupo TN (aproximadamente oito vezes) em comparação com seus respectivos grupos de controle.

Para o tecido muscular, nenhuma diferença foi encontrada entre os grupos SC e TC na concentração de nitrito do sóleo e na concentração de nitrito dos tibiais anteriores. Além disso, os grupos tratados (SN e TN) mostraram diferenças em relação aos seus respectivos controles no músculo sóleo (ambos de aproximadamente quatro vezes). No entanto, no músculo tibial anterior, apenas o grupo SN mostrou uma diferença em comparação com o seu controle (aproximadamente três vezes).

 Discussão

O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da administração oral de nitrito sobre a PA e a rigidez arterial em ratos treinados e sedentários. Resumidamente, nossos resultados demonstraram que a administração oral de nitrito por um curto período (6 dias) foi relacionada a uma redução de 15% e 22,1% na VOP, nos grupos SN e TN, respectivamente, em comparação com os grupos que não receberam tratamento farmacológico.

A rigidez arterial tem sido extensivamente estudada em modelos animais experimentais,5,6,32,35 sendo considerada um importante preditor de risco cardiovascular na população em geral.7 Embora o grupo que realizou apenas treinamento físico não tenha apresentado redução da VOP, existem evidências na literatura de que o exercício físico promove benefícios sobre a rigidez arterial. Em uma revisão sistemática de Lopes et al.,35 foi demonstrado que o treinamento aeróbico, o treinamento combinado e o treinamento resistido podem promover redução da VOP em pacientes hipertensos.

A concentração de nitrito foi maior em ambos os grupos que receberam suplementação oral de nitrito, um resultado esperado devido ao desenho do estudo. No entanto, esses resultados podem contribuir para melhorias no endotélio vascular e para melhorias na biodisponibilidade de NO. Como consequência, contribui para os efeitos anti-hipertensivos.18 Foi demonstrado que a suplementação com nitrito protege o endotélio vascular da atividade antioxidante, reduzindo/inibindo a atividade da NADPH oxidase e da xantina oxidorredutase (XOR) em animais,36,37 o que não foi avaliado por este estudo. A inibição da atividade da NADPH oxidase é um mecanismo importante, pois trata-se da fonte mais proeminente de espécies reativas de oxigênio (ERO) e funciona age por meio da inativação do NO.38-40 Ling et al.18 também demonstraram que a administração oral de nitrito promove mudanças positivas na expressão da NADPH oxidase.

Além disso, a administração oral de nitrito também se mostrou eficaz no aumento das concentrações de nitrito no plasma e em outros tecidos (músculo cardíaco e sóleo), com valores mais altos encontrados nos grupos tratados em comparação com os grupos controle. Esses resultados estão de acordo com a literatura, que relata que a suplementação de nitrito aumenta as concentrações de nitrito no plasma e em outros tecidos.18,30,41 Por outro lado, no músculo tibial anterior, apenas o grupo sedentário que recebeu tratamento apresentou altos valores de concentração de nitrito. Ressalta-se ainda que a literatura tem demonstrado alterações nas concentrações plasmáticas e teciduais de nitrito ao longo do tempo após a administração oral.20 Pinheiro et al. observaram que o aumento das concentrações de nitrito no plasma iniciou-se 15 minutos após o tratamento, permanecendo por até 4 horas; e no músculo cardíaco e esquelético, as concentrações permaneceram altas até 2 horas após o tratamento, demonstrando assim a relação entre concentração e tempo de tratamento. Sendo assim, essa relação confirma nossa hipótese de que a administração oral de nitrito de sódio pode ser uma alternativa satisfatória para aumentar as concentrações de nitrito e, consequentemente, possivelmente a biodisponibilidade de NO.

De acordo com os resultados da PA, ambas as intervenções realizadas isoladamente, seja o treinamento físico ou farmacológico, apresentaram redução da PAS em comparação com o grupo sedentário e não tratado. Embora muitos estudos tenham demonstrado que o treinamento de exercícios aeróbicos não reduz os níveis de PA em animais Wistar.42,43 Em nosso estudo, embora os animais utilizados neste estudo tenham sido considerados normotensos (a linhagem dos animais era normotensa), é possível observar que os valores de PAS estavam em torno de 140 mmHg no grupo SC, o que apresentou valores de PA alterados. Sendo assim, o tratamento com nitrito ou treinamento físico foram suficientes para normalizar os valores de PA. Uma possível explicação para esses resultados é o aumento da produção e concentração de NO, a diminuição da concentração de EROs, o aumento do fator de crescimento endotelial vascular, que são responsáveis pela ativação do mecanismo de angiogênese, redução da produção de Ang-II e menor atividade simpática.10,42,44-46 Além disso, a suplementação de nitrito demonstrou benefícios no relaxamento vascular,47 e melhorias na função e remodelação cardíaca.48

As limitações deste estudo incluem o curto período de tratamento com nitrito, o que requer mais estudos para verificar a resposta a longo prazo. Os níveis de PAS dos animais estavam próximos de 140 mmHg, um valor considerado alterado para animais Wistar e, ainda assim, só conseguimos avaliar a PA no final do protocolo. Sendo assim, não podemos afirmar que o treinamento físico e o tratamento reduziram a PAS ao longo do programa.

 Conclusão

Em resumo, a administração oral de curta duração (6 dias) ou um programa de treinamento físico aeróbico promovem diversos benefícios hemodinâmicos em ratos Wistar machos, como melhorias na rigidez arterial e na PA. Essas respostas sugerem que o treinamento físico e a suplementação de nitrito de sódio podem ser alternativas satisfatórias para a prevenção e tratamento da hipertensão.

 Agradecimentos

Este estudo foi parcialmente financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - BRASIL (CNPq).

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Este artigo é parte de dissertação de mestrado de Thiago Pereira de Souza pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências do Movimento Interunidades - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da CEUA - Faculdade de Ciências - UNESP Bauru sob o número de protocolo 003/2018. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.

O presente estudo foi financiado por Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).

 10.36660/abc.20230783i Original Article Short-term Oral Nitrite Administration Decreases Arterial Stiffness in Both Trained and Sedentary Wistar Rats 0000-0002-5411-5095 Souza Thiago Pereira Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Obtaining financing Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 Tardelli Lidieli Pazin Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Critical revision of the manuscript for content 2 Nicoletti Rafael Antunes Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Critical revision of the manuscript for content 1 0000-0002-5445-429X Jacomini André Mourão Conception and design of the research Statistical analysis Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 Martins Gabriel Francisco de Mello Acquisition of data Critical revision of the manuscript for content 1 Pinheiro Lucas Cézar Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for content 3 0000-0002-9945-9633 Tanus-Santos José Eduardo Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for content 4 Amaral Sandra Lia do Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Obtaining financing Critical revision of the manuscript for content 1 Zago Anderson Saranz Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Obtaining financing Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 Brazil Universidade Estadual Paulista (UNESP) - Departamento de Educação Física, Bauru, SP – Brazil Brazil Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) - Programa Interinstitucional de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, PIPGCF UFSCar/UNESP, São Carlos, SP – Brazil Brazil Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) - Departamento de Farmacologia, Florianópolis, SC – Brazil Brazil Universidade de São Paulo - Departamento de Farmacologia, Ribeirão Preto, SP – Brazil Thiago Pereira Souza • UNESP Câmpus de Bauru - Departamento de Educação Física - Av. Eng. Luís Edmundo Carrijo Coube, 2085. Postal Code 17033-360, Bauru, SP - Brazil E-mail: thiago.pereira@unesp.br

Marina Okoshi

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

: Short-term Oral Nitrite Administration Decreases Arterial Stiffness in Both Trained and Sedentary Wistar Rats

Abstract Background

Nitric Oxide (NO) plays an important role in blood pressure (BP) regulation, acting directly on peripheral vascular resistance through vasodilation. Physical training (via eNOS/NO) and intake of nitrite have been considered major stimuli to increase NO.

 Objective

We examined the effects of oral nitrite administration and aerobic exercise training on BP and arterial stiffness in Wistar rats.

 Methods

Thirty-nine (39) young male Wistar rats were divided into the following groups (n = 9 or 10 per group): Sedentary-Control (SC), Sedentary-Nitrite (SN), Trained-Control (TC), and Trained-Nitrite (TN). They were submitted to aerobic physical training on treadmills for 8 weeks (50-60% of physical capacity, 1h/day, 5 days/week) or kept sedentary. In the last 6 days of training, oral nitrite was administered (15 mg/Kg by gavage). BP, arterial stiffness, and plasma and tissue nitrite concentrations were assessed after the training and oral nitrite administration period. The significant level was defined as p < 0.05.

 Results

Oral administration of nitrite was effective in reducing arterial stiffness values (TN, -23%; and SN, -15%). Both groups that had only one type of intervention showed lower systolic BP compared with control (TC vs. SC, -14.23; and SN vs. SC, - 12.46).

 Conclusion

We conclude that short-term oral administration for 6 days and an aerobic physical training program promote several hemodynamic benefits in male Wistar rats, such as improvements in arterial stiffness and BP. These responses suggest that physical training and sodium nitrite supplementation can be alternatives for the prevention and treatment of hypertension.

 Nitric Oxide Nitrites Exercise Pulse Wave Analysis Hypertension Introduction

It is well known in scientific literature that blood pressure (BP) should be close to 110-115 mmHg for systolic blood pressure (SBP) and 70-75 mmHg for diastolic blood pressure in healthy individuals. The values above are related to a high incidence of cardiovascular events and mortality, such as stroke and acute myocardial infarction, among others.1-4 Several factors are involved in BP regulation, including arterial stiffness (AS) which is characterized by loss of compliance of arterial walls.5,6 Currently, due to its consequences, it has been linked as a predictor of cardiovascular mortality risk even in the general population,7,8 as stiffer arteries promote less efficient blood supply through the vessels to tissues and organs, placing increasing demands on the heart.9

Conversely, physical training is recommended to counteract these effects by preventing HT, decreasing sympathetic tone, and improving peripheral vascular resistance and AS.10-12 Physical exercise can improve many mechanisms related to the regulation of BP levels, such as nitric oxide (NO) production and its bioavailability.13-15

Considered as a potent vasodilator, NO can be produced through two main metabolic pathways: a) eNOS/NO pathway, the production of NO via eNOS occurs from the cleavage of L-arginine into NO and L-citrulline. In aerobic exercise training, this occurs through physical stimulation due to the increase in cardiac output and the consequent promotion of shear stress in vascular endothelial cells.16 This pathway receives a great influence from physical training;17,18and b) Nitrate/Nitrite/NO pathway, in which NO concentration is increased through oral administration of nitrite (NO2 -) and nitrate (NO3 -).19,20 Initially, the ingested nitrite is converted into NO under acidic conditions in the stomach, while the remainder enters the blood circulation. In the tissues, the remaining nitrite is further reduced under low pH and hypoxic conditions by reductase proteins, converting nitrite to NO, being considered a good source of NO independent of eNOS.21-23

As aforementioned, physical exercise and intake of nitrate and nitrite are considered great stimuli to increase NO concentration. Overall, regardless of the production source (eNOS/NO/GMPc or Nitrate/Nitrite/NO pathways), NO plays an important role in controlling BP, acting directly on peripheral vascular resistance through vasodilation.24 However, it is still unclear what the effects of combining the two interventions would be on increasing NO concentration and its impact on AS.

Therefore, the purpose of this study was to verify the effects of oral nitrite administration and aerobic exercise training on BP and AS in Wistar rats. In this study, we hypothesize that oral nitrite administration associated with physical training promotes additional effects on BP regulation and AS than isolated interventions.

 Methods Animals

Forty Wistar rats (8-week-old / males / 250-300g) were obtained from the Animal breeding Facility of the São Paulo State University (UNESP-Botucatu, SP, Brazil). The animals were housed in the Animal Facility of UNESP-School of Sciences (Bauru, SP, Brazil) in cages of up to five animals in a 12-hour light/dark cycle and controlled temperature (22 °C). All procedures were approved by the Ethics Committee for the Use of Animals (CEUA) of São Paulo State University, Bauru, Brazil (protocol no. 003/2018).

 Experimental groups, physical training, and pharmacological treatment

Initially, all animals underwent a 10-day adaptation period on a treadmill (5-10 m/min, 5 minutes). The animals were submitted to the maximum capacity test (Tmax), which consists of running on a progressive treadmill with increments of 5 m/min every 3 minutes until exhaustion, as previously described. The Tmax was repeated at the end of the 4th week to adjust the speed to maintain training intensity and at the end of the experimental protocol to verify the effects of training on physical capacity.25,26After the initial tests, all rats were separated into four groups with similar body weight, pulse wave velocity, and Tmax performance baseline values. Then, these groups were randomly selected to compose the following groups (n=9 or 10 per group): (1) Sedentary-Control (SC), (2) Sedentary-Nitrite (SN), (3) Trained-Control (TC), and (4) Trained-Nitrite (TN). The randomization method chosen was simple randomization. The sample size was based on previous present studies.27,28 The training groups performed aerobic physical training on an ergometric treadmill (Inbramed, Millenium, Brazil), with moderate intensity, at 50-60% of Tmax, for 1h/day, 5 days a week, over 8 weeks, while the non-exercised groups remained sedentary. In the last 6 days of training, nitrite was administered.

Sodium nitrite (15 mg/kg of body weight - Dinâmica®) or vehicle (water) was administered by gavage one hour before physical training (at 9 a.m.). The sodium nitrite concentration follows the previously published literature, which demonstrates the antihypertensive and antioxidant effects of the compound.29-31

Pulse Wave Velocity (PWV)

The pulse wave velocity (PWV) method has been used for the assessment of AS and it is considered the gold standard for arterial compliance.32,33

To assess the PWV, animals were anesthetized with ketamine hydrochloride and xylazine (50mg/kg and 10 mg/kg, respectively, i.p) and placed in the prone position on a heating table. Two pOpet® sensors (Axelife SAS, Saint Nicolas de Redon, France) were placed on the right forelimb and hindlimb. The traveled distance (D, m) estimated the distance between the two probes and transit time (TT, ms), measured by the pOpet 1.0 software, and was used to calculate the PWV by the following formula: PWV(m/s) = D(m)/TT(s). This method aimed to assess AS and recently demonstrated good validation.32 The average of ten measurements was considered as the result. This assessment occurred at two moments: at the beginning of the experiment and the end of the period of physical training and treatment.

 Non-invasive blood pressure assessment

Tail-cuff Plethysmography system was used to determine indirect BP (PanLab LE5001, Barcelona, Spain). All animals were adapted for 5 days to the cylindrical acrylic tube that kept the rats at rest. Animals were kept in a cylindrical acrylic tube, preheated (37 °C) to promote caudal artery vasodilation, and then waited for 5-10 minutes to ensure that the animals were at rest. The cuff was placed in the proximal portion of the tail and connected to the sphygmomanometer to inflate. The measurement was analyzed by the pressure transducer (IITC Inc. Life Science - MRBP-r). The evaluation took place 1 hour after the last nitrite ingestion, and the average of five measurements (1-minute intervals between them) was considered as the result.33

Euthanasia procedures

The animals were euthanized by excess anesthetics, with xylazine hydrochloride (ANASEDAN®, 40mg/kg) and ketamine hydrochloride (DOPALEN®, 160mg/kg), VETEBRANDS Brazil (proportion 1:1, 0.1mg/100g of body weight), and then, decapitation. Euthanasia took place 2 hours after the last nitrite intake. Plasma, cardiac muscle, tibialis anterior, and soleus muscle were collected from the animals.

 Measurement of nitrite concentrations in plasma and tissues

The plasma, cardiac, and muscle tissue (~125mg) were homogenized in a phosphate buffer. After centrifugation, the solution containing the tissues or plasma aliquots was analyzed in duplicate for nitrite concentrations using the ozone-based reductive chemiluminescence method and subsequently evaluated by a gas phase chemiluminescence NO analyzer (Sievers Model 280 analyzer NO; Boulder, CO, USA), as previously described.20,34

Statistical analysis

Descriptive statistics are presented as mean ± standard deviation (SD). The Shapiro-Wilk test was used to test for the normal distribution of the data. A Two-Way ANOVA was used to identify statistical differences in the SBP and plasmatic, muscle, and cardiac nitrite concentrations between groups (SC, SN, TC, and TN). In the presence of interactions, Tukey’s post hoc test was used, and the significant level was defined as p < 0.05.

For PRE and POST comparison in the PWV within groups (SC, SN, TC, and TN), an ANOVA of repeated measures was adopted. The data were analyzed using the SigmaPlot 12.0 statistical package (Systac Software, Inc., San Jose, CA, USA).

 Results

In the central image, we present the main findings of our study. All the groups showed similar results for PWV at the start of the study, demonstrating the homogeneity of the groups in this regard. Both treated groups had lower PWV values compared to the untreated groups (-19% SN vs. SC; -24% TN vs. TC). Figure 1 also shows the comparison between the pre and post-moments. No significant differences were found for the SC and TC groups for PWV. However, the TN (-23%) and SN (-15%) groups showed significant reductions in PWV after the training or treatment period.

– Pulse wave velocity (PWV) before (pre) and after (post) in SC (Sedentary-Control, n=10), SN (Sedentary-Nitrite, n=10), TC (Trained-Control, n=10), and TN (Trained-Nitrite, n=9). *Statistical differences vs. respective control and - (SN vs. SC, p=0.003; and TN vs. TC, p=<0.001); # statistical differences between PRE and POST-intervention – (TN, p=0.007; SN, 0.011); level of significance p<0.05.

Figure 2 presents lower SBP in SN and TC compared to the SC group. This difference reached 12.46 mmHg in the SN group (p=<0.001) and 14.23 mmHg in the TC group (p=<0.001). However, the combination of physical training and oral administration of nitrite did not present additional benefits to those already found in isolation.

– Systolic blood pressure (SBP) values in SC (Sedentary-Control, n=10), SN (Sedentary-Nitrite, n=10), TC (Trained-Control, n=10), and TN (Trained-Nitrite, n=9). *Statistical differences, TC vs SC, p=<0.001; SN vs. SC, p=<0.001; level of significance p<0.05.

Figure 3 presents the nitrite concentrations in the different tissues. It can be observed that both treated groups (SN and TN) presented higher values compared with non-treated groups (SC and TC) in plasma (Figure 3A), heart (Figure 3B) and soleus (Figure 3C), except for the tibialis anterior muscle (Figure 3D).

– Nitrite concentrations in plasma nitrite (A), heart (B), and soleus skeletal muscle (C) and anterior tibial skeletal muscle (D) in SC (Sedentary-Control, n=10), SN (Sedentary-Nitrite, n=10), TC (Trained-Control, n=10), and TN (Trained-Nitrite, n=9). *Statistical differences, Plasm – SN vs. SC, p=0.006; TN vs. TC, p=<0.001; Heart – SN vs. SC, p=0.002; TN vs. TC, p=<0.001; Soleus – SN vs. SC, p=0.005; TN vs. TC, p=0.003; Tibialis Anterior – SN vs. SC, p=0.019; level of significance p<0.05.

No statistical difference was found between the SC and TC groups for plasma nitrite concentration. However, nitrite treatment induced an increase in the SN group (p=0.006) and TN group (p=<0.001) compared with their respective control groups.

The magnitude of the increase in cardiac and skeletal muscle (soleus) nitrite concentration was smaller compared with plasmatic nitrite concentration; however, the same tendency was found. No difference was found between the SC and TC groups for cardiac nitrite concentration. However, nitrite treatment induced an increase in the SN group (by approximately four times) and TN group (by approximately eight times) compared with their respective control groups.

For muscle tissue, no difference was found between SC and TC groups in soleus nitrite concentration and anterior tibial nitrite concentration. Moreover, the treated groups (SN and TN) showed differences concerning their respective controls in the soleus muscle (both by approximately four times). However, in the tibialis anterior muscle, only the SN group showed a difference compared to its control (by approximately three times).

 Discussion

The purpose of this study was to verify the effect of oral nitrite administration on BP and AS in trained and sedentary rats. Briefly, our results demonstrated that the oral nitrite administration for a short period (6 days) was related to a 15% and 22.1% reduction in the PWV in the SN and TN, respectively, compared with groups that did not receive pharmacological treatment.

AS has been extensively studied in experimental animal models,5,6,32,35 and it is considered an important predictor of cardiovascular risk in the general population.7 Although the group that underwent only physical training did not present a reduction in PWV, there is some evidence in the literature that physical exercise promotes benefits on AS. In a systematic review by Lopes et al.,35 it was demonstrated that aerobic training, combined training, and resistance training can promote a reduction in PWV in hypertensive patients.

Nitrite concentration was higher in both groups that received oral nitrite supplementation, which was expected due to the study design. However, these results may contribute to improvements in the vascular endothelium and improvements in NO bioavailability. As a consequence, it contributes to the antihypertensive effects.18 It has been demonstrated that nitrite supplementation protects the vascular endothelium from antioxidant activity, reducing/inhibiting the activity of NADPH oxidase and xanthine oxidoreductase (XOR) in animals,36,37 not evaluated by this study. The inhibition of NADPH oxidase activity is an important mechanism since it is the most prominent source of reactive oxygen species (ROS), and it works by inactivating NO.38-40 Ling et al.18 also demonstrated that oral nitrite administration promotes positive changes in NADPH oxidase expression.

In addition, oral administration of nitrite also proved to be effective in increasing nitrite concentrations in plasma and other tissues (cardiac muscle and soleus), with higher values being found in the treated groups compared to control groups. These results agree with the literature, which reports that nitrite supplementation increases nitrite concentrations in plasma and other tissues.18,30,41 Conversely, in the tibialis anterior muscle, only the sedentary group that received treatment showed high nitrite concentration values. It should also be noted that the literature has shown that there are changes in plasma and tissue nitrite concentrations over time after oral administration.20 Pinheiro et al. showed that the increase in nitrite concentrations in plasma began 15 minutes after treatment and remained high for up to 4 hours. In the heart and skeletal muscle, concentrations remained high up to 2 hours after treatment, thus demonstrating the relationship between concentration and treatment time. Therefore, this relationship confirms our hypothesis that oral administration of sodium nitrite may be an alternative for increasing nitrite concentrations and, consequently, possibly NO bioavailability.

According to the BP results, both interventions, when carried out in isolation, whether physical training or pharmacological treatment, showed a reduction in SBP compared to the sedentary and untreated group. Although many studies have shown that aerobic exercise training does not reduce BP levels in Wistar animals.42,43 In our study, although the animals used in this study were considered normotensive (the strain of animals was normotensive), it can be seen in the SC group that the SBP values were around 140 mmHg, which showed altered BP values. Because of this, treatment with nitrite or physical training were sufficient to normalize BP values. A possible explanation for these results is the increase in NO production and concentration, the decrease in ROS concentration, increase in vascular endothelial growth factor (VEGF), which are responsible for the activation of the angiogenesis mechanism, reduction of Ang-II production, and lower sympathetic activity.10,42,44-46 In addition, nitrite supplementation has demonstrated benefits in vascular relaxation,47 and improvements in cardiac function and remodeling.48

The limitations of this study include the short period of treatment with nitrite, which requires further studies to verify the long-term response. The SBP levels of animals were close to 140 mmHg, which is considered an altered level for Wistar animals, and yet we were only able to assess BP at the end of the protocol. So, we can’t say that the physical training and treatment reduced SBP throughout the program.

 Conclusion

In summary, short-term (6 days) oral administration or an aerobic physical training program promotes several hemodynamic benefits in male Wistar rats, such as improvements in AS and BP. These responses suggest that physical training and sodium nitrite supplementation can be alternatives for the prevention and treatment of hypertension.

 Acknowledgments

This study was financed in part by the National Council for Scientific and Technological Development - BRAZIL (CNPq).

This article is part of the thesis of master submitted by Thiago Pereira de Souza, from Programa de Pós-Graduação em Ciências do Movimento Interunidades - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP).

This study was approved by the Ethics Committee of the CEUA - Faculdade de Ciências - UNESP Bauru under the protocol number 003/2018. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.

This study was funded by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).