Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC 9Xrr3J5kqxPZ5mq4swHKcdR S0066-782X2024001100308 00308 10.36660/abc.20240357 Original Article A Relação Causal entre Microbiota Intestinal e Fibrilação Atrial: Um Estudo de Randomização Mendeliana de Duas Amostras 0009-0002-9393-6950 Zhou Yuan Concepção e desenho da pesquisa e Obtenção de financiamento Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 * Wang Xuan Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito 2 * Guo Jiongchao Análise e interpretação dos dados Análise estatística Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Zhang Lei Análise e interpretação dos dados Análise estatística 1 Zheng Huangsheng Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados 1 Department of Cardiology The First People’s Hospital of Hefei The Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University Hefei China Department of Cardiology, The First People’s Hospital of Hefei, The Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei – China Department of Health Medicine The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Shanxi Province China Department of Health Medicine, The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Shanxi Province – China : Yuan Zhou • Intersection of Huizhou Avenue and Changsha Road, Baohe District, Hefei, Anhui Province, 230001 – China. E-mail: yuan.zhou.hefei@outlook.com

Os autores contribuíram igualmente para este trabalho

Natália Olivetti

Não há conflito com o presente artigo

 06 12 2024 2024 121 11 e20240357 21 05 2024 28 07 2024 04 09 2024 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

: A Relação Causal entre Microbiota Intestinal e Fibrilação Atrial: Um Estudo de Randomização Mendeliana de Duas Amostras

Visão geral do processo de análise de randomização mendeliana (RM) e principais suposições.

Resumo Fundamento

Estudos anteriores caracterizaram adequadamente a microbiota intestinal (MI) na fibrilação atrial (FA). No entanto, a causalidade precisa entre a MI e a FA permanece obscura.

 Objetivos

O presente estudo utilizou dados públicos de estudos de associação genômica ampla para explorar a causalidade entre MI e FA.

 Métodos

Na primeira de duas rodadas de análise de randomização mendeliana (RM), as variáveis instrumentais (VIs) incluíram polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) que ficaram abaixo do limite de significância estatística de todo o genoma (5 × 10-8). Para chegar a uma conclusão mais abrangente e inclusiva, selecionamos ainda SNPs abaixo do nível de significância de todo o lócus (1 × 10-5) como VIs para o segundo grupo. A análise de RM considerou o efeito causal estatisticamente significativo entre MI específica e FA quando p < 0,05. Além disso, na análise de sensibilidade, p > 0,05 não indicou heterogeneidade nem pleiotropia.

 Resultados

No limiar de significância de todo o lócus, os resultados demonstraram um impacto causal da MI no risco de FA. O método de ponderação de variância inversa indicou que Actinobacteria, Firmicutes, Alloprevotella, Bifidobacterium, Blautia, Eggerthella, Howardella, Ruminococcaceae UCG004 e Ruminococcus1 foram negativamente correlacionados com FA, ao passo que Pasteurellales, Pasteurellaceae, Oxalobacter, Ruminiclostridium5 e Turicibacter foram positivamente correlacionados. Além disso, no limiar de significância de todo o genoma, Actinobacteria, Bifidobacteriaceae e Bifidobacterium foram fatores de proteção para o risco de desenvolver FA, ao passo que Oxalobacteraceae e Erysipelatoclostridium foram fatores de risco para FA. Entretanto, análises de sensibilidade mostraram heterogeneidade ou pleiotropia horizontal nos resultados para Actinobacteria, Howardella, Oxalobacter e Firmicutes.

 Conclusões

Este estudo fornece evidências da existência de causalidade favorável e desfavorável da MI no risco de FA.

 Análise da Randomização Mendeliana Microbioma Gastrointestinal Fibrilação Atrial Doenças Cardiovasculares Introdução

A fibrilação atrial (FA) é uma arritmia prevalente e complexa que geralmente se manifesta em indivíduos com mais de 60 anos e atualmente afeta mais de 370 mil indivíduos em todo o mundo.1 A FA é caracterizada por interrupções no processo de despolarização dos átrios, podendo resultar em sintomas como palpitações, desconforto no peito, falta de ar e tensão psicológica devido às contrações atriais irregulares.2 Complicações mais sérias, incluindo acidentes vasculares cerebrais isquêmicos (infartos cerebrais), insuficiência cardíaca e até morte, também podem ocorrer.3 Observações clínicas e pré-clínicas indicam uma combinação de diversos fatores de risco cardiovascular modificáveis que influenciam o início e o avanço da FA, como idade, sexo, doença arterial coronária, insuficiência cardíaca, hipertensão, diabetes mellitus e obesidade.4 Necessita-se urgentemente da elucidação adicional da patogênese da FA para melhorar sua prevenção e tratamento.

O intestino humano serve como habitat para diversos microrganismos não patogênicos, conhecidos coletivamente como microbiota intestinal (MI), que é essencial para moldar e facilitar as operações dos sistemas metabólico e imunológico. Estudos clínicos recentes e experimentos de base revelaram que a MI possivelmente influencia as vias de doenças por meio dos metabólitos gerados nos intestinos. Notavelmente, a associação entre MI e doenças cardiovasculares (DCV) ganhou força significativa em pesquisas em andamento. Em um estudo, o conteúdo fecal de doadores humanos hipertensos foi transplantado em camundongos livres de germes e os aumentos diretos subsequentes na pressão arterial puderam ser atribuídos à MI.5 Além disso, descobriu-se que a MI contribui para a exacerbação da função cardíaca e progressão da fibrose miocárdica em camundongos com insuficiência cardíaca por meio do metabolismo da colina da dieta em N-óxido de trimetilamina (TMAO).6 Embora alguns estudos tenham abordado o perfil diversificado da MI na FA, ainda não está claro se existe uma relação causal entre MI e FA.

A técnica de randomização mendeliana (RM), que envolve a fusão de dados agregados de estudos de associação genômica ampla (GWAS), permite mitigar a influência de fatores de confusão. Portanto, a RM se destaca como uma abordagem predominante para deduzir a existência de uma conexão causal entre exposição e resultado. Variantes genéticas que exibem associações significativas com a exposição são escolhidas como variáveis instrumentais (VIs) para deduzir causalidade. Se a exposição for causal, as VIs que afetam a exposição influenciarão o resultado proporcionalmente.7 No estudo atual, foi realizada RM de duas amostras para examinar se existe uma relação causal entre MI e o risco de FA.

 Métodos Fontes de dados

Aproveitando dados do consórcio MiBioGen, Kurilshikov et al.8 aproveitaram perfis de sequenciamento do gene 16S rRNA e informações de genotipagem de uma coleção de 18.340 amostras para explorar a intrincada interação entre variantes genéticas e a MI. A totalidade dos participantes do consórcio MiBioGen abrangeu populações europeias de 11 países, constituindo um coletivo de 25 coortes distintas. Por meio de um exame das variações nos táxons da MI, o estudo GWAS por fim extraiu 122.110 locais distintos de variação genética originários de 211 táxons em vários níveis (filo, classe, ordem, família, gênero). A partir desse GWAS em larga escala, as VIs correspondentes aos táxons da MI foram derivadas em cinco níveis. Como os dados adquiridos do consórcio MiBioGen não tinham análise no nível de espécie, também obtivemos VIs para táxons da MI no nível de espécie do estudo TwinsUK Registro GWAS.9 Goodrich et al. geraram VIs de táxons da MI no nível de espécie a partir de 1.126 pares de gêmeos para dados de sequenciamento de 16S rRNA, definindo, por fim, quatro espécies qualificadas.9

As estatísticas resumidas do GWAS para FA foram extraídas da versão mais recente (versão R9) do projeto de pesquisa FinnGen (https://r9.finngen.fi/).10 As análises foram realizadas usando 45.766 casos de FA e 191.924 controles após ajustes para idade, sexo, parentesco genético, lote de genotipagem e os primeiros 10 componentes principais separadamente.

Para o desenho de um estudo de RM válido, o tamanho da amostra necessária deve ser calculado. De acordo com a teoria estatística assintótica,11,12 o tamanho mínimo da amostra derivado do uso de ferramentas da web disponíveis (https://sb452.shinyapps.io/power/) no nível de significância (< 0,05) e poder (> 80%) dado deve ser 9900. O tamanho da amostra incluído em nosso estudo de pesquisa conseguiu atender aos critérios.

 Seleção de polimorfismo de nucleotídeo único

Para garantir a credibilidade e a precisão das conclusões sobre o nexo causal entre MI e o risco de FA, diversos procedimentos de controle de qualidade foram empregados para escolher meticulosamente as VIs mais confiáveis. Primeiro, os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) que exibiam associações significativas com a MI foram escolhidos como VIs, com dois limites distintos aplicados para facilitar essa seleção e atingir um escopo mais abrangente de resultados: uma coleção de SNPs abaixo do limite de significância estatística de todo o genoma (5 × 10-8), bem como um grupo adicional de SNPs abaixo do nível de significância de todo o lócus (1 × 10-5).13 Em segundo lugar, foi necessário avaliar a força da correlação entre VIs e exposição. Essas avaliações são normalmente realizadas por meio da estatística F, que foi calculada como F=R2(n−k−1)/k(1−R2), onde R2 representa a variância de exposição explicada pelos SNPs selecionados, n é o tamanho da amostra e k representa o número de VIs incluídas. Se a estatística F for menor que 10, isso significa uma conexão fraca entre VIs e exposição, então os SNPs que contribuem para essas VIs foram excluídos. Em segundo lugar, o limite para a frequência do alelo menor (MAF) da variante em consideração foi definido em 0,01. Terceiro, os SNPs em alto desequilíbrio de ligação (LD) foram excluídos das VIs; a presença de LD substancial poderia introduzir resultados tendenciosos. Neste estudo, o LD entre os SNPs incluídos foi avaliado pelo processo de aglomeração (R2 < 0,001 e distância de aglomeração = 10.000 kb). Quarto, uma faceta fundamental da RM envolve a confirmação de que os efeitos dos SNPs na exposição pertencentes ao mesmo alelo se alinham com os efeitos no resultado. Em conformidade com esse princípio, os SNPs palindrômicos foram excluídos das VIs. Quinto, nos casos em que os SNPs vinculados à exposição não foram identificados no resultado GWAS, SNPs substitutos que apresentaram associações significativas com as variantes pertinentes foram substituídos (r2> 0,8).

 As suposições da randomização mendeliana

Para realizar uma análise de RM de duas amostras precisa e padronizada, as três suposições abaixo tiveram que ser atendidas:14 (1) as VIs incluídas para utilização devem exibir uma forte associação com os táxons da MI; (2) as VIs incluídas e os fatores de confusão (que influenciam a MI e a FA) devem permanecer independentes uns dos outros; e (3) não deve existir nenhuma pleiotropia horizontal, o que significa que as VIs afetam a FA apenas por meio dos táxons da MI. Nossos resultados foram relatados simultaneamente seguindo as orientações MR-STROBE15 (Tabela S1). Este estudo não exigiu consentimento informado ou aprovação ética porque utilizou dados disponíveis publicamente.

 Análise estatística

No presente estudo, empregamos diferentes técnicas de RM, incluindo ponderação de variância inversa (IVW), MR-Egger, mediana ponderada, modo simples e modo ponderado, para verificar a possível influência causal da composição da MI no risco de FA. Neste cenário, o método primário empregado para análise de RM foi o IVW, que funciona essencialmente como uma técnica de meta-análise que se transforma em uma regressão ponderada dos efeitos dos resultados das VIs sobre os efeitos da exposição para produzir uma estimativa abrangente da influência da MI no risco de FA, ao mesmo tempo em que restringe o intercepto a zero. Na ausência de pleiotropia horizontal, o IVW poderia efetivamente contornar a influência de fatores de confusão, permitindo estimativas imparciais.16 Além disso, existem vários outros métodos para complementar os resultados do IVW. A regressão MR-Egger pode identificar e contabilizar a pleiotropia, embora essa abordagem frequentemente gere estimativas com precisão limitada.17 A abordagem da mediana ponderada fornece estimativas confiáveis considerando a suposição de que um mínimo de 50% das VIs são válidas.18 Embora o modo simples possa não possuir o mesmo nível de potência que o IVW, ele oferece resiliência contra os efeitos da multivalência.19 Por fim, o modo ponderado é suscetível a variações na seleção da largura de banda para estimativa do modo.20

As análises de sensibilidade geralmente foram realizadas em três etapas. A regressão MR-Egger, um método que permite identificar e contabilizar a pleiotropia na análise de RM ao mesmo tempo em que deriva estimativas de efeitos causais e analisa se os resultados são influenciados pela pleiotropia horizontal direcionada, foi inicialmente aplicada para avaliar a possível presença de efeitos de pleiotropia horizontal entre os SNPs incluídos.17,21Considerando as limitações de precisão e poder estatístico associadas à regressão MR-Egger, a abordagem de soma residual e valores discrepantes da pleiotropia RM (MR-PRESSO) foi empregada para identificar possíveis valores discrepantes que poderiam indicar viés de pleiotropia e, posteriormente, corrigir os efeitos de pleiotropia horizontal.22 Por fim, a estatística Q de Cochran foi empregada para medir o grau de heterogeneidade entre os SNPs selecionados.23,24

Todas as análises estatísticas foram executadas usando o software R (versão 4.3.1). O pacote R TwoSampleMR (versão 0.5.7, Stephen Burgess, Chicago, IL, EUA) foi usado para realizar análises de RM de causalidade entre MI e FA. P < 0,05 foi considerado um possível efeito causal estatisticamente significativo entre exposição e desfecho.

 Resultados Fontes de dados

A Figura Central ilustra o desenho do estudo e o fluxo específico da análise de RM entre MI e FA. As estatísticas resumidas do GWAS para a MI foram obtidas do consórcio MiBioGen e do consórcio TwinsUK Registry, que contêm 18.340 e 1.126 indivíduos, respectivamente. Além disso, as estatísticas resumidas do GWAS para FA foram obtidas do consórcio FinnGen, que contém 45.766 casos de FA e 191.924 controles. A Tabela 1 mostra os detalhes de três conjuntos de dados.

– Descrição das fontes de dados para microbiota intestinal e fibrilação atrial
Características Consórcio Tamanho da amostra População Ano Periódico
Microbiota intestinal MiBioGen 18.340 indivíduos Europeia 2021 Nature Genetics
TwinsUK Registry 1.126 indivíduos Europeia 2016 Cell Host & Microbe
Fibrilação atrial FinnGen (R9) 45.766 casos e 191.924 controles Europeia 2022 Nature

Seleção das variáveis instrumentais

Após uma rigorosa etapa de controle de qualidade, 2.182 SNPs foram identificados como VIs associados a 207 táxons da MI no nível de significância de todo o lócus (p < 1 × 10-5). Esses táxons compreendiam quatro espécies (14 SNPs), nove filos (102 SNPs), 10 classes (109 SNPs), 19 ordens (210 SNPs), 35 famílias (385 SNPs) e 130 gêneros (1.362 SNPs). Cada SNP apresentou validade suficiente (variando de 14,59 a 88,43, todos F > 10; Tabela 2). A Tabela S2 fornece informações abrangentes sobre as VIs.

– Seleção das VIs após controle de qualidade
Taxonomias p < 1e-05 p < 5e-08
Táxons VIs Alcance (estatísticas F) Táxons VIs Alcance (estatística F)
Espécie 4 14 22,50-30,84 1 2 30,25-30,84
Filo 9 102 16,97-58,16 1 1 58,16
Classe 10 109 17,61-85,38 1 1 85,38
Ordem 19 210 17,68-85,37 1 1 30,07
Família 35 385 16,91-85,37 5 6 29,81-85,37
Gênero 130 1362 14,59-88,43 11 12 29,35-88,43
Total 207 2182 14,59-88,43 20 23 29,35-88,43

VIs: variáveis instrumentais.

Além disso, no limiar de significância estatística de todo o genoma (p < 5 × 10-8), apenas 23 SNPs foram identificados como VIs, associados a 20 táxons da MI. Esses táxons compreendiam uma espécie (2 SNPs), um filo (1 SNP), uma classe (1 SNP), uma ordem (1 SNP), cinco famílias (6 SNPs) e 11 gêneros (12 SNPs). Cada SNP individual apresentou validade satisfatória (variando de 29,35 a 88,43, todos F > 10; Tabela 2). A Tabela S3 apresenta detalhes essenciais das VIs.

 Análise de randomização mendeliana no nível de significância de todo o lócus

Com base no nível de significância de todo o lócus, a Figura 1A descreve graficamente a relação entre MI e FA pela análise de RM. Além disso, uma visão geral abrangente dos resultados pode ser encontrada na Tabela S4. Entre os resultados de RM, descobrimos que a abundância relativa geneticamente prevista de dois filos, uma ordem, uma família e 10 gêneros estava causalmente associada à FA. Em relação às classificações de filos biológicos, o método IVW demonstrou que Actinobacteria e Firmicutes foram negativamente correlacionados com o risco de FA (Figura 1B). Além disso, as estimativas do IVW por RM indicaram que a ordem de Pasteurellales e a família de Pasteurellaceae estavam positivamente correlacionadas com o risco de FA (Figura 1B). Em relação ao gênero, as estimativas do IVW por RM indicaram que Alloprevotella, Bifidobacterium, Blautia, Eggerthella, Howardella, Ruminococcaceae UCG004 e Ruminococcus1 foram fatores de proteção para FA. Em contraste, Oxalobacter, Ruminiclostridium5 e Turicibacter foram fatores de risco para FA (Figura 1B). Os outros dois táxons da MI (espécie e classe) não mostraram relação com FA por IVW.

– Análise causal da microbiota intestinal (MI) e fibrilação atrial (FA) no nível de significância de todo o lócus (p<1x10-5). (A) Todos os resultados da análise de randomização mendeliana (RM) e análise de sensibilidade entre MI e FA. (B) Resultados de RM dos táxons da MI com relação causal com a FA usando o método de ponderação de variância inversa (IVW).

A Tabela S5 demonstra ainda os resultados da análise de sensibilidade, que indicam que não houve heterogeneidade ou pleiotropia horizontal em Pasteurellaceae, Alloprevotella, Bifidobacterium, Eggerthella, Ruminiclostridium5, Ruminococcaceae UCG004, Ruminococcus1, Turicibacter ou Pasteurellales. Além disso, MR-PRESSO não encontrou valores atípicos nesses táxons da MI. Entretanto, a heterogeneidade apareceu em três táxons da MI: Howardella, Oxalobacter e Firmicutes (Tabela S5). Portanto, usamos os resultados dos efeitos aleatórios do IVW para resolver esse problema. Simultaneamente, um táxon da MI exibiu evidências de pleiotropia horizontal, a saber, Actinobacteria, mas a análise MR-PRESSO subsequente indicou que esse táxon em particular não continha nenhum SNP atípico que exigisse remoção (Tabela S5).

 Análise de randomização mendeliana no nível de significância de todo o genoma

Dependendo do limite de significância estatística de todo o genoma, a Figura 2A representa visualmente a associação entre MI e FA por meio da análise de RM. Além disso, uma apresentação abrangente dos resultados é fornecida na Tabela S6. Entre os resultados de RM, descobrimos que a abundância relativa geneticamente prevista de um filo, uma classe, uma ordem, duas famílias e dois gêneros estava causalmente associada à FA. Os resultados da razão de Wald demonstraram que o filo de Actinobacteria e a classe de Actinobacteria estavam negativamente correlacionados com o risco de FA (Figura 2B). Quanto à família, Bifidobacteriaceae foi negativamente correlacionada com o risco de FA usando o método IVW, e Oxalobacteraceae foi positivamente correlacionada com o risco de FA usando o método da razão de Wald (Figura 2B). Além disso, quanto ao gênero, Bifidobacterium foi um fator de proteção para FA usando o método IVW, e Erysipelatoclostridium foi um fator de risco para FA usando o método da razão de Wald (Figura 2B).

– Análise causal da microbiota intestinal (MI) e fibrilação atrial (FA) no limiar de significância estatística de todo o genoma (p<5x10-8). (A) Todos os resultados da análise de randomização mendeliana (RM) e análise de sensibilidade entre MI e FA. (B) Resultados de RM dos táxons da MI com relação causal com a FA usando o método de ponderação de variância inversa (IVW) ou razão de Wald.

A Tabela S7 exibe os resultados do teste de heterogeneidade conduzido para táxons da MI apresentando dois SNPs. A heterogeneidade e a pleiotropia horizontal não puderam ser examinadas porque apenas um SNP foi incluído nos outros táxons da MI.

 Discussão

Pesquisas anteriores demonstraram o envolvimento significativo da ecologia microbiana intestinal no início e no avanço de várias doenças cardiovasculares, incluindo hipertensão, aterosclerose e insuficiência cardíaca. Li et al.5 revelaram que indivíduos com pré-hipertensão e hipertensão apresentam não apenas diminuição da abundância genética e da diversidade α em comparação com controles saudáveis, como também uma proporção elevada de bactérias Prevotella. Concomitantemente, uma análise macrogenômica25 demonstrou que a MI de indivíduos com doença cardiovascular aterosclerótica apresentava níveis elevados de espécies de Streptococcus e Enterobacteriaceae, em contraste com a MI de indivíduos saudáveis. Além disso, uma investigação comparativa de bactérias fecais26 entre indivíduos com insuficiência cardíaca crônica e seus pares saudáveis indicou que aqueles com insuficiência cardíaca exibiram uma maior colonização de bactérias patogênicas, incluindo Campylobacter, Shigella, Salmonella e Yersinia enterocolitica.

A FA é um tipo mais específico de DCV. Vários estudos anteriores identificaram perfis de MI distintos entre indivíduos com FA, sendo que a FA demonstra alterações significativas na diversidade microbiana intestinal em comparação com indivíduos controle. Um aumento na abundância de Ruminococcus, Streptococcus e Enterococcus, juntamente com uma diminuição de Faecalibacterium, Alistipes, Oscillibacter e Bilophila, foi observado em pacientes com FA.27 Além disso, a interrupção do equilíbrio ecológico intestinal tem sido associada ao avanço e à duração da FA. Uma investigação recente de Zuo et al.28 revelou distinções na diversidade microbiana e na composição de metabólitos entre pacientes com FA paroxística, com FA persistente e sem FA. Além disso, bactérias específicas exibiram enriquecimentos variados correspondentes a diferentes durações de FA. Por exemplo, na FA persistente, a abundância de Butyricoccus e Paraprevotella diminuiu, enquanto a abundância de Dorea e Coprococcus apresentou aumento.29 Curiosamente, um aumento no enriquecimento de bactérias benéficas e uma diminuição no enriquecimento de bactérias patogênicas na MI, bem como alterações correspondentes nos níveis de metabólitos, puderam ser observados após a ablação, em comparação com pacientes com FA antes da ablação por radiofrequência.30

Entretanto, a maioria dos estudos anteriores foram estudos observacionais e de pequenas coortes, e os tipos de MI incluídos foram frequentemente limitados. Além disso, muitos estudos exploraram apenas as características da MI na FA sem examinar se a MI poderia influenciar o início da FA. Existia, portanto, a necessidade de caracterizar de forma mais completa a relação causal entre MI e FA. Utilizamos os mais amplos e atualizados dados GWAS para MI e FA, para SNPs intimamente relacionados como VIs. Primeiro, por meio da análise de RM no nível de significância de todo o lócus, identificamos Actinobacteria, Firmicutes, Alloprevotella, Bifidobacterium, Blautia, Eggerthella, Howardella, Ruminococcaceae UCG004 e Ruminococcus como sendo negativamente correlacionados com a ocorrência de FA, e Pasteurellales, Pasteurellaceae, Oxalobacter, Ruminiclostridium5 e Turicibacter como sendo positivamente correlacionados com FA. Em segundo lugar, de acordo com o limiar de significância estatística de todo o genoma, identificamos Actinobacteria, Bifidobacteriaceae e Bifidobacterium como fatores de proteção para o risco de ocorrência de FA, enquanto Oxalobacteraceae e Erysipelatoclostridium foram fatores de risco para FA. Os resultados para Actinobacteria, Howardella, Oxalobacter e Firmicutes devem ser interpretados com mais cautela devido à presença de heterogeneidade ou pleiotropia horizontal.

Nosso estudo identificou um total de 10 táxons da MI associados positivamente à FA e sete que foram associados negativamente. Primeiro, Actinobacteria e Bifidobacterium foram particularmente importantes para reduzir a ocorrência de FA, pois foi comprovado que estavam fortemente correlacionadas negativamente com FA, não apenas no nível de significância de todo o foco, mas também no limiar de todo o genoma, indicando novamente a importância desses dois táxons da MI para prevenir o surgimento de FA. O estudo FINRISK 200231 observou que Bifidobacterium estava negativamente correlacionado com a prevalência de FA e positivamente correlacionado a incidentes de FA. Além disso, Li et al.32 exibiram uma diminuição significativa na abundância de Bifidobacterium em pacientes com FA em comparação aos controles, independentemente de terem recebido terapia anticoagulante oral (ACO) de longo prazo. Apesar da falta de estudos relevantes demonstrando o envolvimento de Actinobacteria com o desenvolvimento de FA, Li et al.32 também descobriram que as cepas enriquecidas (Actinobacteria) presentes em FA submetidas a ACOs de longo prazo estavam positivamente correlacionadas com o tempo de protrombina (p < 0,05), o que pode aumentar o risco de sangramento em pacientes com FA. Notavelmente, a capacidade das Actinobacteria de mitigar o risco de desenvolver FA tem sido uma observação única até o momento. Em segundo lugar, embora não tenha mostrado uma associação causal com FA no limiar de significância estatística de todo o genoma, um subconjunto adicional de táxons da MI ainda sugeria o desenvolvimento da FA, incluindo Firmicutes, Alloprevotella, RuminococcaceaeUCG004, Ruminococcus1, Oxalobacter e Turicibacter. Semelhante às nossas descobertas, Ruminococcus demonstrou estar negativamente associado às pontuações CHA2DS2-VASc, o que significa que a disponibilidade de Ruminococcus pode resultar em um risco reduzido de FA. No entanto, Zuo et al.27 detectaram crescimento excessivo de Ruminococcus em pacientes com FA. Enquanto isso, outro estudo da mesma equipe33 descobriu maior indução de FA em camundongos privados de sono (SD) e descobriu que tais camundongos tinham maiores abundâncias de Ruminococcus e Alloprevotella, o que sugere que essas espécies de bactérias podem ser alvos promissores para a suscetibilidade à FA mediada pela privação de sono. Também diferiu de nossas descobertas, pois o estudo FINRISK 200231 considerou que Turicibacter estava negativamente associado à FA prevalente, enquanto Firmicutes foi considerado equivalente em pacientes com FA e controles no estudo de Li et al.32 Embora o gênero Oxalobacter previsto geneticamente tenha sido positivamente associado ao risco de desenvolver doença arterial coronária em uma análise de RM (OR)=1,06;p=1,67×10−4),34 nosso estudo concluiu que Oxalobacter e Oxalobacteraceae foram fatores de risco para o desenvolvimento de FA, o que complementa e refina as conclusões de estudos anteriores. Por fim, existe um subconjunto de táxons da MI cuja relação com a FA não foi abordada em estudos anteriores, incluindo Blautia, Eggerthella, Howardella, Pasteurellales, Pasteurellaceae, Ruminiclostridium5 e Erysipelatoclostridium. Portanto, nossa pesquisa preenche, de modo satisfatório, essa parte da lacuna.

Os mecanismos que desregulam a ecologia intestinal e, portanto, promovem a FA vêm de duas fontes principais. Primeiro, a desregulação da MI pode causar FA por meio de inflamação. Zhang et al.35 demonstraram pela primeira vez que alterações na MI relacionadas à idade levaram ao aumento das concentrações de lipopolissacarídeos (LPS) e à diminuição da tolerância à glicose, o que aumentou a fibrose atrial e promoveu o desenvolvimento de FA. Os mecanismos subjacentes aos efeitos proarrítmicos atriais causados pelos LPS podem ser atribuídos à ligação de nucleotídeos nos átrios e à ativação de vesículas inflamatórias NLRP3. Sequencialmente, os metabólitos derivados da MI também tiveram uma função vital na patogênese da FA. Ao serem absorvidos pelo intestino do hospedeiro, os metabólitos derivados da MI foram capazes de influenciar células imunes no intestino, além de atuar como moléculas de sinalização e influenciar importantes vias metabólicas. Por exemplo, TMAO, que é derivado da colina e da carnitina da dieta, exacerbou o aumento da atividade neural e induziu FA por meio da estimulação atrial, possivelmente porque TMAO poderia estimular a liberação de fatores inflamatórios e ativar a via de sinalização p65 NF-κB.36 Além disso, o indoxil sulfato (IS) foi a toxina urêmica mais comum, derivada do metabolismo do triptofano da dieta. Em estudos com animais, o IS pode contribuir para o início da FA ao aumentar a expressão de moléculas de sinalização, como fatores pró-inflamatórios e pró-fibróticos, induzindo assim o estresse oxidativo.37 Mais pesquisas básicas ainda são necessárias para explorar se existem mecanismos adicionais pelos quais a MI regula a FA.

Várias imitações desta obra também devem ser abordadas. Primeiro, apesar das três premissas fundamentais da RM terem sido atendidas, nenhuma garantia absoluta de viés instrumental fraco pode ser feita. Em segundo lugar, devido à disponibilidade inadequada de um número substancial de VIs para análise de RM reversa, não conseguimos determinar uma possível relação causal recíproca entre MI e FA. Terceiro, como o GWAS abrangeu apenas populações europeias, as descobertas deste estudo podem não ser universalmente aplicáveis a outros grupos étnicos. Quarto, empregar inúmeras correções estatísticas rigorosas e conservadoras poderia ser excessivamente restritivo, possivelmente negligenciando os táxons da MI que poderiam ter conexões causais com a FA. Considerando a plausibilidade biológica, consequentemente, não incorporamos os resultados de múltiplos testes. Por fim, este estudo marcou a tentativa inaugural de examinar a associação entre táxons da MI e risco de FA por meio de análise de RM no nível de espécie. Entretanto, é importante ressaltar que não foram detectados resultados positivos em nível de espécie. Considerando as distintas fontes de dados utilizadas para a análise em nível de espécie, em contraste com os outros cinco níveis e reconhecendo a diferença substancial nos tamanhos de amostra entre o GWAS conduzido por Goodrich et al.9 e o de Kurilshikov et al.,8 tornou-se evidente que a seleção potencial de VIs foi bastante limitada. Portanto, essa descoberta no nível de espécie foi apenas uma exploração preliminar.

 Conclusões

Concluindo, este estudo de RM demonstrou o efeito causal da MI na FA, encontrando 10 táxons da MI que foram correlacionados positivamente com a FA, bem como sete que foram correlacionados negativamente. Esses tipos de táxons da MI podem servir como novos biomarcadores e fornecer insights sobre o tratamento e a prevenção da FA.

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Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Este artigo não contém estudos com humanos ou animais realizados por nenhum dos autores.

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O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

 10.36660/abc.20240357i Original Article The Causal Relationship between Gut Microbiota and Atrial Fibrillation: A Two-Sample Mendelian Randomization Study 0009-0002-9393-6950 Zhou Yuan Conception and design of the research and Obtaining financing Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 * Wang Xuan Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript 2 * Guo Jiongchao Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Critical revision of the manuscript for content 1 Zhang Lei Analysis and interpretation of the data Statistical analysis 1 Zheng Huangsheng Acquisition of data Analysis and interpretation of the data 1 China Department of Cardiology, The First People’s Hospital of Hefei, The Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei – China China Department of Health Medicine, The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Shanxi Province – China Mailing Address: Yuan Zhou • Intersection of Huizhou Avenue and Changsha Road, Baohe District, Hefei, Anhui Province, 230001 – China. E-mail: yuan.zhou.hefei@outlook.com

The authors contributed equally to this work

Natália Olivetti

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

The Causal Relationship between Gut Microbiota and Atrial Fibrillation: A Two-Sample Mendelian Randomization Study

Overview of Mendelian randomization (MR) analysis process and major assumptions.

Abstract Background

Previous studies have adequately characterized the gut microbiota (GM) in atrial fibrillation (AF). Nevertheless, the precise causality between GM and AF remains elusive.

 Objectives

This study utilized public data from genome-wide association studies to explore the causality between GM and AF.

 Methods

In the first of two rounds of Mendelian randomization (MR) analysis, the instrumental variables (IVs) comprised single nucleotide polymorphisms (SNPs) that fell below the genome-wide statistical significance threshold (5 × 10-8). To attain a more comprehensive and inclusive conclusion, we further selected SNPs falling below the locus-wide significance level (1 × 10-5) as IVs for the second group. The MR analysis considered the statistically significant causal effect between the specific GM and AF when p < 0.05. Furthermore, in sensitivity analysis, p > 0.05 indicated no heterogeneity and pleiotropy.

 Results

At the locus-wide significance threshold, the findings demonstrated a causal impact of GM on AF risk. The inverse variance weighting method indicated that Actinobacteria, Firmicutes, Alloprevotella, Bifidobacterium, Blautia, Eggerthella, Howardella, Ruminococcaceae UCG004, and Ruminococcus1 were negatively correlated with AF, while Pasteurellales, Pasteurellaceae, Oxalobacter, Ruminiclostridium5, and Turicibacter were positively correlated. Furthermore, at the genome-wide significance threshold, Actinobacteria, Bifidobacteriaceae, and Bifidobacterium were protective factors for the risk of developing AF, whereas Oxalobacteraceae and Erysipelatoclostridium were risk factors for AF. However, sensitivity analyses showed heterogeneity or horizontal pleiotropy within the outcomes for Actinobacteria, Howardella, Oxalobacter, and Firmicutes.

 Conclusions

This study provides evidence for the existence of both favorable and unfavorable causality of GM on AF risk.

 Mendelian Randomization Analysis Gastrointestinal Microbiome Atrial Fibrillation Cardiovascular Diseases Introduction

Atrial fibrillation (AF) is a prevalent and intricate arrhythmia that typically manifests in individuals over the age of 60 and currently impacts over 370,000 individuals globally.1 AF is distinguished by disruptions in the depolarization process of the atria, potentially resulting in symptoms such as palpitations, chest discomfort, breathlessness, and psychological strain due to irregular atrial contractions.2 More serious complications, including ischemic strokes (cerebral infarctions), cardiac insufficiency, and even death, can also occur.3 Both clinical and preclinical observations indicate that a multitude of modifiable cardiovascular risk factors coalesce to influence the onset and advancement of AF, such as age, gender, coronary artery disease, heart failure, hypertension, diabetes mellitus, and obesity.4 The further elucidation of AF pathogenesis is urgently needed to improve its prevention and treatment.

The human gut serves as a habitat for a diverse array of non-pathogenic microorganisms collectively known as the gut microbiota (GM), which is pivotal in shaping and facilitating the operations of metabolic and immune systems. Recent clinical studies and foundational experiments have revealed that GM potentially influences disease pathways through the metabolites generated within the intestines. Notably, the association between GM and cardiovascular disease (CVD) has gained significant traction in ongoing research. In one study, the fecal contents of hypertensive human donors were transplanted into germ-free mice, whose subsequent direct increases in blood pressure could be attributed to the GM.5 Furthermore, the GM was found to contribute to the exacerbation of cardiac function and progression of myocardial fibrosis in mice with heart failure through the metabolism of dietary choline into trimethylamine N-oxide (TMAO).6 Although some studies have elaborated upon the diverse GM profile of AF, whether a causal relationship exists between GM and AF remains unclear.

The Mendelian randomization (MR) technique, which involves the amalgamation of aggregated data from genome-wide association studies (GWAS), allows for the mitigation of the confounding influence of factors. Hence, MR stands as a prevalent approach for deducing the existence of a causal connection between exposure and outcome. Genetic variants exhibiting significant associations with exposure are chosen as instrumental variables (IVs) to deduce causality. If exposure is causal, the IVs that affect exposure will influence the outcome proportionally.7 In the current study, two-sample MR was performed to examine whether a causal relationship exists between the GM and AF risk.

 Methods Data sources

Leveraging data from the MiBioGen consortium, Kurilshikov et al.8 harnessed 16S rRNA gene sequencing profiles and genotyping information from a collection of 18,340 samples to explore the intricate interplay between genetic variants and the GM. The entirety of subjects within the MiBioGen consortium encompassed European populations spanning 11 countries, constituting a collective of 25 distinct cohorts. Through an examination of variations in GM taxa, the GWAS study ultimately extracted 122,110 distinct genetic variation sites originating from 211 taxa at various levels (phylum, class, order, family, genus). From this large-scale GWAS, IVs corresponding to GM taxa were derived across five levels. Since the data acquired from the MiBioGen consortium lacked analysis at the species level, we also procured IVs for GM taxa at the species level from the TwinsUK Registry GWAS study.9 Goodrich et al. generated IVs of GM taxa at the species level from 1,126 pairs of twins for 16S rRNA sequencing data, ultimately defining four qualifying species.9

GWAS summary statistics for AF were excerpted from the newest release (Version R9) of the FinnGen research project (https://r9.finngen.fi/).10 Analyses were undertaken using 45,766 AF cases and 191,924 controls after adjusting for age, sex, genetic relatedness, genotyping batch, and the first 10 principal components separately.

In order to design a valid MR study, the required sample size should be calculated. According to asymptotic statistical theory,11,12 the minimum sample size derived from the use of available web tools (https://sb452.shinyapps.io/power/) at the given level of significance (< 0.05) and power (> 80%) should be 9900. The sample size included in our research study could fulfill the criteria.

 Single nucleotide polymorphism selection

To ensure the credibility and precision of the conclusions regarding the causal link between GM and AF risk, a series of quality control procedures were employed to choose the most reliable IVs meticulously. First, single nucleotide polymorphisms (SNPs) displaying significant associations with the GM were chosen as IVs, with two distinct thresholds applied to facilitate this selection and achieve a more comprehensive scope of results: a collection of SNPs below the genome-wide statistical significance threshold (5 × 10-8), as well as an additional group of SNPs below the locus-wide significance level (1 × 10-5).13 Second, it was necessary to assess the strength of the correlation between IVs and exposure. Such evaluations are typically accomplished through the F-statistic, which was calculated as F=R2(n−k−1)/k(1−R2) , where R2 represents the exposure variance explained by the selected SNPs, n is the sample size, and k represents the number of included IVs. If the F-statistic is less than 10, it signifies a weak connection between IVs and exposure, so the SNPs that contribute to these IVs were excluded. Second, the threshold for the minor allele frequency (MAF) of the variant under consideration was set at 0.01. Third, SNPs in high linkage disequilibrium (LD) were excluded from the IVs; the presence of substantial LD could potentially introduce biased outcomes. In this study, LD among the included SNPs was assessed by the clumping process (R2 < 0.001, and clumping distance = 10,000 kb). Fourth, a pivotal facet of MR involves confirming that the effects of the SNPs on the exposure pertaining to the same allele align with the effects on the outcome. In adherence to this principle, palindromic SNPs were excluded from the IVs. Fifth, in instances where SNPs linked to exposure were not identified in the outcome GWAS, proxy SNPs that displayed significant associations with the pertinent variants were substituted (r2 > 0.8).

 The assumptions of mendelian randomization

To perform an accurate and standardized two-sample MR analysis, the following three assumptions had to be met:14 (1) the IVs eventually included for utilization must exhibit a strong association with GM taxa; (2) the included IVs and confounders (influencing the GM and AF) must remain independent of each other; and (3) no horizontal pleiotropy should exist, meaning that the IVs affect AF only through GM taxa. Our findings were simultaneously reported following the MR-STROBE guidance15 (Table S1). This study did not require informed consent or ethical approval because it used publicly available data.

 Statistical analysis

In the present study, we employed different MR techniques, including inverse variance weighting (IVW), MR-Egger, weighted median, simple mode, and weighted mode, to ascertain the potential causal influence of GM composition on AF risk. In this scenario, the primary method employed for MR analysis was IVW, which essentially functions as a meta-analysis technique that transforms into a weighted regression of the outcome effects of IVs on the exposure effects to yield a comprehensive estimate of the influence of the GM on the risk of AF while constraining the intercept to zero. In the absence of horizontal pleiotropy, IVW could effectively circumvent the influence of confounding factors, allowing for unbiased estimates.16 In addition, several other methods exist to complement the IVW results. MR-Egger regression can identify and account for pleiotropy, although this approach often generates estimates with limited precision.17 The weighted median approach furnishes reliable estimates under the assumption that a minimum of 50% of the IVs are valid.18 While the simple mode may not possess the same level of potency as IVW, it does offer resilience against the effects of multivalency.19 Finally, the weighted mode is susceptible to variations in the selection of bandwidth for mode estimation.20

Sensitivity analyses were usually performed in three steps. MR-Egger regression, a method that identifies and accounts for pleiotropy in MR analysis while deriving estimates of causal effects and scrutinizing whether the outcomes are influenced by directed horizontal pleiotropy, was initially conducted to evaluate the potential presence of horizontal pleiotropy effects among the included SNPs.17,21 Considering the limitations in accuracy and statistical power associated with MR-Egger regression, the MR pleiotropy residual sum and outlier (MR-PRESSO) approach was employed to identify potential outliers that might indicate pleiotropy bias and subsequently correct for horizontal pleiotropy effects.22 Finally, Cochran’s Q statistic was employed to measure the degree of heterogeneity among the selected SNPs.23,24

All statistical analyses were executed using R software (Version 4.3.1). The R package TwoSampleMR (version 0.5.7, Stephen Burgess, Chicago, IL, USA) was used to perform MR analyses of causality between the GM and AF. p < 0.05 was considered a potentially statistically significant causal effect between exposure and outcome.

 Results Data Sources

The Central Figure illustrates the study design and specific flow of MR analysis between the GM and AF. GWAS summary statistics for the GM were obtained from the MiBioGen consortium and the TwinsUK Registry consortium, which contain 18,340 and 1,126 individuals, respectively. Moreover, GWAS summary statistics for AF were obtained from the FinnGen consortium, which contains 45,766 AF cases and 191,924 controls. Table 1 shows the details of three datasets.

– Description of data sources for gut microbiota and atrial fibrillation
Traits Consortium Sample size Populations Year Journal
Gut Microbiota MiBioGen 18,340 individuals European 2021 Nature Genetics
TwinsUK Registry 1,126 individuals European 2016 Cell Host & Microbe
Fibrilação atrial FinnGen (R9) 45,766 cases and 191,924 controls European 2022 Nature

Selection of Instrumental Variables

After a rigorous quality control step, 2,182 SNPs were identified as IVs associated with 207 GM taxa at the locus-wide significance level (p < 1 × 10-5). These taxa comprised four species (14 SNPs), nine phyla (102 SNPs), 10 classes (109 SNPs), 19 orders (210 SNPs), 35 families (385 SNPs), and 130 genera (1,362 SNPs). Each SNP showed sufficient validity (ranging from 14.59–88.43, all F > 10; Table 2). Table S2 provides comprehensive information about the IVs.

– Selection of IVs after quality control
Taxonomies p < 1e-05 p < 5e-08
Taxa IVs Range (F statistics) Taxa IVs Range (F statistics)
Species 4 14 22.50-30.84 1 2 30.25-30.84
Phylum 9 102 16.97-58.16 1 1 58.16
Class 10 109 17.61-85.38 1 1 85.38
Order 19 210 17.68-85.37 1 1 30.07
Family 35 385 16.91-85.37 5 6 29.81-85.37
Genus 130 1362 14.59-88.43 11 12 29.35-88.43
Total 207 2182 14.59-88.43 20 23 29.35-88.43

IVs: instrumental variables.

Furthermore, at the genome-wide statistical significance threshold (p < 5 × 10-8), only 23 SNPs were identified as IVs, associated with 20 GM taxa. These taxa comprised one species (2 SNPs), one phylum (1 SNP), one class (1 SNP), one order (1 SNP), five families (6 SNPs), and 11 genera (12 SNPs). Every individual SNP exhibited satisfactory validity (ranging from 29.35–88.43, all F > 10; Table 2). Table S3 presents essential details concerning the IVs.

 Mendelian randomization analysis of locus-wide significance level

Based on the locus-wide significance level, Figure 1A graphically depicts the relationship between GM and AF by MR analysis. Additionally, a comprehensive overview of the outcomes can be found in Table S4. Among the MR results, we found the genetically predicted relative abundance of two phyla, one order, one family, and 10 genera was causally associated with AF. Regarding biological phylum classifications, the IVW method demonstrated that Actinobacteria and Firmicutes were negatively correlated with the risk of AF (Figure 1B). Moreover, the MR estimates of IVW indicated that the order of Pasteurellales and the family of Pasteurellaceae were positively correlated with AF risk (Figure 1B). Regarding genus, the MR estimates of IVW indicated that Alloprevotella, Bifidobacterium, Blautia, Eggerthella, Howardella, Ruminococcaceae UCG004, and Ruminococcus1 were protective factors for AF. In contrast, Oxalobacter, Ruminiclostridium5, and Turicibacter were risk factors for AF (Figure 1B). The other two GM taxa (species and class) did not show a relationship with AF by IVW.

– Causal analysis of gut microbiota (GM) and atrial fibrillation (AF) at the locus-wide significance level (p<1x10-5). (A) All results of Mendelian randomization (MR) analysis and sensitivity analysis between GM and AF. (B) MR results of GM taxa with a causal relationship to AF using the inverse variance weighting (IVW) method.

Table S5 further demonstrates the results of the sensitivity analysis, which indicate that no heterogeneity or horizontal pleiotropy was present in Pasteurellaceae, Alloprevotella, Bifidobacterium, Eggerthella, Ruminiclostridium5, Ruminococcaceae UCG004, Ruminococcus1, Turicibacter, or Pasteurellales. Furthermore, MR-PRESSO did not find outliers in these GM taxa. However, heterogeneity appeared in three GM taxa: Howardella, Oxalobacter, and Firmicutes (Table S5). We thus used the random effects results of IVW to solve this problem. Simultaneously, one GM taxon exhibited evidence of horizontal pleiotropy, namely Actinobacteria, but subsequent MR-PRESSO analysis indicated that this particular taxon did not contain any outlier SNPs requiring removal (Table S5).

 Mendelian randomization analysis of genome-wide significance level

Depending on the genome-wide statistical significance threshold, Figure 2A visually represents the association between GM and AF through MR analysis. Furthermore, a comprehensive presentation of results is provided in Table S6. Among the MR results, we found the genetically predicted relative abundance of one phylum, one class, one order, two families, and two genera was causally associated with AF. The Wald ratio results demonstrated that the phylum of Actinobacteria and the class of Actinobacteria were negatively correlated with the risk of AF (Figure 2B). As for family, Bifidobacteriaceae was negatively correlated with AF risk using the IVW method, and Oxalobacteraceae was positively correlated with AF risk using the Wald ratio method (Figure 2B). Moreover, as for genus, Bifidobacterium was a protective factor for AF using the IVW method, and Erysipelatoclostridium was a risk factor for AF using the Wald ratio method (Figure 2B).

– Causal analysis of gut microbiota (GM) and atrial fibrillation (AF) at the genome-wide statistical significance threshold (p<5x10-8). (A) All results of Mendelian randomization (MR) analysis and sensitivity analysis between GM and AF. (B) MR results of GM taxa with a causal relationship to AF using the inverse variance weighting (IVW) or Wald ratio method.

Table S7 displays the outcomes of the heterogeneity test conducted for GM taxa featuring two SNPs. Heterogeneity and horizontal pleiotropy could not be examined because only one SNP was included in the other GM taxa.

 Discussion

Earlier research has demonstrated the significant involvement of gut microbial ecology in the onset and advancement of various CVDs, encompassing conditions such as hypertension, atherosclerosis, and heart failure. Li et al.5 revealed that individuals with prehypertension and hypertension exhibit not only diminished gene abundance and α-diversity compared to healthy controls but also an elevated proportion of Prevotella bacteria. Concurrently, a macrogenomic analysis25 demonstrated that the GM of individuals with atherosclerotic cardiovascular disease harbored elevated levels of Streptococcus and Enterobacteriaceae species, in contrast to the GM of healthy individuals. Furthermore, a comparative investigation of fecal bacteria26 between individuals with chronic heart failure and their healthy counterparts indicated that those with heart failure exhibited higher colonization of pathogenic bacteria, including Campylobacter, Shigella, Salmonella, and Yersinia enterocolitica.

AF is a more specific type of CVD. Numerous preceding studies have identified distinct GM profiles among individuals with AF, with AF showing significant alterations in gut microbial diversity compared to control individuals. An increased abundance of Ruminococcus, Streptococcus, and Enterococcus, along with a decrease in Faecalibacterium, Alistipes, Oscillibacter, and Bilophila, was observed in patients with AF.27 Furthermore, disruption in gut ecological balance has been linked to the advancement and duration of AF. A recent investigation by Zuo et al.28 revealed distinctions in microbial diversity and metabolite composition among patients with paroxysmal AF, with persistent AF, and without AF. Moreover, specific bacteria exhibited varying enrichments corresponding to different durations of AF. For instance, in persistent AF, the abundance of Butyricoccus and Paraprevotella was diminished, while the abundance of Dorea and Coprococcus showed an increase.29 Interestingly, an increase in the enrichment of beneficial bacteria and a decrease in that of pathogenic bacteria in the GM, as well as corresponding changes in metabolite levels, could be observed after ablation, compared to patients with AF before radiofrequency ablation.30

However, most previous studies have been observational and small cohort studies, and the types of GM included were often limited. In addition, many studies have merely explored GM characteristics in AF without examining whether GM could influence the onset of AF. A need thus existed to characterize the causal relationship between the GM and AF more fully. We used the largest and most up-to-date GWAS data for GM and AF for closely related SNPs as IVs. First, through MR analysis at the locus-wide significance level, we identified Actinobacteria, Firmicutes, Alloprevotella, Bifidobacterium, Blautia, Eggerthella, Howardella, Ruminococcaceae UCG004, and Ruminococcus as being negatively correlated with the occurrence of AF, and Pasteurellales, Pasteurellaceae, Oxalobacter, Ruminiclostridium5, and Turicibacter as being positively correlated with AF. Second, under the genome-wide statistical significance threshold, we identified Actinobacteria, Bifidobacteriaceae, and Bifidobacterium as protective factors for the risk of AF occurrence, whereas Oxalobacteraceae and Erysipelatoclostridium were risk factors for AF. The results for Actinobacteria, Howardella, Oxalobacter, and Firmicutes must be interpreted with more caution due to the presence of heterogeneity or horizontal pleiotropy.

Our study identified a total of 10 GM taxa positively associated with AF and seven that were negatively associated. First, Actinobacteria and Bifidobacterium were particularly important for reducing the occurrence of AF, as they were proved to be markedly negatively correlated with AF not only at the focus-wide significance level but also at the genome-wide threshold, again indicating the importance of these two GM taxa for preventing the emergence of AF. FINRISK 2002 study31 noted that Bifidobacterium was negatively correlated with AF prevalence and positively collateral to AF incidents. Furthermore, Li et al.32 exhibited a significant decrease in Bifidobacterium abundance in patients with AF compared to controls, irrespective of whether they received long-term oral anticoagulant (OAC) therapy. Despite the lack of relevant studies demonstrating the involvement of Actinobacteria with the development of AF, Li et al.32 nonetheless also found that the enriched strains (Actinobacteria) present in AF undergoing long-term OACs were positively correlated with prothrombin time (p < 0.05), which may enhance the bleeding risk in patients with AF. Notably, the ability of Actinobacteria to mitigate the risk of developing AF has been a unique observation to date. Second, while not showing a causal association with AF at the genome-wide statistical significance threshold, an additional subset of GM taxa were still suggestive of AF development, including Firmicutes, Alloprevotella, RuminococcaceaeUCG004, Ruminococcus1, Oxalobacter, and Turicibacter. Similar to in our findings, Ruminococcus was shown to be negatively associated with CHA2DS2-VASc scores, meaning that the availability of Ruminococcus may result in a reduced risk of AF. Nonetheless, Zuo et al.27 detected Ruminococcus overgrowth in AF patients. Meanwhile, another study by the same team33 uncovered higher AF induction in sleep-deprived (SD) mice and found that such mice had higher abundances of Ruminococcus and Alloprevotella, implying that these species of bacteria may be promising targets for SD-mediated AF susceptibility. It also differed from our findings, since the FINRISK 2002 study31 considered Turicibacter to be negatively linked to prevalent AF, whereas Firmicutes were seen to be equivalent in patients with AF and controls in the Li et al. study.32 While the genetically predicted genus Oxalobacter was positively associated with the risk of developing coronary artery disease in an MR analysis [odds ratio (OR)=1.06;p=1.67×10−4),34 our study concluded that Oxalobacter and Oxalobacteraceae were risk factors for developing AF, which complements and refines the conclusions of prior studies. Finally, a subset of GM taxa whose relationship to AF has not been addressed in previous studies exists, including Blautia, Eggerthella, Howardella, Pasteurellales, Pasteurellaceae, Ruminiclostridium5, and Erysipelatoclostridium. Our research thus fills this part of the gap satisfactorily.

The mechanisms that dysregulate gut ecology and thus promote AF come from two main sources. First, GM dysregulation could cause AF to occur through inflammation. Zhang et al.35 demonstrated for the first time that age-related GM alterations led to increased lipopolysaccharide (LPS) concentrations and impaired glucose tolerance, which enhanced atrial fibrosis and promoted the development of AF. The mechanisms underlying the atrial proarrhythmic effects driven by LPS could be attributed to the binding of nucleotides in the atria and the activation of NLRP3 inflammatory vesicles. Sequentially, GM-derived metabolites also had a vital function in the pathogenesis of AF. By being absorbed into the host intestine, GM-derived metabolites were able to influence immune cells in the gut, as well as act as signaling molecules and influence important metabolic pathways. For example, TMAO, which is derived from dietary choline and carnitine, exacerbated increased neural activity and induced AF via atrial pacing, possibly because TMAO could stimulate the release of inflammatory factors and activate the p65 NF-κB signaling pathway.36 In addition, indoxyl sulfate (IS) was the most common uremic toxin derived from the metabolism of dietary tryptophan. In animal studies, IS could contribute to the initiation of AF by upregulating the expression of signaling molecules such as pro-inflammatory and pro-fibrotic factors, thereby inducing oxidative stress.37 Further basic research is still needed to explore whether additional mechanisms exist by which the GM regulates AF.

Several imitations of this work must also be addressed. First, despite the three fundamental assumptions of MR being met, no absolute assurance of weak instrumental bias could be made. Second, owing to the inadequate availability of a substantial number of IVs for reverse MR analysis, we were unable to ascertain a potential reciprocal causal relationship between GM and AF. Third, since the GWAS encompassed solely European populations, the findings of this study might not be universally applicable to other ethnic groups. Fourth, employing numerous stringent and conservative statistical corrections could potentially be excessively restrictive, possibly neglecting the GM taxa that could have causal connections to AF. Considering biological plausibility, we consequently refrained from incorporating the results of multiple tests. Lastly, this study marked the inaugural attempt to scrutinize the association between GM taxa and AF risk via MR analysis at the species level. However, it is noteworthy that positive outcomes at the species level were not detected. Considering the distinct data sources utilized for the species-level analysis, in contrast to the other five levels and recognizing the substantial difference in sample sizes between the GWAS conducted by Goodrich et al.9 and that of Kurilshikov et al.,8 it became evident that the potential selection of IVs was greatly constrained. Thus, this discovery at the species level was only a preliminary exploration.

 Conclusions

In conclusion, this MR study demonstrated the causal effect of GM on AF, finding 10 GM taxa that were positively correlated with AF, as well as seven that were negatively correlated. These types of GM taxa may serve as new biomarkers and provide insights into the treatment and prevention of AF.

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

This article does not contain any studies with human participants or animals performed by any of the authors.

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There were no external funding sources for this study.