Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC BHNmcnKcnNgKc5YDYkVrxSp S0066-782X2024001100302 00302 10.36660/abc.20240155 Artigo Original Determinação dos Níveis Séricos de Glicogênio Sintase 3 Beta em Pacientes com Insuficiência Cardíaca, um Novo Marcador para Diagnóstico e Definição da Gravidade da Doença? Altunbas Gokhan Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 0000-0001-7081-5799 Kaplan Mehmet Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Duzen Veysel Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Kaya Emin Erdem Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística 2 0000-0003-0681-3267 Gokdeniz Hafize Gokce Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 3 0000-0003-1251-3148 Taysi Seyithan Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados 4 Department of Cardiology Gaziantep University School of Medicine Gaziantep Turquia Department of Cardiology, Gaziantep University School of Medicine, Gaziantep – Turquia Gaziantep City Hospital Training and Research Hospital Gaziantep Turquia Gaziantep City Hospital, Training and Research Hospital, Gaziantep – Turquia Hatay Dortyol State Hospital Hatay Turquia Hatay Dortyol State Hospital, Hatay – Turquia Department of Biochemistry Gaziantep University School of Medicine Gaziantep Turquia Department of Biochemistry, Gaziantep University School of Medicine, Gaziantep – Turquia Mehmet Kaplan • Department of Cardiology, Gaziantep University School of Medicine, 27310, Gaziantep – Turquia; E-mail: kardiomehmet27@hotmail.com

Gláucia Maria Moraes de Oliveira

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 22 11 2024 2024 121 11 e20240155 20 04 2024 22 06 2024 14 08 2024 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

: Determinação dos Níveis Séricos de Glicogênio Sintase 3 Beta em Pacientes com Insuficiência Cardíaca, um Novo Marcador para Diagnóstico e Definição da Gravidade da Doença?

Resumo Fundamento

A glicogênio sintase quinase 3β (GSK3β) é uma enzima que tem papéis na patogênese da insuficiência cardíaca (IC). Tentamos revelar os níveis séricos de GSK3β em tipos de IC.

 Objetivos

Neste estudo, avaliamos os níveis séricos de GSK3β em pacientes com IC. Além disso, tentamos elucidar qualquer possível relação entre os níveis séricos de GSK3β e a gravidade da doença entre três tipos diferentes de pacientes com IC.

 Métodos

Realizamos um estudo prospectivo e inscrevemos 112 pacientes: 50 pacientes no grupo IC com fração de ejeção preservada (ICFEp), 30 pacientes no grupo IC com FE levemente reduzida (ICFEmr) e 32 pacientes no grupo IC com FE reduzida (ICFEr). Também avaliamos 50 controles saudáveis. Exames ecocardiográficos foram realizados. Medimos a GSK-3β sérica e o peptídeo natriurético tipo B N-terminal (NT-proBNP). Medimos os níveis de proteína C-reativa altamente sensível (PCR-as) e calculamos a razão neutrófilo-linfócito (NLR) e a razão plaquetas-linfócitos (PLR) a partir da contagem do hemograma. A significância estatística aceita foi p < 0,05.

 Resultados

Os níveis séricos de GSK3β foram significativamente maiores entre pacientes com IC em comparação com controles saudáveis (níveis medianos de GSK3β; 117,26 (45,39 -223,85) vs 13,91 (5,6 -23,3) ng/mL, p < 0,001). Além disso, os níveis de GSK3β foram maiores entre pacientes com ICFEp e menores entre pacientes com ICFEr; 236,44 (132,89 -432) vs. 38,72 (23,15-67,31) ng/mL, respectivamente (p < 0,001). Os níveis medianos de NT-proBNP, como esperado, foram significativamente maiores entre pacientes com IC em comparação com controles saudáveis (660 (291 -1000) vs. 92 (78 -102) pg/mL, p<0,001). Como um marcador de inflamação sistêmica, os valores de hsCRP, NLR e PLR não diferiram significativamente entre pacientes com IC e controles. Conclusão: Os níveis de GSK3β foram significativamente maiores entre pacientes com IC. Além disso, à medida que a fração de ejeção diminui, os níveis de GSK3β também se reduzem, provavelmente como um mecanismo de proteção para evitar mais apoptose e morte de miócitos.

 Quinase 3 da Glicogênio Sintase Insuficiência Cardíaca Peptídeos Natriuréticos Introdução

A incidência e prevalência de insuficiência cardíaca (IC) estão aumentando em todo o mundo. Devido aos avanços cada vez maiores no tratamento de doença arterial coronária, doença cardíaca valvular, arritmias e até mesmo cardiomiopatias inflamatórias e genéticas, a probabilidade de sobrevivência aumenta, e isso resulta em mais pacientes vivendo com IC. Além disso, o envelhecimento da população e o aumento da incidência de hipertensão levam a um aumento no número de pacientes com insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEp).1 Com base nas diretrizes recentes da Sociedade Europeia de Cardiologia sobre a definição de insuficiência cardíaca, existem três tipos de insuficiência cardíaca com base na fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE): insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (ICFEr), onde a FEVE é ≤40%, insuficiência cardíaca com fração de ejeção levemente reduzida (ICFEmr), onde a FE está entre 41 e 49% e, finalmente; ICFEp, onde a FE é ≥50%.2

A glicogênio sintase quinase 3 (GSK 3β) é uma serina-treonina quinase que foi descoberta primeiro como a principal enzima responsável pelo metabolismo do glicogênio. No entanto, descobertas recentes sugerem que essa enzima tem vários papéis em uma infinidade de funções celulares, incluindo regulação de fatores de transcrição, embriogênese, progressão do ciclo celular, proliferação celular, fibrose, apoptose, hipertrofia miocárdica e até mesmo expressão gênica. No que diz respeito, há vários estudos indicando seu papel em vários estados de doença, incluindo lesão de isquemia-reperfusão, câncer, doença de Alzheimer e acidente vascular cerebral.3-5 Quanto à doença cardiovascular, a principal área de interesse é o papel da GSK 3 na lesão de isquemia-reperfusão. Recentemente, o papel da GSK 3 na IC ganhou mais interesse. As principais descobertas sugerem que a inibição sustentada da GSK3 induz hipertrofia e inibe a apoptose, e essa regulação negativa na IC pode ser vista como uma resposta compensatória e mecanismo de proteção.6 À luz desta pesquisa, queríamos avaliar os níveis séricos de GSK-3 beta em três perfis diferentes de IC e comparar os resultados com indivíduos saudáveis.

 Métodos

Neste estudo, inscrevemos pacientes com IC e controles saudáveis entre 18 e 65 anos de idade. Com base nas diretrizes mais recentes da Sociedade Europeia de Cardiologia sobre insuficiência cardíaca,2 categorizamos os pacientes com insuficiência cardíaca em três grupos: 50 pacientes no grupo de ICFEp, 30 pacientes no grupo de ICFEmr e 32 pacientes no grupo de ICFEr. Também incluímos 50 controles saudáveis para comparar os resultados com pacientes com IC. Determinamos o número de pacientes em cada grupo por conveniência. A GSK-3β (BT Lab, Número de catálogo: E3196Hu, China) foi determinada com um kit comercial. A intensidade da cor gerada pelo método de ensaio imunoenzimático (ELISA) foi medida com um leitor de ELISA (Biotek ELx800, EUA). Todos os procedimentos foram realizados na Faculdade de Medicina da Universidade de Gaziantep, Departamento de Bioquímica. Os resultados são expressos como ng/mL. O nível de pró-peptídeo natriurético tipo B N-terminal (NT-proBNP) foi medido com um analisador de hemoglobina totalmente automático e dispositivos UNICELL-S (Shenzen, China). Os resultados são expressos como pg/mL. Os níveis de proteína C-reativa alta sensibilidade (PCR-as) sérica foram determinados com o dispositivo Beckman Coulter Chemistry Analyzer AU5800 (Beckman Coulter Inc., Brea, CA 92821 EUA). Os resultados são expressos como mg/mL.

Avaliação ecocardiográfica

As medidas ecocardiográficas transtorácicas foram registradas com base nos padrões da Sociedade Americana de Ecocardiografia. A FEVE foi determinada usando a fórmula 2D de Simpson nas vistas apicais de quatro câmaras e duas câmaras. Para determinar a presença de disfunção diastólica para ICFEp, usamos três determinantes principais da disfunção diastólica: velocidades diastólicas precoces (E) e tardias (A) do ventrículo esquerdo que foram registradas nas pontas dos folhetos da valva mitral na vista apical de quatro câmaras, velocidades diastólicas Doppler tecidual (e’) registradas no septo interventricular e na parede livre lateral e velocidade do jato de regurgitação da valva tricúspide.7 Além dessas variáveis ecocardiográficas, sintomas clínicos e achados de IC também foram necessários para o diagnóstico de ICFEp.

 Análise estatística

Variáveis contínuas com distribuição normal foram descritas por meio de média ± desvio padrão, e variáveis contínuas sem distribuição normal foram descritas por meio de mediana e intervalo interquartil. Para variáveis categóricas, os dados foram expressos como frequência e porcentagem. Os parâmetros bioquímicos foram avaliados com o teste de Shapiro-Wilk e revelaram que não apresentaram distribuição normal (p<0,05). Ao comparar essas variáveis aos grupos de estudo, foram usados os test U de Mann-Whitney ou o de Kruskal Wallis. Para determinar a diferença entre os grupos, foi usado o teste de comparação múltipla de Dunn. Além disso, a análise de correlação de Spearman foi usada para avaliar a associação entre variáveis numéricas. As análises foram realizadas usando o SPSS 22.0, e p < 0,05 foi determinado como o nível de significância estatística.

 Resultados

Inscrevemos 112 pacientes com IC e 50 controles saudáveis. A idade média da população total do estudo foi de 59,57 ± 9,24 anos. As características basais dos pacientes e controles foram resumidas na Tabela 1. A idade média foi semelhante entre os grupos de pacientes e controles e entre pacientes com diferentes grupos de IC. Como um marcador de gravidade da doença e prognóstico, o marcador característico da IC, os níveis medianos do peptídeo natriurético tipo B N-terminal (NT-proBNP) foram significativamente maiores no grupo de pacientes em comparação aos controles saudáveis (660 (291 -1000) vs. 92 (78 -102) p < 0,001). Além disso, houve um aumento significativo nos níveis de NT-proBNP com a diminuição da fração de ejeção (p < 0,01). Os níveis séricos de GSK-3β foram significativamente aumentados em pacientes com IC em comparação ao controle saudável (117,26 (45,39 -223,85) vs 13,91 (5,6 -23,3) p < 0,001). Os pacientes com IC foram divididos em três grupos com base na FEVE: a) ICFEp onde a FEVE é ≥ 50%, b) ICFEmr onde a FEVE é ≥ 40%, mas < 50% e c) ICFEr onde a FEVE é < 40%. Ao considerar diferentes grupos de IC com base na FEVE, os níveis de GSK-3β foram mais baixos entre os pacientes com ICFEr (mediana 38,72) e mais altos entre os pacientes com ICFEp (mediana 236,44) (p < 0,001). Ao avaliar pacientes com IC, em três grupos com base na FEVE, os níveis de GSK-3β foram significativamente menores entre os pacientes com frações de ejeção do ventrículo esquerdo mais baixas. Entre os pacientes com ICFEP, os níveis medianos de GSK-3β foram 236,44, enquanto os níveis séricos de GSK-3β foram 129,2 para pacientes com ICFEM e 38,72 para pacientes com ICFEr (p<0,001). Os níveis séricos de BNP também aumentaram significativamente com a diminuição das frações de ejeção (p<0,001). Como um marcador de inflamação e prognóstico, os níveis de PCR-as e as razões NLR foram semelhantes entre os diferentes grupos de IC com base na FEVE. As diferenças e comparações dentro do grupo são resumidas na Figura Central e na Tabela 2.

– Características basais dos pacientes e controles
Controles Pacientes com insuficiência cardíaca p
Mediana (Q1-Q3) Mediana (Q1-Q3)
GSK-3β (ng/mL) 13,91 (5,6 -23,3) 117,26 (45,39 -223,85) 0,001***
NT-proBNP (pg/mL) 92 (78 -102 ) 660 (291 -1000 ) 0,001***
FEVE (%) 55 (55 -57 ) 44,5 (35 -53,5 ) 0,001***
PCR-as (mg/L) 5 (2 -8,4) 4,78 (2 -7,05 ) 0,405
Leucócito 9 (7,21 -11,53) 9,71 (7,21 -11,53) 0,878
Plaquetas 258,5 (225 -311 ) 281 (237 -333 ) 0,252
Linfócito 2,23 (1,78 -4,87) 2,31 (1,5 -3,58) 0,187
Neutrófilo 7,1 (4,96 -7,77 ) 6,01 (4,44 -7,77) 0,330
Creatinina 0,87 (0,71 -1,01) 0,77 (0,7 -0,99) 0,148
TFGe 82,36 (65 -109 ) 99,5 (72 -109,5 ) 0,200
NLR 2,06 (1,12 -4,02) 2,32 (1,61 -4,01) 0,212
PLR 111,05 (57,7 -150,25) 123,93 (79,21 -180,99) 0,069

***p<0,001; Teste U de Mann-Whitney. GSK-3β: glicogênio sintase quinase 3 beta; NT-proBNP: peptídeo natriurético cerebral N-terminal; FEVE: fração de ejeção do ventrículo esquerdo; PCR-as: proteína C reativa altamente sensível; TFGe: taxa de filtração glomerular estimada (mL/min/1,73 m2); NLR: razão neutrófilos/linfócitos; PLR: razão plaquetas/linfócitos.

– Diferenças e comparações dentro do grupo
Variáveis Controles saudáveis e tipos de insuficiência cardíaca Mediana (Q1-Q3) p
GSK-3β (ng/mL) Controles saudáveis 13,91 (5,6 -23,3) 0,001***
ICFEr 38,72 (23,15 -67,31)
ICFEmr 129,2 (78,9 -199,63)
ICFEp 236,44 (132,89 -432)
NT-proBNP (pg/mL) Controles saudáveis 92 (78 -102) 0,001***
ICFEr 1110 (817,5 -2220)
ICFEmr 607 (430 -780)
ICFEp 225 (180 -312)
PCR-as (mg/L) Controles saudáveis 5 (2 -8,4) 0,425
ICFEr 5 (2,44 -9)
ICFEmr 5 (1 -6)
ICFEp 3,64 (2 -6)
Leucócito Controles saudáveis 9 (7,21 -11,53) 0,998
ICFEr 9,86 (7,12 -11,77)
ICFEmr 9,87 (7,21 -11,06)
ICFEp 8,9 (7,67 -12)
Plaquetas Controles saudáveis 258,5 (225 -311) 0,550
ICFEr 272 (237,5 -358,5)
ICFEmr 280,5 (228 -321)
ICFEp 281 (238 -365)
Linfócito Controles saudáveis 2,23 (1,78 -4,87) 0,344
ICFEr 2,31 (1,53 -4,87)
ICFEmr 2,31 (1,56 -2,75)
ICFEp 2,34 (1,42 -3,12)
Neutrófilo Controles saudáveis 7,1 (4,96 -7,77) 0,025*
ICFEr 7,59 (5,41 -8,33)
ICFEmr 5,95 (4,35 -6,87)
ICFEp 4,99 (4,37 -7,77)
NLR Controles saudáveis 2,06 (1,12 -4,02) 0,601
ICFEr 2,13 (1,12 -4,62)
ICFEmr 2,62 (1,67 -3,95)
ICFEp 2,28 (1,87 -3,49)
PLR Controles saudáveis 111,05 (57,7 -150,25) 0,116
ICFEr 116,22 (53,62 -175,07)
ICFEmr 119,25 (86,34 -161,04)
ICFEp 147,33 (101,08 -190)

***: p<0,001 (diferença estatisticamente significativa muito forte). *: p<0,05 (diferença estatisticamente significativa). GSK-3β: glicogênio sintase quinase 3 beta; NT-proBNP: peptídeo natriurético cerebral N-terminal; FEVE: fração de ejeção do ventrículo esquerdo; PCR-as: proteína C reativa altamente sensível; TFGe: taxa de filtração glomerular estimada (mL/min/1,73m2); NLR: razão neutrófilos/linfócitos; PLR: razão plaquetas/linfócitos.

 Discussão

Neste estudo, avaliamos marcadores estabelecidos para prognóstico entre pacientes com IC e, como um marcador novo e promissor, medimos os níveis séricos de GSK-3β e comparamos os resultados com controles saudáveis. A principal descoberta do estudo foi que os níveis séricos de GSK-3β aumentaram significativamente entre pacientes com IC. Além disso, com a redução da fração de ejeção, os níveis de GSK-3β tiveram uma tendência à redução. Os níveis mais altos de níveis de GSK-3β foram registrados entre pacientes com ICFEp. A glicogênio sintase quinase (GSK) tem duas isoformas, α e β. Para mecanismos específicos do coração, a isoforma β ganhou muito interesse. Estudos recentes revelaram que a GSK-3β tem um papel importante no pré-condicionamento isquêmico, pós-condicionamento, hipertrofia e IC. Entre várias vias e mecanismos, o efeito da GSK-3β na fisiologia cardíaca é exercido pela fosforilação de reguladores transcricionais e fatores de iniciação translacional.8 A GSK-3β ativada previne o crescimento hipertrófico de miócitos e, especialmente no processo de avanço da IC, a GSK-3β é inibida provavelmente como um mecanismo de proteção.9 Em nosso estudo, os níveis séricos de GSK-3β foram mais altos entre pacientes com ICFEp. Com a redução das frações de ejeção, os níveis de GSK-3β estavam diminuindo constantemente, e essa diferença atingiu uma diferença fortemente significativa (p<0,001). Nossas descobertas apoiam descobertas de pesquisas anteriores de que, com o avanço da IC, a GSK-3 é regulada negativamente como um mecanismo de proteção. Outro suporte para essa descoberta vem de um estudo animal. Kirk et al. avaliaram corações de cães com IC com dissincronia.1º Eles usaram terapia de ressincronização cardíaca (TRC) para esses animais e descobriram que o GSK-3β foi desativado nesses corações e reativado pela TRC. Além disso, a TRC melhorou a responsividade ao cálcio dos miofilamentos por meio da reativação do GSK-3. Essa descoberta também sugere uma possível abordagem terapêutica para terapias de IC em um futuro próximo. Nós medimos os níveis séricos de BNP, que é aceito como o biomarcador padrão para IC tanto no diagnóstico quanto na determinação do prognóstico e também na avaliação da resposta ao tratamento.2 Em comparação com controles saudáveis, os níveis medianos de NT-proBNP foram significativamente maiores entre pacientes com IC. Essa associação foi positivamente correlacionada com os níveis de GSK-3β, que também foram significativamente aumentados entre pacientes com IC em comparação com controles saudáveis. A partir deste ponto, podemos assumir que o GSK-3β pode ser usado como um novo biomarcador para IC como o BNP. No entanto, estudos adicionais com um número maior de pacientes são necessários para esclarecer essa associação.

Como um fator de risco estabelecido para eventos cardiovasculares e especialmente coronários futuros, também medimos os níveis séricos de PCR-as. Tanto para doença arterial coronária quanto para IC, a PCR-as é um marcador estabelecido para prognóstico. Os níveis séricos de PCR-as foram semelhantes entre controles saudáveis e pacientes com IC. Outros marcadores amplamente estudados de inflamação sistêmica são a razão neutrófilos-linfócitos (NLR) e a razão plaquetas-linfócitos (PLR). A inflamação sistêmica é aceita como uma etapa patogênica fundamental tanto para o desenvolvimento de aterosclerose quanto para IC. Além disso, um nível aumentado de inflamação sistêmica é aceito como um marcador de prognóstico ruim para eventos coronários agudos e IC crônica. Em sua grande metanálise, Dong et al. avaliaram 9.406 pacientes de oito estudos e revelaram que a NLR é um marcador de prognóstico ruim para pacientes com síndrome coronária aguda recente, e valores mais altos de NLR basal foram associados ao aumento da mortalidade hospitalar.11 Uthamalingam et al. avaliaram pacientes hospitalizados por IC aguda descompensada e revelaram que valores aumentados de NLR foram independentemente associados à mortalidade a longo prazo.12 Em nosso estudo, os valores medianos de NLR foram semelhantes tanto para controles saudáveis e para pacientes com IC (p: 0,212). Além disso, os valores medianos de NLR foram semelhantes entre diferentes subgrupos de IC (p: 0,601). O número relativamente baixo de pacientes pode explicar essa falta de diferença. Além disso, não inscrevemos pacientes com descompensação aguda. Como NLR é geralmente um marcador de inflamação aguda e, portanto, a descompensação aguda de IC provavelmente causaria elevação dos valores de NLR calculados.

Limitações do estudo e perspectivas futuras

Uma limitação do nosso estudo foi o número relativamente pequeno de pacientes inscritos. O maior número de pacientes produziria dados clinicamente mais relevantes e robustos. A via da glicogênio sintase quinase beta está ganhando interesse crescente na via da IC. Com uma maior compreensão dessa via, novas terapias para IC visando a via GSK podem se tornar disponíveis em um futuro próximo.

 Conclusão

Os níveis séricos de GSK-3β aumentaram significativamente entre pacientes com IC em comparação com controles saudáveis. Além disso, os níveis de GSK-3 mostraram uma redução significativa com fração de ejeção reduzida, apontando para um possível mecanismo de proteção e também um alvo terapêutico para o tratamento de IC.

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Dong CH Wang ZM Chen SY Neutrophil to Lymphocyte Ratio Predict Mortality and Major Adverse Cardiac Events in Acute Coronary Syndrome: A Systematic Review and Meta-analysis Clin Biochem 2018 52 131 136 10.1016/j.clinbiochem.2017.11.008 12. Uthamalingam S, Patvardhan EA, Subramanian S, Ahmed W, Martin W, Daley M, et al. Utility of the Neutrophil to Lymphocyte Ratio in Predicting Long-term Outcomes in Acute Decompensated Heart Failure. Am J Cardiol. 2011;107(3):433-8. doi: 10.1016/j.amjcard.2010.09.039. Uthamalingam S Patvardhan EA Subramanian S Ahmed W Martin W Daley M et al Utility of the Neutrophil to Lymphocyte Ratio in Predicting Long-term Outcomes in Acute Decompensated Heart Failure Am J Cardiol 2011 107 3 433 438 10.1016/j.amjcard.2010.09.039

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Gaziantep University School of Medicine sob o número de protocolo 2021-672. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

 10.36660/abc.20240155i Original Article Determination of Serum Glycogen Synthase 3 Beta Levels in Patients with Heart Failure, a Novel Marker for Diagnosis and Defining Disease Severity? Altunbas Gokhan Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 0000-0001-7081-5799 Kaplan Mehmet Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Critical revision of the manuscript for content 1 Duzen Veysel Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for content 1 Kaya Emin Erdem Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis 2 0000-0003-0681-3267 Gokdeniz Hafize Gokce Conception and design of the research Acquisition of data Critical revision of the manuscript for content 3 0000-0003-1251-3148 Taysi Seyithan Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data 4 Turkey Department of Cardiology, Gaziantep University School of Medicine, Gaziantep – Turkey Turkey Gaziantep City Hospital, Training and Research Hospital, Gaziantep –Turkey Turkey Hatay Dortyol State Hospital, Hatay – Turkey Turkey Department of Biochemistry, Gaziantep University School of Medicine, Gaziantep – Turkey Mehmet Kaplan • Department of Cardiology, Gaziantep University School of Medicine, 27310, Gaziantep – Turkey; E-mail: kardiomehmet27@hotmail.com

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Gláucia Maria Moraes de Oliveira

: Determination of Serum Glycogen Synthase 3 Beta Levels in Patients with Heart Failure, a Novel Marker for Diagnosis and Defining Disease Severity?

Abstract Background

Glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) is an enzyme that has roles in the pathogenesis of heart failure (HF). We try to reveal serum GSK3β levels in types of HF.

 Objectives

In this study, we evaluated serum GSK3β levels in HF patients. Also, we tried to elucidate any possible relationship between serum GSK3β levels and disease severity among three different types of HF patients.

 Methods

We performed a prospective study and enrolled 112 patients: 50 patients in heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) group, 30 patients in heart failure with mildly reduced ejection fraction (HFmrEF) group, and 32 patients in heart failure with reduced ejection fraction group (HFrEF). We also evaluated 50 healthy controls. Echocardiographic examinations were performed. We measured serum GSK-3β and N-terminal pro-B-type natriuretic peptide (NT-proBNP). We measured highly sensitive C-reactive protein (hs-CRP) levels and calculated neutrophil-lymphocyte ratio (NLR) platelets-to-lymphocyte ratio (PLR) from the hemogram count. Statistical significance was accepted p < 0.05.

 Results

Serum GSK3β levels were significantly higher among patients with HF compared to healthy controls (median GSK3β levels; 117.26 (45.39 -223.85) vs 13.91 (5.6 -23.3) ng/mL, p<0.001). Also, GSK3β levels were highest among patients with HFpEF and lowest among patients with HFrEF; 236.44 (132.89 -432) vs. 38.72 (23.15-67.31) ng/mL respectively (p<0.001). Median NT-proBNP levels, as expected, were significantly higher among patients with HF compared to healthy controls (660 (291 -1000) vs. 92 (78 -102) pg/mL, p<0.001). As a marker of systemic inflammation, hsCRP values, NLR, and PLR did not differ significantly among HF patients and controls.

 Conclusion

GSK3β levels were significantly higher among patients with HF. Also, as the ejection fraction declines, GSK3β levels also reduce, probably as a protective mechanism to prevent further apoptosis and myocyte death.

 Glycogen Synthase Kinase 3 Heart Failure Natriuretic Peptides Introduction

The incidence and prevalence of heart failure (HF) is increasing worldwide. Due to ever-growing advances in the treatment of coronary artery disease, valvular heart disease, arrhythmias, and even inflammatory and genetic cardiomyopathies, the probability of survival increases, and this results in more patients living with HF. Also, the aging population and the increased incidence of hypertension lead to an increased number of patients with heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF).1 Based on the European Society of Cardiology’s recent guidelines on HF definition, there are three types of HF based on left ventricle ejection fraction (LVEF): heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF) where LVEF is ≤ 40%, heart failure with mildly reduced ejection fraction (HFmrEF) where EF is between 41 and 49% and finally; HFpEF where EF is ≥ 50%.2

Glycogen synthase kinase 3 (GSK 3) is a serine-threonine kinase that was primarily discovered as the main enzyme responsible for glycogen metabolism. However, recent findings suggest that this enzyme has various roles in a multitude of cellular functions, including regulation of transcription factors, embryogenesis, cell cycle progression, cell proliferation, fibrosis, apoptosis, myocardial hypertrophy, and even gene expression. As regards there are numerous studies indicating its role in various disease states, including ischemia-reperfusion injury, cancer, Alzheimer’s disease, and stroke.3-5 As for cardiovascular disease, the main area of interest is the role of GSK 3 in ischemia-reperfusion injury. Recently, the role of GSK 3 in HF has gained more interest. The main findings suggest that sustained inhibition of GSK3 induces hypertrophy and inhibits apoptosis, and this downregulation in HF can be viewed as a compensatory response and protective mechanism.6 In light of this research, we wanted to evaluate serum levels of GSK-3 beta levels in three different HF profiles and compare the results with healthy subjects.

 Methods

In this study, we enrolled HF patients and healthy controls between 18 and 65 years of age. Based on the most recent European Society of Cardiology guidelines on HF,2 we categorized HF patients into three groups: 50 patients in HFpEF group, 30 patients in HFmrEF group and 32 patients in HFrEF. We also included 50 healthy controls to compare the results with HF patients. We determined the number of patients in each group by convenience. The glycogen synthase kinase 3 beta (GSK-3β) (BT Lab, Catalog No: E3196Hu, China) level was determined with a commercial kit. The color intensity generated by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method was measured with an ELISA reader (Biotek ELx800, USA). All procedures were performed at Gaziantep University Faculty of Medicine, Department of Biochemistry. Results are expressed as ng/mL. N-terminal pro-B-type natriuretic peptide (NT-proBNP) level was measured with a fully automatic Hemoglobin Analyzer and UNICELL-S (Shenzen, China) devices. Results are expressed as pg/mL. Serum highly sensitive C-reactive protein (hs-CRP) levels were determined with the Beckman Coulter Chemistry Analyzer AU5800 (Beckman Coulter Inc., Brea, CA 92821 USA) device. Results are expressed as mg/mL.

Echocardiographic evaluation

Transthoracic echocardiographic measurements were recorded based on American Society of Echocardiography standards. The left ventricular ejection fraction was determined using the 2D Simpson formula from both apical four-chamber and two-chamber views. To determine the presence of diastolic dysfunction for HFpEF group, we used three main determinants of diastolic dysfunction: left ventricle early (E) and late (A) diastolic velocities which were recorded at mitral valve leaflet tips from apical 4-chamber view, tissue Doppler diastolic velocities (e’) recorded at interventricular septum and lateral free wall and tricuspid valve regurgitation jet velocity.7 In addition to these echocardiographic variables, clinical symptoms and findings of HF were also needed for the diagnosis of HFpEF.

 Statistical analysis

Continuous variables with normal distribution were described through mean ± standard deviation, and continuous variables without normal distribution were described through median and interquartile range. For categorical variables, data were expressed as frequency and percentage. Biochemical parameters were evaluated with the Shapiro-Wilk test and revealed that they did not show normal distribution (p<0.05). While comparing these variables to study groups, the Mann-Whitney U test or Kruskal Wallis tests were used. In order to determine the difference between groups, Dunn’s multiple comparison test was used. Additionally, Spearman correlation analysis was used to evaluate the association between numerical variables. Analyses were performed using SPSS 22.0, and p<0.05 was determined as the level of statistical significance.

 Results

We enrolled 112 patients with HF and 50 healthy controls. The mean age of the total study population was 59.57 ± 9.24 years. The baseline characteristics of the patients and controls were summarized in Table 1. Mean age was similar both between patient and control groups and between patients with different HF groups. As a marker of disease severity and prognosis, the hallmark marker of HF, N-terminal pro-B-type natriuretic peptide (NT-proBNP) median levels were significantly higher in the patient group compared to healthy controls (660 (291 -1000) vs. 92 (78 -102) p< 0.001). Also, there was a significant increase in NT-proBNP levels with decreasing ejection fraction (p<0.01). Serum GSK-3β levels were significantly increased in HF patients compared to healthy control (117.26 (45.39 -223.85) vs 13.91 (5.6 -23.3) p<0.001). HF patients were divided into three groups based on left ventricular ejection fraction (LVEF): a) HFpEF where LVEF is > 50%, b) HFmrEF where LVEF is > 40% but <50% and c) HFrEF where LVEF is <40%. While considering different HF groups based on LVEF, GSK-3β levels were lowest among patients with HFrEF (median 38.72) and highest among patients with HFpEF (median 236.44) (p<0.001). While evaluating patients with HF, in three groups based on LVEF, GSK-3β levels were significantly lower among patients with lower left ventricular ejection fractions. Among patients with HFpEF, median GSK-3β levels were 236.44, whereas serum GSK-3β levels were 129.2 for patients with HFmrEF and 38.72 for patients with HFrEF (p<0.001). Serum BNP levels were also significantly increased with decreasing ejection fractions (p<0.001). As a marker of inflammation and prognosis, hs-CRP levels and NLR ratios were similar between different HF groups based on LVEF. In-group differences and comparisons are summarized in the Central Figure and Table 2.

– Baseline characteristics of the patients and controls
Controls Patients with heart failure p
Median (Q1-Q3) Median (Q1-Q3)
GSK-3β (ng/mL) 13.91 (5.6 -23.3) 117.26 (45.39 -223.85) 0.001***
NT-proBNP (pg/mL) 92 (78 -102 ) 660 (291 -1000 ) 0.001***
LVEF (%) 55 (55 -57 ) 44.5 (35 -53.5 ) 0.001***
hs-CRP (mg/L) 5 (2 -8.4) 4.78 (2 -7.05 ) 0.405
Leukocyte 9 (7.21 -11.53) 9.71 (7.21 -11.53) 0.878
Platelet 258.5 (225 -311 ) 281 (237 -333 ) 0.252
Lymphocyte 2.23 (1.78 -4.87) 2.31 (1.5 -3.58) 0.187
Neutrophil 7.1 (4.96 -7.77 ) 6.01 (4.44 -7.77) 0.330
Creatinine 0.87 (0.71 -1.01) 0.77 (0.7 -0.99) 0.148
eGFR 82.36 (65 -109 ) 99.5 (72 -109.5 ) 0.200
NLR 2.06 (1.12 -4.02) 2.32 (1.61 -4.01) 0.212
PLR 111.05 (57.7 -150.25) 123.93 (79.21 -180.99) 0.069

***p<0.001; Mann-Whitney U test. GSK-3β; glycogen synthase kinase 3 beta, NT-proBNP: N-terminal pro-brain natriuretic peptide; LVEF: left ventricular ejection fraction; hsCRP: highly sensitive C reactive protein; eGFR: estimated glomerular filtration rate (mL/min/1.73 m2); NLR: neutrophil to lymphocyte ratio; PLR: platelet to lymphocyte ratio.

– In-group differences and comparisons
Variables Healthy controls and types of heart failure Median (Q1-Q3) p
GSK-3β (ng/mL) Healthy controls 13.91 (5.6 -23.3) 0.001***
HFrEF 38.72 (23.15 -67.31)
HFmrEF 129.2 (78.9 -199.63)
HFpEF 236.44 (132.89 -432)
NT-proBNP (pg/mL) Healthy controls 92 (78 -102) 0.001***
HFrEF 1110 (817.5 -2220)
HFmrEF 607 (430 -780)
HFpEF 225 (180 -312)
hs-CRP (mg/L) Healthy controls 5 (2 -8.4) 0.425
HFrEF 5 (2.44 -9)
HFmrEF 5 (1 -6)
HFpEF 3.64 (2 -6)
Leukocyte Healthy controls 9 (7.21 -11.53) 0.998
HFrEF 9.86 (7.12 -11.77)
HFmrEF 9.87 (7.21 -11.06)
HFpEF 8.9 (7.67 -12)
Platelet Healthy controls 258.5 (225 -311) 0.550
HFrEF 272 (237.5 -358.5)
HFmrEF 280.5 (228 -321)
HFpEF 281 (238 -365)
Lymphocyte Healthy controls 2.23 (1.78 -4.87) 0.344
HFrEF 2.31 (1.53 -4.87)
HFmrEF 2.31 (1.56 -2.75)
HFpEF 2.34 (1.42 -3.12)
Neutrophil Healthy controls 7.1 (4.96 -7.77) 0.025*
HFrEF 7.59 (5.41 -8.33)
HFmrEF 5.95 (4.35 -6.87)
HFpEF 4.99 (4.37 -7.77)
NLR Healthy controls 2.06 (1.12 -4.02) 0.601
HFrEF 2.13 (1.12 -4.62)
HFmrEF 2.62 (1.67 -3.95)
HFpEF 2.28 (1.87 -3.49)
PLR Healthy controls 111.05 (57.7 -150.25) 0.116
HFrEF 116.22 (53.62 -175.07)
HFmrEF 119.25 (86.34 -161.04)
HFpEF 147.33 (101.08 -190)

***: p<0.001 (statistically very strong significant difference). *: p<0.05 (statistically significant difference). GSK-3β; glycogen synthase kinase 3 beta; NT-proBNP: N-terminal pro-brain natriuretic peptide; LVEF: left ventricular ejection fraction; hsCRP: highly sensitive C reactive protein; eGFR: estimated glomerular filtration rate (mL/min/1.73 m2); NLR: neutrophil to lymphocyte ratio; PLR: platelet to lymphocyte ratio.

 Discussion

In this study, we evaluated established markers for prognosis among patients with HF, and as a new and promising marker, we measured serum GSK-3β levels and compared results to healthy controls. The main finding of the study was that serum GSK-3β levels had significantly increased among patients with HF. Also, with reducing ejection fraction, GSK-3β levels had a trend toward a reduction. The highest levels of GSK-3β levels were recorded among patients with HFpEF.

Glycogen synthase kinase (GSK) has two isoforms, α and β. For mechanisms specific to the heart, β isoform has gained much interest. Recent studies revealed that GSK-3β has an important role in ischemic preconditioning, postconditioning, hypertrophy, and HF. Among various pathways and mechanisms, the effect of GSK-3β on cardiac physiology is exerted by phosphorylation of transcriptional regulators and translational initiation factors.8 Activated GSK-3β prevents hypertrophic growth of myocytes, and especially in the process of advancing HF, GSK-3β is inhibited probably as a protective mechanism.9 In our study, serum GSK-3β levels were highest among patients with HFpEF. With reducing ejection fractions, GSK-3β levels were constantly decreasing, and this difference had reached a strongly significant difference (p<0.001). Our findings support previous research findings that, with advancing HF, GSK-3β is downregulated as a protective mechanism. Another support for this finding comes from an animal study. Kirk et al. evaluated dog hearts with HF with dyssynchrony.1º They used cardiac resynchronization therapy (CRT) for these animals and found that GSK-3β was deactivated in these hearts and reactivated by CRT. Also, CRT improved the calcium responsiveness of myofilaments through GSK-3 reactivation. This finding also suggests a possible therapeutic approach for HF therapies in the near future.

We measured serum BNP levels, which is accepted as the standard biomarker for HF both at the diagnosis and determination for prognosis and also evaluating the response to treatment.2 As compared to healthy controls, median NT-proBNP levels were significantly higher among patients with HF. This association was positively correlated with GSK-3β levels, which were also significantly increased among patients with HF compared to healthy controls. From this point, we can assume that GSK-3β may be used as a novel biomarker for HF like BNP. However, further studies with a greater number of patients are needed to clarify this association.

As an established risk factor for future cardiovascular and especially coronary events, we also measured serum high-sensitivity C-reactive protein (hsCRP) levels. Both for coronary artery disease and HF, hsCRP is an established marker for prognosis. Serum levels of hs-CRP were similar between healthy controls and patients with HF. Other widely studied markers of systemic inflammation are neutrophil-to-lymphocyte ratio (NLR) and platelets-to-lymphocyte ratio (PLR). Systemic inflammation is accepted as a key pathogenetic step both for the development of atherosclerosis and HF. Also, an increased level of systemic inflammation is accepted as a poor prognostic marker for acute coronary events and chronic HF. In their large meta-analysis, Dong et al. evaluated 9406 patients from eight studies and revealed that NLR is a poor prognostic marker for patients with recent acute coronary syndrome, and higher baseline NLR values were associated with increased in-hospital mortality.11 Uthamalingam et al. evaluated patients hospitalized for acute decompensated HF and revealed that increased NLR values were independently associated with long-term mortality.12 In our study, median values of NLR were similar both for healthy controls and for patients with HF (p:0.212). Also, median NLR values were similar across different HF subgroups (p:0.601). The relatively low number of patients can explain this lack of difference. Also, we did not enroll patients with acute decompensation. Since NLR is generally a marker of acute inflammation and hence acute decompensation of HF would probably cause in elevation of calculated NLR values.

Study limitations and future perspectives

One limitation of our study was the relatively small number of patients enrolled. The higher number of patients would yield more clinically relevant and robust data. The glycogen synthase kinase beta pathway is gaining increased interest in the HF pathway. With an increased understanding of this pathway, new therapies for HF targeting the GSK pathway may become available in the near future.

 Conclusion

Serum levels of glycogen synthase kinase 3 beta (GSK-3β) is significantly increased among patients with HF compared to healthy controls. Also, GSK-3β levels showed a significant reduction with reduced ejection fraction, pointing towards a possible protective mechanism and also a therapeutic target for the treatment of HF.

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

This study was approved by the Ethics Committee of the Gaziantep University School of Medicine under the protocol number 2021-672. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.

There were no external funding sources for this study.