Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC cYcKfRFDZjJWRy57h4DmT3m S0066-782X2024001000307 00307 10.36660/abc.20240181 Artigo Original O Knockdown de LncRNA CCAT2 Alivia a Sobrecarga de Pressão ou a Hipertrofia Cardíaca Induzida por Ang II por Meio da Interrupção da Sinalização Wnt/β-catenina Zhang Xiaojun Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Obtenção de financiamento 1 Chen Zhen Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Obtenção de financiamento 2 Zhang Ning Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados; Análise estatística Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Obtenção de financiamento 1 Yu Bo Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 2 Li Wei Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 2 Zhang Mengli Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 2 Wu Xian Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 2 Liu Ganzhe Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 2 0009-0007-0938-9584 Dong Meizhen Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Obtenção de financiamento 1 Qilu Hospital Cheeloo College of Medicine Shangdong University Qingdao Shangdong China Department of Emergency, Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shangdong University, Qingdao, Shangdong – China The Central Hospital of Wuhan Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology Wuhan Hubei China The Central Hospital of Wuhan, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Hubei – China Meizhen Dong • Department of emergency, Qilu Hospital(Qingdao), Cheeloo College of Medicine, shandong University, 758 Hefei Road, Qingdao, Shandong, 266035 - China E-mail: dongmeizhendr@hotmail.com

Marina Okoshi

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 11 11 2024 10 2024 121 10 e20240181 26 03 2024 15 05 2024 24 07 2024 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

: O <italic>Knockdown</italic> de LncRNA CCAT2 Alivia a Sobrecarga de Pressão ou a Hipertrofia Cardíaca Induzida por Ang II por Meio da Interrupção da Sinalização Wnt/β-catenina

Resumo Fundamento

A hipertrofia cardíaca patológica (HC) sustentada é um fator de risco independente para aumento da incidência e mortalidade de eventos cardiovasculares.

 Objetivos

Esta pesquisa foi projetada para desvendar o papel do RNA não codificante longo (LncRNA) CCAT2 na progressão da HC.

 Métodos

Procedimentos de constrição aórtica transversal (TAC) foram conduzidos para construir um modelo de HC in vivo induzido por sobrecarga de pressão. O tratamento com angiotensina II (Ang II) foi utilizado para induzir células hipertróficas de cardiomiócitos de rato H9c2.

 Resultados

Os resultados in vivo mostraram que o silenciamento de CCAT2 reduziu a área de superfície dos cardiomiócitos, aliviou a fibrose cardíaca e diminuiu os níveis de β-MHC, ANP e BNP em modelos de camundongos HC. Os resultados in vitro revelaram que o knockdown de CCAT2 reduziu a área de superfície celular e atenuou os níveis de β-MHC, ANP e BNP em células hipertróficas H9c2. Além disso, o silenciamento de CCAT2 diminuiu os níveis de β-catenina ativa, GSK-3β fosforilada e genes alvo Wnt (c-Myc, ciclinaD1 e c-Jun) em camundongos HC e células H9c2 hipertróficas. É importante ressaltar que o tratamento com o ativador da via Wnt / β-catenina LiCl reverteu a supressão do knockdown de CCAT2 na área de superfície celular H9c2 e nos níveis de MHC, ANP e BNP.

 Conclusões

Coletivamente, o silenciamento do CCAT2 desempenha um papel protetor contra a HC através da inativação da sinalização Wnt/β-catenina, o que sugere que o CCAT2 pode se tornar um alvo terapêutico promissor para o HC.

 Cardiomegalia Cateninas Angiotensina II Natural Science Foundation of Hubei Science 2022CFC002 Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado por Natural Science Foundation of Hubei Science and Technology Department, General Project (2022CFC002). Introdução

A hipertrofia cardíaca (HC), como reação adaptativa ao estresse hemodinâmico, é responsável pela manutenção da função sistólica cardíaca normal na fase inicial dos estímulos de estresse.1 Fatores fisiológicos como exercício e gravidez podem aumentar a carga miocárdica e causar HC, que é considerada um fenômeno normal, sendo leve e reversível.2 No entanto, sob a influência de fatores patológicos, como hipertensão e estenose aórtica, se desenvolverá HC patológica, caracterizada por crescimento excessivo do músculo cardíaco, aumento no tamanho e área de superfície das células dos cardiomiócitos, desorganização dos cardiomiócitos e fibrose intersticial do miocárdio.3 A HC contínua leva a um aumento no consumo de oxigênio pelo miocárdio, o que causa incompatibilidade entre oferta e demanda do miocárdio e desencadeia ainda vários distúrbios cardiovasculares, incluindo arritmias, insuficiência cardíaca, infarto do miocárdio e morte súbita cardíaca.4 Os sintomas comuns de HC incluem dispneia aos esforços, falta de ar, fadiga, aperto no peito, dor no peito, palpitações e síncope.5 O sistema renina-angiotensina, responsável pela manutenção da pressão arterial, do equilíbrio hídrico e eletrolítico e da homeostase cardiovascular, consiste em dois eixos principais: o eixo “clássico” que compreende a enzima conversora de angiotensina, a angiotensina II e o receptor tipo 1 da angiotensina (ACE/AngII/AT1) e o eixo “contrarregulador” composto pela enzima conversora de angiotensina 2, angiotensina (1-7) e receptor Mas (ACE2/Ang-(1-7)/Mas).6 O eixo clássico exerce efeitos pró-vasoconstritores, pró-inflamatórios, pró-trombóticos e pró-fibróticos, enquanto o eixo contra-regulatório desempenha o papel oposto.6,7 Terapias destinadas a inibir a ativação do eixo ECA/AngII/AT1 e/ou promover a função do eixo ECA2/Ang-(1-7)/Mas foram desenvolvidas para o tratamento de doenças cardiovasculares, incluindo HC e insuficiência cardíaca.8,9 A fisiopatologia do HC envolve múltiplos sistemas celulares e moleculares, sendo complexa e multifatorial.10 Os RNAs não codificantes (ncRNAs) têm atraído atenção considerável nas últimas décadas, com evidências crescentes ligando-os à patogênese do HC e das doenças cardiovasculares.11 Portanto, é urgente explorar a etiologia molecular específica da HC para encontrar alvos mais eficazes para o seu tratamento e melhorar a eficácia diagnóstica e terapêutica.

RNAs não codificantes longos (LncRNAs) são transcritos com um comprimento de sequência de mais de 200 nucleotídeos sem potencial de codificação de proteínas.12 Um grande conjunto de estudos elucidou que os LncRNAs estão inextricavelmente ligados ao desenvolvimento de doenças humanas através da regulação da expressão gênica em níveis transcricionais e pós-transcricionais.13 Até agora, vários LncRNAs foram confirmados como tendo um papel fundamental no desenvolvimento do CH e os mecanismos reguladores subjacentes foram esclarecidos. Por exemplo, o LncRNA ZEB2-AS1 é regulado positivamente em modelos murinos induzidos por constrição aórtica transversa (TAC) de HC e cardiomiócitos primários de camundongos estimulados por fenilefrina, e o silenciamento de ZEB2-AS1 desempenha um papel protetor contra HC através da regulação negativa de PTEN.14 O LncRNA NBR2 regulado negativamente em pacientes com HC está negativamente correlacionado com a função cardíaca e o grau da doença, e a superexpressão de NBR2 ativa a via LKB1/AMPK/Sirt1 e enfraquece o estresse do retículo endoplasmático, aliviando assim a hipertrofia induzida por angiotensina II (Ang II) de células miocárdicas humanas.15 A expressão de LncRNA MIAT é elevada em células H9c2 derivadas de coração de rato e camundongos submetidos à indução de HC pelo tratamento com Ang II, e o knockdown de MIAT mitiga a HC através do aumento do nível de miR-150.16 LncRNA CCAT2, localizado no cromossomo 8q24.21, foi originalmente identificado como um oncogene no câncer colorretal.17 O locus genômico CCAT2 abriga o SNP rs6983267, que está intimamente relacionado ao aumento do risco de várias doenças malignas. O papel oncogênico do CCAT2 tem sido bem documentado em vários tipos de câncer humano, incluindo câncer de pulmão, mama, gástrico, cervical e de próstata.18 No entanto, faltam pesquisas sobre o papel do CCAT2 no HC.

No presente estudo, modelos in vitro e in vivo de HC foram construídos realizando tratamento com Ang II em células H9c2 de cardiomiócitos de rato e TAC em camundongos, respectivamente. O objetivo da nossa pesquisa é examinar a função do LncRNA CCAT2 na progressão da HC e o mecanismo subjacente.

 Métodos Animais

Setenta camundongos C57BL/6 J machos (8 a 10 semanas de idade, 22 a 24 g) foram adquiridos no Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, EUA). Todos os camundongos foram alojados em condições específicas livres de patógenos, a uma temperatura padrão de 23°C e 55-60% de umidade em um ciclo claro/escuro de 12 horas, com comida e água disponíveis livremente. Os cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram permitidos pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Wuhan Myhalic Biotechnology Co., Ltd sob o número de protocolo HLK-202303112.

 Experimentos animais

A HC induzido por sobrecarga de pressão foi construída por cirurgia TAC conforme descrito anteriormente.19 Resumindo, os ratos foram anestesiados com pentobarbital sódico a 0,3% (40 mg/kg; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) via injeção intraperitoneal após adaptação de uma semana. Em seguida os camundongos receberam toracotomia seguida de dissecção aórtica e constrição transversal da aorta com agulha de calibre 26 e sutura com fio de seda 7-0. Os ratos do grupo Sham receberam a mesma operação sem ligadura transversa da aorta. Após 24 h de operação do TAC, vetores do vírus adeno-associado-9 (AAV9) transportando um shRNA específico para CCAT2 (AAV9-shCCAT2) foram injetados em camundongos modelo HC induzidos por TAC através da veia da cauda para knockdown CCAT2, com AAV9-shNC como o controle negativo (Figura 2A). Os ratos foram alocados aleatoriamente em 4 grupos: o grupo Sham (n=10), o grupo TAC (n=20), o grupo TAC + AAV9-shCCAT2 (n=20), e o grupo TAC + AAV9-shNC (n=20). Os camundongos nos grupos TAC + AAV9-shCCAT2 e TAC + AAV9-shNC foram injetados diariamente com 100 μL (1,2×1012 vg/mL) AAV9-shCCAT2 ou AAV9-shNC por 3 semanas, enquanto os ratos nos grupos Sham e TAC foram injetados diariamente com 100 μL de solução salina por 3 semanas. Posteriormente, os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical e seus corações foram colhidos para análise posterior. O desenho experimental para os ensaios in vivo é apresentado na Figura 1.

– CCAT2 é regulado positivamente nos tecidos cardíacos de modelos de camundongos HC e células H9c2 hipertróficas tratadas com Ang II. (A) Imagens representativas de coloração H&E de seções cardíacas e quantificação da área transversal de cardiomiócitos em camundongos HC simulados e induzidos por TAC. Barra de escala, 20 μm. n = 6 camundongos por grupo. (B-E) Exame de parâmetros ecocardiográficos, incluindo diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo (LVEDd), diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo (LVESd), fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) e encurtamento fracionário do ventrículo esquerdo (LVFS) de camundongos Sham e induzidos por HC com sistema de ultrassom. n = 6 camundongos por grupo. (F-H) A relação entre o peso do coração (HW) e o peso corporal (BW), o peso do ventrículo esquerdo (LVW) em relação ao BW e a relação entre o LVW e o comprimento tibial (TL) de camundongos HC simulados e induzidos por TAC. n = 6 camundongos por grupo. (I-K) Medição dos níveis de proteína β-MHC, ANP e BNP em tecidos cardíacos de camundongos por Western blotting. n = 6 camundongos por grupo.(L) Detecção da expressão de mRNA de CCAT2 em tecidos cardíacos de camundongos por RT-qPCR. n= 6 camundongos por grupo. (M) Observação do tamanho das células miocárdicas de ratos H9c2 após tratamento com Ang II através da coloração de imunofluorescência α-SMA. Barra de escala, 20 μm. n = 3 repetições. (N) Análise dos níveis de mRNA de β-MHC, ANP e BNP em células H9c2 controle e estimuladas por Ang II por meio de RT-qPCR. n=3 repetições. (O) Avaliação da expressão de mRNA de LncRNA CCAT2 em células H9c2 após estimulação com Ang II. n=3 repetições. Os dados são expressos como médias ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

– Desenho do experimento.

Análise ecocardiográfica

O Vevo 2100 Imaging System (Visual Sonics, Toronto, ON, Canada) foi utilizado para realizar ecocardiografia do ventrículo esquerdo em camundongos 3 semanas após a indução do TAC. Resumidamente, os ratos foram anestesiados por inalação de 1,5% de isoflurano (Sigma-Aldrich), colocado com o peito para cima em uma tábua de exame e limpado para remover todos os pelos do peito. As medidas do modo M das dimensões do ventrículo esquerdo (VE), incluindo o diâmetro sistólico final do VE (LVESd) e o diâmetro diastólico final do VE (LVEDd), foram realizadas usando o cabeçote de varredura e calculadas a média de dez ciclos cardíacos consecutivos. A fração de ejeção (FE) e a fração de encurtamento (FS) do VE foram calculadas com base nos dados de LVESd e LVEDd.

 Avaliação histológica

Os tecidos cardíacos dos camundongos foram fixados em formalina a 10% por 24 h, desidratados em etanol e xileno, embebidos em blocos de parafina e cortados em cortes transversais de 5 μm de espessura. Os cortes foram então corados com hematoxilina e eosina (H&E; LMAI Bio, Xangai, China) e tricrômico de Masson (Solarbio, Pequim, China) para avaliar os tamanhos transversais dos cardiomiócitos e a deposição de colágeno cardíaco, respectivamente. As lâminas foram examinadas microscopicamente, seguido do cálculo da área transversal e da área fibrótica dos cardiomiócitos utilizando o software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA).

 Tratamento celular e transfecção

Células H9c2 de cardiomiócitos de rato adquiridas da American Type Culture Collection (Manassas VA, EUA) foram cultivados em DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) contendo 10% de soro fetal bovino (HyClone, South Logan, UT, EUA) e soluções de penicilina-estreptomicina a 1% (HyClone) e foram mantidas a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. Para estabelecer o modelo in vitro de HC, as células H9c2 foram tratadas com Ang II (150 nM; Sigma-Aldrich) por 24 h.20 Células H9c2 tratadas com Ang II foram então transfectadas com shCCAT2 ou shNC (RibiBio, Guangzhou, China) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) para avaliar a influência do silenciamento de CCAT2 na hipertrofia de cardiomiócitos induzida por Ang II. Além disso, para confirmar o papel da via Wnt/β-catenina na hipertrofia de cardiomiócitos mediada por CCAT2, as células H9c2 foram pré-tratadas com cloreto de lítio (LiCl; 2,5 mM; Sigma-Aldrich) por 12 h antes do tratamento com Ang II e transfecção com shCCAT2 ou shNC. O delineamento experimental para os ensaios in vitro é apresentado na Figura 1.

 RT-qPCR

O mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EUA) foi utilizado para extração de RNA total de células H9c2 e tecidos cardíacos de camundongos. Posteriormente, 1 µg de RNA foi purificado usando DNase I (Medchem Express, Monmouth Junction, EUA) e transcrito reversamente em DNA complementar (cDNA) utilizando Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen). A amplificação e detecção por PCR foram realizadas com o GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, EUA) no ABI7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As sequências iniciadoras estão listadas na Tabela 1. Os níveis de expressão relativa foram calculados com o método 2 CT após normalização para mRNA de GAPDH.

– Sequências de primers usadas em RT-qPCR
Gene Espécie Sequências iniciais
β-MHC Camundongo Avanço: 5’-AACCTGTCCAAGTTCCGCAAGGTG-3’
Reversa: 5'-GAGCTGGGTAGCACAAGAGCTACT-3'
β-MHC Rato Avanço: 5’-AAGTGAAGAGCCTCCAGAGTTT-3’
Reversa: 5'-TGATGAGGCTGGTGTTCTGGG-3'
ANP Camundongo Avanço: 5’-CTCCGATAGATCTGCCCTCTTGAA-3’
Reversa: 5'-GGTACCGGAAGCTGTTGCAGCCTA-3'
ANP Rato Avanço: 5’-CCTGGACTGGGGAAGTCAAC-3’
Reversa: 5'-ATCTATCGGAGGGGTCCCAG-3'
BNP Camundongo Avanço: 5’-GCTCTTGAAGGACCAAGGCCTCAC-3’
Reversa: 5'-GATCCGATCCGGTCTATCTTGTGC-3'
BNP Rato Avanço: 5’-TGACGGGCTGAGGTTGTTTT-3’
Reversa: 5'-ACACTGTGGCAAGTTTGTGC-3'
c-Myc Camundongo Avanço: 5’-TCCATCCTATGTTGCGGTCG-3’
Reversa: 5'-AACCGCTCCACATACAGTCC-3'
c-Myc Rato Avanço: 5’-AGCGACACAAGAAGCTTCTG-3’
Reversa: 5'-CTGAAGCAGCTCCGCCAAAC-3'
ciclinaD1 Camundongo Avanço: 5’-TCAAGTGTGACCCGGACTG-3’
Reversa: 5'-ATGTCCACATCTCGCACGTC-3'
ciclinaD1 Rato Avanço: 5’-TCAAGTGTGACCCGGACTG -3’
Reversa: 5'-CACTACTTGGTGACTCCCGC-3'
c-Jun Camundongo Avanço: 5’-GCACATCACCACTACACCGA-3’
Reversa: 5'-GGGAAGCGTGTTCTGGCTAT-3'
c-Jun Rato Avanço: 5’-GCCACCGAGACCGTAAAGAA-3’
Reversa: 5'-TAGCACTCGCCCAACTTCAG-3'
GAPDH Camundongo Avanço: 5’-TTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3’
Reversa: 5'-GCCATGTAGGCCATGAGGTC-3'
GAPDH Rato Avanço: 5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’
Reversa: 5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'

Western blotting

Células H9c2 e tecidos cardíacos de camundongo foram lisados usando buffer RIPA contendo coquetel de proteinase (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). Em seguida, proteínas iguais foram carregadas em géis de SDS-PAGE a 10% para eletroforese, seguido de transferência para membranas de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EUA). As membranas foram incubadas com os anticorpos primários contra β-MHC (SAB2106550, 1/2000, Sigma-Aldrich), ANP (sc-515701, 1/1000, Santa Cruz Biotecnology, Santa Cruz, CA, EUA), BNP (sc-271185, 1/1000, Santa Cruz Biotecnology), β-catenina ativa (ab246504, 1/1000, Abcam,Cambridge, Reino Unido), β-catenina (ab68183, 1/1000, Abcam), GSK-3β fosforilada (ab131097, 1/1000, Abcam), GSK-3β (ab227208, 1/1000, Abcam) e β-actina (ab8227, 1/1000, Abcam) a 4°C durante a noite após ser bloqueadas por 1 h com 5% de leite desnatado. No segundo dia, as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário conjugado com HRP (ab205718, 1/2000, Abcam) por 1 h em temperatura ambiente (RT) após serem lavadas com solução TBST (Beyotime, Xangai, China). Os complexos imunes foram visualizados usando o método de quimioluminescência aprimorada (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA). O software Image J (NIH, Bethesda, MD, EUA) foi empregado para determinar a densidade óptica de cada proteína. A β-actina foi usada como controle de carga.

 Coloração imunofluorescente

As células H9c2 foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (Zeye, Xangai, China), fixadas com paraformaldeído a 4% (Zeye) por 15 min e permeabilizadas com Triton X-100 a 0,2%(Sigma-Aldrich) por 15 minutos. Em seguida, 5% de albumina de soro bovino (Sigma-Aldrich) foi usado para bloquear as células por 30 min em temperatura ambiente, após o que o anticorpo α-SMA (14395-1-AP, 1/1000, Proteintech, Rosemont, IL, EUA) foi adicionado, seguido de incubação durante a noite no escuro a 4 °C.

No dia seguinte, as células passaram por outra incubação de 1 h a 37°C com o anticorpo secundário conjugado com FITC (SA00003-8, 1/100, Proteintech). A coloração nuclear foi obtida com DAPI (Sigma-Aldrich). As lâminas foram observadas em um microscópio de fluorescência axiovert 200 invertido (Carl Zeiss, Gottingen, Alemanha), e a área da superfície celular foi calculada usando o software Image-Pro Plus 6.0.

 Ensaio flash TOP/FOP

Os repórteres de luciferase Topflash ou FOPflash (EMD Millipore, Billerica, MA, EUA) foram usados para detectar a atividade da via de sinalização Wnt. Em resumo, após o tratamento indicado ou transfecção, as células H9c2 foram plaqueadas (5000 células/poço) em placas de 24 poços e privadas de soro durante a noite.

Posteriormente, as células foram transfectadas com 0,2 µg de plasmídeos de expressão TOPflash ou FOPflash utilizando Lipofectamine 2000. As atividades de luciferase TOP/FOP foram medidas utilizando o Luciferase Assay System (Promega,Madison, WI, EUA) 48 h após a transfecção.

 Análise estatística

Todos os dados de pelo menos três experimentos individuais repetidos foram analisados usando o software GraphPad Prism versão 5.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA) e são apresentados como média ± desvio padrão (DP). Comparações duplas e múltiplas foram realizadas com teste-t de Student não pareado e ANOVA unidirecional seguido pelo teste post hoc de Tukey. Um valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

 Resultados Taxa de mortalidade de camundongos

Todos os animais toleraram a cirurgia e nenhum camundongo morreu durante a operação. Após três semanas da cirurgia TAC e injeção de AAV, 1 camundongo, 12 camundongos, 11 camundongos e 6 camundongos morreram no grupo Sham, no grupo TAC, no grupo TAC+AAV9-shCCAT2 e no grupo TAC+AAV9-shNC, com taxa de sobrevivência de 90%, 40%, 45% e 70% respectivamente.

 CCAT2 é regulado positivamente nos tecidos cardíacos de modelos de camundongos HC e células H9c2 hipertróficas induzidas por Ang II

Os corações dos ratos foram colhidos para exame histológico 4 semanas após a operação TAC. Como mostrado pelas imagens da coloração H&E, a cirurgia TAC aumentou acentuadamente a área transversal dos cardiomiócitos em camundongos (Figura 2A). A medição ecocardiográfica refletiu que LVEDd e LVESd de corações pós-TAC em 3 semanas foram significativamente maiores, enquanto FEVE e LVFS foram menores do que aqueles de corações Sham (Figura 2B-E), indicando a função cardíaca prejudicada de camundongos operados de TAC. A TAC desencadeou um aumento óbvio na relação peso do coração (PC) em relação ao peso corporal (PC), peso do ventrículo esquerdo (PVE) em relação ao PC e relação entre PVE e comprimento tibial (TL), mostrando uma proporção notavelmente maior de tecido cardíaco em camundongos HC (Figura 2F-H). Além disso, a expressão consideravelmente regulada de marcadores HC (β-MHC, ANP e BNP) foi observada nos tecidos cardíacos de camundongos após a indução de TAC (Figura2I-K). Posteriormente, a expressão de LncRNA CCAT2 em tecidos cardíacos de camundongos após operação TAC foi detectada por RT-qPCR, que revelou que CCAT2 estava superexpresso em tecidos cardíacos hipertróficos vs. tecidos cardíacos normais (Figura 2L), implicando que o LncRNA CCAT2 pode participar no desenvolvimento do HC. Para confirmar ainda mais a função do CCAT2 na HC, um modelo celular foi construído tratando células miocárdicas de rato H9c2 com Ang II. O tamanho das células H9c2 foi avaliado por meio da coloração de imunofluorescência α-SMA, que demonstrou que o tratamento com Ang II demonstrou área celular de cardiomiócitos de ratos (Figura 2M).

Enquanto isso, os cardiomiócitos hipertróficos induzidos por Ang II exibiram expressão significativamente maior de ANP, BNP e β-MHC de mRNA do que os cardiomiócitos de controle (Figura 2N). É importante ressaltar que se descobriu que a expressão de LncRNA CCAT2 em células H9c2 aumentava notavelmente após o tratamento com Ang II (Figura 2O), o que implica ainda o papel potencial do CCAT2 no desenvolvimento do HC.

 Silenciamento de CCAT2 alivia HC e fibrose cardíaca in vivo

Depois, para determinar o papel detalhado do CCAT2 na regulação do HC in vivo, o AAV9-shCCAT2 foi injetado em camundongos modelo HC induzidos por TAC através da veia da cauda para knockdown o CCAT2 (Figura 3A). Após três semanas, detectamos e descobrimos que o aumento induzido por TAC na expressão de CCAT2 em tecidos cardíacos de camundongos foi revertido após a depleção de CCAT2 (Figura 3B). A coloração H&E ilustrou que a injeção com AAV9-shCCAT2 reduziu a área de superfície de cardiomiócitos em camundongos HC induzidos por TAC (Figura 3C). Como característica importante do HC patológico, a fibrose cardíaca foi detectada através da coloração tricrômica de Masson. Comparados aos camundongos Sham, os camundongos submetidos à cirurgia TAC apresentaram alterações fibróticas intersticiais e perivasculares nos tecidos cardíacos, acompanhadas de notável acúmulo de colágeno. No entanto, as alterações fibróticas cardíacas induzidas por TAC acima foram melhoradas após o knockdown de CCAT2 (Figura 3D). A análise ecocardiográfica mostrou que a elevação induzida por TAC em LVEDd e LVESd e a redução em FEVE e LVFS de corações de camundongos foram marcadamente revertidas após a regulação negativa de CCAT2 (Figura 3 E-H). Além disso, a elevação nas relações HW/BW, LVW/BW e LVW/TL em camundongos causada pela operação TAC foi anulada pelo silenciamento de CCAT2 (Figura 3I). O Western blotting demonstrou que o incremento induzido por TAC nos níveis de proteína β-MHC, ANP e BNP em tecidos cardíacos de camundongos foi antagonizado por injeção com AAV9-shCCAT2 (Figura 3 J-L). No geral, o silenciamento CCAT2 mitiga efetivamente a HC em ratos.

– Silenciamento de CCAT2 alivia HC em ratos modelo. (A) Protocolo para injeção de AAV9-shCCAT2 ou AAV9-shNC em camundongos modelo HC induzidos por TAC. (B) Detecção da expressão de CCAT2 em tecidos cardíacos de camundongos silenciadores de CCAT2 3 semanas após a cirurgia TAC por RT-qPCR. n = 6 camundongos por grupo. (C) Imagens representativas de coloração H&E de seções cardíacas e quantificação da área transversal de cardiomiócitos em camundongos simulados e camundongos HC induzidos por TAC com ou sem knockdown de CCAT2. Barra de escala, 20 μm. n = 6 camundongos por grupo. (D) Imagens representativas de coloração tricrômica de Masson de seções cardíacas e quantificação de fibrose miocárdica. Barra de escala, 50 μm. n = 6 camundongos por grupo. (E-H) LVEDd, LVES, LVEF e LVFS do coração do rato. n = 6 camundongos por grupo.(I) Proporção HW/BW, LVW/BW e LVW/TL de camundongos. n = 6 camundongos por grupo. (J.-L) Determinação dos níveis de proteína β-MHC, ANP e BNP em tecidos cardíacos de camundongos por meio de western blotting. n = 6 camundongos por grupo. Os dados são expressos como médias ± DP. *P < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs. Sham; #p < 0,05, ###p < 0,001 vs. TAC.

Silenciamento de CCAT2 melhora a hipertrofia de cardiomiócitos in vitro

Da mesma forma, os impactos do knockdown de CCAT2 na hipertrofia de cardiomiócitos in vitro foram avaliados posteriormente após células H9c2 tratadas com Ang II terem sido transfectadas com shCCAT2. Descobrimos a partir de RT-qPCR que a transfecção shCCAT2 debilitou a promoção do tratamento com Ang II no nível CCAT2 em células H9c2 (Figura 4 A). Conforme revelado pela coloração de imunofluorescência de α-SMA, o knockdown de CCAT2 obviamente reduziu a área de superfície em células H9c2 hipertróficas (Figura 4B-C). Além disso, a deficiência de CCAT2 neutralizou o aumento nos níveis de β-MHC, ANP e BNP causados pelo tratamento com Ang II em células H9c2 (Figura 4D-G). Esses dados sugerem que o silenciamento de CCAT2 melhora a hipertrofia de cardiomiócitos in vitro.

– O silenciamento de CCAT2 melhora a hipertrofia de cardiomiócitos in vitro. Células H9c2 estimuladas com Ang II foram transfectadas com shCCAT2 ou shNC. (A) Análise da expressão de CCAT2 em células H9c2 por RT-qPCR. n=3 repetições. (B-C) Avaliação do tamanho das células H9c2 por coloração imuno-fluorescente com α-SMA. Barra de escala, 20 μm. n=3 repetições. (D-G) Exame dos níveis de β-MHC, ANP e BNP em células H9c2 por western blotting e RT-qPCR. n=3 repetições. Os dados são expressos como médias ± DP. ***P < 0,001 vs Controle; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs Ang II.

O silenciamento do CCAT2 inibe a ativação da sinalização Wnt/β-catenina no CH

Para descobrir o mecanismo molecular através do qual o knockdown de CCAT2 desempenha um papel protetor contra HC, a influência da depleção de CCAT2 no Wnt/β-cateninaa sinalização foi estimada em modelos de camundongos HC e cardiomiócitos hipertróficos. Conforme mostrado na Figura 5A-B, a cirurgia TAC resultou na ativação da via Wnt/β-catenina em camundongos CH, que, no entanto, foi suprimida pela depleção de CCAT2, conforme evidenciado pela redução nos níveis de β-catenina ativa e proteína GSK-3β fosforilada em camundongos CH silenciados por CCAT2.

– O silenciamento do CCAT2 inibe a ativação da via Wnt/β-catenina na HC. (A-B) Medição dos níveis de β-catenina ativa e proteína GSK-3β fosforilada em camundongos Sham e camundongos HC induzidos por TAC com ou sem injeção de AAV9-shCCAT2 ou AAV9-shNC por western blotting. n = 6 camundongos por grupo. (C) Detecção de níveis de mRNA de c-Myc, ciclinaD1 e c-Jun em camundongos HC induzidos por TAC após silenciamento de CCAT2 por RT-qPCR. n = 6 camundongos por grupo. Os dados são expressos como médias ± DP. **P < 0,01, ***p < 0,001 vs. Sham; #p < 0,05, ###p < 0,001 vs. TAC. (D-E) Exame dos níveis de β-catenina ativa e proteína GSK-3β fosforilada em células H9c2 de controle e células H9c2 estimuladas por Ang II com ou sem transfecção shCCAT2 ou shNC via western blotting. n= 3 repetições.(F) Avaliação dos níveis de mRNA de c-Myc, ciclinaD1 e c-Jun em células H9c2 tratadas com Ang II após knockdown de CCAT2 por RT-qPCR. n = 3 repetições. (G) Avaliação da atividade da via Wnt/β-catenina em células H9c2 após tratamento com Ang II e transfecção shCCAT2 ou shNC por ensaio flash TOP/FOP. n = 3 repetições. Os dados são expressos como médias ± DP. ***P < 0,001 vs. Controle; #p < 0,05, ###p < 0,001 vs. Ang II.

A expressão dos genes alvo Wnt foi detectada através de RT-qPCR, que mostrou que a expressão de c-Myc, ciclinaD1 e c-Jun em tecidos cardíacos de camundongos foi marcadamente aumentada após a operação TAC, mas foi atenuada após a injeção de AAV9-shCCAT2 (Figura 5 C). Além disso, a inativação do knockdown de CCAT2 na via Wnt/β-catenina no HC foi validada in vitro. O incremento induzido por Ang II nos níveis de β-catenina ativa e GSK-3β fosforilada em células H9c2 foi compensado pela regulação negativa de CCAT2 (Figura 5 D-E). RT-qPCR ilustrou que a regulação positiva induzida por Ang II na expressão de c-Myc, ciclinaD1 e c-Jun em células H9c2 foi revertida por knockdown de CCAT2 (Figura 5 F). Mais importante ainda, observamos um declínio significativo na relação TOP/FOP em células H9c2 hipertróficas, enquanto o silenciamento de CCAT2 anulou pronunciadamente esse efeito causado por Ang II (Figura 5 G). Em conjunto, o knockdown de CCAT2 desempenha um papel inibitório na via Wnt/β-catenina no HC.

 O silenciamento do CCAT2 alivia a hipertrofia dos cardiomiócitos in vitro, restringindo a via Wnt/β-catenina

Para validar se a hipertrofia de cardiomiócitos mediada por CCAT2 é dependente da via Wnt/β-catenina, as células H9c2 foram pré-tratadas com LiCl, um agonista da via Wnt/β-catenina, antes do tratamento com Ang II. De acordo com a coloração de imunofluorescência α-SMA, descobrimos que a inibição do silenciamento de CCAT2 na área de superfície das células H9c2 hipertróficas foi anulada pelo pré-tratamento com LiCl (Figura 6A-B). Conforme ilustrado por western blotting, o pré-tratamento com LiCl reverteu a redução nos níveis de proteína β-MHC, ANP e BNP causada pela depleção de CCAT2 em células hipertróficas H9c2 (Figura 6 C-E). Os resultados do RT-qPCR estavam alinhados com os do western blotting, que demonstraram que o LiCl aboliu o declínio induzido por shCCAT2 nos níveis de mRNA de β-MHC, ANP e BNP em células H9c2 hipertróficas (Figura 6 F). No geral, o LiCl atenua os efeitos preventivos do silenciamento do CCAT2 na hipertrofia dos cardiomiócitos induzida por Ang II.

– O silenciamento do CCAT2 alivia a hipertrofia dos cardiomiócitos in vitro ao restringir a via Wnt/β-catenina. Células H9c2 foram pré-tratadas com LiCl antes da estimulação com Ang II e da transfeção com shCCAT2 ou shNC. (A-B) Determinação do tamanho das células H9c2 por coloração imuno-fluorescente com α-SMA. n=3 repetições. Barra de escala, 20 μm. (C-F) Avaliação dos níveis de β-MHC, ANP e BNP em células H9c2 por western blotting e RT-qPCR. n=3 repetições. (G) Diagrama esquemático ilustrando o mecanismo molecular subjacente do LncRNA CCAT2 na hipertrofia cardíaca (CH). Os dados são expressos como médias ± DP. ***P < 0,001 vs Controle; #P < 0,05, ###P < 0,001 vs Ang II; &&P < 0,01, &&&P < 0,001 vs Ang II + shCCAT2.

Discussão

Este estudo fornece evidências que apoiam os efeitos de alívio da regulação negativa do LncRNA CCAT2 na HC. Foi demonstrado que o silenciamento de CCAT2 atenua a hipertrofia de cardiomiócitos induzida por Ang II in vitro e melhora a hipertrofia miocárdica induzida por sobrecarga de pressão em modelos de camundongos. Mecanicamente, o knockdown de CCAT2 inativou a sinalização Wnt/β-catenina, e a suplementação de LiCl, um agonista da sinalização Wnt/β-catenina, diminuiu o efeito anti-hipertrófico do silenciamento de CCAT2. As evidências acima indicam que o silenciamento do CCAT2 exerce um efeito anti-hipertrófico no CH, que depende da interrupção da sinalização Wnt/β-catenina.

O acúmulo de evidências provou que os LncRNAs exercem efeitos promotores ou inibitórios na progressão do HC através de uma diversidade de mecanismos. Por exemplo, Wen et al. sugeriram que o PEG10 foi regulado positivamente na HC patológica, e o PEG10 agravou a HC através do aumento da expressão de HOXA9.21 Zhou et al. descobriram que o UCA1 era altamente expresso nos cardiomiócitos hipertróficos construídos e nos modelos murinos da HC, e o UCA1 facilitou a progressão do HC aumentando a expressão de HOXA9 através da ligação competitiva com o miR-184.22 Em contrapartida, outros estudos indicaram os efeitos protetores de alguns LncRNAs no desenvolvimento da HC. Song et al. divulgaram que a expressão de ADAMTS9-AS1 foi reduzida em pacientes com cardiomiopatia hipertrófica obstrutiva e células de cardiomiócitos humanos tratados com isoproterenol, e a superexpressão de ADAMTS9-AS1 reprimiu a hipertrofia de cardiomiócitos regulando positivamente o KAT7 através da esponja miR-185-5p.23 Wang et al. relataram que tanto os modelos celulares quanto os animais de HC apresentaram expressão diminuída de H19, e a superexpressão de H19 prejudicou o desenvolvimento de HC através da modulação do eixo miR-145-3p/SMAD4.24 Anteriormente, o papel detalhado e o mecanismo molecular do LncRNA CCAT2 em doenças humanas, especialmente o câncer, foram elucidados. Por exemplo, a deficiência de CCAT2 restringe o crescimento celular e a metástase, mas induz a parada G0/G1 e a apoptose no câncer de mama através da inativação da via de sinalização TGF-β.25 CCAT2 atenua a radiossensibilidade e a apoptose de células cancerígenas do esôfago regulando negativamente o eixo miR-145/p70S6K1 e a via de sinalização p53.26 CCAT2 promove o crescimento e a metástase de células cancerígenas gástricas por meio da modulação do splicing alternativo do CD44 por meio da ligação ao ESRP1.27 No entanto, não foi explorado se o CCAT2 exerce efeitos regulatórios na HC. Aqui, descobrimos que o nível de LncRNA CCAT2 era consideravelmente maior em modelos de camundongos HC induzidos por TAC e células H9c2 tratadas com Ang II. Além disso, o silenciamento de CCAT2 aliviou substancialmente a HC em camundongos e células hipertróficas H9c2, o que foi validado pela inibição da expressão dos principais marcadores HC (β-MHC, ANP e BNP). Isto sugere o efeito potenciador do LncRNA CCAT2 na progressão da HC.

A via canônica de sinalização Wnt/β-catenina é bem conhecida por seu papel regulador no desenvolvimento embrionário, na homeostase de células-tronco e na regeneração de tecidos.28 Nos últimos anos, evidências acumuladas demonstraram que a ativação anormal desta via no coração está subjacente à fisiopatologia da hipertrofia miocárdica e da lesão miocárdica.29 Foi confirmado que a β-catenina participa do metabolismo dos cardiomiócitos, afetando assim a função e o desenvolvimento do coração.30 Estudos provaram que a superexpressão de β-catenina pode resultar em HC.31,32 A superexpressão de β-catenina em miócitos cardíacos aumenta o volume celular, induz a formação de actina, ativa marcadores de hipertrofia patológica e eleva os níveis de ANP e BNP.33 A HC pode ser melhorada por meio de knockdown ou inibição da β-catenina miocárdica.34 Zhao et al. relataram que múltiplos ligantes Wnt foram induzidos e a β-catenina foi ativada em ratos com infusão crônica de Ang II e cardiomiócitos primários de ratos, e o bloqueio da via Wnt / β-catenina pelo ICG-001 atenuou a HC e a fibrose miocárdica, bem como inibiu a expressão gênica do marcador hipertrófico.35 Portanto, a supressão da sinalização Wnt/β-catenina pode ser considerada um alvo terapêutico promissor para o HC. Recentemente, muitos estudos revelaram que o CCAT2 participa na mediação do desenvolvimento do câncer através da modulação da sinalização Wnt/βcatenina. Por exemplo, o knockdown de CCAT2 restringe o crescimento celular e a metástase e facilita a parada do ciclo celular e a apoptose no câncer de tireoide, atenuando a atividade da cascata Wnt/β-catenina.36 Os efeitos inibitórios sobre o crescimento celular do câncer de próstata, ciclo celular, transição epitelial-mesenquimal e metástase induzidos pelo silenciamento de CCAT2 foram antagonizados pelo tratamento com o ativador da via Wnt/β-catenina LiCl.37 A regulação negativa do CCAT2 impede comportamentos biológicos malignos das células do carcinoma espinocelular oral através da inativação da sinalização Wnt / β-catenina.38 Com base na literatura acima, especulamos que o CCAT2 também poderia mediar o desenvolvimento da HC modulando a sinalização Wnt/β-catenina. Aqui, observamos que a regulação positiva nos níveis de β-catenina ativa e genes-alvo GSK-3β fosforilados e Wnt c-Myc, ciclinaD1 e c-Jun induzidos por TAC em camundongos HC e por Ang II em cardiomiócitos hipertróficos foi anulada silenciando o CCAT2. É importante ressaltar que o tratamento com LiCl anulou a supressão do knockdown de CCAT2 na área de superfície celular e nos níveis de β-MHC, ANP e BNP em células H9c2 hipertróficas, sugerindo que o silenciamento de CCAT2 dificulta a progressão de HC ao inativar a sinalização Wnt / β-catenina.

Para ser honesto, existem algumas limitações em nosso estudo. Primeiro, ao medir o tamanho dos cardiomiócitos de camundongos, o coração deve estar em diástole, portanto a área dos cardiomiócitos que obtivemos pode ser menor que o tamanho real. Em segundo lugar, para elucidar ainda mais o papel do CCAT2 na patogênese da HC, são necessários diferentes silenciamentos condicionais específicos do tipo de célula de camundongos CCAT2 para investigações adicionais. Terceiro, a expressão de CCAT2 em tecidos de insuficiência cardíaca humana permanece incerta. Amostras de tecidos de pacientes com insuficiência cardíaca terminal devem ser coletadas e analisadas em estudos futuros. Finalmente, mais estudos são necessários para explorar o mecanismo subjacente detalhado através do qual o CCAT2 inativa a via de sinalização Wnt/β-catenina durante a HC.

Até o momento, este é o primeiro relatório a demonstrar que o silenciamento de CCAT2 tem um efeito inibitório na hipertrofia de cardiomiócitos induzida por Ang II in vitro e HC induzida por TAC in vivo, reprimindo a sinalização Wnt/β-catenina (Figura 6G). CCAT2 tem o potencial de fornecer um alvo para o desenvolvimento de terapêuticas clínicas mais eficazes para HC.

Células H9c2 estimuladas com Ang II foram transfectadas com shCCAT2 ou shNC. (A) Análise da expressão de CCAT2 em células H9c2 através de RT-qPCR. n = 3 repetições. (B-C) Avaliação do tamanho das células H9c2 por imunofluorescência de α-SMA. Barra de escala, 20 μm. n = 3 repetições. (D-G) Exame dos níveis de β-MHC, ANP e BNP em células H9c2 por western blotting e RT-qPCR. n= 3 repetições. Os dados são expressos como médias ± DP. ***P < 0,001 vs. Controle; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 vs. Ang II.

As células H9c2 foram pré-tratadas com LiCl antes da estimulação com Ang II e transfecção shCCAT2 ou shNC. (A-B) Determinação do tamanho da célula H9c2 por meio da coloração de imunofluorescência α-SMA. n = 3 repetições. Barra de escala, 20 μm. (C-F) Avaliação dos níveis de β-MHC, ANP e BNP em células H9c2 através de western blotting e RT-qPCR. n = 3 repetições.(G) Diagrama esquemático que ilustra o mecanismo molecular subjacente do LncRNA CCAT2 em HC. Os dados são expressos como médias ± DP.***p < 0,001 vs. Controle; #p < 0,05, ###p < 0,001 vs. Ang II; &&p < 0,01, &&&p < 0,001 vs. Ang II + shCCAT2.

 Referências 1. Facundo HDTF, Brainard RE, Caldas FRL, Lucas AMB. Mitochondria and Cardiac Hypertrophy. Adv Exp Med Biol. 2017;982:203-26. doi: 10.1007/978-3-319-55330-6_11. Facundo HDTF Brainard RE Caldas FRL Lucas AMB Mitochondria and Cardiac Hypertrophy Adv Exp Med Biol 2017 982 203 226 10.1007/978-3-319-55330-6_11 2. Oldfield CJ, Duhamel TA, Dhalla NS. Mechanisms for the Transition from Physiological to Pathological Cardiac Hypertrophy. Can J Physiol Pharmacol. 2020;98(2):74-84. doi: 10.1139/cjpp-2019-0566. Oldfield CJ Duhamel TA Dhalla NS Mechanisms for the Transition from Physiological to Pathological Cardiac Hypertrophy Can J Physiol Pharmacol 2020 98 2 74 84 10.1139/cjpp-2019-0566 3. Hou J, Kang YJ. Regression of Pathological Cardiac Hypertrophy: Signaling Pathways and Therapeutic Targets. Pharmacol Ther. 2012;135(3):337-54. doi: 10.1016/j.pharmthera.2012.06.006. Hou J Kang YJ Regression of Pathological Cardiac Hypertrophy: Signaling Pathways and Therapeutic Targets Pharmacol Ther 2012 135 3 337 354 10.1016/j.pharmthera.2012.06.006 4. Ho MY, Wang CY. Role of Irisin in Myocardial Infarction, Heart Failure, and Cardiac Hypertrophy. Cells. 2021;10(8):2103. doi: 10.3390/cells10082103. Ho MY Wang CY Role of Irisin in Myocardial Infarction, Heart Failure, and Cardiac Hypertrophy Cells 2021 10 8 2103 10.3390/cells10082103 5. Veselka J, Anavekar NS, Charron P. Hypertrophic Obstructive Cardiomyopathy. Lancet. 2017;389(10075):1253-67. doi: 10.1016/S0140-6736(16)31321-6. Veselka J Anavekar NS Charron P Hypertrophic Obstructive Cardiomyopathy Lancet 2017 389 10075 1253 1267 10.1016/S0140-6736(16)31321-6 6. Horiuchi M, Iwanami J, Mogi M. Regulation of Angiotensin II Receptors Beyond the Classical Pathway. Clin Sci. 2012;123(4):193-203. doi: 10.1042/CS20110677. Horiuchi M Iwanami J Mogi M Regulation of Angiotensin II Receptors Beyond the Classical Pathway Clin Sci 2012 123 4 193 203 10.1042/CS20110677 7. Miranda AS, Macedo DS, Rocha NP, Teixeira AL. Targeting the Renin-Angiotensin System (RAS) for Neuropsychiatric Disorders. Curr Neuropharmacol. 2024;22(1):107-22. doi: 10.2174/1570159X20666220927093815. Miranda AS Macedo DS Rocha NP Teixeira AL Targeting the Renin-Angiotensin System (RAS) for Neuropsychiatric Disorders Curr Neuropharmacol 2024 22 1 107 122 10.2174/1570159X20666220927093815 8. Silva SD Jr, Jara ZP, Peres R, Lima LS, Scavone C, Montezano AC, et al. Temporal Changes in Cardiac Oxidative Stress, Inflammation and Remodeling Induced by Exercise in Hypertension: Role for Local Angiotensin II Reduction. PLoS One. 2017;12(12):e0189535. doi: 10.1371/journal.pone.0189535. Silva SD Jr Jara ZP Peres R Lima LS Scavone C Montezano AC et al Temporal Changes in Cardiac Oxidative Stress, Inflammation and Remodeling Induced by Exercise in Hypertension: Role for Local Angiotensin II Reduction PLoS One 2017 12 12 e0189535 10.1371/journal.pone.0189535 9. Tanno T, Tomita H, Narita I, Kinjo T, Nishizaki K, Ichikawa H, et al. Olmesartan Inhibits Cardiac Hypertrophy in Mice Overexpressing Renin Independently of Blood Pressure: Its Beneficial Effects on ACE2/Ang(1-7)/Mas Axis and NADPH Oxidase Expression. J Cardiovasc Pharmacol. 2016;67(6):503-9. doi: 10.1097/FJC.0000000000000374. Tanno T Tomita H Narita I Kinjo T Nishizaki K Ichikawa H et al Olmesartan Inhibits Cardiac Hypertrophy in Mice Overexpressing Renin Independently of Blood Pressure: Its Beneficial Effects on ACE2/Ang(1-7)/Mas Axis and NADPH Oxidase Expression J Cardiovasc Pharmacol 2016 67 6 503 509 10.1097/FJC.0000000000000374 10. Samak M, Fatullayev J, Sabashnikov A, Zeriouh M, Schmack B, Farag M, et al. Cardiac Hypertrophy: An Introduction to Molecular and Cellular Basis. Med Sci Monit Basic Res. 2016;22:75-9. doi: 10.12659/MSMBR.900437. Samak M Fatullayev J Sabashnikov A Zeriouh M Schmack B Farag M et al Cardiac Hypertrophy: An Introduction to Molecular and Cellular Basis Med Sci Monit Basic Res 2016 22 75 79 10.12659/MSMBR.900437 11. Li Y, Liang Y, Zhu Y, Zhang Y, Bei Y. Noncoding RNAs in Cardiac Hypertrophy. J Cardiovasc Transl Res. 2018;11(6):439-49. doi: 10.1007/s12265-018-9797-x. Li Y Liang Y Zhu Y Zhang Y Bei Y Noncoding RNAs in Cardiac Hypertrophy J Cardiovasc Transl Res 2018 11 6 439 449 10.1007/s12265-018-9797-x 12. Chen L, Zhu QH, Kaufmann K. Long Non-coding RNAs in Plants: Emerging Modulators of Gene Activity in Development and Stress Responses. Planta. 2020;252(5):92. doi: 10.1007/s00425-020-03480-5. Chen L Zhu QH Kaufmann K Long Non-coding RNAs in Plants: Emerging Modulators of Gene Activity in Development and Stress Responses Planta 2020 252 5 92 10.1007/s00425-020-03480-5 13. Beermann J, Piccoli MT, Viereck J, Thum T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 2016;96(4):1297-325. doi: 10.1152/physrev.00041.2015. Beermann J Piccoli MT Viereck J Thum T Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches Physiol Rev 2016 96 4 1297 1325 10.1152/physrev.00041.2015 14. Cheng Z, Liu L, Li Q. lncRNA ZEB2-AS1 Stimulates Cardiac Hypertrophy by Downregulating PTEN. Exp Ther Med. 2020;20(5):92. doi: 10.3892/etm.2020.9220. Cheng Z Liu L Li Q lncRNA ZEB2-AS1 Stimulates Cardiac Hypertrophy by Downregulating PTEN Exp Ther Med 2020 20 5 92 10.3892/etm.2020.9220 15. Zhu C, Wang M, Yu X, Shui X, Tang L, Chen Z, et al. lncRNA NBR2 Attenuates Angiotensin II-induced Myocardial Hypertrophy Through Repressing ER Stress Via Activating LKB1/AMPK/Sirt1 Pathway. Bioengineered. 2022;13(5):13667-79. doi: 10.1080/21655979.2022.2062527. Zhu C Wang M Yu X Shui X Tang L Chen Z et al lncRNA NBR2 Attenuates Angiotensin II-induced Myocardial Hypertrophy Through Repressing ER Stress Via Activating LKB1/AMPK/Sirt1 Pathway Bioengineered 2022 13 5 13667 13679 10.1080/21655979.2022.2062527 16. Zhu XH, Yuan YX, Rao SL, Wang P. LncRNA MIAT Enhances Cardiac Hypertrophy Partly Through Sponging miR-150. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2016;20(17):3653-60. Zhu XH Yuan YX Rao SL Wang P LncRNA MIAT Enhances Cardiac Hypertrophy Partly Through Sponging miR-150 Eur Rev Med Pharmacol Sci 2016 20 17 3653 3660 17. Ling H, Spizzo R, Atlasi Y, Nicoloso M, Shimizu M, Redis RS, et al. CCAT2, a Novel Noncoding RNA Mapping to 8q24, Underlies Metastatic Progression and Chromosomal Instability in Colon Cancer. Genome Res. 2013;23(9):1446-61. doi: 10.1101/gr.152942.112. Ling H Spizzo R Atlasi Y Nicoloso M Shimizu M Redis RS et al CCAT2, a Novel Noncoding RNA Mapping to 8q24, Underlies Metastatic Progression and Chromosomal Instability in Colon Cancer Genome Res 2013 23 9 1446 1461 10.1101/gr.152942.112 18. Xin Y, Li Z, Zheng H, Chan MTV, Wu WKK. CCAT2: A novel Oncogenic Long Non-coding RNA in Human Cancers. Cell Prolif. 2017;50(3):e12342. doi: 10.1111/cpr.12342. Xin Y Li Z Zheng H Chan MTV Wu WKK CCAT2: A novel Oncogenic Long Non-coding RNA in Human Cancers Cell Prolif 2017 50 3 e12342 10.1111/cpr.12342 19. Deng H, Ma LL, Kong FJ, Qiao Z. Distinct Phenotypes Induced by Different Degrees of Transverse Aortic Constriction in C57BL/6N Mice. Front Cardiovasc Med. 2021;8:641272. doi: 10.3389/fcvm.2021.641272. Deng H Ma LL Kong FJ Qiao Z Distinct Phenotypes Induced by Different Degrees of Transverse Aortic Constriction in C57BL/6N Mice Front Cardiovasc Med 2021 8 641272 10.3389/fcvm.2021.641272 20. Zhang Q, Wang F, Wang F, Wu N. Long Noncoding RNA MAGI1-IT1 Regulates Cardiac Hypertrophy by Modulating miR-302e/DKK1/Wnt/beta-catenin Signaling Pathway. J Cell Physiol. 2020;235(1):245-53. doi: 10.1002/jcp.28964. Zhang Q Wang F Wang F Wu N Long Noncoding RNA MAGI1-IT1 Regulates Cardiac Hypertrophy by Modulating miR-302e/DKK1/Wnt/beta-catenin Signaling Pathway J Cell Physiol 2020 235 1 245 253 10.1002/jcp.28964 21. Wen ZQ, Li SH, Shui X, Tang LL, Zheng JR, Chen L. LncRNA PEG10 Aggravates Cardiac Hypertrophy Through Regulating HOXA9. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2019;23(3):281-6. doi: 10.26355/eurrev_201908_18658. Wen ZQ Li SH Shui X Tang LL Zheng JR Chen L LncRNA PEG10 Aggravates Cardiac Hypertrophy Through Regulating HOXA9 Eur Rev Med Pharmacol Sci 2019 23 3 281 286 10.26355/eurrev_201908_18658 22. Zhou G, Li C, Feng J, Zhang J, Fang Y. lncRNA UCA1 is a Novel Regulator in Cardiomyocyte Hypertrophy Through Targeting the miR-184/HOXA9 Axis. Cardiorenal Med. 2018;8(2):130-9. doi: 10.1159/000487204. Zhou G Li C Feng J Zhang J Fang Y lncRNA UCA1 is a Novel Regulator in Cardiomyocyte Hypertrophy Through Targeting the miR-184/HOXA9 Axis Cardiorenal Med 2018 8 2 130 139 10.1159/000487204 23. Song B, Li W, Xu X, Dang H, Dong R. The lncRNA ADAMTS9-AS1/miR-185-5p/KAT7 ceRNA Network Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy in Hypertrophic Obstructive Cardiomyopathy. Biomed Res. 2023;44(3):105-15. doi: 10.2220/biomedres.44.105. Song B Li W Xu X Dang H Dong R The lncRNA ADAMTS9-AS1/miR-185-5p/KAT7 ceRNA Network Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy in Hypertrophic Obstructive Cardiomyopathy Biomed Res 2023 44 3 105 115 10.2220/biomedres.44.105 24. Wang H, Lian X, Gao W, Gu J, Shi H, Ma Y, et al. Long Noncoding RNA H19 Suppresses Cardiac Hypertrophy Through the MicroRNA-145-3p/SMAD4 Axis. Bioengineered. 2022;13(2):3826-39. doi: 10.1080/21655979.2021.2017564. Wang H Lian X Gao W Gu J Shi H Ma Y et al Long Noncoding RNA H19 Suppresses Cardiac Hypertrophy Through the MicroRNA-145-3p/SMAD4 Axis Bioengineered 2022 13 2 3826 3839 10.1080/21655979.2021.2017564 25. Wu ZJ, Li Y, Wu YZ, Wang Y, Nian WQ, Wang LL, et al. Long Non-coding RNA CCAT2 Promotes the Breast Cancer Growth and Metastasis by Regulating TGF-ß Signaling Pathway. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017;21(4):706-14. Wu ZJ Li Y Wu YZ Wang Y Nian WQ Wang LL et al Long Non-coding RNA CCAT2 Promotes the Breast Cancer Growth and Metastasis by Regulating TGF-ß Signaling Pathway Eur Rev Med Pharmacol Sci 2017 21 4 706 714 26. Wang M, Wang L, He X, Zhang J, Zhu Z, Zhang M, et al. lncRNA CCAT2 Promotes Radiotherapy Resistance for Human Esophageal Carcinoma Cells Via the miR-145/p70S6K1 and p53 Pathway. Int J Oncol. 2020;56(1):327-36. doi: 10.3892/ijo.2019.4929. Wang M Wang L He X Zhang J Zhu Z Zhang M et al lncRNA CCAT2 Promotes Radiotherapy Resistance for Human Esophageal Carcinoma Cells Via the miR-145/p70S6K1 and p53 Pathway Int J Oncol 2020 56 1 327 336 10.3892/ijo.2019.4929 27. Deng H, Gao J, Cao B, Qiu Z, Li T, Zhao R, et al. LncRNA CCAT2 Promotes Malignant Progression of Metastatic Gastric Cancer Through Regulating CD44 Alternative Splicing. Cell Oncol. 2023;46(6):1675-90. doi: 10.1007/s13402-023-00835-4. Deng H Gao J Cao B Qiu Z Li T Zhao R et al LncRNA CCAT2 Promotes Malignant Progression of Metastatic Gastric Cancer Through Regulating CD44 Alternative Splicing Cell Oncol 2023 46 6 1675 1690 10.1007/s13402-023-00835-4 28. Majidinia M, Aghazadeh J, Jahanban-Esfahlani R, Yousefi B. The Roles of Wnt/ß-Catenin Pathway in Tissue Development and Regenerative Medicine. J Cell Physiol. 2018;233(8):5598-612. doi: 10.1002/jcp.26265. Majidinia M Aghazadeh J Jahanban-Esfahlani R Yousefi B The Roles of Wnt/ß-Catenin Pathway in Tissue Development and Regenerative Medicine J Cell Physiol 2018 233 8 5598 5612 10.1002/jcp.26265 29. Ni B, Sun M, Zhao J, Wang J, Cao Z. The Role of ß-catenin in Cardiac Diseases. Front Pharmacol. 2023;14:1157043. doi: 10.3389/fphar.2023.1157043. Ni B Sun M Zhao J Wang J Cao Z The Role of ß-catenin in Cardiac Diseases Front Pharmacol 2023 14 1157043 10.3389/fphar.2023.1157043 30. Balatskyi VV, Vaskivskyi VO, Myronova A, Avramets D, Nahia KA, Macewicz LL, et al. Cardiac-specific ß-catenin Deletion Dysregulates Energetic Metabolism and Mitochondrial Function in Perinatal Cardiomyocytes. Mitochondrion. 2021;60:59-69. doi: 10.1016/j.mito.2021.07.005. Balatskyi VV Vaskivskyi VO Myronova A Avramets D Nahia KA Macewicz LL et al Cardiac-specific ß-catenin Deletion Dysregulates Energetic Metabolism and Mitochondrial Function in Perinatal Cardiomyocytes Mitochondrion 2021 60 59 69 10.1016/j.mito.2021.07.005 31. Li L, Fang C, Xu D, Xu Y, Fu H, Li J. Cardiomyocyte Specific Deletion of PP2A Causes Cardiac Hypertrophy. Am J Transl Res. 2016;8(4):1769-79. Li L Fang C Xu D Xu Y Fu H Li J Cardiomyocyte Specific Deletion of PP2A Causes Cardiac Hypertrophy Am J Transl Res 2016 8 4 1769 1779 32. Lin L, Xu W, Li Y, Zhu P, Yuan W, Liu M, et al. Pygo1 Regulates Pathological Cardiac Hypertrophy Via a ß-catenin-dependent Mechanism. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2021;320(4):1634-45. doi: 10.1152/ajpheart.00538.2020. Lin L Xu W Li Y Zhu P Yuan W Liu M et al Pygo1 Regulates Pathological Cardiac Hypertrophy Via a ß-catenin-dependent Mechanism Am J Physiol Heart Circ Physiol 2021 320 4 1634 1645 10.1152/ajpheart.00538.2020 33. Lee CY, Kuo WW, Baskaran R, Day CH, Pai PY, Lai CH, et al. Increased ß-catenin Accumulation and Nuclear Translocation are Associated with Concentric Hypertrophy in Cardiomyocytes. Cardiovasc Pathol. 2017;31:9-16. doi: 10.1016/j.carpath.2017.07.003. Lee CY Kuo WW Baskaran R Day CH Pai PY Lai CH et al Increased ß-catenin Accumulation and Nuclear Translocation are Associated with Concentric Hypertrophy in Cardiomyocytes Cardiovasc Pathol 2017 31 9 16 10.1016/j.carpath.2017.07.003 34. Srivastava S, Yadav S, Singh G, Bajwa SS. Wnt/ß-catenin Antagonist Pyrvinium Rescues High Dose Isoproterenol Induced Cardiotoxicity in Rats: Biochemical and Immunohistological Evidences. Chem Biol Interact. 2022;358:109902. doi: 10.1016/j.cbi.2022.109902. Srivastava S Yadav S Singh G Bajwa SS Wnt/ß-catenin Antagonist Pyrvinium Rescues High Dose Isoproterenol Induced Cardiotoxicity in Rats: Biochemical and Immunohistological Evidences Chem Biol Interact 2022 358 109902 10.1016/j.cbi.2022.109902 35. Zhao Y, Wang C, Wang C, Hong X, Miao J, Liao Y, et al. An Essential Role for Wnt/ß-catenin Signaling in Mediating Hypertensive Heart Disease. Sci Rep. 2018;8(1):8996. doi: 10.1038/s41598-018-27064-2. Zhao Y Wang C Wang C Hong X Miao J Liao Y et al An Essential Role for Wnt/ß-catenin Signaling in Mediating Hypertensive Heart Disease Sci Rep 2018 8 1 8996 10.1038/s41598-018-27064-2 36. Xin S, Ye X. Knockdown of Long Non-coding RNA CCAT2 Suppresses the Progression of Thyroid Cancer by Inhibiting the Wnt/ß-catenin Pathway. Int J Mol Med. 2020;46(6):2047-56. doi: 10.3892/ijmm.2020.4761. Xin S Ye X Knockdown of Long Non-coding RNA CCAT2 Suppresses the Progression of Thyroid Cancer by Inhibiting the Wnt/ß-catenin Pathway Int J Mol Med 2020 46 6 2047 2056 10.3892/ijmm.2020.4761 37. He P, Xiong G, Guo W, Jiang G, Li Y, Li H. Long Non-coding RNA CCAT2 Promotes Prostate Cancer Cell Proliferation and Invasion by Regulating the Wnt/ß-Catenin Signaling Pathway. Oncol Lett. 2020;20(4):97. doi: 10.3892/ol.2020.11958. He P Xiong G Guo W Jiang G Li Y Li H Long Non-coding RNA CCAT2 Promotes Prostate Cancer Cell Proliferation and Invasion by Regulating the Wnt/ß-Catenin Signaling Pathway Oncol Lett 2020 20 4 97 10.3892/ol.2020.11958 38. Ma Y, Hu X, Shang C, Zhong M, Guo Y. Silencing of Long Non-coding RNA CCAT2 Depressed Malignancy of Oral Squamous Cell Carcinoma Via Wnt/ß-Catenin Pathway. Tumour Biol. 2017;39(7):1010428317717670. doi: 10.1177/1010428317717670. Ma Y Hu X Shang C Zhong M Guo Y Silencing of Long Non-coding RNA CCAT2 Depressed Malignancy of Oral Squamous Cell Carcinoma Via Wnt/ß-Catenin Pathway Tumour Biol 2017 39 7 1010428317717670 10.1177/1010428317717670

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Wuhan Myhalic Biotechnology Co., Ltd sob o número de protocolo HLK-202303112. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.

O presente estudo foi financiado por Natural Science Foundation of Hubei Science and Technology Department, General Project (2022CFC002).

 10.36660/abc.20240181i Original Article LncRNA CCAT2 Knockdown Alleviates Pressure Overload or Ang II-Induced Cardiac Hypertrophy Via Disruption of the Wnt/β-Catenin Signaling Zhang Xiaojun Conception and design of the research Obtaining financing Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 Chen Zhen Conception and design of the research Obtaining financing Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 2 Zhang Ning Conception and design of the research Obtaining financing Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 Yu Bo Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 2 Li Wei Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 2 Zhang Mengli Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 2 Wu Xian Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 2 Liu Ganzhe Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 2 0009-0007-0938-9584 Dong Meizhen Obtaining financing Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 China Department of Emergency, Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shangdong University, Qingdao, Shangdong – China China The Central Hospital of Wuhan, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Hubei – China Meizhen Dong • Department of emergency, Qilu Hospital(Qingdao), Cheeloo College of Medicine, shandong University, 758 Hefei Road, Qingdao, Shandong, 266035 - China; E-mail: dongmeizhendr@hotmail.com

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Marina Okoshi

: LncRNA CCAT2 Knockdown Alleviates Pressure Overload or Ang II-Induced Cardiac Hypertrophy Via Disruption of the Wnt/β-Catenin Signaling

Abstract Background

Sustained pathological cardiac hypertrophy (CH) is an independent risk factor for increased incidence and mortality of cardiovascular events.

 Objectives

This research was designed to unravel the role of long non-coding RNA (LncRNA) CCAT2 in CH progression.

 Methods

Transverse aortic constriction (TAC) procedures were conducted to construct a pressure overload-induced in vivo CH model. Angiotensin II (Ang II) treatment was utilized to induce hypertrophic rat cardiomyocyte H9c2 cells.

 Results

In vivo results showed that silencing of CCAT2 reduced cardiomyocyte surface area, alleviated cardiac fibrosis, and decreased β-MHC, ANP, and BNP levels in CH mouse models. In vitro results revealed that CCAT2 knockdown reduced cell surface area and attenuated β-MHC, ANP, and BNP levels in hypertrophic H9c2 cells. Besides, CCAT2 silencing decreased the levels of active β-catenin, phosphorylated-GSK-3β, and Wnt target genes (c-Myc, cyclinD1, and c-Jun) in CH mice and hypertrophic H9c2 cells. Importantly, treatment with the Wnt/β-catenin pathway activator LiCl reversed the suppression of CCAT2 knockdown on H9c2 cell surface area and MHC, ANP, and BNP levels.

 Conclusions

Collectively, CCAT2 silencing plays a protective role against CH through inactivating the Wnt/β-catenin signaling, which suggests that CCAT2 might become a promising therapeutic target for CH.

 Cardiomegaly Catenins Angiotensin II Introduction

Cardiac hypertrophy (CH), as an adaptive reaction to hemodynamic stress, is responsible for maintaining normal cardiac systolic function at the early stage of stress stimuli.1 Physiological factors such as exercise and pregnancy may increase the myocardial load and cause CH, which is considered a normal phenomenon, being mild and reversible.2 However, under the influence of pathological factors such as hypertension and aortic stenosis, pathological CH will develop, which is characterized by cardiac muscle overgrowth, an increase in cardiomyocyte cell size and surface area, cardiomyocyte disorganization, and myocardial interstitial fibrosis.3 Continuous CH leads to an increase in myocardial oxygen consumption, which causes myocardial supply-demand mismatch and further triggers multiple cardiovascular disorders, including arrhythmias, heart failure, myocardial infarction, and sudden cardiac death.4 Common symptoms of CH include exertional dyspnea, shortness of breath, fatigue, chest tightness, chest pain, palpitations, and syncope.5 The renin-angiotensin system, which is responsible for the maintenance of blood pressure, water and electrolyte balance, and cardiovascular homeostasis, consists of two major axes: the “classical” axis comprising angiotensin-converting enzyme, angiotensin II, and angiotensin type 1 receptor (ACE/AngII/AT1) and the “counter-regulatory” axis comprising angiotensin-converting enzyme 2, angiotensin (1-7), and Mas receptor (ACE2/Ang- (1-7)/Mas).6 The classical axis exerts pro-vasoconstrictive, pro-inflammatory, pro-thrombotic, and pro-fibrotic effects, while the counter-regulatory axis plays the opposite role.6,7 Therapies aimed at inhibiting the activation of the ACE/AngII/AT1 axis and/or promoting the function of the ACE2/Ang-(1-7)/Mas axis have been developed for the treatment of cardiovascular diseases, including CH and heart failure.8,9 The pathophysiology of CH involves multiple cellular and molecular systems, being complex and multifactorial.10 Non-coding RNAs (ncRNAs) have attracted considerable attention in recent decades, with increasing evidence linking them to the pathogenesis of CH and cardiovascular disease.11 Therefore, it is under great urgency to explore the specific molecular etiology of CH to find more effective targets for its treatment and improve diagnostic and therapeutic efficacies.

Long non-coding RNAs (LncRNAs) are transcripts with a sequence length of more than 200 nucleotides without protein-coding potential.12 A large body of studies have elucidated that LncRNAs are inextricably linked to human disease development through gene expression regulation at transcriptional and post-transcriptional levels.13 Till now, multiple LncRNAs have been confirmed to play a pivotal role in CH development and the underlying regulatory mechanisms have been clarified. For example, LncRNA ZEB2-AS1 is upregulated in both transverse aortic constriction (TAC)-induced murine models of CH and phenylephrine-stimulated primary mouse cardiomyocytes, and silencing of ZEB2-AS1 plays a protective role against CH through downregulating PTEN.14 Downregulated LncRNA NBR2 in patients with CH is negatively correlated with cardiac function and disease degree, and overexpressing NBR2 activates the LKB1/AMPK/Sirt1 pathway and weakens endoplasmic reticulum stress, thereby alleviating angiotensin II (Ang II)-induced hypertrophy of human myocardial cells.15 LncRNA MIAT expression is elevated in rat heart-derived H9c2 cells and mice subjected to induction of CH by Ang II treatment, and MIAT knockdown mitigates CH through increasing miR-150 level.16 LncRNA CCAT2, which is located on chromosome 8q24.21, was originally identified as an oncogene in colorectal cancer.17 The CCAT2 genomic locus harbors the SNP rs6983267, which is closely related to increased risks for various malignancies. The oncogenic role of CCAT2 has been well-documented in various human cancers, including lung, breast, gastric, cervical, and prostate cancers.18 Nevertheless, there lack of research on the role of CCAT2 in CH.

In the present study, in vitro and in vivo models of CH were constructed by performing Ang II treatment in rat cardiomyocyte H9c2 cells and TAC in mice, respectively. The purpose of our research is to scrutinize the function of LncRNA CCAT2 in CH progression and the underlying mechanism.

 Methods Animals

Seventy male C57BL/6 J mice (8–10 weeks old, 22–24 g) were purchased from the Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA). All mice were housed under specific pathogen-free conditions at a standard temperature of 23°C and 55–60% humidity on a 12-h light/dark cycle with food and water freely available. The animal care and experimental procedures were permitted by the Institutional Animal Care and Use Committee of the Wuhan Myhalic Biotechnology Co., Ltd under the protocol number HLK-202303112..

 Animal experiments

The pressure overload-induced CH was constructed by TAC surgery as described previously.19 In short, mice were anesthetized with 0.3% pentobarbital sodium (40 mg/kg; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) via intraperitoneal injection after one-week adaptation. Then, mice received thoracotomy, followed by aortic dissection and transverse aorta constriction using a 26-gauge needle and a 7-0 silk thread suture. Mice in the Sham group received the same operation without transverse aortic ligation. After 24 h of TAC operation, adeno-associated virus-9 (AAV9) vectors carrying a CCAT2-specific shRNA (AAV9-shCCAT2) were injected into TAC-induced CH model mice through the tail vein to knockdown CCAT2, with AAV9-shNC as the negative control (Figure 2A). Mice were randomly allocated into 4 groups: the Sham group (n=10), the TAC group (n=20), the TAC + AAV9-shCCAT2 group (n=20), and the TAC + AAV9-shNC group (n=20). Mice in the TAC + AAV9-shCCAT2 and the TAC + AAV9-shNC groups were daily injected with 100 μL (1.2×1012 vg/mL) AAV9-shCCAT2 or AAV9-shNC for 3 weeks, while mice in the Sham and TAC groups were daily injected with 100 μL saline for 3 weeks. Afterward, mice were sacrificed by cervical dislocation, and their hearts were harvested for further analysis. The experimental design for the in vivo assays is presented in Figure 1.

– CCAT2 is upregulated in the cardiac tissues of CH mouse models and Ang II-treated hypertrophic H9c2 cells. (A) Representative H&E staining images of heart sections and quantification of cardiomyocyte cross-sectional area in sham and TAC-induced CH mice. Scale bar, 20 μm. n=6 mice per group. (B-E) Examination of echocardiographic parameters including left ventricle end-diastolic diameter (LVEDd), left ventricle end-systolic diameter (LVESd), left ventricular ejection fraction (LVEF), and left ventricle fractional shortening (LVFS) of sham and TAC-induced CH mice with an ultrasound system. n=6 mice per group. (F-H) The heart weight (HW) to body weight (BW) ratio, left ventricle weight (LVW) to BW ratio, and LVW to tibial length (TL) ratio of sham and TAC-induced CH mice. n=6 mice per group. (I-K) Measurement of β-MHC, ANP, and BNP protein levels in mouse cardiac tissues by western blotting. n=6 mice per group. (L) Detection of CCAT2 mRNA expression in mouse cardiac tissues by RT-qPCR. n=6 mice per group. (M) Observation of the size of rat myocardial cells H9c2 after Ang II treatment through α-SMA immunofluorescence staining. Scale bar, 20 μm. n = 3 repetitions. (N) Analysis of β-MHC, ANP, and BNP mRNA levels in control and Ang II-stimulated H9c2 cells through RT-qPCR. n=3 repetitions. (O) Assessment of LncRNA CCAT2 mRNA expression in H9c2 cells upon Ang II stimulation. n=3 repetitions. Data are expressed as the means ± SD. *P < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

– The experimental design.

Echocardiographic analysis

The Vevo 2100 Imaging System (Visual Sonics, Toronto, ON, Canada) was used to perform echocardiography of the left ventricle in mice 3 weeks after TAC induction. Briefly, mice were anesthetized by inhalation of 1.5% isoflurane (Sigma-Aldrich), placed chest up on an examination board, and wiped clean to remove all the chest hair. The M-mode measurements of left ventricular (LV) dimensions including LV end-systolic diameter (LVESd) and LV end-diastolic diameter (LVEDd) were conducted using the scan head and averaged from ten consecutive cardiac cycles. The LV ejection fraction (EF) and fractional shortening (FS) were calculated based on LVESd and LVEDd data.

 Histological assessment

The heart tissues of mice were fixed in 10% formalin for 24 h, dehydrated in ethanol and xylene series, embedded into paraffin blocks, and sliced into 5-μm-thick cross-sectional sections. The sections were then stained with hematoxylin and eosin (H&E; LMAI Bio, Shanghai, China) and Masson’s trichrome (Solarbio, Beijing, China) to evaluate the cross-sectional sizes of cardiomyocytes and the cardiac collagen deposition, respectively. The slides were examined microscopically, followed by the calculation of the cross-sectional area and the fibrotic area of cardiomyocytes using Image-Pro Plus 6.0 software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA).

 Cell treatment and transfection

Rat cardiomyocyte H9c2 cells acquired from American Type Culture Collection (Manassas VA, USA) were cultivated in DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) containing 10% fetal bovine serum (HyClone, South Logan, UT, USA) and 1% penicillin-streptomycin solutions (HyClone) and were maintained at 37°C in a humidified 5% CO2 incubator. To establish the in vitro model of CH, H9c2 cells were treated with Ang II (150 nM; Sigma-Aldrich) for 24 h.20 Ang II-treated H9c2 cells were then transfected with shCCAT2 or shNC (RibiBio, Guangzhou, China) using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) to assess the influence of CCAT2 silencing on Ang II-induced cardiomyocyte hypertrophy. Besides, to confirm the role of the Wnt/β-catenin pathway in CCAT2-mediated cardiomyocyte hypertrophy, H9c2 cells were pretreated with lithium chloride (LiCl; 2.5 mM; Sigma-Aldrich) for 12 h before Ang II treatment and shCCAT2 or shNC transfection. The experimental design for the in vitro assays is presented in Figure 1.

 RT-qPCR

The RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) was used for total RNA extraction from H9c2 cells and mouse heart tissues. Subsequently, 1 µg RNA was purified using DNase I (Medchem Express, Monmouth Junction, USA) and reverse transcribed to complementary DNA (cDNA) utilizing Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen). PCR Amplification and detection were conducted with the GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) on the ABI7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Primer sequences are listed in Table 1. The relative expression levels were calculated with the 2CT method after normalization to GAPDH mRNA.

– Primer sequences used in RT-qPCR
Gene Species Primer sequences
β-MHC Mouse Forward: 5’-AACCTGTCCAAGTTCCGCAAGGTG-3’
Reverse: 5’-GAGCTGGGTAGCACAAGAGCTACT-3’
β-MHC Rat Forward: 5’-AAGTGAAGAGCCTCCAGAGTTT-3’
Reverse: 5’-TGATGAGGCTGGTGTTCTGGG-3’
ANP Mouse Forward: 5’-CTCCGATAGATCTGCCCTCTTGAA-3’
Reverse: 5’-GGTACCGGAAGCTGTTGCAGCCTA-3’
ANP Rat Forward: 5’-CCTGGACTGGGGAAGTCAAC-3’
Reverse: 5’-ATCTATCGGAGGGGTCCCAG-3’
BNP Mouse Forward: 5’-GCTCTTGAAGGACCAAGGCCTCAC-3’
Reverse: 5’-GATCCGATCCGGTCTATCTTGTGC-3’
BNP Rat Forward: 5’-TGACGGGCTGAGGTTGTTTT-3’
Reverse: 5’-ACACTGTGGCAAGTTTGTGC-3’
c-Myc Mouse Forward: 5’-TCCATCCTATGTTGCGGTCG-3’
Reverse: 5’-AACCGCTCCACATACAGTCC-3’
c-Myc Rat Forward: 5’-AGCGACACAAGAAGCTTCTG-3’
Reverse: 5’-CTGAAGCAGCTCCGCCAAAC-3’
cyclinD1 Mouse Forward: 5’-TCAAGTGTGACCCGGACTG-3’
Reverse: 5’-ATGTCCACATCTCGCACGTC-3’
cyclinD1 Rat Forward: 5’-TCAAGTGTGACCCGGACTG -3’
Reverse: 5’-CACTACTTGGTGACTCCCGC-3’
c-Jun Mouse Forward: 5’-GCACATCACCACTACACCGA-3’
Reverse: 5’-GGGAAGCGTGTTCTGGCTAT-3’
c-Jun Rat Forward: 5’-GCCACCGAGACCGTAAAGAA-3’
Reverse: 5’-TAGCACTCGCCCAACTTCAG-3’
GAPDH Mouse Forward: 5’-TTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3’
Reverse: 5’-GCCATGTAGGCCATGAGGTC-3’
GAPDH Rat Forward: 5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’
Reverse: 5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’

Western blotting

H9c2 cells and mouse heart tissues were lysed using RIPA buffer containing proteinase cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Then, equal proteins were loaded onto 10% SDS-PAGE gels for electrophoresis, followed by transferring them to PVDF membranes (Millipore, Billerica, MA, USA). The membranes were incubated with the primary antibodies against β-MHC (SAB2106550, 1/2000, Sigma-Aldrich), ANP (sc-515701, 1/1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), BNP (sc-271185, 1/1000, Santa Cruz Biotechnology), active β-catenin (ab246504, 1/1000, Abcam, Cambridge, UK), β-catenin (ab68183, 1/1000, Abcam), phosphorylated-GSK-3β (ab131097, 1/1000, Abcam), GSK-3β (ab227208, 1/1000, Abcam), and β-actin (ab8227, 1/1000, Abcam) at 4°C overnight following being blocked for 1 h with 5% non-fat milk. On the second day, the membranes were incubated with the HRP-conjugated secondary antibody (ab205718, 1/2000, Abcam) for 1 h at room temperature (RT) after being washed with TBST solution (Beyotime, Shanghai, China). The immune complexes were visualized by using the enhanced chemiluminescence method (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Image J software (NIH, Bethesda, MD, USA) was employed to determine the optical density of each protein. β-actin was used as the loading control.

 Immunofluorescent staining

H9c2 cells were washed twice with phosphate-buffered saline (Zeye, Shanghai, China), fixed with 4% paraformaldehyde (Zeye) for 15 min, and permeabilized with 0.2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) for 15 min. Then, 5% bovine serum album (Sigma-Aldrich) was used to block cells for 30 min at RT, after which α-SMA antibody (14395-1-AP, 1/1000, Proteintech, Rosemont, IL, USA) was added, followed by overnight incubation in the dark at 4°C. The next day, cells underwent another 1 h incubation at 37°C with the FITC-conjugated secondary antibody (SA00003-8, 1/100, Proteintech). Nuclear staining was achieved with DAPI (Sigma-Aldrich). The slides were observed under an inverted axiovert 200 fluorescence microscope (Carl Zeiss, Gottingen, Germany), and cell surface area was calculated using Image-Pro Plus 6.0 software.

 TOP/FOP flash assay

Topflash or FOPflash luciferase reporters (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) were used to detect the activity of the Wnt signaling pathway. In brief, after indicated treatment or transfection, H9c2 cells were plated (5000 cells/well) into 24-well plates and serum-starved overnight. Thereafter, cells were transfected with 0.2 µg TOPflash or FOPflash expression plasmids using Lipofectamine 2000. TOP/FOP luciferase activities were measured using the Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA) 48 h after transfection.

 Statistical analysis

All data from at least three repeated individual experiments were analyzed using GraphPad Prism version 5.0 software (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) and are presented as the mean ± standard deviation (SD). Two and multiple comparisons were performed with unpaired Student’s t-test and one-way ANOVA followed by the post hoc Tukey test. A value of p<0.05 was considered statistically significant.

 Results The mortality rate of mice

All animals tolerated the surgery, and no mice died during the operation. After three weeks of the TAC surgery and AAV injection, 1 mouse, 12 mice, 11 mice, and 6 mice died in the Sham group, the TAC group, the TAC + AAV9-shCCAT2 group, and the TAC + AAV9-shNC group, with the survival rate being 90%, 40%, 45%, and 70% respectively.

 CCAT2 is upregulated in the cardiac tissues of CH mouse models and Ang II-induced hypertrophic H9c2 cells

The hearts of mice were harvested for histological examination at 4 weeks post-TAC operation. As shown by the images of H&E staining, TAC surgery markedly enlarged the cross-sectional area of cardiomyocytes in mice (Figure 2A). The echocardiographic measurement reflected that LVEDd and LVESd of post-TAC hearts at 3 weeks were significantly higher while LVEF and LVFS were lower than those of sham hearts (Figure 2B-E), indicating the impaired cardiac function of TAC-operated mice. TAC triggered an obvious increase in heart weight (HW) to body weight (BW) ratio, left ventricle weight (LVW) to BW ratio, and LVW to tibial length (TL) ratio, showing a notably larger proportion of cardiac tissue in CH mice (Figure 2F-H). Besides, considerably upregulated expression of CH markers (β-MHC, ANP, and BNP) was observed in the cardiac tissues of mice after TAC induction (Figure 2I-K). Afterwards, the expression of LncRNA CCAT2 in mouse cardiac tissues after TAC operation was detected by RT-qPCR, which revealed that CCAT2 was overexpressed in hypertrophic heart tissues versus normal heart tissues (Figure 2L), implying that LncRNA CCAT2 might participate in CH development. To further confirm the function of CCAT2 in CH, a cellular model was constructed by treating rat myocardial cells H9c2 with Ang II. The size of H9c2 cells was evaluated through α-SMA immunofluorescence staining, which manifested that Ang II treatment demonstrably cell area of rat cardiomyocytes (Figure 2M). Meanwhile, Ang II-induced hypertrophic cardiomyocytes exhibited significantly higher ANP, BNP, and β-MHC mRNA expression than control cardiomyocytes (Figure 2N). Importantly, LncRNA CCAT2 expression in H9c2 cells was discovered to be remarkably increased upon Ang II treatment (Figure 2O), which further implies the potential role of CCAT2 in CH development.

 Silencing of CCAT2 alleviates CH and cardiac fibrosis in vivo

Next, to determine the detailed role of CCAT2 in regulating CH in vivo, AAV9-shCCAT2 was injected into TAC-induced CH model mice through the tail vein to knock down CCAT2 (Figure 3A). After three weeks, we detected and found that the TAC-induced increase in CCAT2 expression in mouse heart tissues was reversed after CCAT2 depletion (Figure 3B). H&E staining illustrated that injection with AAV9-shCCAT2 reduced cardiomyocyte surface area in TAC-induced CH mice (Figure 3C). As an important feature of pathological CH, cardiac fibrosis was detected through Masson’s trichrome staining. Compared with sham mice, mice subjected to TAC surgery presented interstitial and perivascular fibrotic changes in cardiac tissues, accompanied by notable collagen accumulation. However, the above TAC-induced cardiac fibrotic changes were ameliorated after CCAT2 knockdown (Figure 3D). The echocardiographic analysis showed that TAC-induced elevation in LVEDd and LVESd and reduction in LVEF and LVFS of mouse hearts were markedly reversed after downregulating CCAT2 (Figure 3E-H). Moreover, the elevation in HW/BW, LVW/BW, and LVW/TL ratios in mice caused by TAC operation was overturned by silencing of CCAT2 (Figure 3I). Western blotting demonstrated that the TAC-induced increment in β-MHC, ANP, and BNP protein levels in mouse cardiac tissues was antagonized by injection with AAV9-shCCAT2 (Figure 3J-L). Overall, CCAT2 silencing effectively mitigates CH in mice.

– Silencing of CCAT2 alleviates CH in model mice. (A) Protocol for AAV9-shCCAT2 or AAV9-shNC injection into TAC-induced CH model mice. (B) Detection of CCAT2 expression in cardiac tissues of CCAT2-silencing mice 3 weeks after TAC surgery by RT-qPCR. n=6 mice per group. (C) Representative H&E staining images of heart sections and quantification of cardiomyocyte cross-sectional area in sham mice and TAC-induced CH mice with or without CCAT2 knockdown. Scale bar, 20 μm. n=6 mice per group. (D) Representative Masson’s trichrome staining images of heart sections and quantification of myocardial fibrosis. Scale bar, 50 μm. n=6 mice per group. (E-H) The LVEDd, LVES, LVEF, and LVFS of mouse hearts. n=6 mice per group. (I) The HW/BW, LVW/BW, and LVW/TL ratio of mice. n=6 mice per group. (J-L) Determination of β-MHC, ANP, and BNP protein levels in mouse cardiac tissues through western blotting. n=6 mice per group. Data are expressed as the means ± SD. *P < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs Sham; #p < 0.05, ###p < 0.001 vs TAC.

Silencing of CCAT2 ameliorates cardiomyocyte hypertrophy in vitro

Similarly, the impacts of CCAT2 knockdown on cardiomyocyte hypertrophy in vitro were further evaluated after Ang II-treated H9c2 cells were transfected with shCCAT2. We discovered from RT-qPCR that shCCAT2 transfection debilitated the promotion of Ang II treatment on CCAT2 level in H9c2 cells (Figure 4A). As revealed by α-SMA immunofluorescence staining, the knockdown of CCAT2 obviously reduced the surface area in hypertrophic H9c2 cells (Figure 4B-C). Additionally, CCAT2 deficiency counteracted the enhancement in β-MHC, ANP, and BNP levels caused by Ang II treatment in H9c2 cells (Figure 4D-G). These data suggest that CCAT2 silencing improves cardiomyocyte hypertrophy in vitro.

– Silencing of CCAT2 ameliorates cardiomyocyte hypertrophy in vitro. Ang II-stimulated H9c2 cells were transfected with shCCAT2 or shNC. (A) Analysis of CCAT2 expression in H9c2 cells through RT-qPCR. n=3 repetitions. (B-C) Assessment of the size of H9c2 cells by α-SMA immunofluorescence staining. Scale bar, 20 μm. n=3 repetitions. (D-G) Examination of β-MHC, ANP, and BNP levels in H9c2 cells by western blotting and RT-qPCR. n=3 repetitions. Data are expressed as the means ± SD. ***P < 0.001 vs Control; #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 vs Ang II.

Silencing of CCAT2 inhibits the activation of the Wnt/β-catenin signaling in CH

To Figure out the molecular mechanism through which CCAT2 knockdown plays a protective role against CH, the influence of CCAT2 depletion on the Wnt/β-catenin signaling was estimated in both CH mouse models and hypertrophic cardiomyocytes. As shown in Figure 5A-B, TAC surgery resulted in the Wnt/β-catenin pathway activation in CH mice, which however, was suppressed by depletion of CCAT2, as evidenced by the reduction in active β-catenin and phosphorylated-GSK-3β protein levels in CCAT2-silenced CH mice. The expression of Wnt target genes was detected through RT-qPCR, which depicted that c-Myc, cyclinD1, and c-Jun expression in mouse cardiac tissues was markedly enhanced after TAC operation, but was attenuated after AAV9-shCCAT2 injection (Figure 5C). Furthermore, the inactivation of CCAT2 knockdown on the Wnt/β-catenin pathway in CH was validated in vitro. Ang II-induced increment in active β-catenin and phosphorylated-GSK-3β levels in H9c2 cells was offset by the downregulation of CCAT2 (Figure 5D-E). RT-qPCR illustrated that Ang II-induced upregulation in c-Myc, cyclinD1, and c-Jun expression in H9c2 cells was reversed by CCAT2 knockdown (Figure 5F). More importantly, we observed a significant decline in TOP/FOP ratio in hypertrophic H9c2 cells, while CCAT2 silencing pronouncedly abrogated this effect caused by Ang II (Figure 5G). Jointly, CCAT2 knockdown plays an inhibitory role on the Wnt/β-catenin pathway in CH.

– Silencing of CCAT2 inhibits the activation of the Wnt/β-catenin pathway in CH. (A-B) Measurement of active β-catenin and phosphorylated-GSK-3β protein levels in sham mice and TAC-induced CH mice with or without AAV9-shCCAT2 or AAV9-shNC injection by western blotting. n=6 mice per group. (C) Detection of c-Myc, cyclinD1, and c-Jun mRNA levels in TAC-induced CH mice after silencing of CCAT2 by RT-qPCR. n=6 mice per group. Data are expressed as the means ± SD. **P < 0.01, ***p < 0.001 vs Sham; #p < 0.05, ###p < 0.001 vs TAC. (D-E) Examination of active β-catenin and phosphorylated-GSK-3β protein levels in control H9c2 cells and Ang II-stimulated H9c2 cells with or without shCCAT2 or shNC transfection via western blotting. n=3 repetitions. (F) Assessment of c-Myc, cyclinD1, and c-Jun mRNA levels in Ang II-treated H9c2 cells after knockdown of CCAT2 by RT-qPCR. n=3 repetitions. (G) Evaluation of the Wnt/β-catenin pathway activity in H9c2 cells following Ang II treatment and shCCAT2 or shNC transfection by TOP/FOP flash assay. n=3 repetitions. Data are expressed as the means ± SD. ***P < 0.001 vs Control; #p < 0.05, ###p < 0.001 vs Ang II.

Silencing of CCAT2 relieves cardiomyocyte hypertrophy in vitro by restraining the Wnt/β-catenin pathway

To validate whether CCAT2-mediated cardiomyocyte hypertrophy is dependent on the Wnt/β-catenin pathway, H9c2 cells were pretreated with LiCl, an agonist of the Wnt/β-catenin pathway, before Ang II treatment. According to α-SMA immunofluorescence staining, we found that the inhibition of CCAT2 silencing on the surface area of hypertrophic H9c2 cells was overturned by LiCl pretreatment (Figure 6A-B). As illustrated by western blotting, pretreatment with LiCl reversed the reduction in β-MHC, ANP, and BNP protein levels caused by CCAT2 depletion in hypertrophic H9c2 cells (Figure 6C-E). The results of RT-qPCR were in line with those of western blotting, which demonstrated that LiCl abolished the shCCAT2-induced decline in β-MHC, ANP, and BNP mRNA levels in hypertrophic H9c2 cells (Figure 6F). Overall, LiCl blunts the preventive effects of CCAT2 silencing on Ang II-induced cardiomyocyte hypertrophy.

– Silencing of CCAT2 relieves cardiomyocyte hypertrophy in vitro by restraining the Wnt/β-catenin pathway. H9c2 cells were pretreated with LiCl before Ang II stimulation and shCCAT2 or shNC transfection. (A-B) Determination of H9c2 cell size through α-SMA immunofluorescence staining. n=3 repetitions. Scale bar, 20 μm. (C-F) Assessment of β-MHC, ANP, and BNP levels in H9c2 cells through western blotting and RT-qPCR. n=3 repetitions. (G) Schematic diagram illustrating the underlying molecular mechanism of LncRNA CCAT2 in CH. Data are expressed as the means ± SD. ***P < 0.001 vs Control; #p < 0.05, ###p < 0.001 vs Ang II; &&p < 0.01, &&&p < 0.001 vs Ang II + shCCAT2.

Discussion

This study provides evidence supporting the alleviative effects of LncRNA CCAT2 downregulation on CH. Silencing of CCAT2 has been demonstrated to blunt Ang II-induced cardiomyocyte hypertrophy in vitro and ameliorate pressure overload-induced myocardial hypertrophy in mouse models. Mechanically, CCAT2 knockdown inactivated the Wnt/β-catenin signaling, and supplementation of LiCl, an agonist of the Wnt/β-catenin signaling, abated the anti-hypertrophic effect of CCAT2 silencing. The above evidence indicates that silencing of CCAT2 exerts an anti-hypertrophic effect in CH, which relies on its interruption of the Wnt/β-catenin signaling.

Accumulating evidence has proved that LncRNAs exert either promotive or inhibitory effects on the progression of CH through a diversity of mechanisms. For example, Wen et al. suggested that PEG10 was upregulated in pathological CH, and PEG10 aggravated CH through increasing HOXA9 expression.21 Zhou et al. discovered that UCA1 was highly expressed in the constructed hypertrophic cardiomyocytes and CH murine models, and UCA1 facilitated CH progression by enhancing HOXA9 expression through competitively binding with miR-184.22 In contrast, other studies have indicated the protective effects of some LncRNAs in the development of CH. Song et al. disclosed that ADAMTS9-AS1 expression was reduced in hypertrophic obstructive cardiomyopathy patients and isoproterenol-treated human cardiomyocyte cells, and overexpression ADAMTS9-AS1 repressed cardiomyocyte hypertrophy by upregulating KAT7 through sponging miR-185-5p.23 Wang et al. reported that both cellular and animal models of CH presented decreased expression of H19, and H19 overexpression hindered CH development via modulating the miR-145-3p/SMAD4 axis.24 Previously, the detailed role and molecular mechanism of LncRNA CCAT2 in human diseases, especially cancers, have been elucidated. For example, deficiency of CCAT2 restrains cell growth and metastasis but induces G0/G1 arrest and apoptosis in breast cancer through inactivating the TGF-β signaling pathway.25 CCAT2 attenuates radiosensitivity and apoptosis of esophageal cancer cells by negatively regulating the miR-145/p70S6K1 axis and the p53 signaling pathway.26 CCAT2 promotes gastric cancer cell growth and metastasis through modulating CD44 alternative splicing via binding to ESRP1.27 Nonetheless, whether CCAT2 exerts regulatory effects in CH has not been explored before. Herein, we discovered that LncRNA CCAT2 level was considerably higher in TAC-induced CH mouse models and Ang II-treated H9c2 cells. Furthermore, silencing of CCAT2 substantially alleviated CH in mice and hypertrophic H9c2 cells, which was validated by its inhibition of the expression of key CH markers (β-MHC, ANP, and BNP). This suggests the enhancing effect of LncRNA CCAT2 on the progression of CH.

The canonical Wnt/β-catenin signaling pathway is well known for its regulatory role in embryonic development, stem cell homeostasis, and tissue regeneration.28 In recent years, accumulating evidence has demonstrated that the abnormal activation of this pathway in the heart underlies the pathophysiology of myocardial hypertrophy and myocardial injury.29 It has been confirmed that β-catenin participates in the metabolism of cardiomyocytes, thereby affecting the function and development of the heart.30 Studies have proved that β-catenin overexpression can result in CH.31,32 Overexpressing β-catenin in cardiac myocytes increases cell volume, induces actin formation, activates pathological hypertrophy markers, and elevates ANP and BNP levels.33 CH can be ameliorated through knockout or inhibition of myocardial β-catenin.34 Zhao et al. reported that multiple Wnt ligands were induced and β-catenin was activated in rats with chronic infusion of Ang II and rat primary cardiomyocytes, and blockade of the Wnt/β-catenin pathway by ICG-001 attenuated CH and myocardial fibrosis as well as inhibited hypertrophic marker gene expression.35 Therefore, suppression of the Wnt/β-catenin signaling might be considered a promising therapeutic target for CH. Previously, many studies have unraveled that CCAT2 participates in mediating cancer development via modulating the Wnt/β-catenin signaling. For instance, CCAT2 knockdown restrains cell growth and metastasis and facilitates cell cycle arrest and apoptosis in thyroid cancer by attenuating Wnt/β-catenin cascade activity.36 The inhibitory effects on prostate cancer cell growth, cell cycle, epithelial-mesenchymal transition, and metastasis induced by silencing of CCAT2 were antagonized by treatment with the Wnt/β-catenin pathway activator LiCl.37 Downregulation of CCAT2 impedes oral squamous cell carcinoma cell malignant biological behaviors via inactivating the Wnt/β-catenin signaling.38 Based on the above literature, we speculated that CCAT2 might also mediate CH development by modulating the Wnt/β-catenin signaling. Herein, we observed that the upregulation in the levels of active β-catenin and phosphorylated-GSK-3β and Wnt target genes c-Myc, cyclinD1, and c-Jun induced by TAC in CH mice and by Ang II in hypertrophic cardiomyocytes was overturned by silencing of CCAT2. Importantly, LiCl treatment abrogated the suppression of CCAT2 knockdown on cell surface area and β-MHC, ANP, and BNP levels in hypertrophic H9c2 cells, suggesting that CCAT2 silencing hampers CH progression by inactivating the Wnt/β-catenin signaling.

To be honest, there exist some limitations in our study. First, when measuring the size of mouse cardiomyocytes, the heart should be in diastole, so the area of cardiomyocytes we obtained may be smaller than the actual size. Second, to further elucidate the role of CCAT2 in the pathogenesis of CH, different cell type-specific conditional silencing of CCAT2 mice are required for further investigations. Third, the expression of CCAT2 in human heart failure tissues remains uncertain. Tissue specimens from patients with end-stage heart failure should be collected and analyzed in future studies. Finally, further studies are warranted to explore the detailed underlying mechanism through which CCAT2 inactivates the Wnt/β-catenin signaling pathway during CH.

To date, this is the first report to demonstrate that silencing CCAT2 has an inhibitory effect on Ang II-induced cardiomyocyte hypertrophy in vitro and TAC-induced CH in vivo by repressing the Wnt/β-catenin signaling (Figure 6G). CCAT2 has the potential to provide a target for the development of more effective clinical therapeutics for CH.

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

This study was approved by the Ethics Committee of the Wuhan Myhalic Biotechnology Co., Ltd under the protocol number HLK-202303112. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.

This study was partially funded by Natural Science Foundation of Hubei Science and Technology Department, General Project (2022CFC002).