Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC RBnYLx9KmtVmsPpqNR3sGYn S0066-782X2024000700301 00301 10.36660/abc.20230602 Artigo Original Função do Ventrículo Direito e Estresse Oxidativo Melhoram com a Administração de Hormônios da Tireoide e Suco de Uva em um Modelo de Hipertensão Pulmonar Proença Isabel Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito 1 0000-0001-5994-5218 Turck Patrick Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Ortiz Vanessa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 0000-0001-6054-4243 Campos-Carraro Cristina Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Klein Adriane Bello Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de financiamento Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Castro Alexandre de Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Dani Caroline Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados Obtenção de financiamento Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 0000-0002-9482-7388 Araujo Alex Sander da Rosa 1 Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre RS Brasil Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS – Brasil Correspondência: Alex Sander da Rosa Araujo • Universidade Federal do Rio Grande do Sul – Rua Ramiro Barcelos, 2500. CEP 90035-003, Porto Alegre, RS - Brasil. E-mail: alex.rosa@ufrgs.br

Editor responsável pela revisão: Marina Okoshi

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Não há conflito com o presente artigo

 15 07 2024 06 2024 121 7 e20230602 28 08 2023 16 02 2024 27 03 2024 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

: Função do Ventrículo Direito e Estresse Oxidativo Melhoram com a Administração de Hormônios da Tireoide e Suco de Uva em um Modelo de Hipertensão Pulmonar

O tratamento com hormônios tireoidianos (HT) e suco de uva (SU) melhora a contratilidade e a homeostase redox, conforme indicado pelo aumento da ESPAT (excursão sistólica do plano anular tricúspide), NRF2, glutationa peroxidase (GPx), níveis de sulfidrila (SH) total e redução de xantina oxidase (XO), usando ventrículo direito (VD), no modelo de hipertensão arterial pulmonar (HAP) induzida por monocrotalina. Partes da figura foram desenhadas usando imagens da Servier Medical Art. A Servier Medical Art da Servier é licenciada sob Creative Commons, com licença não portada de atribuição 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).

Resumo Fundamento

A remodelação adversa dos vasos pulmonares eleva a pressão pulmonar e provoca hipertensão arterial pulmonar (HAP). A HAP resulta em aumento da pós-carga do ventrículo direito (VD), causando hipertrofia ventricular e consequente insuficiência cardíaca. Não existe um tratamento específico para o remodelamento desadaptativo do VD secundário à HAP.

 Objetivos

Este estudo tem como objetivo explorar duas abordagens terapêuticas, o suco de uva (SU) e os hormônios tireoidianos (HT), no tratamento do estresse oxidativo induzido pela HAP e nas alterações funcionais cardíacas.

 Métodos

Parâmetros ecocardiográficos relacionados à resistência dos vasos pulmonares (relação TA/TE), contratilidade do VD (ESPAT) e função diastólica do VD (relação dos picos E/A) foram avaliados. Além disso, foram medidos ROS totais, peroxidação lipídica, enzimas antioxidantes, proteínas de manipulação de cálcio, expressão de proteínas pró-oxidantes e antioxidantes. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

 Resultados

Ambos os tratamentos, com SU e HT, demonstraram uma redução na resistência pulmonar (~22%), além de melhorias na ESPAT (inotropismo ~11%) e na relação TA/TE (~26%) (p<0,05). Não houve alterações entre os grupos na relação do pico de E/A. Embora ROS e TBARS não tenham sido estatisticamente significativos, os tratamentos com SU e HT diminuíram os níveis de xantina oxidase (~49%) e normalizaram a expressão de HSP70 e proteínas de manipulação de cálcio (p<0,05). No entanto, apenas o tratamento com HT melhorou a função diastólica (~50%) e aumentou o imunoconteúdo de NRF2 (~48%) (p<0,05).

 Conclusões

Até onde sabemos, este estudo é pioneiro ao mostrar que o HT administrado em conjunto com o SU promoveu melhorias funcionais e bioquímicas em um modelo de HAP. Além disso, nossos dados sugerem que os tratamentos com SU e HT se mostraram cardioprotetores, sejam combinados ou não, e exibiram seus benefícios ao modular o estresse oxidativo e as proteínas de manipulação do cálcio.

 Antioxidantes Distúrbios do manejo do Cálcio Monocrotalina Fator 2 Relacionado a NF-E2 Introdução

A hipertensão pulmonar (HAP) é uma condição patológica que afeta aproximadamente 15-26 por milhão de adultos.1,2 A HAP leva à vasoconstrição pulmonar e ao aumento da resistência vascular pulmonar (RVP).3 A RVP elevada resulta em sobrecarga pressórica, causando dilatação, hipertrofia e disfunção do ventrículo direito (VD), conhecida como cor pulmonale.4 Essa disfunção resulta do comprometimento de proteínas manipuladoras de cálcio, como ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático (SERCA), receptor de rianodina e fosfolambam, devido ao aumento da pós-carga ventricular.5,6 O estresse oxidativo tem sido considerado um importante fator mecanicista envolvido na progressão da hipertrofia para a insuficiência do VD.

A perturbação da homeostase redox está associada ao remodelamento adverso do VD e à progressão para a insuficiência cardíaca.7 Além da produção mitocondrial de ROS, outras fontes apresentam papéis importantes na geração de radicais livres, como a xantina oxidase.8 Por outro lado, a resposta antioxidante é estimulada pelo fator de transcrição nuclear eritroide 2 (NFE2), relacionado ao fator 2 (NRF2), que reconhece o elemento responsivo antioxidante (ERA) comum do DNA e inicia a transcrição de genes antioxidantes. Condições de estresse, hormônios e compostos fenólicos podem induzir a expressão de NRF2 e aumentar a capacidade antioxidante celular.

Nesse contexto, foi descrito anteriormente que o consumo de suco de uva (SU) induz efeitos vasodilatadores, que a presença de diversas moléculas antioxidantes, como catequina, quercetina e antocianidina, pode explicar.9,10 Os polifenóis atuam como moléculas sinalizadoras, modulando a expressão de NRF2 e afetando o estado redox celular.11 Além desses compostos, os hormônios tireoidianos (HT) também podem influenciar a ativação do NRF2.12 Além disso, os HT têm sido reconhecidos como cardioprotetores em modelos de infarto cardíaco, uma vez que o tratamento com HT melhorou a contratilidade ventricular em ratos infartados.13

Os HT exercem efeito protetor sobre o ventrículo e o SU apresenta ação relevante como vasodilatador e, portanto, o objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da administração de SU e HT, isolados e combinados, sobre a remodelação cardiovascular, bem como sobre o estresse oxidativo em modelo experimental de HAP.

 Métodos Considerações éticas e grupos experimentais

Ratos Wistar machos foram cedidos pelo Centro de Reprodução e Experimentação de Animais de Laboratório (CREAL) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). A pesquisa foi conduzida de acordo com o Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA – UFRGS) (número de aprovação: 37372). Os animais foram divididos em cinco grupos experimentais (N=46): o grupo controle recebeu injeção intraperitoneal de soro fisiológico e água por gavagem; o grupo HAP recebeu injeção de monocrotalina (MCT); o grupo HAP+SU recebeu MCT e suco de uva por gavagem; o grupo HAP+HT recebeu MCT e T3/T4 por gavagem; o grupo HAP+HT+SU recebeu MCT, hormônios tireoidianos e, uma hora após esta administração, suco de uva. No 21º dia experimental, um ecocardiograma foi realizado, seguido de eutanásia. De acordo com o método de randomização, os animais foram numerados de 1 a 46 e o sorteio dos números foi realizado manualmente para compor os grupos experimentais. As análises foram realizadas de forma duplo-cega.

 Determinação do tamanho da amostra

O tamanho da amostra foi estimado utilizando o software Sigma Plot 11.0. A probabilidade de erro α = 0,05 e o poder estatístico do teste (probabilidade de erro 1-β) = 0,95 foram considerados. O n calculado foi de 10 amostras por grupo experimental (considerando três protocolos experimentais distintos) utilizando a pressão sistólica intraventricular direita como desfecho principal.

 HAP induzida por MCT

No primeiro dia do protocolo experimental, uma dose única de MCT (60 mg/kg intraperitoneal) foi administrada a ratos Wistar (180-220 g) para induzir a HAP.

 Tratamento com suco orgânico de uva roxa

O SU integral orgânico foi obtido da empresa Uva’só Produtos Orgânicos (Garibaldi, RS, Brasil). O conteúdo total de compostos fenólicos analisados resultou em 4.052,2 mg/L (flavonoides (87%), antocianinas (13%) e resveratrol (0,01%)). Os animais receberam SU por gavagem na dose de 7 µL/g. A administração do suco foi iniciada sete dias após a injeção do MCT e durou 14 dias, até o final do protocolo experimental. A dose de SU foi baseada em estudos anteriores, que mostram que 7 µl/g equivale a cerca de 400 mL de suco (aproximadamente dois copos de 200 mL de suco/dia) para um adulto com peso de 70 kg.14

 Administração de HT

A administração de HT (T3 (2μg/100g/dia) e T4 (8μg/100g/dia) por gavagem) começou sete dias após a injeção do MCT e durou 14 dias, até o final do protocolo experimental.13

 Análise ecocardiográfica e morfométrica

Os animais foram anestesiados (cetamina 90 mg/kg; xilazina 10 mg/kg, intraperitoneal). As imagens foram obtidas por meio de Doppler bidimensional, modo M e pulsado (Philips HD7 Ultrasound System, Andover, MA, EUA), com transdutor S12-4 (Philips, Andover, MA, EUA). A relação entre o tempo de aceleração e o tempo de ejeção do fluxo sanguíneo pela artéria pulmonar (TA/TE), a excursão sistólica do plano anular tricúspide (ESPAT) e a taxa de fluxo durante o enchimento rápido e lento do VD (relação entre picos E/A) foram avaliadas. O índice de Fulton foi calculado usando peso do VD/peso (ventrículo esquerdo (VE) + septo (S)).

 Coleta da amostra

Após avaliação ecocardiográfica, os animais foram eutanasiados, o VD foi dissecado e armazenado a -80 °C.

 Avaliação do estresse oxidativo

A concentração de radicais livres totais foi determinada pelo método de fluorescência por meio da reação com diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA)15 (nmol/mg de proteína). O dano lipídico foi avaliado pela determinação da concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (nmol/mg de proteína).16

 Determinação da resposta antioxidante

A quantificação da atividade da superóxido dismutase (SOD) foi baseada na capacidade da SOD em inibir a auto-oxidação do pirogalol (unidades de SOD/mg de proteína).17 A atividade da catalase (CAT) foi medida pelo consumo de H2O218 (pmol CAT/mg proteína). A glutationa peroxidase (GPx) foi determinada proporcionalmente ao consumo de NADPH (nmol por minuto/mg de proteína).19 O conteúdo total de sulfidrila foi medido pela reação com DTNB (nmol TNB/mg de proteína).20

 Análise de Western Blot

As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida (8-14%). As proteínas foram transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (membrana de transferência Immobilon-P; Millipore). A imunodetecção foi realizada utilizando os seguintes anticorpos: xantina oxidase (XO) (150 kDa) (H-110): sc-20991, Lote: D1511; HSP 70 (70 kDa) (K-20): as-1060; Lote: G3013; SOD2 (25kDa) (G-20): as-18504, Lote: G1013; catalase (64kDa) (H-300): sc-50508, Lote: L2812; NRF2 (57 kDa) (c-20): sc-722; Lote: h1613; p-fosfolambam (25 kDa) (Trh 17): sc-17024-R, Lote: K2409; fosfolambam (25 kDa) (FL-52): sc-30142, Lote: H1908; SERCA (100 kDa) (H-300): sc-30110, Lote: L0205; e rianodina (42 kDa) (H-300): sc-13942, Lote: F1808. Todos os anticorpos foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology. Anticorpos secundários (conjugado de peroxidase de rabanete anti-cabra ou anti-coelho) foram utilizados para detecção por quimioluminescência no sistema Quant LAS4000 (GE Healthcare) e a expressão foi quantificada utilizando o software ImageJ. O método de Ponceau foi utilizado para normalização.21 O tamanho da amostra para cada proteína foi de quatro animais por grupo, escolhidos aleatoriamente.

 Análise estatística

A distribuição dos dados foi determinada pelo teste de Shapiro-Wilks. Para os dados com distribuição normal de variância homogênea, utilizamos a análise de variância (ANOVA) unidirecional, seguida do pós-teste de Tukey (F). Para os dados com distribuição normal e variância não homogênea, utilizamos a análise de variância de Welch (ANOVA), seguida do pós-teste de Games Holmes (W), os quais foram apresentados como média ± desvio padrão. Para os dados que não apresentaram distribuição normal, utilizamos a análise de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn (K), e os dados foram apresentados como mediana e percentis 25 e 75. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todas as análises foram realizadas no software SPSS Statistic 18. O teste de Grubbs do software GraphPad Prism foi utilizado para determinar valores discrepantes, que foram retirados das análises estatísticas.

 Resultados Avaliação funcional e morfométrica do VD

Considerando os parâmetros ecocardiográficos, observamos que a condição de HAP reduziu a relação TA/TE, conforme demonstrado pelos grupos HAP e HAP+HT+SU. No entanto, os tratamentos isolados foram eficazes na melhoria deste parâmetro, como observado nos grupos HAP+SU e HAP+HT (p<0,05). Da mesma forma, os tratamentos atenuaram a diminuição da ESPAT, que foi observada apenas no grupo HAP (p<0,05). Sobre a relação dos picos E/A do VD, houve diminuição no grupo HAP; apenas o grupo HAP+HT apresentou melhora em relação ao grupo HAP (p<0,05) (Tabela 1 e Figura 1).

– Dados morfométricos e ecocardiográficos
Parâmetros Controle (n=10) HAP (n=10) HAP+SU (n=9) HAP+HT (n=7) HAP+HT+SU (n=10) Valor p
Dados morfométricos
Peso VD (g) 0,64 [0,61-0,65] 0,56 [0,53-0,60] 0,53 [0,52-0,65] 0,62 [0,59-0,66] 0,60 [0,58-0,64] 0,048
Índice de Fulton (VD/VE+S) 0,27 ± 0,02 0,42 ± 0,07* 0,40 ± 0,07* 0,48 ± 0,10* 0,42 ± 0,07* ≤0,001
Dados Ecocardiográficos
TA/TE 0,26 ± 0,04 0,15 ± 0,05* 0,19 ± 0,07 0,20 ± 0,08 0,15 ± 0,03* 0,002
ESPAT (cm) 0,21 [0,21-0,22] 0,18 [0,16-0,19]* 0,19 [0,18-0,21] 0,20 [0,18-0,21] 0,19 [0,18-0,19] 0,002
E/A 1,12 ± 0,12 0,76 ± 0,06* 0,79 ± 0,15* 1,27 ± 0,46 0,73 ± 0,09* ≤0,000

HAP: hipertensão arterial pulmonar; SU: suco de uva; HT: hormônios tireoidianos; VD: ventrículo direito; VE: ventrículo esquerdo; TA/TE: razão entre o tempo de aceleração e o tempo de ejeção do fluxo sanguíneo pela artéria pulmonar; ESPAT: excursão sistólica do plano do anel tricúspide; E/A: velocidade de enchimento ventricular precoce/velocidade de enchimento ventricular tardio para o VD. ANOVA unidirecional (pós-teste de Tukey), dados apresentados como média ± desvio padrão. Teste de Kruskal-Wallis (pós-Dunn), dados apresentados como mediana e percentis 25 e 75. *diferença significativa em relação ao grupo controle.

– Imagem representativa dos dados ecocardiográficos do VD. O ESPAT está marcado para os grupos (A) CTR: Controle, (B) HAP: hipertensão arterial pulmonar; (C) HAP+SU: Hipertensão Arterial Pulmonar mais Suco de Uva, (D) HAP+HT: Hipertensão Arterial Pulmonar mais Hormônios Tireoidianos, e (E) HAP+HT+SU: Hipertensão Arterial Pulmonar mais Hormônios Tireoidianos mais Suco de Uva.

Ao analisar o índice de Fulton, o grupo HAP+HT apresentou aumento significativo em relação ao grupo HAP+SU (p<0,05). Não foi observada diferença significativa no pós-teste em relação ao peso do VE. Porém, foi observado aumento do índice de Fulton em todos os grupos submetidos à HAP em relação ao controle (p<0,05) (Tabela 1).

 Marcadores de estresse oxidativo

Em relação aos níveis de TBARS e ROS, não houve diferença significativa entre os grupos (Figura 2A e B). A enzima pró-oxidante xantina oxidase (XO) apresentou expressão proteica aumentada no grupo HAP em relação ao controle. No entanto, foi detectado um efeito positivo dos tratamentos, pois os grupos tratados apresentaram uma diminuição nos níveis de XO nos grupos HAP+SU, HAP+HT e HAP+HT+SU em relação ao grupo HAP (p<0,05) (Figura 2C). Além disso, o grupo HAP apresentou expressão elevada de HSP70 em comparação com o grupo controle. Porém, os grupos HAP+HT e HAP+HT+SU apresentaram diminuição na expressão de HSP70 em relação ao grupo HAP (p<0,05) (Figura 2D).

– Análise de marcadores de estresse oxidativo (A) TBARS, (B) ROS, (C) XO, e (D) HSP70. Os dados foram expressos em média e desvio padrão (n=9-4/grupo). (*) Diferença significativa em relação ao grupo controle. (#) Diferença significativa em relação ao grupo HAP. Análise estatística de (A) pela ANOVA de Welch com pós-teste de Games Holmes e de (B), (C), (D) e (E) ANOVA unidirecional com pós-teste de Tukey (p<0,05). CTR: Controle; HAP: hipertensão arterial pulmonar; HAP+SU: Hipertensão Arterial Pulmonar mais Suco de Uva; HAP+HT: hipertensão arterial pulmonar mais hormônios tireoidianos; HAP+HT+SU: hipertensão arterial pulmonar mais hormônios tireoidianos mais suco de uva.

Resposta antioxidante

Ao avaliarmos os antioxidantes enzimáticos, a atividade de SOD e CAT não apresentou diferenças entre os grupos (Figura 3A e B). A expressão da proteína SOD2 foi diminuída nos grupos HAP e HAP+HT+SU em relação ao controle (p<0,05). A expressão da catalase não foi diferente entre os grupos (Figura 3C e D). Considerando a atividade da glutationa peroxidase (GPx), os animais com HAP apresentaram diminuição quando comparados ao controle. Porém, a atividade dessa enzima foi aumentada nos grupos HAP+SU, HAP+HT e HAP+HT+SU em relação aos grupos controle e HAP (p<0,05). Além disso, houve diminuição nos níveis de grupos sulfidrila nos grupos HAP em relação ao controle, HAP+SU, HAP+HT e HAP+HT+SU (p<0,05) (Figura 3E e F). Como o NRF2 é capaz de controlar a transcrição de diversas enzimas antioxidantes, a expressão desse fator foi avaliada. O grupo HAP+HT+SU apresentou níveis aumentados de proteína NRF2 em comparação com o grupo controle (p<0,05) (Figura 3G).

– Resposta antioxidante: (A) atividade SOD, (B) atividade CAT, (C) expressão da proteína SOD2, (D) expressão da proteína CAT, (E) atividade GPX, (F) grupo Sulfidril e (G) expressão da proteína NRF2. Os dados foram expressos em média e desvio padrão (n=10-4/grupo). (*) Diferença significativa em relação ao grupo controle. (#) Diferença significativa em relação ao grupo HAP. Análise estatística de (B), (C) e (E) pela ANOVA de Welch com pós-teste de Games Holmes e de (A), (C), (D), (F) e (G) ANOVA unidirecional com Pós-teste de Tukey (p< 0,05). CTR: controle; HAP: hipertensão arterial pulmonar; HAP+SU: hipertensão arterial pulmonar mais suco de uva; HAP+HT: hipertensão arterial pulmonar mais hormônios tireoidianos; HAP+HT+SU: hipertensão arterial pulmonar mais hormônios tireoidianos mais suco de uva.

Proteínas de manejo de cálcio

Em relação à expressão da proteína p-fosfolambam, foi observada diminuição no grupo co-tratado em comparação ao grupo controle (p<0,05) (Figura 4A). Quanto aos níveis de fosfolambam total, houve aumento no grupo HAP+SU em relação aos grupos controle e HAP. Por outro lado, esta proteína foi diminuída nos grupos HAP+HT e HAP+HT+SU em comparação ao grupo HAP+SU (p<0,05) (Figura 4B). Apesar disso, quando avaliada a relação p-fosfolambam/fosfolambam, não houve alteração significativa entre os grupos (Figura 4C). Em relação à expressão da SERCA, houve aumento nos níveis proteicos no grupo HAP; entretanto, os grupos HAP+SU, HAP+HT e HAP+HT+SU apresentaram expressão diminuída da proteína em relação ao grupo HAP (p<0,05). Em relação à expressão da proteína receptora de rianodina, houve diminuição nos grupos HAP+HT e HAP+HT+SU em relação aos grupos HAP e HAP+SU (p<0,05) (Figura 4D e E). Sobre a relação SERCA/fosfolambam total, não houve diferença entre os grupos (Figura 4F).

– Proteína de manejo do cálcio. (A) P-fosfolambam, (B) fosfolambam total, (C) Razão P-fosfolambam/Fosfolambam total, (D) SERCA, (E) Receptor de rianodina e (F) Razão SERCA/fosfolambam total. Os dados foram expressos em média e desvio padrão (n=4/grupo). (*) Diferença significativa em relação ao grupo controle. (#) Diferença significativa em relação ao grupo HAP. ($) Diferença significativa em relação ao grupo HAP+SU. Análise estatística de (A) por Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn, de (B), (D) e (E) por ANOVA unidirecional com pós-teste de Tukey e de (C) e (F) por ANOVA de Welch com pós-teste de Games Holmes (p<0,05). CTR: controle; HAP: hipertensão arterial pulmonar; HAP+SU: hipertensão arterial pulmonar mais suco de uva; HAP+HT: hipertensão arterial pulmonar mais hormônios tireoidianos; HAP+HT+SU: hipertensão arterial pulmonar mais hormônios tireoidianos mais suco de uva.

Discussão

O presente trabalho é inovador ao considerarmos que, pela primeira vez, descreveu a associação entre o efeito protetor do SU nos vasos pulmonares e a ação do HT contra o remodelamento adverso do VD em um modelo de HAP. Em nosso protocolo experimental, tanto SU quanto HT melhoraram parâmetros funcionais, como as relações ESPAT, TA/TE e E/A, além de modularem a expressão de proteínas reguladoras de cálcio. Em relação ao estresse oxidativo, a xantina oxidase (XO), a proteína de choque térmico 70 kDa (HSP70) e a NrF2 foram responsivas à administração de SU e HT, o que culminou na restauração da homeostase redox (Figura Central).

A HAP induziu a hipertrofia do VD, o que corrobora outros estudos utilizando o mesmo protocolo experimental.22 Embora a resposta hipertrófica do VD seja uma tentativa de superar o aumento da pós-carga cardíaca causado pela hipertensão pulmonar; suas consequências a longo prazo são deletérias à função cardíaca.23 Essa hipertrofia está associada a alterações na relação TA/TE e E/A, bem como no ESPAT. O LA reduzido representa um fechamento prematuro da valva pulmonar devido à hipertensão. Ratos com HAP também exibem uma extensão da TE, levando a uma relação TA/TE reduzida neste grupo. A análise ESPAT, por outro lado, representa uma forma de avaliar a contratilidade do VD.24 A HAP apresentou redução no ESPAT, indicando que o VD diminuiu a função contrátil. Além disso, a relação E/A apresentou redução significativa no grupo HAP, indicando diminuição da complacência ventricular e comprometimento da função diastólica. Tomados em conjunto, estes dados ecocardiográficos corroboram o fato que a HAP leva à insuficiência do VD. O tratamento da HAP com SU e HT demonstrou melhora nos parâmetros funcionais, já que, nos grupos HAP+HT e HAP+SU, a relação TA/TE não foi diferente do controle, significando menor resistência na vasculatura pulmonar. Ludke et al.25 também demonstraram que o tratamento por seis semanas com SU evitou as alterações na relação TA/TE induzidas pela HAP.25,26 Em relação ao ESPAT, ambos os tratamentos, isolados ou combinados, melhoraram a contratilidade do VD. A melhora do inotropismo pode estar associada a alterações na expressão das proteínas de manejo do cálcio. Nossos resultados mostraram uma normalização da expressão das proteínas de manejo do cálcio, principalmente no grupo HAP+SU+HT, apresentando valores mais próximos aos encontrados no grupo controle. Isso sugere que a combinação de tratamentos parece evidenciar um potencial cardioprotetor na HAP. As proteínas de manipulação de cálcio também foram sensíveis ao redox, indicando o papel crítico das ROS no modelo de HAP.

Mosele et al.27 e Castro et al.13 mostraram que a proteção do sistema cardiovascular pelo tratamento com SU e HT, respectivamente, envolveu a atenuação do estresse oxidativo. Em nosso estudo, os níveis de sulfidrila diminuíram em ratos com HAP, indicando redução na capacidade antioxidante não enzimática desses animais. Este contexto pode ser prejudicial, uma vez que os HAP diminuíram a expressão de SOD, reduzindo a proteção antioxidante não enzimática e enzimática. Por outro lado, embora os níveis reduzidos de SOD também tenham diminuído no HAP+ HT+SU, o HT mais o SU preveniram a diminuição dos níveis de sulfidrila e contra-regularam a resposta antioxidante ao estresse oxidativo imposto pela HAP.

Os radicais ânion superóxido são convertidos em peróxido de hidrogênio, que pode desempenhar um papel importante em muitas vias de sinalização.28 No entanto, os níveis suprafisiológicos de peróxido de hidrogênio podem superar a resposta antioxidante e perturbar a homeostase redox.29 CAT e GPx são relevantes para manter níveis adequados desta ROS. A HAP reduziu a atividade da GPx, implicando uma resposta antioxidante inadequada. Um perfil semelhante foi encontrado por Dos Santos Lacerda et al.,30 em cujo estudo a HAP levou à redução dos níveis de GPx. Além disso, Sun et al.31 mostraram que pacientes com HAP associada à esclerose sistêmica apresentaram GPx reduzido. SU e HT, isolados ou combinados, foram eficazes no aumento da GPx em nosso estudo. Corroborando esse resultado, em modelo experimental gestacional, Proença et al. demonstraram que o tratamento com SU protegeu o coração do feto contra o estresse oxidativo por meio de melhorias nos níveis de GPx.32 Bedê et al.33também observaram melhorias nos antioxidantes e aumento dos níveis de GPx após administração de SU em ratos tratados com dieta rica em gordura. Esses dados estão associados ao aumento dos níveis de NrF2 induzido pelo tratamento com HT e SU em nosso estudo, uma vez que a ativação de NrF2 resulta em maior expressão de enzimas antioxidantes e desencadeia efeitos citoprotetores.34 Assim, a modulação do NrF2 pode ser sugerida como mecanismo de ação do SU e HT na cardioproteção.

O presente estudo também avaliou a expressão de XO, proteína relacionada à produção de ROS, que estava aumentada no grupo HAP. Como fonte de ROS, um trabalho anterior descreveu uma interação molecular entre XO e TLR4 na ativação de neutrófilos, induzindo a translocação de NF-kB e promovendo inflamação.35 Ambos os tratamentos SU e HT, isolados ou combinados, foram eficazes na redução da expressão de XO. Corroborando isso, Castro et al.13 observaram redução na expressão de XO em ratos infartados tratados com HT; esse resultado foi correlacionado com a diminuição da expressão de MyD88, proteína relacionada ao processo inflamatório.36

A ruptura na homeostase redox desencadeia uma resposta ao estresse que envolve o recrutamento de proteínas chaperonas.37 Intracelularmente, a HSP70 desempenha papel relevante como chaperona, promovendo o enovelamento e redobramento de proteínas, além de exibir efeito anti-inflamatório e atenuar o estresse celular. Em nosso estudo, observamos um elevado imunoconteúdo de HSP70 no grupo HAP. O aumento na expressão desta proteína pode indicar um mecanismo compensatório ao dano cardíaco induzido pela HAP. A administração de SU e HT reduziu os níveis de HSP70, indicando um ambiente celular menos oxidado.

Limitação do estudo

A avaliação histológica do VD, para verificar o tamanho dos cardiomiócitos e a deposição de colágeno, seria importante no estudo do remodelamento cardíaco induzido pela HAP. Nesse sentido, consideramos a ausência desta avaliação no protocolo experimental uma limitação do estudo. Além disso, este relatório continua em fase de protocolo experimental e necessita de mais estudos para compreender os mecanismos relacionados à eficácia e segurança desta abordagem terapêutica.

 Conclusão

Nosso estudo demonstra, pela primeira vez, que o tratamento com SU com HT, isolado ou combinado, pode melhorar parâmetros vasculares funcionais do VD e pulmonares de ratos com HAP. Essa proteção cardiovascular pode estar associada à modulação da expressão das proteínas de manejo do cálcio, melhorando o inotropismo do VD e promovendo o restabelecimento da homeostase redox celular. Estes resultados são relevantes e abrem uma perspectiva de novas estratégias terapêuticas para mitigar as complicações cardiovasculares da HAP.

 Agradecimentos

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Os autores também agradecem à Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS, ao Ibravin (Instituto Brasileiro do Vinho) e à Uva’só que forneceram o suco de uva para o experimento e à FAPERGS - Fundação de Amparo à pesquisa do Estado do RS.

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Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado por CNPq e FAPERGS.

 10.36660/abc.20230602i Original Article Right Ventricular Function and Oxidative Stress Improve with the Administration of Thyroid Hormones and Grape Juice in a Pulmonary Hypertension Model Proença Isabel Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript 1 0000-0001-5994-5218 Turck Patrick Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for content 1 Ortiz Vanessa Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for content 1 0000-0001-6054-4243 Campos-Carraro Cristina Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for content 1 Klein Adriane Bello Conception and design of the research Obtaining financing Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 Castro Alexandre de Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 Dani Caroline Conception and design of the research Obtaining financing Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 0000-0002-9482-7388 Araujo Alex Sander da Rosa 1 Brazil Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS – Brazil Mailing Address: Alex Sander da Rosa Araujo • Universidade Federal do Rio Grande do Sul – Rua Ramiro Barcelos, 2500. Postal Code 90035-003, Porto Alegre, RS - Brazil. E-mail: alex.rosa@ufrgs.br

Potential conflict of interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Editor responsible for the review: Marina Okoshi

: Right Ventricular Function and Oxidative Stress Improve with the Administration of Thyroid Hormones and Grape Juice in a Pulmonary Hypertension Model

Treatment with thyroid hormones (TH) and grape juice (GJ) improves contractility and redox homeostasis, indicated by increased TAPSE (tricuspid annular plane systolic excursion), NRF2, glutathione peroxidase (GPx), total sulfhydryl (SH) levels, and reduced xanthine oxidase (XO) level, using right ventricle (RV), in the pulmonary arterial hypertension model (PAH) induced by monocrotaline. Parts of the figure were drawn by using pictures from Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier is licensed under a Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).

Abstract Background

Adverse remodeling of lung vessels elevates pulmonary pressure and provokes pulmonary arterial hypertension (PAH). PAH results in increased right ventricle (RV) afterload, causing ventricular hypertrophy and the onset of heart failure. There is no specific treatment for maladaptive RV remodeling secondary to PAH.

 Objectives

This study aims to explore two therapeutic approaches, grape juice (GJ) and thyroid hormones (TH), on PAH-induced oxidative stress and cardiac functional changes.

 Methods

Parameters of echocardiography related to lung vessel resistance (AT/ET ratio), RV contractility (TAPSE), and RV diastolic function (E/A peaks ratio) were evaluated. Also, total ROS, lipid peroxidation, antioxidant enzymes, calcium handling proteins, pro-oxidant and antioxidant protein expression were measured. Values of p<0.05 were considered statistically significant.

 Results

Both GJ and TH treatments demonstrated reductions in pulmonary resistance (~22%) and improvements in TAPSE (inotropism ~11%) and AT/ET ratio (~26%) (p<0.05). There were no changes amongst groups regarding the E/A peak ratio. Although ROS and TBARS were not statistically significant, GJ and TH treatments decreased xanthine oxidase (~49%) levels and normalized HSP70 and calcium handling protein expression (p<0.05). However, only TH treatment ameliorated diastolic function (~50%) and augmented NRF2 immunocontent (~48%) (p<0.05).

 Conclusions

To the best of our knowledge, this study stands as a pioneer in showing that TH administered together with GJ promoted functional and biochemical improvements in a PAH model. Moreover, our data suggest that GJ and TH treatments were cardioprotective, combined or not, and exhibited their beneficial effects by modulating oxidative stress and calcium-handling proteins.

 Antioxidants Calcium Handling Disorders Monocrotaline NF-E2-Related Factor 2 Introduction

Pulmonary hypertension (PAH) is a pathological condition that affects approximately 15-26 per million adults.1,2PAH exhibits pulmonary vasoconstriction, leading to increased pulmonary vascular resistance (PVR).3 The elevated PVR results in pressure overload, which causes dilatation, hypertrophy and dysfunction of the right ventricle (RV), known as cor pulmonale.4 This dysfunction results from the impairment of calcium-handling proteins such as sarcoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA), ryanodine receptor and phospholamban due to the increased ventricular afterload.5,6 Oxidative stress has been considered an important mechanical factor involved in the progression from hypertrophy to RV failure.

The disruption of redox homeostasis is related to the adverse remodeling of RV and progression to heart failure.7 In addition to the mitochondrial production of ROS, other sources exhibit important roles in free radical generation, such as xanthine oxidase.8 On the other hand, the antioxidant response is stimulated by the transcription factor nuclear erythroid 2 (NFE2)-related factor 2 (NRF2), which recognizes the common DNA antioxidant responsive element (ARE) and initiates the transcription of antioxidant genes. Stress conditions, hormones and phenolic compounds can induce NRF2 expression and increase cellular antioxidant capacity.

In this context, it was previously described that grape juice (GJ) consumption induces vasodilator effects, which the presence of many antioxidant molecules, such as catechin, quercetin, and anthocyanidin, in the GJ can explain.9,10 Polyphenols act as signaling molecules, modulating NRF2 expression and affecting cellular redox status.11 Besides these compounds, thyroid hormones (TH) can also influence NRF2 activation.12 Moreover, TH were recognized as cardioprotective in a cardiac infarction model, since treatment with TH improved ventricular contractility in infarcted rats.13

Since the TH exert a protective effect on the ventricle and the GJ shows a relevant action as a vasodilator, the objective of the study was to assess the effects of GJ and TH administration, isolated and combined, on cardiovascular remodeling and oxidative stress in an experimental model of PAH.

 Methods Ethical considerations and experimental groups

The Center for Reproduction and Experimentation of Laboratory Animals (CREAL) of the Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS) provided the male Wistar rats. The research was conducted in accordance with the Committee for Ethical Use of Animals (CEUA – UFRGS) (approval number: 37372). The animals were divided into five experimental groups (N=46): control received an intraperitoneal injection of saline and water by gavage; PAH received monocrotaline injection (MCT); PAH+GJ received MCT and grape juice by gavage; PAH+TH received MCT and T3/T4 by gavage; PAH+TH+GJ received MCT, thyroid hormones and, one hour after this administration, grape juice. On the 21st experimental day, echocardiography was performed, followed by euthanasia. According to the randomization method, the animals were numbered from 1 to 46, and the number draw was performed manually to compose the experimental groups. The analyses were performed in a double-blind manner.

 Determination of sample size

The sample size was estimated using the Sigma Plot 11.0 Software. The probability of error α = 0.05 and statistical test power (1-β error probability) = 0.95 were considered. The calculated n was 10 samples per experimental group (considering three distinctive experimental protocols) using right intraventricular systolic pressure as the main outcome.

 MCT-induced PAH

On the first day of the experimental protocol, a single dose of MCT (60 mg/kg intraperitoneal) was administered to Wistar rats (180-220 g) to induce PAH.

 Organic red grape juice treatment

Organic whole GJ was obtained from Uva’só Organic Products (Garibaldi, RS, Brazil) company. The total phenolic compound content analyzed resulted in 4,052.2 mg/L (flavonoids (87%), anthocyanins (13%), and resveratrol (0.01%)). Animals received GJ via gavage at a dose of 7 µL/g. Juice administration started seven days after the MCT injection and lasted for 14 days until the end of the experimental protocol. The dose of GJ was based on previous studies showing that 7 µl/g accounts for circa 400 mL of juice (approximately two 200 mL glasses of juice/day) for an adult weighing 70 kg.14

 TH administration

TH administration (T3 (2μg/100g/day) and T4 (8μg/100g/day) by gavage) started seven days after MCT injection and lasted for 14 days until the end of the experimental protocol.13

 Echocardiographic and morphometric analysis

The animals were anesthetized (ketamine 90 mg/kg; xylazine 10 mg/kg, intraperitoneal). Images were obtained using two-dimensional, M-mode and pulsed Doppler (Philips HD7 Ultrasound System, Andover, MA, USA), with an S12-4 transducer (Philips, Andover, MA, USA). The ratio between the acceleration time and ejection time of blood flow through the pulmonary artery (AT/ET), the tricuspid annular plane systolic excursion (TAPSE) and the flow rate during fast and slow filling of the RV (E/A peaks ratio) were assessed. Fulton index was calculated using RV weight/(left ventricle (LV) + septum (S)) weight.

 Sample Collection

After echocardiography evaluation, animals were euthanized, the RV dissected, and stored at -80°C.

 Oxidative stress evaluation

The concentration of total free radicals was determined by the fluorescence method through reaction with dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)15 (nmol/mg protein). Lipid damage was evaluated through determination of the concentration of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) (nmol/mg protein).16

 Determination of antioxidant response

The superoxide dismutase (SOD) activity quantification was based on the ability of SOD to inhibit pyrogallol auto-oxidation (units of SOD/mg protein).17 The catalase activity (CAT) was measured through the consumption of H2O218 (pmol CAT/mg protein). Glutathione peroxidase (GPx) was determined proportionally to NADPH consumption (nmol per minute/mg protein).19 The total sulfhydryl content was measured by the reaction with DTNB (nmol TNB/mg protein).20

 Western Blot analysis

Samples were subjected to electrophoresis in polyacrylamide gel (8-14%). Proteins were transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Immobilon-P transfer membrane; Millipore). Immunodetection was performed using the following antibodies: xanthine oxidase (XO) (150 kDa) (H-110): sc-20991, Lot: D1511; HSP 70 (70 kDa) (K-20): as-1060, Lot: G3013; SOD2 (25kDa) (G-20): as-18504, Lot: G1013; catalase (64kDa) (H-300): sc-50508, Lot: L2812; NRF2 (57 kDa) (c-20): sc-722, Lot: h1613; p-phospholamban (25 kDa) (Trh 17): sc-17024-R, Lot: K2409; phospholamban (25 kDa) (FL-52): sc-30142, Lot: H1908; SERCA (100 kDa) (H-300): sc-30110, Lot: L0205; and ryanodine (42 kDa) (H-300): sc-13942, Lot: F1808. All antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology. Secondary antibodies (anti-mouse, anti-goat or anti-rabbit radish peroxidase conjugate) were used for detection by chemiluminescence on Quant LAS4000 system (GE Healthcare), and expression was quantified using ImageJ software. The Ponceau method was used for normalization.21 The sample size for each protein was four animals per group, randomly chosen.

 Statistical analysis

Data distribution was determined using the Shapiro-Wilks test. For data showing normal distribution of homogeneous variance, one-way analysis of variance (ANOVA) was used, followed by Tukey’s post-test (F). For data showing normal distribution and non-homogeneous variance, Welch’s analysis of variance (ANOVA) was used, followed by the Games Holmes post-test (W), and presented as mean ± standard deviation. For data that did not show normal distribution, Kruskal-Wallis analysis with Dunn’s post-test was used (K), and the data was presented as median and 25th and 75th percentiles. Values of p<0.05 were considered statistically significant. All analyses were performed using SPSS Statistic 18 Software. The GraphPad Prism software’s Grubbs test was used to determine outlier values, which were removed from the statistical analyses.

 Results Functional and morphometric RV evaluation

Considering the echocardiographic parameters, we observed that the PAH condition reduced the AT/ET ratio, as shown by the PAH and PAH+TH+GJ groups. However, isolated treatments were effective in improving this parameter, as seen in the PAH+GJ and PAH+TH groups (p<0.05). Likewise, the treatments mitigated the decrease in TAPSE, observed only in the PAH group (p<0.05). Regarding the RV E/A peaks ratio, there was a decrease in the PAH group; only the PAH+HT group showed an improvement in relation to the PAH group (p<0.05) (Table 1 and Figure 1).

– Morphometric and Echocardiographic Data
Parameters Control (n=10) PAH (n=10) PAH+GJ (n=9) PAH+TH (n=7) PAH+TH+GJ (n=10) Value p
Morphometric Data
Weigth LV (g) 0.64 [0.61-0.65] 0.56 [0.53-0.60] 0.53 [0.52-0.65] 0.62 [0.59-0.66] 0.60 [0.58-0.64] 0.048
Fulton Index (RV/LV+S) 0.27 ± 0.02 0.42 ± 0.07* 0.40 ± 0.07* 0.48 ± 0.10* 0.42 ± 0.07* ≤0.001
Echocardiographic Data
AT/ET 0.26 ± 0.04 0.15 ± 0.05* 0.19 ± 0.07 0.20 ± 0.08 0.15 ± 0.03* 0.002
TAPSE (cm) 0.21 [0.21-0.22] 0.18 [0.16-0.19]* 0.19 [0.18-0.21] 0.20 [0.18-0.21] 0.19 [0.18-0.19] 0.002
E/A 1.12 ± 0.12 0.76 ± 0.06* 0.79 ± 0.15* 1.27 ± 0.46 0.73 ± 0.09* ≤0.000

PAH: pulmonary arterial hypertension; GJ: grape juice; TH: thyroid hormones; RV: right ventricle; LV: left ventricle; AT/ ET: ratio between acceleration time and ejection time of blood flow through pulmonary artery; TAPSE: tricuspid annular plane systolic excursion; E/A: early ventricular filling velocity / late ventricular filling velocity for RV. One-way ANOVA (post Tukey test), data presented as mean ± standard deviation. Kruskal-Wallis’ test (post-Dunn’s) data presented as median and 25th and 75th percentiles. * significant difference compared to the control group.

– Representative image of echocardiographic data in the RV. The TAPSE is marked for the groups (A) CTR: Control, (B) PAH: pulmonary arterial hypertension, (C) PAH+GJ: pulmonary arterial hypertension plus grape juice, (D) PAH+TH: pulmonary arterial hypertension plus thyroid hormones, and (E) PAH+TH+GJ: pulmonary arterial hypertension plus thyroid hormones plus grape juice.

When analyzing the Fulton index, the PAH+TH group showed a significant increase in relation to the PAH+GJ group (p<0.05). No significant difference was observed in the post-test regarding LV weight. However, an increase in the Fulton index was observed in all groups subjected to PAH in relation to the control (p<0.05) (Table 1).

 Oxidative stress markers

Regarding TBARS and ROS levels, there was no significant difference between the groups (Figure 2A and B). The pro-oxidant enzyme xanthine oxidase (XO) showed increased protein expression in the PAH group in relation to the control. Nevertheless, a positive effect of treatments was detected, as treated groups presented a decrease in XO levels in PAH+GJ, PAH+TH and PAH+TH+GJ groups in relation to the PAH group (p<0.05) (Figure 2C). Besides that, the PAH group showed elevated HSP70 expression compared with the control group. However, the PAH+TH and PAH+TH+GJ groups showed a decrease in HSP70 expression in relation to the PAH group (p<0.05) (Figure 2D).

– Analysis of oxidative stress markers (A) TBARS, (B) ROS, (C) XO, e (D) HSP70. Data were expressed as mean and standard deviation (n=9-4/group). (*) Significant difference compared to the control group. (#) Significant difference in relation to the PAH group. Statistical analysis of (A) by Welch’s ANOVA with Games Holmes post-test and of (B), (C), (D) and (E) one-way ANOVA with the Tukey post-test (p<0.05). CTR: control; PAH: pulmonary arterial hypertension; PAH+GJ: pulmonary arterial hypertension plus grape juice; PAH+TH: pulmonary arterial hypertension plus thyroid hormones; PAH+TH+GJ: pulmonary arterial hypertension plus thyroid hormones plus grape juice.

Antioxidant response

When evaluating enzymatic antioxidants, SOD and CAT activity showed no differences between the groups (Figure 3A and B). SOD2 protein expression was decreased in the PAH and PAH+TH+GJ groups in relation to the control (p<0.05). Catalase expression was not different between the groups (Figure 3C and D). Considering the glutathione peroxidase (GPx) activity, PAH animals presented a decrease when compared to the control. However, the activity of this enzyme was increased in the PAH+GJ, PAH+TH and PAH+TH+GJ groups in relation to the control and PAH groups (p<0.05). Moreover, there was a decrease in the levels of sulfhydryl groups in the PAH groups in relation to the control, PAH+GJ, PAH+TH, and PAH+TH+GJ (p<0.05) (Figure 3E and F). Since NRF2 is capable of controlling the transcription of several antioxidant enzymes, the expression of this factor was evaluated. PAH+TH+GJ group showed increased NRF2 protein levels compared with the control group (p<0.05) (Figure 3G).

– Antioxidant response: (A) SOD activity, (B) CAT activity, (C) SOD2 protein expression, (D) CAT protein expression, (E) GPX activity, (F) Sulphydryl group, and (G) NRF2 protein expression. Data were expressed as mean and standard deviation (n=10-4/group). (*) Significant difference compared to the control group. (#) Significant difference in relation to the PAH group. Statistical analysis of (B), (C), and (E) by Welch’s ANOVA with Games Holmes post-test and of (A), (C), (D), (F) and (G) one-way ANOVA with Tukey post-test (p< 0.05). CTR: control; PAH: pulmonary arterial hypertension; PAH+GJ: pulmonary arterial hypertension plus grape juice; PAH+TH: pulmonary arterial hypertension plus thyroid hormones; PAH+TH+GJ: pulmonary arterial hypertension plus thyroid hormones plus grape juice.

Calcium handling proteins

In respect of p-phospholamban protein expression, a decrease was observed in a co-treated group compared to the control group (p<0.05) (Figure 4A). As for total phospholamban levels, there was an increase in the PAH+GJ group in relation to the control and PAH groups. On the other hand, this protein was decreased in PAH+TH and PAH+TH+GJ groups as compared to PAH+GJ group (p<0.05) (Figure 4B). Despite that, when the p-phospholamban/phospholamban ratio was evaluated, there was no significant change between groups (Figure 4C). Concerning SERCA expression, there was an increase in protein levels in the PAH group; however, the PAH+GJ, PAH+TH and PAH+TH+GJ groups showed diminished SERCA protein expression in relation to the PAH group (p<0.05). Regarding ryanodine receptor protein expression, there was a decrease in PAH+TH and PAH+TH+GJ groups in relation to the PAH and PAH+GJ groups (p<0.05) (Figure 4D and E). Concerning the SERCA/total phospholamban ratio, there was no difference between groups (Figure 4F).

– Calcium-handling protein. (A) P-phospholamban, (B) Total phospholamban, (C) P-phospholamban/Total phospholamban ratio, (D) SERCA, (E) Ryanodine receptor, and (F) SERCA/Total phospholamban ratio. Data were expressed as mean and standard deviation (n=4/group). (*) Significant difference compared to the control group. (#) Significant difference in relation to the PAH group. ($) Significant difference in relation to the PAH+GJ group. Statistical analysis of (A) by Kruskal-Wallis with Dunn’s post-test, of (B), (D) and (E) by one-way ANOVA with Tukey post-test and of (C) and (F) by Welch’s ANOVA with Games post-test Holmes (p<0.05). CTR: cControl; PAH: pulmonary arterial hypertension; PAH+GJ: pulmonary arterial hypertension plus grape juice; PAH+TH: pulmonary arterial hypertension plus thyroid hormones; PAH+TH+GJ: pulmonary arterial hypertension plus thyroid hormones plus grape juice.

Discussion

The present work is innovative, considering that, for the first time, it described the association between the protective effect of GJ on pulmonary vessels and the action of TH against RV adverse remodeling in a PAH model. In our experimental protocol, both GJ and TH improved functional parameters such as TAPSE, AT/ET and E/A ratios, as well as modulating the expression of calcium regulatory proteins. Regarding the oxidative stress, xanthine oxidase (XO), 70 kDa heat shock protein (HSP70), and NrF2 were responsive to both GJ and TH administration, which culminated in the restoration of redox homeostasis (Central Illustration).

HAP-induced RV hypertrophy, which corroborates other studies using the same experimental protocol.22 Although the RV hypertrophic response is an attempt to overcome the increase in cardiac afterload caused by pulmonary hypertension, its long-term consequences are harmful to cardiac function.23 This hypertrophy is associated with changes in AT/ET and E/A ratio, as well as TAPSE. The reduced AT represents a premature closure of the pulmonary valve due to hypertension. The PAH rats also exhibit an extension of ET, leading to a reduced AT/ET ratio in this group. TAPSE analysis, on the other hand, represents a way to assess RV contractility.24 PAH showed a reduction in TAPSE, indicating that RV decreased contractile function. Moreover, the E/A ratio showed a significant reduction in the PAH group, indicating a decrease in ventricle compliance and impaired diastolic function. Taken together, these echocardiographic data support that PAH leads to RV failure. The treatment of PAH with GJ and TH showed improvement in functional parameters since in the PAH+HT and PAH+GJ groups, the AT/ET ratio was not different from the control, meaning less resistance in the pulmonary vasculature. Ludke et al.25 also demonstrated that treatment for six weeks with GJ prevented PAH-induced AT/ET ratio changes.25,26 Regarding the TAPSE, both treatments, isolated or in combination, improved RV contractility. The inotropism improvement can be associated with changes in calcium handling protein expression. Our results showed, especially in the PAH+GJ+TH group, a normalization of calcium handling protein expression, exhibiting values closer to those found in the control group. This suggests that the combination of treatments seems to evidence a cardioprotective potential in PAH. The calcium-handling proteins were also redox-sensitive, indicating the critical role of ROS in the PAH model.

Mosele et al.27 and Castro et al.13 showed that the protection of the cardiovascular system by GJ and TH treatment, respectively, involved attenuation of oxidative stress. In our study, sulfhydryl levels decreased in PAH rats, indicating a reduction in the non-enzymatic antioxidant capacity of these animals. This context can be detrimental since PAH decreased SOD expression, reducing both non-enzymatic and enzymatic antioxidant protection. On the other hand, although reduced SOD levels were also diminished in the PAH+TH+GJ, TH plus GJ prevented the decrease in sulfhydryl levels and counter-regulated the antioxidant response to the PAH-imposed oxidative stress.

Anion superoxide radicals are converted to hydrogen peroxide, which can play an important role in many signaling pathways.28 Nevertheless, supraphysiological hydrogen peroxide levels may overcome antioxidant response and disrupt redox homeostasis.29 CAT and GPx are relevant to maintain adequate levels of this ROS. PAH reduced GPx activity, implying an inadequate antioxidant response. A similar profile was found by Dos Santos Lacerda et al.,30 in which PAH led to a reduction in GPx levels. Moreover, Sun et al.31 showed that patients with systemic sclerosis-associated PAH had reduced GPx. GJ and TH, isolated or combined, were effective in increasing GPx in our study. Corroborating this result, in a gestational experimental model, Proença et al. demonstrated that GJ treatment protected the heart of the fetus against oxidative stress through improvements in GPx.32 Bedê et al.33also observed antioxidant improvements and increased GPx levels after GJ administration in rats treated with a high-fat diet. These data are associated with TH and GJ treatment-induced increases in NrF2 levels in our study since NrF2 activation results in enhanced expression of antioxidant enzymes and triggers cytoprotective effects.34 Therefore, the NrF2 modulation can be suggested as a mechanism of action of GJ and TH in the cardioprotection.

The present study also evaluated XO expression, a protein related to ROS production, which was increased in the PAH group. As a source of ROS, a previous work described a molecular interaction between XO and TLR4 in neutrophil activation, inducing NF-kB translocation and promoting inflammation.35 Both GJ and TH treatments, isolated or combined, were effective in reducing XO expression. Corroborating this, Castro et al.13 observed a reduction in XO expression in TH-treated infarcted rats; this result was correlated with diminished MyD88 expression, which is a protein related to the inflammatory process.36

The disruption in the redox homeostasis triggers a stress response that involves the recruitment of chaperone proteins.37 Intracellularly, HSP70 plays a relevant role as a chaperone, promoting protein folding and refolding, as well as exhibiting an anti-inflammatory effect and attenuating cellular stress. In our study, we observed elevated HSP70 immunocontent in the PAH group. The increase in this protein expression can indicate a compensatory mechanism for cardiac damage induced by PAH. GJ and TH administration reduced HSP70 levels, indicating a cellular environment that was less oxidated.

Limitation of study

Histological evaluation of the RV to verify cardiomyocyte size and collagen deposition would be important in the study of cardiac remodeling induced by PAH. In this sense, we consider the absence of this evaluation in the experimental protocol as a limitation of the study. Furthermore, this report is still in the experimental protocol phase and requires further studies to understand the mechanisms related to the efficacy and safety of this therapeutic approach.

 Conclusion

Our study demonstrates, for the first time, that the GJ with TH treatment, isolated or combined, can improve RV functional and pulmonary vascular parameters of rats with PAH. This cardiovascular protection can be associated with calcium handling protein expression modulation, improving RV inotropism, and promotion of the reestablishment of cellular redox homeostasis. These results are relevant and open a perspective of new therapeutic strategies to mitigate the cardiovascular complications of PAH.

 Acknowledgments

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). The authors also thank the Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS, Ibravin (the Brazilian Wine Institute), Uva’só for providing the grape juice for the experiment, and FAPERGS - Fundação de Amparo à pesquisa do Estado do RS

Study association

This article is part of the thesis of doctoral submitted by Isabel Proença, from Programa de Pós-gradução em Ciências Biológicas: Fisiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Universidade Federal do Rio Grande do Sul under the protocol number 37372. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.

Sources of funding

This study was partially funded by CNPQ and FAPERGS.