Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC Gc4PKTMqyskSQfrbJCwpdRH S0066-782X2024000600303 00303 10.36660/abc.20230675 Artigo Original Efeito Protetor do RNA Não Codificante Longo OXCT1-AS1 na Apoptose de Células Miocárdicas Humanas Induzida pela Doxorrubicina pelo Padrão Competitivo de RNA Endógeno Chen Zhen 1 * Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados Análise estatística Obtenção de financiamento Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Liu Yijue 1 * Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Obtenção de financiamento Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Ma Rui 2 * Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Obtenção de financiamento Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Zhang Mengli 1 Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Wu Xian 1 Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Pen Huan 1 Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Gui Feng 1 Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Liu Yafeng 3 Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Obtenção de financiamento Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 0009-0007-2615-5181 Xia Hao 4 Obtenção de dados Hu Niandan 3 Obtenção de dados Ai Bo 3 Obtenção de dados Xiong Jun 3 Obtenção de dados Xia Hongxia 3 Obtenção de dados Li Wenqiang 3 Obtenção de dados Ai Fen 1 Obtenção de dados Análise estatística Análise e interpretação dos dados Obtenção de financiamento Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo Huazhong University of Science and Technology Tongji Medical College The Central Hospital of Wuhan Wuhan China Department of Emergency – The Central Hospital of Wuhan – Tongji Medical College – Huazhong University of Science and Technology, Wuhan – China Hubei University of Medicine Sinopharm Dongfeng General Hospital Department of Geriatric Medicine Shiyan China Department of Geriatric Medicine – Sinopharm Dongfeng General Hospital – Hubei University of Medicine, Shiyan – China Renmin Hospital of Wuhan University Department of Emergency Wuhan China Department of Emergency – Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan – China Renmin Hospital of Wuhan University Department of Cardiology Wuhan China Department of Cardiology – Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan – China Correspondência: Fen Ai e Yafeng Liu • The Central Hospital of Wuhan, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, No. 26 Shengli Street, Jiang'an District, Wuhan, Hubei – China (Fen Ai); Renmin Hospital of Wuhan University, No.238, Jiefang Road, No.99, Zhangzhidong Road (formerly Ziyang Road), Huanghelou Street, WuchangDistrict, Wuhan, Hubei – China (Yafeng Liu). E-mail:doctoraifen@outlook.com, tflyf1@hotmail.com

Editor responsável pela revisão: Marina Okoshi

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Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo.

 01 07 2024 2024 121 6 e20230675 07 10 2023 26 01 2024 11 03 2024 This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License

Resumo Fundamento:

O antibiótico quimioterápico antraciclina doxorrubicina (DOX) pode induzir cardiotoxicidade cumulativa e levar à disfunção cardíaca. RNAs não codificantes longos (lncRNAs) podem funcionar como importantes reguladores na lesão miocárdica induzida por DOX.

 Objetivo:

Este estudo tem como objetivo investigar o papel funcional e o mecanismo molecular do RNA antisense lncRNA OXCT1 1 (OXCT1-AS1) na lesão celular miocárdica induzida por DOX in vitro.

 Métodos:

Cardiomiócitos humanos (AC16) foram estimulados com DOX para induzir um modelo de lesão celular miocárdica. A expressão de OXCT1-AS1, miR-874-3p e BDH1 em células AC16 foi determinada por RT-qPCR. A viabilidade das células AC16 foi medida pelo ensaio XTT. A citometria de fluxo foi empregada para avaliar a apoptose de células AC16. Western blotting foi utilizado para avaliar os níveis proteicos de marcadores relacionados à apoptose. O ensaio repórter de luciferase dupla foi conduzido para verificar a capacidade de ligação entre miR-874-3p e OXCT1-AS1 e entre miR-874-3p e BDH1. O valor de p<0,05 indicou significância estatística.

 Resultados:

A expressão de OXCT1-AS1 foi diminuída em células AC16 tratadas com DOX. A superexpressão de OXCT1-AS1 reverteu a redução da viabilidade celular e a promoção da apoptose celular causada pela DOX. OXCT1-AS1 está ligado competitivamente ao miR-874-3p para regular positivamente o BDH1. A superexpressão de BDH1 restaurou a viabilidade das células AC16 e suprimiu a apoptose celular sob estimulação com DOX. A derrubada do BDH1 reverteu a atenuação da apoptose de células AC16 mediada por OXCT1-AS1 sob tratamento com DOX.

 Conclusão:

LncRNA OXCT1-AS1 protege células miocárdicas humanas AC16 da apoptose induzida por DOX através do eixo miR-874-3p/BDH1.

 Palavras-chave: RNA Doxorrubicina Miócitos Cardíacos Apoptose Natural Science Foundation of Hubei Province 2020CFB270 Introdução

A insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome clínica complexa caracterizada por disfunção sistólica e diastólica.1 É o resultado final da transformação de diversas doenças cardiovasculares e está associada a altas taxas de morbidade e mortalidade.2 A apoptose de cardiomiócitos causa a perda de cardiomiócitos e leva à baixa contratilidade miocárdica.3 Evidências crescentes indicam que a apoptose de cardiomiócitos atua como um fator chave no agravamento da IC, e a supressão do remodelamento ventricular causado pela apoptose de cardiomiócitos pode melhorar o prognóstico de pacientes com IC.4 Assim, uma melhor compreensão do mecanismo subjacente à apoptose de cardiomiócitos na IC pode ajudar a identificar novos alvos e desenvolver estratégias mais eficazes para o tratamento da IC.

A doxorrubicina (DOX) é um antibiótico quimioterápico antraciclina que tem sido utilizado como agente antitumoral em tumores sólidos e neoplasias hematológicas.5 Contudo, a aplicação clínica da DOX é limitada devido à sua cardiotoxicidade cumulativa, que pode levar a um espectro de efeitos cardiotóxicos de curto e longo prazo, incluindo disfunção ventricular esquerda, cardiomiopatia e até IC.6 A taxa de mortalidade aumenta significativamente para 50% dentro de dois anos após a terapia com DOX.7 Vários mecanismos foram propostos para a cardiotoxicidade induzida pela DOX, incluindo a apoptose de cardiomiócitos.8 Portanto, a DOX foi utilizada para induzir um modelo de cultura celular de lesão miocárdica em nosso estudo.

RNAs não codificantes longos (lncRNAs) são um grupo de transcritos com mais de duzentos nucleotídeos que não possuem capacidade de codificação de proteínas.9 Estudos demonstraram que os lncRNAs participam na regulação da cardiotoxicidade induzida pela DOX na IC. Por exemplo, lncRNA NONMMUT015745 suprime a apoptose de cardiomiócitos induzida por DOX via eixo Rab2A-p53.10 A regulação negativa do lncRNA SOX2-OT melhora a disfunção miocárdica na IC isquêmica.11 LncRNA KCNQ1OT1 contribui para a apoptose de cardiomiócitos ao direcionar o FUS na IC.12 É importante ressaltar que um estudo anterior mencionou que a perda de RNA antisense lncRNA OXCT1 1 (OXCT1-AS1) em tecido cardíaco de engenharia humana resulta na diminuição do desenvolvimento da força contrátil. No entanto, não está claro se o OXCT1-AS1 pode afetar a toxicidade miocárdica desencadeada pela DOX.13,14

Evidências acumuladas demonstraram que os lncRNAs podem funcionar como RNAs endógenos concorrentes (ceRNAs) para afetar a estabilidade e tradução do mensageiro (mRNA), interagindo competitivamente com os microRNAs compartilhados (miRNAs). Vários relatórios indicaram que OXCT1-AS1 pode funcionar como um ceRNA para regular positivamente a expressão de mRNA a jusante, afetando assim os comportamentos malignos das células tumorais.15,16 No entanto, as moléculas a jusante envolvidas nas redes de ceRNA mediadas por OXCT1-AS1 na IC permanecem obscuras. Aqui, ferramentas de bioinformática foram utilizadas para explorar as moléculas a jusante de OXCT1-AS1, com o objetivo de compreender seu mecanismo molecular em afetar a lesão celular miocárdica induzida por DOX.

Neste estudo, nosso objetivo foi investigar o papel funcional e o mecanismo molecular do lncRNA OXCT1-AS1 em um modelo de lesão celular miocárdica induzido por DOX. Nossa hipótese é que OXCT1-AS1 poderia afetar a apoptose de cardiomiócitos induzida por DOX, modulando moléculas a jusante através da rede ceRNA.

 Materiais e métodos Cultura celular e tratamento

Cardiomiócitos humanos AC16 foram obtidos da ATCC (Rockville, MD, EUA) e mantidos em meio Eagle modificado por Dulbecco (Gibco, Grand Island, NY, EUA) suplementado com 10% de soro bovino fetal (Gibco) e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco) em atmosfera umidificada a 37°C com 95% de ar e 5% de CO2. Para induzir um modelo de lesão celular miocárdica, as células AC16 foram tratadas com 5 μM de DOX (Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, China) por 24 horas.17 Em alguns experimentos, as células AC16 foram tratadas com 5 μM de DOX por diferentes períodos (0, 0,5, 2, 6, 12, 24 e 48 h) para detecção da expressão de RNA.

 Transfecção celular

Para ensaios de superexpressão, o cDNA completo de OXCT1-AS1 e BDH1 (3-hidroxibutirato desidrogenase 1) foi amplificado e clonado no vetor pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) para construir OE-OXCT1-AS1 e OE -BDH1, com um vetor vazio (EV) como controle negativo. RNA em gancho curto direcionado a BDH1 (sh-BDH1), inibidor de miR-874-3p e o controle negativo (inibidor de NC) (Invitrogen) foram usados para ensaios de knockdown. Ao atingir 80% de confluência em placas de 6 poços, as células AC16 foram transfectadas com os vectores ou oligonucleótidos acima utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Após 48 h de transfecção, as células AC16 foram submetidas a tratamento com DOX durante 24 h para subsequentes análises funcionais.

 Reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR)

O RNA total foi isolado de células AC16 tratadas utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen). O RNA foi então transcrito reversamente em cDNA usando o kit de reagentes PrimeScript RT (TaKaRa, Dalian, China). Para a detecção da expressão OXCT1-AS1, miR-874-3p e BDH1, o qPCR em tempo real foi conduzido usando o kit SYBR Green Quantitative RT-qPCR (Sigma-Aldrich, Shanghai, China) em um CFX96 Touch Real-Time PCR Detection Sistema (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). A expressão gênica relativa foi calculada usando o método 2-ΔΔCT, com normalização para GAPDH ou U6.18

 Ensaio XTT

Células AC16 foram semeadas em placas de 96 poços (1×105/poço), seguidas pelos tratamentos indicados. Em seguida, as células em cada poço foram incubadas com 10 μlde solução XTT (X2000, Solarbio, Pequim, China) por mais 4 horas a 37°C. A viabilidade celular foi determinada medindo o valor da densidade óptica a 450 nm utilizando um leitor de microplacas (Bio-Rad).

 Análise de citometria de fluxo

A apoptose celular foi avaliada por citometria de fluxo utilizando o Kit de Detecção de Apoptose Anexina V-FITC (C1062M, Beyotime) de acordo com os protocolos do fabricante. Após o tratamento com DOX, as células AC16 foram colhidas, lavadas com tampão fosfato salino e depois ressuspensas em 195 μl de tampão de ligação. Posteriormente, as células foram incubadas com Anexina V-FITC (5 μl) e PI (10 μl) no escuro à temperatura ambiente durante 15 min. A apoptose celular foi medida utilizando um citômetro de fluxo (FC500MCL, Beckman Coulter, Brea, CA, EUA).

 Western blotting

A proteína total foi extraída de células AC16 utilizando tampão de lise RIPA (Solarbio). Um kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico (Beyotime, Xangai, China) foi utilizado para quantificar a concentração de proteína. Em seguida, quantidades iguais de amostras de proteína (20 μg) foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio a 10% e transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (Beyotime). Após serem bloqueadas com leite desengordurado a 5%, as células foram incubadas a 4°C durante a noite com os seguintes anticorpos primários: anti-Bcl-2 (ab32124, 1:1000), anti-Bax (ab32503, 1:1000), anti-Cleaved caspase-3 (ab2302, 1:500), caspase-9 anti-clivada (ab2324, 1:500), anti-GAPDH (ab8245, 1:2500) (todos da Abcam, Xangai, China). Em seguida, as membranas foram lavadas três vezes com o tampão de lavagem (Beyotime), seguido de incubação com o anticorpo secundário de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (ab97080, 1: 5000, Abcam) à temperatura ambiente durante 1 h. Finalmente, as bandas proteicas foram visualizadas utilizando um reagente de quimiluminescência melhorado (BeyoECL Plus, Beyotime) e a intensidade relativa da banda foi analisada utilizando o software ImageJ.

 Ensaio de repórter de luciferase dupla

Locais de ligação putativos entre miR-874-3p e OXCT1-AS1, e entre miR-874-3p e BDH1 3’UTR foram previstos pelos bancos de dados ENCORI e TargetScan, respectivamente. As sequências de ligação previstas em OXCT1-AS1 e BDH1 3’UTR foram mutadas pelo QuickMutation™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Beyotime). Posteriormente, as sequências de tipo selvagem (WT) e mutante (MUT) de OXCT1-AS1 e BDH1 3’UTR foram clonadas no vetor pmirGLO (Promega, Madison, WI, EUA) para construir OXCTA-AS1-WT/MUT e BDH1 3’ UTR-WT/MUT. Em seguida, as células AC16 foram co-transfectadas com os plasmídeos repórteres acima juntamente com o inibidor miR-874-3p ou inibidor de NC usando Lipofectamine 2000. Após 48 h, um sistema de ensaio repórter de luciferase dupla (Promega) foi usado para avaliar a atividade da luciferase, com normalização para Renilla luciferase.19

 Análise estatística

O software SPSS 22.0 (IBM, Armonk, NY, EUA) foi utilizado para análise dos resultados experimentais. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes. O tamanho da amostra foi definido por conveniência. A distribuição normal dos dados foi avaliada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Todos os dados quantitativos deste estudo são apresentados como médias ± desvio padrão. As comparações entre os dois grupos foram realizadas por meio de t de Student. Quanto às comparações entre múltiplos grupos, foi aplicada análise de variância unidirecional seguida do teste de Tukey. O valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

 Resultados A superexpressão de OXCT1-AS1 inibe a apoptose de células miocárdicas humanas desencadeada por DOX

Células miocárdicas AC16 humanas foram estimuladas com DOX por 0,5, 2, 6, 12, 24 e 48 h. Comparado com o grupo controle, o nível de expressão de OXCT1-AS1 diminuiu de forma dependente do tempo após o tratamento com DOX (Figura 1A). Como mostrado pelo ensaio XTT, o tratamento com DOX prejudicou significativamente a viabilidade das células AC16, enquanto este efeito foi neutralizado pela superexpressão de OXCT1-AS1 (Figura 1B). Em seguida, avaliamos a apoptose celular via citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a DOX promoveu a apoptose de células AC16, enquanto a superexpressão de OXCT1-AS1 reduziu a apoptose de células AC16 sob estimulação com DOX (Figura 1C). Consistentemente, western blotting revelou que o tratamento com DOX levou a um aumento nos níveis de expressão de proteínas pró-apoptóticas, incluindo Bax, caspase-3 clivada e caspase-9 clivada e uma diminuição no nível de expressão da proteína anti-apoptótica Bcl- 2 em células AC16 (Figura 1D). No entanto, os efeitos acima causados pelo tratamento com DOX foram atenuados de forma proeminente pela superexpressão de OXCT1-AS1 (Figura 1D). Coletivamente, esses achados revelaram que a superexpressão de OXCT1-AS1 poderia atenuar a apoptose de células AC16 induzida por DOX in vitro.

A superexpressão de OXCT1-AS1 inibe a apoptose de células miocárdicas humanas desencadeada por DOX. A) Células AC16 foram tratadas com DOX por 0,5, 2, 6, 12, 24 e 48 h, e a expressão relativa de OXCT1-AS1 em células miocárdicas humanas AC16 foi medida por RT-qPCR. B) A viabilidade das células AC16 foi determinada pelo ensaio XTT. C) A citometria de fluxo foi realizada para detectar apoptose celular. D) Os níveis de proteína dos genes relacionados à apoptose foram analisados por western blotting. n=3.*p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001. DOX: doxorrubicina; EV: vetor vazio; OE: superexpressão. OXCT1-AS1 se liga ao miR-874-3p

Para determinar o mecanismo potencial pelo qual OXCT1-AS1 afetou a apoptose de células AC16 sob estimulação DOX, identificamos então três miRNAs candidatos a jusante de OXCT1-AS1 através do site ENCORI. Notavelmente, o tratamento com DOX aumentou de forma dependente do tempo a expressão de miR-874-3p em células AC16 (Figura 2A), mas não teve efeito significativo na expressão de miR-3186-3p e miR-132-5p (Figura 2B-C). Assim, o miR-874-3p foi selecionado para investigação adicional. De acordo com o RT-qPCR, a expressão do miR-874-3p foi significativamente suprimida pela superexpressão de OXCT1-AS1 (Figura 2D). O sítio de ligação do miR-874-3p no OXCT1-AS1 foi previsto pelo banco de dados ENCORI (Figura 2E). Em seguida, mutamos o sítio de ligação previsto em OXCT1-AS1 e realizamos o ensaio repórter da luciferase. Como demonstrado pelos resultados, a regulação negativa do miR-874-3p diminuiu acentuadamente a atividade da luciferase de OXCT1-AS1-WT, mas não teve efeito significativo sobre a de OXCT1-AS1-MUT em células AC16 (Figura 2F), confirmando que OXCT1-AS1 poderia se ligar ao miR-874-3p em células AC16.

OXCT1-AS1 liga-se ao miR-874-3p. A-C) Os níveis de expressão de possíveis miRNAs a jusante de OXCT1-AS1 em AC16 tratado com DOX foram examinados por RT-qPCR. D) A expressão de miR-874-3p foi mostrada por RT-qPCR após superexpressão de OXCT1-AS1. E) O sítio de ligação entre OXCT1-AS1 e miR-874-3p foi previsto pelo banco de dados ENCORI. F) O ensaio repórter da luciferase foi conduzido para verificar a capacidade de ligação entre miR-874-3p e OXCT1-AS1 em células AC16, n=3. *p< 0,05, **p< 0,01 vs. 0 h ou EV.DOX, doxorrubicina; EV: vetor vazio; OE: superexpressão; NC: controle negativo; WT: tipo largo; MUT: mutante. miR-874-3p tem como alvo BDH1

Para descobrir melhor o mecanismo de OXCT1-AS1 na lesão celular miocárdica induzida por DOX, pesquisamos os potenciais alvos a jusante do miR-874-3p usando o banco de dados TargetScan e selecionamos os dez principais genes. Detectamos então os níveis de expressão desses genes em células AC16 estimuladas com ou sem DOX. Como mostrado na Figura 3A, três dos dez genes (RGS4, BDH1, HEG1) foram significativamente expressos diferencialmente entre o grupo DOX e o grupo controle. Para confirmar ainda mais o gene alvo, foi realizado RT-qPCR para examinar os níveis de expressão de RGS4, BDH1 e HEG1 após a inibição do miR-874-3p. Em comparação com o grupo controle, apenas o BDH1 foi proeminentemente regulado positivamente no grupo depletado de miR-874-3p (Figura 3B). Além disso, a superexpressão de OXCT1-AS1 aumentou o nível de expressão de BDH1 (Figura 3C). O banco de dados TargetScan previu um potencial sítio de ligação do miR-874-3p na 3’UTR do BDH1 (Figura 3D). O ensaio repórter da luciferase foi conduzido para verificar a relação de ligação entre as duas moléculas. Em comparação com a do grupo inibidor de NC, a atividade da luciferase do BDH1 3’UTR-WT foi significativamente aumentada no grupo do inibidor miR-874-3p, mas permaneceu quase inalterada após a mutação (Figura 3E). Consequentemente, o miR-874-3p poderia ter como alvo o 3’UTR do BDH1.

miR-874-3p tem como alvo BDH1. A)Os níveis de expressão de dez mRNAs que possuem potenciais sítios de ligação ao miR-874-3p foram avaliados por RT-qPCR. (B) RT-qPCR foi realizado para avaliar a expressão de RGS4, BDH1 e HEG1 em células AC16 com ou sem inibição de miR-874-3p. (C) RT-qPCR mostrou o nível de expressão de BDH1 após superexpressão de OXCT1-AS1. (D) O sítio de ligação entre miR-874-3p e OXCT1-AS1 foi previsto pelo TargetScan. (E). O ensaio repórter da luciferase foi realizado para validar a relação de ligação entre miR-874-3p e BDH1 em células AC16. n=3.**p< 0,01, ***p< 0,001. DOX: doxorrubicina; EV: vetor vazio; OE: superexpressão; NC: controle negativo; WT: tipo largo; MUT: mutante. BDH1 suprime a apoptose de células miocárdicas humanas estimuladas por DOX

Para revelar o papel funcional do BDH1, superexpressamos o BDH1 em células AC16 tratadas com DOX. RT-qPCR demonstrou que a expressão de BDH1 foi significativamente regulada positivamente em células AC16 após transfecção de OE-BDH1 (Figura 4A). Como mostrado pelo ensaio XTT e citometria de fluxo, a superexpressão de BDH1 reverteu marcadamente o comprometimento da viabilidade celular AC16 induzido por DOX e a promoção da apoptose celular (Figura 4B-C). Além disso, em comparação com o grupo DOX + EV, o DOX + OE-BDH1 apresentou níveis significativamente diminuídos de Bax, caspase-3 clivada e caspase-9 clivada e níveis elevados de Bcl-2 (Figura 4D). Em conjunto, a superexpressão de BDH1 poderia aliviar a apoptose de células AC16 sob estimulação com DOX.

BDH1 suprime a apoptose de células miocárdicas humanas estimuladas por DOX. A) A expressão de BDH1 em células AC16 de diferentes grupos (controle, DOX, DOX-EV e DOX+OE-OXCT1-AS1) foi examinada por RT-qPCR. (B) A viabilidade das células AC16 após os tratamentos indicados foi detectada pelo ensaio XTT. (C) A apoptose das células AC16 em cada grupo foi examinada por citometria de fluxo. (D) Os efeitos da superexpressão de BDH1 nos níveis de proteína de genes relacionados à apoptose (Bax, caspase-3 clivada, caspase-9 clivada e Bcl-2) em células AC16 tratadas com DOX foram analisados por western blotting. n=3.*p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001. DOX: doxorrubicina; EV: vetor vazio; OE: superexpressão. Silenciamento de BDH1 resgata o efeito supressor de OXCT1-AS1 na apoptose de células AC16 sob estimulação DOX

Posteriormente, experimentos de resgate foram conduzidos para verificar o papel do eixo OXCT1-AS1/miR-874-3p/BDH1 na lesão celular miocárdica induzida por DOX. Células AC16 foram co-transfectadas com OE-OXCT1-AS1 mais sh-BDH1. Notavelmente, o knockdown de BDH1 reverteu significativamente o aumento da viabilidade celular AC16 mediado pela superexpressão de OXCT1-AS1 e a atenuação da apoptose celular, como demonstrado pelo ensaio XTT e análise de citometria de fluxo, respectivamente (Figura 5A-B). De acordo com western blotting, o knockdown de BDH1 resgatou os níveis de proteína regulados negativamente de Bax, caspase-3 clivada e caspase-9 clivada e os níveis regulados positivamente de Bcl-2 causados pela superexpressão de OXCT1-AS1 (Figura 5C). Portanto, esses dados revelaram que o OXCT1 poderia aliviar a apoptose de cardiomiócitos AC16 induzida por DOX, regulando positivamente o BDH1.

O silenciamento de BDH1 resgata o efeito supressor de OXCT1-AS1 na apoptose de células AC16 tratadas com DOX. Células AC16 foram transfectadas com EV, OE-OXCT1-AS1 ou OE-OXCT1-AS1 + sh-BDH1, seguido de estimulação com DOX. (A) A viabilidade das células AC16 foi avaliada pelo ensaio XTT. (B) A apoptose de células AC16 foi demonstrada por citometria de fluxo. (C) Western blotting foi utilizado para avaliar os níveis de proteína relacionados à apoptose em células AC16. n=3.*p< 0,05, **p< 0,01. DOX: doxorrubicina; EV: vetor vazio; OE: superexpressão; sh: RNA em gancho curto. Discussão

O presente estudo revelou que a superexpressão de OXCT1-AS1 poderia aumentar a viabilidade dos cardiomiócitos AC16 e suprimir a apoptose dos cardiomiócitos sob estimulação com DOX. Mecanisticamente, descobrimos que o OXCT1-AS1 interagiu competitivamente com o miR-874-3p para regular positivamente a expressão de BDH1 em células AC16. Além disso, o silenciamento do BDH1 poderia reverter os efeitos acima mediados pela superexpressão de OXCT1-AS1 em células AC16 estimuladas por DOX. O mecanismo investigado neste estudo foi mostrado na Figura Central.

A cardiotoxicidade induzida pela DOX é um problema clínico crítico no manejo de diferentes tipos de malignidades.20 As evidências sugerem que a DOX pode provocar apoptose maciça de cardiomiócitos e resultar em disfunção cardíaca grave, levando finalmente à IC.21 A inibição da apoptose de cardiomiócitos pode melhorar a disfunção cardíaca induzida por DOX.22 Recentemente, o papel dos lncRNAs nas doenças cardiovasculares tem sido relatado em numerosos estudos.23,24 Além disso, a desregulação dos lncRNAs contribui para a apoptose de cardiomiócitos induzida por DOX.10,25 Como mencionado acima, as evidências sugerem que o lncRNA OXCT1-AS1 está associado ao desenvolvimento da força contrátil no tecido cardíaco humano e pode servir como um regulador da sobrevivência dos cardiomiócitos.13 No entanto, o papel preciso e o mecanismo do OXCT1-AS1 na toxicidade miocárdica induzida pela DOX ainda não foram estudados. Consistente com evidências anteriores, nosso estudo revelou que o tratamento com DOX prejudicou a viabilidade das células AC16 e induziu a apoptose celular in vitro. Além disso, o tratamento com DOX regulou negativamente a expressão de OXCT1-AS1 em cardiomiócitos AC16. Evidências sugerem que o silenciamento de OXCT1-AS1 aumenta a apoptose de cardiomiócitos humanos e de camundongos.13 Da mesma forma, nosso estudo mostrou que a superexpressão de OXCT1-AS1 atenuou significativamente os efeitos acima causados pelo tratamento com DOX, indicando o papel cardioprotetor de OXCT1-AS1 na lesão miocárdica induzida por DOX.

Está bem estabelecido que os lncRNAs podem se ligar competitivamente aos miRNAs e subsequentemente liberar a degradação de mRNAs mediada por miRNAs, nomeadamente a teoria do ceRNA.26 Para determinar o mecanismo molecular de OXCT1-AS1 na regulação da lesão celular miocárdica induzida por DOX, investigamos os miRNAs e mRNAs a jusante através de análise de bioinformática e validação experimental. Como resultado, o OXCT1-AS1 poderia se ligar ao miR-874-3p para regular positivamente o BDH1. Relatórios anteriores demonstraram o envolvimento do miR-874-3p em múltiplas doenças. Por exemplo, o miR-874-3p pode suprimir a osteoporose visando a leptina.27 Wei et al. propuseram que o miR-874-3p facilita a apoptose de células da granulosa induzida por testosterona através da supressão da desacetilação de p53 mediada por HDAC1.28 No entanto, até onde sabemos, não há estudo sobre o papel do miR-874-3p na lesão miocárdica induzida por DOX. Aqui, nosso estudo revelou a regulação positiva do miR-874-3p em células AC16 estimuladas por DOX, indicando seu papel potencial na cardiotoxicidade desencadeada por DOX. Mais investigações são necessárias para elucidar os achados.

O BDH1 está localizado no cromossomo 3q29 e pertence à família de genes da desidrogenase/redutase de cadeia curta. Relatórios anteriores indicaram que o BDH1 atua como um regulador crítico em múltiplas doenças, como doença renal diabética, doença hepática gordurosa e câncer.29-31 É importante ressaltar que foi revelado que a superexpressão de BDH1 atenua a apoptose de cardiomiócitos32 de camundongos induzida por peróxido de hidrogênio. Consistentemente, nosso estudo mostrou que o BDH1 foi significativamente regulado negativamente em células AC16 tratadas com DOX, e a superexpressão de BDH1 suprimiu a apoptose de células AC16 induzida por DOX. Além disso, o knockdown de BDH1 reverteu a atenuação mediada por OXCT1-AS1 da apoptose de cardiomiócitos humanos sob estimulação com DOX, confirmando o efeito cardioprotetor do eixo OXCT1-AS1/miR-874-3p/BDH1.

Vale ressaltar que este estudo ainda apresenta algumas limitações. Primeiro, faltavam dados in vivo neste estudo. Em segundo lugar, considerando a complexidade dos mecanismos, os reguladores a montante ou as vias de sinalização a jusante do OXCT1-AS1 precisam ser explorados em estudos futuros. Além disso, investigações adicionais podem se beneficiar da exploração dos papéis de RGS4 e HEG1 que são desregulados após a estimulação com DOX.

 Conclusões

Em conclusão, o presente estudo demonstra pela primeira vez que OXCT1-AS1 pode proteger células miocárdicas AC16 humanas da apoptose induzida por DOX, regulando o eixo miR-874-3p/BDH1. Nossos achados podem fornecer novas ideias para a atenuação da lesão miocárdica desencadeada pela DOX e a prevenção da IC.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado por Natural Science Foundation of Hubei Province (2020CFB270).

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Aprovação ética e consentimento informado

Este artigo não contém estudos com humanos ou animais realizados por nenhum dos autores.

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E-mail:doctoraifen@outlook.com, tflyf1@hotmail.com

Potential conflict of interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

The authors contributed equally to this work

Editor responsible for the review: Marina Okoshi

Abstract Background:

The anthracycline chemotherapeutic antibiotic doxorubicin (DOX) can induce cumulative cardiotoxicity and lead to cardiac dysfunction. Long non-coding RNAs (lncRNAs) can function as important regulators in DOX-induced myocardial injury.

 Objective:

This study aims to investigate the functional role and molecular mechanism of lncRNA OXCT1 antisense RNA 1 (OXCT1-AS1) in DOX-induced myocardial cell injury in vitro.

 Methods:

Human cardiomyocytes (AC16) were stimulated with DOX to induce a myocardial cell injury model. OXCT1-AS1, miR-874-3p, and BDH1 expression in AC16 cells were determined by RT-qPCR. AC16 cell viability was measured by XTT assay. Flow cytometry was employed to assess the apoptosis of AC16 cells. Western blotting was used to evaluate protein levels of apoptosis-related markers. Dual-luciferase reporter assay was conducted to verify the binding ability between miR-874-3p and OXCT1-AS1 and between miR-874-3p and BDH1. The value of p<0.05 indicated statistical significance.

 Results:

OXCT1-AS1 expression was decreased in DOX-treated AC16 cells. Overexpression of OXCT1-AS1 reversed the reduction of cell viability and promotion of cell apoptosis caused by DOX. OXCT1-AS1 is competitively bound to miR-874-3p to upregulate BDH1. BDH1 overexpression restored AC16 cell viability and suppressed cell apoptosis under DOX stimulation. Knocking down BDH1 reversed OXCT1-AS1-mediated attenuation of AC16 cell apoptosis under DOX treatment.

 Conclusion:

LncRNA OXCT1-AS1 protects human myocardial cells AC16 from DOX-induced apoptosis via the miR-874-3p/BDH1 axis.

 Keywords: RNA Doxorubicin Cardiac Myocytes Apoptosis Natural Science Foundation of Hubei Province 2020CFB270 Introduction

Heart failure (HF) is a complex clinical syndrome characterized by systolic and diastolic dysfunction.1 It is the ultimate transformation result of various cardiovascular diseases and is associated with high morbidity and mortality rates.2 Cardiomyocyte apoptosis causes the loss of cardiomyocytes and leads to poor myocardial contractility.3 Mounting evidence has indicated that cardiomyocyte apoptosis acts as a key factor in the aggravation of HF, and suppression of ventricular remodeling caused by cardiomyocyte apoptosis can improve the prognosis of patients with HF.4 Thus, a better understanding of the underlying mechanism of cardiomyocyte apoptosis in HF may help to identify new targets and develop more effective strategies for HF treatment.

Doxorubicin (DOX) is an anthracycline chemotherapeutic antibiotic that has been used as an anti-tumor agent in solid tumors and hematologic neoplasia.5 However, the clinical application of DOX is limited due to its cumulative cardiotoxicity, which can lead to a spectrum of short- and long-term cardiotoxic effects, including left ventricular dysfunction, cardiomyopathy, and even HF.6 The mortality rate increases significantly to 50% within two years following DOX therapy.7 Several mechanisms have been proposed for DOX-induced cardiotoxicity, including cardiomyocyte apoptosis.8 Therefore, DOX was used to induce a cell culture model of myocardial injury in our study.

Long non-coding RNAs (lncRNAs) are a group of transcripts longer than two hundred nucleotides that have no protein-coding ability.9 Studies have shown that lncRNAs participate in regulating DOX-induced cardiotoxicity in HF. For example, lncRNA NONMMUT015745 suppresses DOX-induced cardiomyocyte apoptosis via Rab2A-p53 axis.10 Down-regulation of lncRNA SOX2-OT improves myocardial dysfunction in ischemic heart failure.11 LncRNA KCNQ1OT1 contributes to cardiomyocyte apoptosis by targeting FUS in HF.12 Importantly, a previous study has mentioned that loss of lncRNA OXCT1 antisense RNA 1 (OXCT1-AS1) in human-engineered heart tissue results in decreased contractile force development. However, it is unclear whether OXCT1-AS1 can affect DOX-triggered myocardial toxicity.13,14

Accumulating evidence has demonstrated that lncRNAs can function as competing endogenous RNAs (ceRNAs) to affect messenger (mRNA) stability and translation by competitively interacting with the shared microRNAs (miRNAs). Several reports have indicated that OXCT1-AS1 can work as a ceRNA to indirectly upregulate downstream mRNA expression, thereby affecting the malignant behaviors of tumor cells.15,16 However, the downstream molecules involved in OXCT1-AS1-mediated ceRNA networks in HF remain unclear. Herein, bioinformatics tools were used to explore the downstream molecules of OXCT1-AS1, aiming to understand its molecular mechanism in affecting DOX-induced myocardial cell injury.

In this study, we aimed to investigate the functional role and molecular mechanism of lncRNA OXCT1-AS1 in a myocardial cell injury model induced by DOX. We hypothesized that OXCT1-AS1 could affect DOX-induced cardiomyocyte apoptosis by modulating downstream molecules via the ceRNA network.

 Materials and methods Cell culture and treatment

Human AC16 cardiomyocytes were obtained from ATCC (Rockville, MD, USA) and maintained in Dulbecco's modified Eagle medium (Gibco, Grand Island, NY, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco) and 1% penicillin-streptomycin (Gibco) in a humidified atmosphere at 37°C with 95% air and 5% CO2. To induce a myocardial cell injury model, AC16 cells were treated with 5 μM DOX (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) for 24 h.17 In some experiments, AC16 cells were treated with 5 μM DOX for different periods (0, 0.5, 2, 6, 12, 24, and 48 h) for the detection of RNA expression.

 Cell transfection

For overexpression assays, the full-length cDNA of OXCT1-AS1 and BDH1 (3-hydroxybutyrate dehydrogenase 1) were amplified and cloned into the pcDNA3.1 vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) to construct OE-OXCT1-AS1 and OE-BDH1, with an empty vector (EV) as the negative control. Short hairpin RNA targeting BDH1 (sh-BDH1), miR-874-3p inhibitor, and the negative control (NC inhibitor) (Invitrogen) were used for knockdown assays. When reaching 80% confluence in 6-well plates, AC16 cells were transfected with the above vectors or oligonucleotides using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). After 48 h of transfection, AC16 cells were subjected to DOX treatment for 24 h for subsequent functional analyses.

 Reverse transcriptase-quantitative real time PCR (RT-qPCR)

Total RNA was isolated from treated AC16 cells using TRIzol reagent (Invitrogen). RNA was then reverse transcribed into cDNA using the PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa, Dalian, China). For the detection of OXCT1-AS1, miR-874-3p, and BDH1 expression, real-time qPCR was conducted using SYBR Green Quantitative RT-qPCR Kit (Sigma-Aldrich, Shanghai, China) on a CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). The relative gene expression was calculated using the 2-ΔΔCt method, with normalization to GAPDH or U6.18

 XTT assay

AC16 cells were seeded in 96-well plates (1×105/well), followed by indicated treatments. Then, cells in each well were incubated with 10 μl of XTT solution (X2000, Solarbio, Beijing, China) for an additional 4 h at 37°C. Cell viability was determined by measuring the optical density value at 450 nm using a microplate reader (Bio-Rad).

 Flow cytometry analysis

Cell apoptosis was evaluated by flow cytometry using Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (C1062M, Beyotime) as per the manufacturer's protocols. After DOX treatment, AC16 cells were harvested, washed with phosphate buffer saline, and then resuspended in 195 μl binding buffer. Afterward, cells were incubated with Annexin V-FITC (5 μl) and PI (10 μl) in the dark at room temperature for 15 min. Cell apoptosis was measured using a flow cytometer (FC500MCL, Beckman Coulter, Brea, CA, USA).

 Western blotting

Total protein was extracted from AC16 cells using RIPA lysis buffer (Solarbio). A bicinchoninic acid protein assay kit (Beyotime, Shanghai, China) was used to quantify the protein concentration. Then, equal amounts of protein samples (20 μg) were separated by 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred onto polyvinylidene fluoride membranes (Beyotime). After being blocked with 5% defatted milk, cells were incubated at 4°C overnight with the following primary antibodies: anti-Bcl-2 (ab32124, 1:1000), anti-Bax (ab32503, 1:1000), anti-Cleaved caspase-3 (ab2302, 1:500), anti-Cleaved caspase-9 (ab2324, 1:500), anti-GAPDH (ab8245, 1:2500) (all from Abcam, Shanghai, China). Then, the membranes were washed three times with the wash buffer (Beyotime), followed by incubation with the horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody (ab97080, 1:5000, Abcam) at room temperature for 1h. Finally, protein bands were visualized using an enhanced chemiluminescence reagent (BeyoECL Plus, Beyotime) and relative band intensity was analyzed using ImageJ software.

 Dual-luciferase reporter assay

Putative binding sites between miR-874-3p and OXCT1-AS1, and between miR-874-3p and BDH1 3’UTR were predicted by ENCORI and TargetScan databases, respectively. The predicted binding sequences on OXCT1-AS1 and BDH1 3’UTR were mutated by QuickMutation™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Beyotime). Subsequently, the wild type (WT) and mutant (MUT) sequences of OXCT1-AS1 and BDH1 3’UTR were cloned into pmirGLO vector (Promega, Madison, WI, USA) to construct OXCTA-AS1-WT/MUT and BDH1 3’UTR-WT/MUT. Then, AC16 cells were co-transfected with the above reporter plasmids together with miR-874-3p inhibitor or NC inhibitor using Lipofectamine 2000. After 48h, a dual-luciferase reporter assay system (Promega) was used to assess the luciferase activity, with normalization to Renilla luciferase.19

 Statistical analysis

SPSS 22.0 software (IBM, Armonk, NY, USA) was used for analyzing the experimental results. Each experiment was repeated at least three times. The sample size was defined by convenience. Normal distribution of data was assessed with Kolmogorov-Smirnov test. All quantitative data in this study are presented as means ± standard deviation. Comparisons between the two groups were performed using paired Student's t-tests. As for the comparisons among multiple groups, a one-way analysis of variance followed by Tukey's test was applied. The value of p < 0.05 was considered statistically significant.

 Results Overexpression of OXCT1-AS1 inhibits DOX-triggered apoptosis of human myocardial cells

Human AC16 myocardial cells were stimulated with DOX for 0.5, 2, 6, 12, 24, and 48 h. Compared with that in the control group, the expression level of OXCT1-AS1 was time-dependently decreased after DOX treatment (Figure 1A). As shown by the XTT assay, DOX treatment significantly impaired the viability of AC16 cells, while this effect was counteracted by OXCT1-AS1 overexpression (Figure 1B). We next assessed cell apoptosis via flow cytometry. The results showed that DOX promoted AC16 cell apoptosis, whereas OXCT1-AS1 overexpression reduced the apoptosis of AC16 cells under DOX stimulation (Figure 1C). Consistently, western blotting revealed that DOX treatment led to an increase in the expression levels of pro-apoptotic proteins, including Bax, Cleaved caspase-3, and Cleaved caspase-9 and a decrease in the expression level of the anti-apoptotic protein Bcl-2 in AC16 cells (Figure 1D). However, the above effects caused by DOX treatment were prominently abated by overexpression of OXCT1-AS1 (Figure 1D). Collectively, these findings revealed that overexpression of OXCT1-AS1 could attenuate DOX-induced apoptosis of AC16 cells in vitro.

Overexpression of OXCT1-AS1 inhibits DOX-triggered apoptosis of human myocardial cells. A) AC16 cells were treated with DOX for 0.5, 2, 6, 12, 24, and 48 h, and relative expression of OXCT1-AS1 in human myocardial cells AC16 was measured by RT-qPCR. B) The viability of AC16 cells was determined by XTT assay. C) Flow cytometry was conducted to detect cell apoptosis. D) Protein levels of apoptosis-related genes were analyzed by western blotting. n=3. *p< 0.05, **p< 0.01, ***p< 0.001. DOX: doxorubicin; EV: empty vector; OE: overexpression. OXCT1-AS1 binds to miR-874-3p

To determine the potential mechanism by which OXCT1-AS1 affected AC16 cell apoptosis under DOX stimulation, we then identified three candidate downstream miRNAs of OXCT1-AS1 via the ENCORI website. Notably, DOX treatment time-dependently increased miR-874-3p expression in AC16 cells (Figure 2A) but had no significant effect on the expression of miR-3186-3p and miR-132-5p (Figure 2B-C). Thus, miR-874-3p was selected for further investigation. According to RT-qPCR, miR-874-3p expression was significantly suppressed by overexpression of OXCT1-AS1 (Figure 2D). The binding site of miR-874-3p on OXCT1-AS1 was predicted by the ENCORI database (Figure 2E). Then, we mutated the predicted binding site on OXCT1-AS1 and performed the luciferase reporter assay. As demonstrated by the results, downregulating miR-874-3p markedly increased the luciferase activity of OXCT1-AS1-WT but had no significant effect on that of OXCT1-AS1-MUT in AC16 cells (Figure 2F), confirming that OXCT1-AS1 could bind to miR-874-3p in AC16 cells.

OXCT1-AS1 binds to miR-874-3p. A-C) Expression levels of possible downstream miRNAs of OXCT1-AS1 in DOX-treated AC16 were examined by RT-qPCR. D) miR-874-3p expression was shown by RT-qPCR after overexpressing OXCT1-AS1. E) The binding site between OXCT1-AS1 and miR-874-3p was predicted by the ENCORI database. F) Luciferase reporter assay was conducted to verify the binding ability between miR-874-3p and OXCT1-AS1 in AC16 cells. n=3. *p< 0.05, **p< 0.01 vs. 0 h or EV. DOX, doxorubicin; EV, empty vector; OE, overexpression; NC, negative control; WT, wide type; MUT, mutant. miR-874-3p targets BDH1

To further figure out the mechanism of OXCT1-AS1 in DOX-induced myocardial cell injury, we searched the potential downstream targets of miR-874-3p using the TargetScan database and selected the top ten genes. We then detected the expression levels of these genes in AC16 cells stimulated with or without DOX. As shown in Figure 3A, three of the ten genes (RGS4, BDH1, HEG1) were significantly differentially expressed between the DOX group and the control group. To further confirm the target gene, RT-qPCR was conducted to examine the expression levels of RGS4, BDH1, and HEG1 after miR-874-3p inhibition. In comparison to the control group, only BDH1 was prominently upregulated in the miR-874-3p-depleted group (Figure 3B). Furthermore, overexpression of OXCT1-AS1 enhanced the expression level of BDH1 (Figure 3C). TargetScan database predicted a potential binding site of miR-874-3p on the 3’UTR of BDH1 (Figure 3D). Luciferase reporter assay was conducted to verify the binding relation between the two molecules. Compared with that in the NC inhibitor group, the luciferase activity of BDH1 3’UTR-WT was significantly increased in the miR-874-3p inhibitor group but was almost unchanged after mutation (Figure 3E). Accordingly, miR-874-3p could target the 3’UTR of BDH1.

miR-874-3p targets BDH1. A) The expression levels of ten mRNAs that have potential binding sites to miR-874-3p were evaluated by RT-qPCR. (B) RT-qPCR was performed to evaluate the expression of RGS4, BDH1, and HEG1 in AC16 cells with or without miR-874-3p inhibition. (C) RT-qPCR showed the expression level of BDH1 after OXCT1-AS1 overexpression. (D) The binding site between miR-874-3p and OXCT1-AS1 was predicted by TargetScan. (E). Luciferase reporter assay was performed to validate the binding relation between miR-874-3p and BDH1 in AC16 cells. n=3. **p< 0.01, ***p< 0.001. DOX, doxorubicin; EV, empty vector; OE, overexpression; NC, negative control. WT, wide type; MUT, mutant. BDH1 suppresses the apoptosis of DOX-stimulated human myocardial cells

To reveal the functional role of BDH1, we overexpressed BDH1 in DOX-treated AC16 cells. RT-qPCR demonstrated that BDH1 expression was significantly upregulated in AC16 cells after transfection of OE-BDH1 (Figure 4A). As shown by XTT assay and flow cytometry, overexpressing BDH1 markedly reversed DOX-induced impairment of AC16 cell viability and promotion of cell apoptosis (Figure 4B-4C). Moreover, in comparison to the DOX + EV group, the DOX + OE-BDH1 displayed significantly decreased levels of Bax, Cleaved caspase-3, and Cleaved caspase-9 and elevated levels of Bcl-2 (Figure 4D). Taken together, overexpressing BDH1 could alleviate the apoptosis of AC16 cells under DOX stimulation.

BDH1 suppresses the apoptosis of DOX-stimulated human myocardial cells. A) BDH1 expression in AC16 cells of different groups (control, DOX, DOX-EV, and DOX+OE-OXCT1-AS1) was examined by RT-qPCR. B) The viability of AC16 cells after indicated treatments was detected by XTT assay. C) The apoptosis of AC16 cells in each group was examined by flow cytometry. D) Effects of BDH1 overexpression on the protein levels of apoptosis-related genes (Bax, Cleaved caspase-3, Cleaved caspase-9, and Bcl-2) in DOX-treated AC16 cells were analyzed by western blotting. n=3. *p< 0.05, **p< 0.01, ***p< 0.001. DOX, doxorubicin; EV, empty vector; OE, overexpression. Silencing of BDH1 rescues the suppressive effect of OXCT1-AS1 on AC16 cell apoptosis under DOX stimulation

Subsequently, rescue experiments were conducted to verify the role of OXCT1-AS1/miR-874-3p/BDH1 axis in DOX-induced myocardial cell injury. AC16 cells were co-transfected with OE-OXCT1-AS1 plus sh-BDH1. Notably, BDH1 knockdown significantly reversed OXCT1-AS1 overexpression-mediated enhancement of AC16 cell viability and attenuation of cell apoptosis, as demonstrated by XTT assay and flow cytometry analysis, respectively (Figure 5A-5B). According to western blotting, BDH1 knockdown rescued the downregulated protein levels of Bax, Cleaved caspase-3, and Cleaved caspase-9 and the upregulated levels of Bcl-2 caused by OXCT1-AS1 overexpression (Figure 5C). Therefore, these data revealed that OXCT1 could alleviate DOX-induced apoptosis of AC16 cardiomyocytes by upregulating BDH1.

Silencing of BDH1 rescues the suppressive effect of OXCT1-AS1 on the apoptosis of DOX-treated AC16 cells. AC16 cells were transfected with EV, OE-OXCT1-AS1, or OE-OXCT1-AS1 + sh-BDH1, followed by DOX stimulation. A) The viability of AC16 cells was evaluated by XTT assay. B) AC16 cells apoptosis was shown by flow cytometry. C) Western blotting was used to assess apoptosis-related protein levels in AC16 cells. n=3. *p< 0.05, **p< 0.01. DOX, doxorubicin; EV: empty vector; OE: overexpression; sh: short hairpin RNA. Discussion

The present study revealed that overexpressing OXCT1-AS1 could enhance AC16 cardiomyocyte viability and suppress cardiomyocyte apoptosis under DOX stimulation. Mechanistically, we found that OXCT1-AS1 competitively interacted with miR-874-3p to upregulate BDH1 expression in AC16 cells. Moreover, silencing of BDH1 could reverse the above effects mediated by OXCT1-AS1 overexpression on DOX-stimulated AC16 cells. The mechanism investigated in this study was shown in the Central Illustration.

DOX-induced cardiotoxicity is a critical clinical issue in managing different types of malignancies.20 Evidence suggests that DOX can elicit massive cardiomyocyte apoptosis and result in severe cardiac dysfunction, ultimately leading to HF.21 Inhibition of cardiomyocyte apoptosis can ameliorate DOX-induced cardiac dysfunction.22 Recently, the role of lncRNAs in cardiovascular diseases has been reported in numerous studies.23,24 Furthermore, dysregulation of lncRNAs contributes to DOX-induced cardiomyocyte apoptosis.10,25 As mentioned above, evidence suggests that lncRNA OXCT1-AS1 is associated with contractile force development in human heart tissue and may serve as a regulator of cardiomyocyte survival.13 However, the precise role and mechanism of OXCT1-AS1 in DOX-induced myocardial toxicity have not been studied yet. Consistent with previous evidence, our study revealed that DOX treatment impaired AC16 cell viability and induced cell apoptosis in vitro. Moreover, DOX treatment time-dependently downregulated OXCT1-AS1 expression in AC16 cardiomyocytes. Evidence suggests that silencing of OXCT1-AS1 enhances human and mouse cardiomyocyte apoptosis.13 Similarly, our study depicted that overexpressing OXCT1-AS1 significantly attenuated the above effects caused by DOX treatment, indicating the cardioprotective role of OXCT1-AS1 in DOX-induced myocardial injury.

It is well-established that lncRNAs can bind competitively to miRNAs and subsequently liberate the degradation of mRNAs mediated by miRNAs, namely ceRNA theory.26 To determine the molecular mechanism of OXCT1-AS1 in regulating DOX-induced myocardial cell injury, we investigated the downstream miRNAs and mRNAs via bioinformatics analysis and experimental validation. As a result, OXCT1-AS1 could bind to miR-874-3p to upregulate BDH1. Previous reports have demonstrated the involvement of miR-874-3p in multiple diseases. For example, miR-874-3pcan suppress osteoporosis by targeting leptin.27 Wei et al. proposed that miR-874-3p facilitates testosterone-induced apoptosis of granulosa cells via the suppression of HDAC1-mediated p53 deacetylation.28 However, to our knowledge, there is no study on the role of miR-874-3p in DOX-induced myocardial injury. Here, our study revealed the upregulation of miR-874-3p in DOX-stimulated AC16 cells, indicating its potential role in DOX-triggered cardiotoxicity. Further investigations are needed to elucidate the findings.

BDH1 is located at chromosome 3q29 and belongs to the short-chain dehydrogenase/reductase gene family. Previous reports have indicated that BDH1 acts as a critical regulator in multiple diseases, such as diabetic kidney disease, fatty liver disease, and cancer.29-31 Importantly, it has been revealed that BDH1 overexpression attenuates hydrogen peroxide-induced apoptosis of mouse cardiomyocytes.32 Consistently, our study depicted that BDH1 was significantly downregulated in DOX-treated AC16 cells, and overexpressing BDH1 suppressed DOX-induced AC16 cell apoptosis. In addition, BDH1 knockdown reversed OXCT1-AS1-mediated attenuation of human cardiomyocyte apoptosis under DOX stimulation, confirming the cardioprotective effect of the OXCT1-AS1/miR-874-3p/BDH1 axis.

It is worth noting that this study still has some limitations. First, in vivo data were lacking in this study. Secondly, considering the complexity of mechanisms, the upstream regulators or downstream signaling pathways of OXCT1-AS1 need to be explored in future studies. In addition, further investigations may benefit from exploring the roles of RGS4 and HEG1 which are dysregulated after DOX stimulation.

 Conclusions

In conclusion, the present study demonstrates for the first time that OXCT1-AS1 can protect human AC16 myocardial cells from DOX-induced apoptosis by regulating the miR-874-3p/BDH1 axis. Our findings may provide new ideas for the attenuation of DOX-triggered myocardial injury and the prevention of HF.

Sources of funding

This study was partially funded by Natural Science Foundation of Hubei Province (2020CFB270).

Study association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Ethics approval and consent to participate

This article does not contain any studies with human participants or animals performed by any of the authors.