Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC gTkBkf7JXSzZ8rWv4BDNHDB S0066-782X2024000600305 00305 10.36660/abc.20230588 Artigo Original Contagem Absoluta de Linfócitos: um Preditor de PCR Sérica Positiva para o Trypanosoma cruzi em Pacientes com Chagas Submetidos ao Transplante Cardíaco 0000-0001-7545-2683 Wolf Plínio José Whitaker Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Finger Marco Aurelio Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Rossi João Manoel Neto Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito 1 Santos Carolina Casadei Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo 1 Mattos Victor Bemfica de Mello Obtenção de dados Redação do manuscrito 1 Rossi Raphael Obtenção de dados Redação do manuscrito 1 0000-0002-5836-3379 Damiani Lucas Petri Análise e interpretação dos dados Análise estatística 1 2 Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia São Paulo SP Brasil Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia, São Paulo, SP – Brasil Hospital Israelita Albert Einstein São Paulo SP Brasil Hospital Israelita Albert Einstein – ARO, São Paulo, SP – Brasil Correspondência: Plínio José Whitaker Wolf • Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia – Miocárdio - Av. Doutor Dante Pazzanese, 500. CEP 04012-909, São Paulo, SP - Brasil E-mail: Pjwwolf@hotmail.com

Editor responsável pela revisão: Gláucia Maria Moraes de Oliveira

Não há conflito com o presente artigo

 15 07 2024 06 2024 121 6 e20230588 17 08 2023 28 01 2024 13 03 2024 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

: Contagem Absoluta de Linfócitos: um Preditor de PCR Sérica Positiva para o Trypanosoma cruzi em Pacientes com Chagas Submetidos ao Transplante Cardíaco HR: razão de riscos; IC: intervalo de confiança; PCR: reação em cadeia da polimerase; TxC: transplante cardíaco.

Resumo Fundamento

É desconhecido se a linfopenia é fator de risco para a reativação da doença de Chagas no transplante cardíaco (TxC), como recentemente descrito na reativação de citomegalovírus em pacientes transplantados.

 Objetivo

Avaliar se a linfopenia no perioperatório do TxC está relacionada à parasitemia precoce pelo Trypanosoma cruzi.

 Métodos

Amostra analisada (janeiro de 2014 a janeiro de 2023) em estudo observacional e retrospectivo. A parasitemia foi avaliada nos primeiros 3 meses após o TxC por meio da reação em cadeia da polimerase sérica (PCR) e comparada com a contagem total de linfócitos no perioperatório do TxC por curvas ROC. Comparadas características de base com a PCR Chagas por modelos de risco proporcionais de Cox independentes. Nível de significância adotado de 5%.

 Resultados

Amostra (n = 35) apresentou idade média de 52,5 ± 8,1 anos e PCR Chagas positiva em 22 pacientes (62,8%). As médias dos menores valores de linfócitos nos primeiros 14 dias do TxC foram 398 ± 189 e 755 ± 303 células/mm3 em pacientes com e sem parasitemia nos 3 meses após o TxC, respectivamente (área sob a curva = 0,857; intervalo de confiança de 95%: 0,996 a 0,718, sensibilidade e especificidade de 83,3% e 86,4%). Determinado valor de corte inferior a 550 linfócitos/mm3 como fator de risco para presença de parasitemia. Pacientes com linfócitos < 550 unidades/mm3 nos primeiros 14 dias do pós-TxC apresentaram PCR positiva em 80% dos casos. Para cada aumento de 100 linfócitos/mm3, o risco de positividade da PCR é reduzido em 26% (razão de riscos = 0,74; intervalo de confiança de 95%: 0,59 a 0,93, p = 0,009).

 Conclusão

Houve associação entre a linfopenia no perioperatório do TxC com a parasitemia precoce pelo T. cruzi detectada por PCR.

 Palavras-chave Transplante de Coração Doença de Chagas Linfopenia Terapia de Imunossupressão Introdução

A doença de Chagas (DC) afeta, aproximadamente, 1,9 a 4,6 milhões de indivíduos no Brasil (1% a 2,4% da população),1 levando em consideração a elevada prevalência e incidência anual de insuficiência cardíaca,2 envolvendo, inclusive, países desenvolvidos, devido à atual globalização e consequente emigração de povos latino-americanos.3,4 A doença é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e transmitida pelos insetos da família Triatominae (pela inoculação de suas fezes infectadas após sua picada, ou por via oral, através da ingestão acidental do inseto e/ou suas fezes), podendo ser também transmitida por vias vertical, transfusional, pelo transplante de órgãos contaminados ou acidentes com materiais biológicos. A DC, em sua forma crônica, pode acometer órgãos específicos em 30% a 40% dos infectados, expressando-se nas formas cardíacas, digestivas ou mistas,5 sendo a forma cardíaca a mais comum, manifestada por sintomas de insuficiência cardíaca, angina, tromboembolismo, arritmias ou mesmo morte súbita.4 Em pacientes de alto risco (segundo escore de RASSI), o prognóstico é desfavorável, podendo alcançar uma mortalidade de 84% em 10 anos.6

Em casos de miocardiopatia chagásica refratária, o transplante cardíaco (TxC) é uma importante opção terapêutica (terceira principal causa de TxC no Brasil), uma vez que o prognóstico desses pacientes, após o transplante, é favorável, por serem doentes jovens, com poucas comorbidades e baixas taxas de hipertensão pulmonar, doença vascular de enxerto e reoperação.3,7

A imunossupressão, por sua vez, apesar de ser imprescindível para redução da rejeição e, consequentemente, para o aumento da sobrevida após o TxC, pode levar a importantes complicações, como a reativação da doença de Chagas (RDC).3,7

Descrita inicialmente em pacientes com neoplasias hematológicas em 1980 e, posteriormente, em portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) em 1990,8,9 a RDC ocorre em 26,4% a 40% dos transplantados por miocardiopatia chagásica,9 podendo chegar a 61%, conforme Gray et al. demonstraram.10 A condução adequada diante da RDC é essencial, devido à elevada morbimortalidade quando não tratada adequadamente. Contudo, quando é realizado o diagnóstico precoce e o tratamento correto é empregado (benzonidazol como primeira linha), a mortalidade encontrada é inferior a 1%.3,7,9

A RDC apresenta manifestações cardíacas e extracardíacas, sendo a miocardite, sintomática ou não, a mais comum.3,4 O diagnóstico se baseia na clínica associada à evidência do parasita nos tecidos, por métodos parasitológicos (pesquisa direta do T. cruzi), histológicos em biópsias endomiocárdicas (BEM) ou pelo teste de reação em cadeia de polimerase (PCR) no sangue (ou no material da biópsia),3,7,9 método este não invasivo, com alta precocidade diagnóstica e acurácia.11,12

Devido à alta prevalência e ao prognóstico desfavorável, a determinação de fatores de risco para a RDC é essencial. De forma semelhante ao Chagas, a reativação do citomegalovírus (CMV), infecção comum no transplante cardíaco relacionada à imunossupressão, tem a linfopenia como importante fator de risco no pós-transplante, conforme evidenciado em estudos recentes.13-16 Apesar de a resposta imunológica da DC, assim como no CMV, também ser intimamente dependente dos linfócitos,7,17 não há estudos que avaliaram a linfopenia como fator de risco para a RDC até a presente análise, cujo objetivo é avaliar a relação entre a contagem absoluta de linfócitos no perioperatório do TxC e a detecção sérica precoce do T. cruzi por PCR, auxiliando no diagnóstico, rastreio e tratamento precoces da RDC.

 Métodos

Trata-se de um estudo observacional, retrospectivo, unicêntrico, realizado pela coleta e análise de dados de prontuário físico/eletrônico dos pacientes com cardiopatia chagásica refratária e que foram submetidos ao TxC no Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia (IDPC).

Seleção da amostra

Os pacientes selecionados para a amostra foram aqueles com insuficiência cardíaca avançada refratária (confirmada durante a avaliação prévia do TxC), secundária à cardiopatia chagásica (diagnosticada por dois testes sorológicos com métodos diferentes), que tinham indicação e que foram submetidos ao TxC no IDPC, no período de janeiro de 2014 a janeiro de 2023.

Foram selecionados pacientes que apresentaram sobrevida de pelo menos 30 dias do pós-operatório de TxC, sendo excluídos os indivíduos que vieram a óbito antes desse período.

De janeiro de 2014 a janeiro de 2023, foram realizados 128 TxC, dos quais 40 eram portadores da DC, confirmados por dois métodos diferentes. Dentre eles, 5 foram a óbito antes de 30 dias (nenhum óbito relacionado à RDC), resultando em uma amostra total de 35 pacientes, cuja PCR qualitativa para Chagas foi realizada, avaliando se houve detecção sérica do T. cruzi após o TxC (Figura 1).

– Seleção da amostra do estudo. PCR: reação em cadeia da polimerase; TxC: transplante cardíaco.

Definições e seleção de dados

A detecção sérica da parasitemia pelo T. cruzi, neste estudo, se deu por meio da PCR Chagas, analisada no Instituto Adolfo Lutz, a partir da amostra de sangue periférico, de forma qualitativa convencional, detectando DNA do Trypanosoma cruzi por meio da amplificação específica de um fragmento de 330 pb correspondente à região variável do minicírculo do kDNA. Foi avaliada, neste estudo, a positividade da PCR Chagas até o terceiro mês do TxC (período inicial do TxC, marcado por intensa imunossupressão e, portanto, maior incidência de RDC, conforme demonstraram Diez et al. com tempo médio de RDC avaliado em 71 dias).12 A frequência de solicitação da PCR Chagas seguiu o protocolo do serviço e, neste período estudado (primeiros 3 meses após TxC), foi solicitada pelo menos uma coleta até o primeiro mês e outra até o terceiro mês ou a qualquer momento na suspeita de RDC (alterações elétricas, ecocardiográficas ou clínicas sugestivas da reativação). Não existe um protocolo universal recomendado para solicitação de PCR e, por isso, os protocolos devem ser adequados às características e disponibilidades de cada serviço.3

A contagem absoluta de linfócitos foi avaliada pelo hemograma completo de sangue periférico (método citoquímico/isovolumétrico) do laboratório Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa (AFIP), imediatamente antes do TxC (D0) e nos seguintes momentos do pós-operatório (PO): três dias, sete dias, dez dias, quatorze, trinta e noventa dias (D3, D7, D10, D14, D30 e D90, respectivamente). Os intervalos D0 e D7 foram baseados em estudos prévios que avaliaram a linfopenia na reativação do CMV,14,16 e os demais intervalos foram selecionados por opção dos autores. A disponibilidade desses dados foi possível devido à rotina do serviço, em que ocorre a solicitação de exames laboratoriais durante todo o perioperatório do TxC (e, após, nos retornos ambulatoriais), incluindo o hemograma completo, no pré-operatório e, diariamente, no PO de tal forma que todos os pacientes apresentaram adequadamente a dosagem de linfócitos nesses períodos. Diante de ampla disponibilidade de dados disponíveis em relação à contagem de linfócitos, o valor dos linfócitos coletado e utilizado no estudo foi exatamente o dos dias determinados: D0, D3, D7, D10, D14, D30 e D90.

Foi realizada a média dos menores valores de linfócitos totais encontrados nos primeiros quatorze dias do TxC e analisada de acordo com a reatividade da PCR Chagas. Utilizou-se o menor valor dos linfócitos para avaliar a hipótese de que a linfopenia possa estar associada à detecção sérica do T. cruzi e à RDC.

Evidente que, como sabidamente se espera na pluralidade dos TxC precoces, a maioria dos pacientes incluídos sofreu alguma mudança no esquema imunossupressor (dose e tipo) durante o seguimento, alterado em casos de rejeição, infecção ou efeitos adversos (lesão renal aguda, por exemplo), mas o estudo não avaliou a variação da imunossupressão e seu possível impacto na contagem de linfócitos. Assim, a terapia imunossupressora foi avaliada em torno do terceiro mês do pós-transplante, quando o tipo e as doses dos imunossupressores tendem a se estabilizar e as biópsias já foram realizadas para definição do grau de imunossupressão. Além disso, esse período é próximo ao tempo médio da RDC de 71 dias após TxC sugerido por Diez et al.12

A pesquisa de CMV também foi previamente realizada nos pacientes e analisada neste estudo, dentro do período de 3 meses após TxC, de forma preemptiva, conforme protocolo institucional (2, 6 e 10 semanas), por meio da PCR quantitativa, realizada pelo laboratório AFIP (detecção a partir de 50 cópias/mL).

Demais dados selecionados foram aqueles relacionados ao perfil clínico e laboratorial e anatomopatológico (pela BEM) do paciente, extraídos do prontuário.

Foram coletadas características basais dos pacientes, como idade, sexo, tipagem sanguínea, peso, altura, índice de massa corpórea (IMC), data da cirurgia, ocorrência de óbito (se presente), além das comorbidades que se apresentavam previamente ao TxC, como hipertensão arterial sistêmica, diabetes mellitus, dislipidemia e histórico de tabagismo.

Ainda, foram avaliados na amostra a presença e o grau de rejeição celular (classificação conforme proposto por Stewart et al., em 200518) pela BEM realizada conforme protocolo institucional (segunda, quarta, oitava e décima-segunda semanas após o TxC).

 Análise estatística

As variáveis contínuas foram descritas por média ± desvio-padrão ou mediana e intervalo interquartil, conforme normalidade de dados, avaliadas através da inspeção por histogramas. As variáveis categóricas foram apresentadas por suas frequências absolutas e relativas.

As comparações das características de base em relação ao resultado de PCR Chagas, nos 3 meses do TxC, foram realizadas por modelos de riscos proporcionais de Cox independentes. Os resultados foram apresentados por razões de taxa de risco com intervalos de confiança de 95%.

Foi avaliada a associação entre a contagem absoluta de linfócitos no perioperatório (por meio da média do menor valor dos linfócitos em até 7 e 14 dias de PO) e a presença da PCR Chagas positiva em até três meses do TxC, a partir de curvas ROC. As áreas sob as curvas (AUC) foram descritas para cada caso.

Três modelos de tempo até evento, considerando modelos de riscos proporcionais de Cox, foram apresentados para mostrar a chance de positivar o resultado da PCR para Chagas de acordo com os valores de linfócitos de base (D0), e mínimo até 7 dias e até 14 dias do PO. Modelos de sensibilidade ajustados (por idade, dose de micofenolato e episódios de rejeição com indicação de pulsoterapia) também foram incluídos. Construiu-se um gráfico de Kaplan-Meier para a avaliação dos linfócitos de melhor acurácia.

As análises foram conduzidas com auxílio do software R, versão 4.2.1. Testes de hipótese foram avaliados ao nível de significância de 5%.

 Considerações éticas

O estudo atendeu a todos os princípios éticos requeridos, tendo sido encaminhado e aprovado, primeiramente, pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Dante Pazzanese (número de protocolo do Comitê de Ética: 5331; número do parecer: 5918442; CAAE: 67067923.3.0000.5462), e esteve em conformidade com a lei geral de proteção de dados e resolução 466/2012.

 Resultados

O estudo apresentou amostra total de 35 pacientes, idade média de 52,5 ± 8,1 anos, com IMC médio de 22,6 ± 2,8 kg/m2. Durante o seguimento de 3 meses, houve 4 óbitos, 11% da amostra, que não apresentaram relação com RDC. A Tabela 1 sumariza as características de base, de acordo com a análise da PCR Chagas. Não houve associação das variáveis descritas com a positividade da PCR, incluindo tipo de imunossupressor, doses mais elevadas do micofenolato, episódios de rejeição (> 2R com indicação de pulsoterapia) ou reativação/carga viral de CMV.

– Comparação das características de base de acordo com a positividade da PCR Chagas em até 3 meses do pós-operatório do transplante cardíaco (n = 35)
Variáveis Total Negativo, N = 13 Positivo, N = 22 Razão de taxa de riscos [IC95%] p*
Idade, anos, média ± DP 52,5 ± 8,1 50,8 ± 8,8 53,5 ± 7,7 1.03 [0,97 –1,08] 0,358
Sexo masculino, n/N (%) 22/35 (62,9%) 6/13 (46,2%) 16/22 (72,7%) 1,51 [0,63 – 3,65] 0,358
Tipagem sanguínea, n/N (%)
A 11/35 (31,4%) 5/13 (38,5%) 6/22 (27,3%) referência
B 5/35 (14,3%) 2/13 (15,4%) 3/22 (13,6%) 1,43 [0,4 – 5,09] 0,579
AB 6/35 (17,1%) 1/13 (7,7%) 5/22 (22,7%) 2,1 [0,62 – 7,07] 0,232
O 13/35 (37,1%) 5/13 (38,5%) 8/22 (36,4%) 1,11 [0,39 – 3,13] 0,841
HAS, n/N (%) 11/35 (31,4%) 4/13 (30,8%) 7/22 (31,8%) 0,74 [0,31 – 1,8] 0,509
DM, n/N (%) 5/35 (14,3%) 2/13 (15,4%) 3/22 (13,6%) 0,64 [0,19 – 2,17] 0,474
DLP, n/N (%) 13/35 (37,1%) 5/13 (38,5%) 8/22 (36,4%) 0,7 [0,31 – 1,62] 0,408
Ex-tabagista, n/N (%) 12/35 (34,3%) 3/13 (23,1%) 9/22 (40,9%) 1,52 [0,66 – 3,5] 0,324
Número de imunossupressores no PO 3 meses, n/N (%)
2 1/35 (2,9%) 0/13 (0,0%) 1/22 (4,5%) referência
3 33/35 (94,3%) 13/13 (100,0%) 20/22 (90,9%) 0,31 [0,04 – 2,47] 0,270
4 1/35 (2,9%) 0/13 (0,0%) 1/22 (4,5%) 0,45 [0,03 – 7,61] 0,582
Micofenolato, n/N (%) 34/35 (97,1%) 13/13 (100,0%) 21/22 (95,5%) 0,32 [0,04 – 2,5] 0,276
Dose > 1000 mg/dia mofetil ou > 720 mg/dia sódico, n/N (%) 4/35 (11,4%) 0/13 (0,0%) 4/22 (18,2%) 1,75 [0,58 – 5,25] 0,321
Azatioprina, n/N (%) 0/35 (0,0%) 0/13 (0.0%) 0/22 (0.0%) - -
Tacrolimus, n/N (%) 15/35(42,9%) 3/13 (23,1%) 12/22 (54,5%) 1,51 [0,67 – 3,36] 0,318
Ciclosporina, n/N (%) 20/35 (57,1%) 10/13 (76,9%) 10/22 (45,5%) 0,66 [0,3 – 1,48] 0,318
Prednisona, n/N (%) 35/35 (100,0%) 13/13 (100,0%) 22/22 (100,0%) - -
Inibidor mTOR, n/N (%) 1/35 (2,9%) 0/13 (0,0%) 1/22 (4,5%) 1,4 [0,19 – 10,57] 0,743
Reativação de CMV, n/N (%) 25/35 (71,4%) 8/13 (61,5%) 17/22 (77,3%) 1,54 [0,57 – 4,13] 0,391
Logaritmo da carga viral máxima de CMV, log (cópia/ml), mediana [quartis] 7,3 [6,6; 9,0] 8,9 [7,3; 9,9] 8,6 [6,7; 9,9] 1,05 [0,89 – 1,24] 0,574
Rejeição > 2R/pulsoterapia, n/N (%) 19/35 (54,3%) 7/13 (53,8%) 12/22 (54,5%) 1,21 [0,53 – 2,73] 0,650

*Modelos de riscos proporcionais de Cox para PCR negativa em até 3 meses pós transplante. CMV: citomegalovírus; DLP: dislipidemia; DM: diabetes mellitus; DP: desvio-padrão; HAS: hipertensão arterial; IC: intervalo de confiança; mTOR: proteína alvo da rapamicina em mamíferos; PCR: reação em cadeia de polimerase qualitativa; PO: pós-operatório; TxC: transplante cardíaco.

No período de até 3 meses após o TxC, 22 pacientes apresentaram PCR Chagas positiva, ou seja, 62% da amostra, sendo que o tempo médio para a reatividade da PCR foi de 45 dias ± 26,2. Todos os pacientes que apresentaram PCR Chagas positiva receberam tratamento com benzonidazol por 60 dias, conforme protocolo do serviço, sendo que todos eles negativaram PCR após o tratamento e nenhum apresentou complicações ligadas à RDC após. Não houve outros pacientes que receberam benzonidazol, além daqueles que apresentaram PCR positiva.

A Tabela 2 e a Figura 2 descrevem os valores de linfócitos de acordo com o resultado da PCR Chagas até o terceiro mês do TxC. A Tabela 2, ainda, apresenta a AUC dos linfócitos para a positividade da PCR para T. cruzi (representado graficamente pela Figura 3), além dos pontos de corte sugeridos como fator de risco (para reatividade da PCR) para os valores do linfócito de base (D0), do mínimo em até D7 e do mínimo em até D14.

– Média e desvio padrão da contagem absoluta de linfócitos por dia, segundo resultados da PCR Chagas em até 3 meses do transplante cardíaco, com AUC e ponto de corte de linfócitos como fator de risco para reatividade de PCR
Dia (D) PCR Chagas em até 3 meses do TxC Ponto de corte ‡ Sensibilidade Especificidade
Negativo Positivo AUC
D0 1585 ± 713 1343 ± 508 0,621 1120 83,3% 42,9%
D3 922 ± 360 546 ± 241 0,808
D7 1238 ± 693 607 ± 412 0,795
D10 1504 ± 946 700 ± 390 0,778
D14 1160 ± 537 703 ± 395 0,771
Mínimo* em 7 dias 810 ± 342 438 ± 224 0,822 550 83,3% 71,4%
Mínimo† em 14 dias 755 ± 303 398 ± 189 0,857 550 83,3% 86,4%

*Considerando a média dos menores valores dos linfócitos nas avaliações até D7 (incluindo D0, D3 e D7). †Média dos menores valores de linfócitos nas avaliações até D14 (incluindo D0, D3, D7, D10 e D14). ‡Linfócitos/mm3. AUC: área sob a curva ROC; PCR: reação em cadeia da polimerase; TxC: transplante cardíaco.

– Média e desvio padrão dos linfócitos por dia, segundo resultados da PCR Chagas (até 3 meses do transplante cardíaco). PCR: reação em cadeia da polimerase.

– Curvas ROC para a média dos linfócitos de base (pré-operatório imediato, D0) e a média dos menores valores de linfócitos em até 7 dias (D7) e até 14 dias (D14) após transplante como preditor de negatividade para PCR Chagas em até 3 meses do transplante cardíaco. *Considerando a média dos menores valores dos linfócitos nas avaliações até D7 (incluindo D0, D3 e D7). †Média dos menores valores de linfócitos nas avaliações até D14 (incluindo D0, D3, D7, D10 e D14). AUC: área abaixo da curva ROC; D: dia após o transplante cardíaco; IC: intervalo de confiança.

Nota-se que houve associação entre a média dos menores valores de linfócitos observados nos primeiros 7 e 14 dias do TxC e a reatividade da PCR Chagas ocorrida nos primeiros 3 meses, destacando-se a média dos menores valores de linfócitos encontrados nos primeiros 14 dias após o transplante (incluindo D3, D7, D10 e D14), que apresentou estatísticas preditoras (pela AUC) de maior relação com a positividade da PCR em até 3 meses do TxC. Neste caso, a média do valor mínimo de linfócitos foi de 755 ± 303 unidades/mm3 nos pacientes com PCR negativa, bastante superior ao valor médio de 398 ± 189 unidades/mm3 nos pacientes com PCR positiva nos primeiros 3 meses pós TxC, configurando AUC = 0,857. A partir desses dados, o ponto de corte como fator de risco para reatividade de PCR Chagas foi determinado em 550 linfócitos/mm3.

Destaca-se, na Figura 2, que a média de linfócitos nos pacientes com PCR positiva após o TxC é superior àqueles com PCR negativa, sobretudo nos períodos de 3 dias a 14 dias após o transplante, sendo os valores de linfócitos semelhantes após 90 dias.

Ainda, foi realizada a avaliação do tempo até positividade da PCR Chagas a partir de uma análise de sobrevivência, conforme demonstrado na Tabela 3. Considerando a média dos menores valores de linfócitos em até 7 e 14 dias, houve efeitos significativos para o aumento de cada 100 unidades de linfócitos. Para o valor mínimo até 14 dias, evidencia-se que, a cada 100 unidades a mais de linfócitos, o risco de reativação se reduz em 26% (razão de riscos = 0.74 [intervalo de confiança 95%: 0.59 a 0,93]). Ajustou-se o modelo a outras variáveis (idade, dose da imunossupressão com micofenolato e rejeição com indicação de pulsoterapia, esses dois últimos previamente descritos como relacionados à RDC19), mantendo significância estatística. Demais variáveis não foram utilizadas para ajustar o modelo devido à ausência de associação com a reatividade da PCR, conforme visto na Tabela 1.

– Modelos de Cox para tempo até reativação segundo linfócitos contínuos
Modelo para tempo até reativação Razão de taxa de riscos [IC95%] Valor p Razão de taxa de riscos ajustada‡ [IC95%] Valor p
Linfócito pré-operatório imediato (D0) 0,79 [0,66 – 0,93] 0,006 0,75 [0,61 – 0,92] 0,007
Mínimo linfócitos até D7* 0,74 [0,59 – 0,93] 0,009 0,73 [0,58 – 0,93] 0,010
Mínimo linfócitos até D14† 0,74 [0,59 – 0,93] 0,009 0,73 [0,58 – 0,93] 0,010

*Considerando a média dos menores valores dos linfócitos nas avaliações até D7 (incluindo D0, D3 e D7). †Média dos menores valores de linfócitos nas avaliações até D14 (incluindo D0, D3, D7, D10 e D14). ‡ Modelos ajustados por idade, número de episódios de rejeição > 2R/pulsoterapia e doses mais elevadas de micofenolato (> 1000 mg/dia mofetil ou > 720 mg/dia sódico). D: dia após o transplante cardíaco; IC: intervalo de confiança.

Na Figura 4, percebe-se que os pacientes que alcançaram valores de linfócitos inferiores a 550 unidades/mm3, no pós-transplante, apresentaram PCR positivo em 80% dos casos precocemente, enquanto que portadores de linfócitos mínimos superiores a 550 unidades/mm3 positivaram PCR em apenas 30%, de forma mais tardia.

– Kaplan-Meier para positividade de PCR Chagas de acordo com o valor mínimo de linfócitos menor ou igual a 550 linfócitos/mm3, apresentado em até 14 dias do pós-operatório do transplante cardíaco.

Discussão

O TxC em pacientes com miocardiopatia chagásica refratária é frequente e apresenta prognóstico favorável, mas tem como complicação a RDC grave secundária à imunossupressão. Não se sabe se a linfopenia tem relação com a RDC, conforme recentemente descrito na reativação do CMV após o TxC.13-16

PCR qualitativa para Chagas e a RDC

O estudo avaliou a reatividade da PCR Chagas e sua associação com a linfopenia no perioperatório do TxC. É sabido que a PCR qualitativa apresenta alta associação com o diagnóstico de RDC, conforme demonstraram Da Costa et al. em 2017, uma vez que esse exame apresenta sensibilidade acima de 80% para RDC, conferindo AUC = 0,702, o que é superior aos métodos diagnósticos convencionais para a RDC, além de conferir precocidade na identificação dessa complicação (em até 2 meses).11 Portanto, é razoável que a associação da linfopenia no perioperatório com a reatividade da PCR Chagas possa ter também relação com a RDC propriamente dita. A PCR sérica quantitativa, por sua vez, não foi utilizada neste estudo e já é conhecido que não existem valores de corte específicos para definição de RDC, pois, conforme propõem Benvenuti et al., o sangue nem sempre é capaz de refletir o grau de acometimento de outros órgãos pelo T. cruzi, como o miocárdio.19,20

A PCR Chagas pode ser positiva também em pacientes com miocardiopatia chagásica crônica avançada previamente ao TxC (imunocompetentes), conferindo a eles maior risco cardiovascular.21 Contudo, ainda não há consenso quanto ao tratamento etiológico desses pacientes,5 diferentemente dos pacientes submetidos ao TxC por DC com detecção do T. cruzi e RDC, em que o tratamento antiparasitário é fortemente recomendado.3 Ou seja, a monitorização com a PCR pode alterar a conduta nos transplantados portadores de DC, devido à possibilidade do diagnóstico e tratamento precoces.

 Linfopenia como fator de risco para parasitemia (detectada por PCR Chagas)

Inicialmente, a amostra apresentou, nos primeiros 3 meses após o TxC, PCR Chagas positiva em 62% dos pacientes, o que se assemelha à incidência de estudo norte-americano, em que a reativação alcançou a taxa de 61% dos transplantados,10 refletindo alta prevalência dessa complicação que, associada a sua gravidade, torna necessária a identificação dos seus fatores de risco para o manejo adequado da RDC.

Já são conhecidos alguns fatores de risco associados à RDC, como episódios de rejeição, presença de neoplasia e grau de imunossupressão com o micofenolato.19 Contudo, não se sabe se a linfopenia tem relação com a RDC.

Os resultados deste estudo, em que a média dos linfócitos nos pacientes que apresentaram PCR positiva se mostrou inferior àqueles cuja PCR foi negativa (Figura 2), sobretudo para a média dos menores valores dos linfócitos nos primeiros 14 dias após o transplante (Tabela 2, com médias de 398 ± 189 e 755 ± 303 células/mm3 nos pacientes com PCR positiva e negativa, respectivamente, com sensibilidade e especificidade superiores a 80%), evidencia que houve associação entre a linfopenia e a reatividade da PCR e, analogamente, com a RDC, de forma semelhante ao constatado nos estudos sobre CMV.13-16 Soma-se a este achado o fato de que, como demonstra a Tabela 3, a cada aumento de 100 linfócitos, há redução do risco de reatividade da PCR em 26%.

Ressalta-se, também, a semelhança entre o valor de corte como fator de risco para positividade de PCR Chagas identificado, neste estudo, de 550 unidades/mm3, como descrito em estudos prévios com reativação do CMV após TxC, entre 500 e 610 unidades/mm3,14,15 reforçando a dependência da resposta imunológica frente a essas infecções.

Foi observada precocidade na positividade da PCR, que ocorreu em média após 45 dias do TxC, período pouco inferior ao demonstrado por Diez et al., em torno de 71 dias.12 Quando o número de linfócitos foi superior a 550 unidades/mm3 nos primeiros 14 dias, houve, além de evidente menor prevalência da PCR Chagas positiva, um retardo no tempo para positividade desse exame.

 Imunossupressão e a detecção de T. cruzi precoce por PCR Chagas

Neste estudo, conforme demonstrou a Tabela 1, não houve associação estatisticamente significativa entre a reatividade da PCR com episódios de rejeição prévios, apesar dessa associação já ter sido relatada previamente,19 provavelmente devido às limitações deste estudo, sobretudo referentes ao tamanho amostral. Não houve relação também com o número, tipo e dose de imunossupressores. Ressalta-se o fato de que o serviço avaliado não faz uso de azatioprina como imunossupressor de escolha nos pacientes com DC (conforme sugerem alguns autores3), por isso, a ausência de pacientes com esse antiproliferativo na amostra, fazendo-se opção pelo micofenolato na menor dose possível, pela evidência de sua superioridade nos desfechos do TxC em geral.22

Em relação à resposta imunológica contra o protozoário, destaca-se, principalmente, a imunidade celular, por meio dos linfócitos T CD4, produtores de anticorpos líticos e citocinas (como intérferon gama), que auxiliam na destruição de formas intracelulares dos parasitas, além de algum papel dos linfócitos T CD8 neste processo.17 Com a imunossupressão no TxC, há redução função/número dessas células, criando um ambiente propício para a RDC.7

Como confirmação da importância da imunidade celular no controle da DC, sabe-se que, em pacientes com infecções pelo HIV e T. cruzi concomitantes, há elevada frequência (maior que 80%) de RDC quando linfócitos T CD4 são inferiores a 200 células/mm3

 Contribuições dos achados na prática médica

O conhecimento da linfopenia como fator de risco para reatividade da PCR Chagas pode propiciar um melhor manejo dos transplantados por miocardiopatia chagásica, visto que a dosagem de linfócitos é um exame laboratorial amplamente disponível, de baixo custo e de fácil interpretação que pode selecionar pacientes de alto risco para a RDC. Dessa maneira, esses indivíduos podem ter uma vigilância mais rigorosa quanto à RDC, propiciando diagnósticos e tratamentos precoces. Na verdade, o estudo confirmou a alta eficácia do tratamento da RDC com benzonidazol, haja vista que houve resolução completa da parasitemia (confirmada com nova PCR, negativa) após o tratamento adequado em todos os pacientes que apresentaram PCR Chagas positiva.

Por fim, esses pacientes, inclusive, podem se beneficiar de tratamentos profiláticos e/ou redução da intensidade de imunossupressão. Apesar de Rossi et al. demonstrarem em estudo retrospectivo que houve benefício na redução da incidência da RDC com o uso do benzonidazol profilático após TxC,23 atualmente, o tratamento profilático contra a RDC não é recomendado pelas atuais diretrizes, sobretudo devido aos efeitos adversos causados por esse tratamento.3 No entanto, a identificação de pacientes de alto risco com linfopenia pode direcionar a indicação mais precisa de uma possível profilaxia medicamentosa, mas, certamente, são necessários novos estudos para avaliar o possível benefício desse tipo de conduta.

 Limitações

Evidentemente, o estudo apresenta limitações inerentes ao fato de ser retrospectivo, unicêntrico, além do tamanho amostral reduzido e ausência de validações interna e externa.

Além disso, apresenta disponibilidade limitada da realização de exames da PCR qualitativa sérica. Por fim, não há disponibilidade, no serviço, de realização da PCR Chagas quantitativa sérica ou da PCR Chagas realizada em material obtido pela biópsia do miocárdio.

 Conclusão

O estudo demonstrou que houve relação entre a baixa contagem absoluta de linfócitos durante o perioperatório do TxC com a detecção sérica precoce do T. cruzi por PCR nos primeiros 3 meses após o TxC.

 Referências 1. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Boletim Epidemiológico: Territorialização e Vulnerabilidade para Doença de Chagas Crônica. Brasília: Ministério da Saúde; 2022. Brasil Ministério da Saúde Secretaria de Vigilância em Saúde Boletim Epidemiológico: Territorialização e Vulnerabilidade para Doença de Chagas Crônica Brasília Ministério da Saúde 2022 2. Rohde LEP, Montera MW, Bocchi EA, Clausell NO, Albuquerque DC, Rassi S, et al. Diretriz Brasileira de Insuficiência Cardíaca Crônica e Aguda. Arq Bras Cardiol. 2018;111(3):436-539. doi: 10.5935/abc.20180190. Rohde LEP Montera MW Bocchi EA Clausell NO Albuquerque DC Rassi S et al Diretriz Brasileira de Insuficiência Cardíaca Crônica e Aguda Arq Bras Cardiol 2018 111 3 436 539 10.5935/abc.20180190 3. Bacal F, Marcondes-Braga FG, Rohde LEP, Xavier JL Jr, Brito FS, Moura LAZ, et al 3ª Diretriz Brasileira de Transplante Cardíaco. Arq Bras Cardiol. 2018;111(2):230-89. doi: 10.5935/abc.20180153. Bacal F Marcondes-Braga FG Rohde LEP Xavier JL Jr Brito FS Moura LAZ et al 3ª Diretriz Brasileira de Transplante Cardíaco Arq Bras Cardiol 2018 111 2 230 289 10.5935/abc.20180153 4. Andrade JP, Marin JÁ Neto, Paola AA, Vilas-Boas F, Oliveira GM, Bacal F, et al. I Latin American Guidelines for the Diagnosis and Treatment of Chagas' Heart Disease: Executive Summary. Arq Bras Cardiol. 2011;96(6):434-42. doi: 10.1590/s0066-782x2011000600002. Andrade JP Marin JÁ Neto Paola AA Vilas-Boas F Oliveira GM Bacal F et al I Latin American Guidelines for the Diagnosis and Treatment of Chagas' Heart Disease: Executive Summary Arq Bras Cardiol 2011 96 6 434 442 10.1590/s0066-782x2011000600002 5. Marin-Neto JA, Rassi A Jr, Oliveira GMM, Correia LCL, Ramos AN Jr, Luquetti AO, et al. SBC Guideline on the Diagnosis and Treatment of Patients with Cardiomyopathy of Chagas Disease - 2023. Arq Bras Cardiol. 2023;120(6):e20230269. doi: 10.36660/abc.20230269. Marin-Neto JA Rassi A Jr Oliveira GMM Correia LCL Ramos AN Jr Luquetti AO et al SBC Guideline on the Diagnosis and Treatment of Patients with Cardiomyopathy of Chagas Disease - 2023 Arq Bras Cardiol 2023 120 6 e20230269 10.36660/abc.20230269 6. Rassi A Jr, Rassi A, Little WC, Xavier SS, Rassi SG, Rassi AG, et al. Development and Validation of a Risk Score for Predicting Death in Chagas' Heart Disease. N Engl J Med. 2006;355(8):799-808. doi: 10.1056/NEJMoa053241. Rassi A Jr Rassi A Little WC Xavier SS Rassi SG Rassi AG et al Development and Validation of a Risk Score for Predicting Death in Chagas' Heart Disease N Engl J Med 2006 355 8 799 808 10.1056/NEJMoa053241 7. Moreira MDCV, Cunha-Melo JR. Chagas Disease Infection Reactivation after Heart Transplant. Trop Med Infect Dis. 2020;5(3):106. doi: 10.3390/tropicalmed5030106. Moreira MDCV Cunha-Melo JR Chagas Disease Infection Reactivation after Heart Transplant Trop Med Infect Dis 2020 5 3 106 10.3390/tropicalmed5030106 8. Recommendations for Diagnosis, Treatment and Follow-up of the Trypanosoma Cruzi: Human Immunodeficiency Virus Co-infection. Rev Soc Bras Med Trop. 2006;39(4):392-415. Recommendations for Diagnosis, Treatment and Follow-up of the Trypanosoma Cruzi: Human Immunodeficiency Virus Co-infection Rev Soc Bras Med Trop 2006 39 4 392 415 9. Dias JC, Ramos AN Jr, Gontijo ED, Luquetti A, Shikanai-Yasuda MA, Coura JR, et al. Brazilian Consensus on Chagas Disease, 2015. Epidemiol Serv Saude. 2016;25(spe):7-86. doi: 10.5123/S1679-49742016000500002. Dias JC Ramos AN Jr Gontijo ED Luquetti A Shikanai-Yasuda MA Coura JR et al Brazilian Consensus on Chagas Disease, 2015 Epidemiol Serv Saude 2016 25 spe 7 86 10.5123/S1679-49742016000500002 10. Gray EB, La Hoz RM, Green JS, Vikram HR, Benedict T, Rivera H, et al. Reactivation of Chagas Disease Among Heart Transplant Recipients in the United States, 2012-2016. Transpl Infect Dis. 2018;20(6):e12996. doi: 10.1111/tid.12996. Gray EB La Hoz RM Green JS Vikram HR Benedict T Rivera H et al Reactivation of Chagas Disease Among Heart Transplant Recipients in the United States, 2012-2016 Transpl Infect Dis 2018 20 6 e12996 10.1111/tid.12996 11. Costa PA, Segatto M, Durso DF, Moreira WJC, Junqueira LL, Castilho FM, et al. Early Polymerase Chain Reaction Detection of Chagas Disease Reactivation in Heart Transplant Patients. J Heart Lung Transplant. 2017;36(7):797-805. doi: 10.1016/j.healun.2017.02.018. Costa PA Segatto M Durso DF Moreira WJC Junqueira LL Castilho FM et al Early Polymerase Chain Reaction Detection of Chagas Disease Reactivation in Heart Transplant Patients J Heart Lung Transplant 2017 36 7 797 805 10.1016/j.healun.2017.02.018 12. Diez M, Favaloro L, Bertolotti A, Burgos JM, Vigliano C, Lastra MP, et al. Usefulness of PCR Strategies for Early Diagnosis of Chagas' Disease Reactivation and Treatment Follow-up in Heart Transplantation. Am J Transplant. 2007;7(6):1633-40. doi: 10.1111/j.1600-6143.2007.01820.x. Diez M Favaloro L Bertolotti A Burgos JM Vigliano C Lastra MP et al Usefulness of PCR Strategies for Early Diagnosis of Chagas' Disease Reactivation and Treatment Follow-up in Heart Transplantation Am J Transplant 2007 7 6 1633 1640 10.1111/j.1600-6143.2007.01820.x 13. Gardiner BJ, Nierenberg NE, Chow JK, Ruthazer R, Kent DM, Snydman DR. Absolute Lymphocyte Count: A Predictor of Recurrent Cytomegalovirus Disease in Solid Organ Transplant Recipients. Clin Infect Dis. 2018;67(9):1395-402. doi: 10.1093/cid/ciy295. Gardiner BJ Nierenberg NE Chow JK Ruthazer R Kent DM Snydman DR Absolute Lymphocyte Count: A Predictor of Recurrent Cytomegalovirus Disease in Solid Organ Transplant Recipients Clin Infect Dis 2018 67 9 1395 1402 10.1093/cid/ciy295 14. Yoon M, Oh J, Chun KH, Lee CJ, Kang SM. Post-transplant Absolute Lymphocyte Count Predicts Early Cytomegalovirus Infection after Heart Transplantation. Sci Rep. 2021;11(1):1426. doi: 10.1038/s41598-020-80790-4. Yoon M Oh J Chun KH Lee CJ Kang SM Post-transplant Absolute Lymphocyte Count Predicts Early Cytomegalovirus Infection after Heart Transplantation Sci Rep 2021 11 1 1426 10.1038/s41598-020-80790-4 15. Schoeberl AK, Zuckermann A, Kaider A, Aliabadi-Zuckermann A, Uyanik-Uenal K, Laufer G, et al. Absolute Lymphocyte Count as a Marker for Cytomegalovirus Infection after Heart Transplantation. Transplantation. 2023;107(3):748-52. doi: 10.1097/TP.0000000000004360. Schoeberl AK Zuckermann A Kaider A Aliabadi-Zuckermann A Uyanik-Uenal K Laufer G et al Absolute Lymphocyte Count as a Marker for Cytomegalovirus Infection after Heart Transplantation Transplantation 2023 107 3 748 752 10.1097/TP.0000000000004360 16. Meesing A, Razonable RR. Absolute Lymphocyte Count Thresholds: A Simple, Readily Available Tool to Predict the Risk of Cytomegalovirus Infection after Transplantation. Open Forum Infect Dis. 2018;5(10):ofy230. doi: 10.1093/ofid/ofy230. Meesing A Razonable RR Absolute Lymphocyte Count Thresholds: A Simple, Readily Available Tool to Predict the Risk of Cytomegalovirus Infection after Transplantation Open Forum Infect Dis 2018 5 10 ofy230 10.1093/ofid/ofy230 17. Brodskyn CI, Barral M Netto. Resposta Imune Humana na Doença de Chagas. In: Brener Z, Andrade ZA, Barral Netto M (editors). Trypanosoma Cruzi e Doença de Chagas. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2000. p. 170-6. Brodskyn CI Barral M Netto Resposta Imune Humana na Doença de Chagas Brener Z Andrade ZA Barral M Netto editors Trypanosoma Cruzi e Doença de Chagas Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2000 170 176 18. Stewart S, Winters GL, Fishbein MC, Tazelaar HD, Kobashigawa J, Abrams J, et al. Revision of the 1990 Working Formulation for the Standardization of Nomenclature in the Diagnosis of Heart Rejection. J Heart Lung Transplant. 2005;24(11):1710-20. doi: 10.1016/j.healun.2005.03.019. Stewart S Winters GL Fishbein MC Tazelaar HD Kobashigawa J Abrams J et al Revision of the 1990 Working Formulation for the Standardization of Nomenclature in the Diagnosis of Heart Rejection J Heart Lung Transplant 2005 24 11 1710 1720 10.1016/j.healun.2005.03.019 19. Campos SV, Strabelli TM, Amato V Neto, Silva CP, Bacal F, Bocchi EA, et al. Risk Factors for Chagas' Disease Reactivation after Heart Transplantation. J Heart Lung Transplant. 2008;27(6):597-602. doi: 10.1016/j.healun.2008.02.017. Campos SV Strabelli TM Amato V Neto Silva CP Bacal F Bocchi EA et al Risk Factors for Chagas' Disease Reactivation after Heart Transplantation J Heart Lung Transplant 2008 27 6 597 602 10.1016/j.healun.2008.02.017 20. Benvenuti LA, Freitas VLT, Roggério A, Nishiya AS, Mangini S, Strabelli TMV. Usefulness of PCR for Trypanosoma Cruzi DNA in Blood and Endomyocardial Biopsies for Detection of Chagas Disease Reactivation after Heart Transplantation: A Comparative Study. Transpl Infect Dis. 2021;23(4):e13567. doi: 10.1111/tid.13567. Benvenuti LA Freitas VLT Roggério A Nishiya AS Mangini S Strabelli TMV Usefulness of PCR for Trypanosoma Cruzi DNA in Blood and Endomyocardial Biopsies for Detection of Chagas Disease Reactivation after Heart Transplantation: A Comparative Study Transpl Infect Dis 2021 23 4 e13567 10.1111/tid.13567 21. Mendes VG, Rimolo L, Lima ACB, Ferreira RR, Oliveira LS, Nisimura LM, et al. Biomarkers and Echocardiographic Predictors of Cardiovascular Outcome in Patients with Chronic Chagas Disease. J Am Heart Assoc. 2023;12(12):e028810. doi: 10.1161/JAHA.122.028810. Mendes VG Rimolo L Lima ACB Ferreira RR Oliveira LS Nisimura LM et al Biomarkers and Echocardiographic Predictors of Cardiovascular Outcome in Patients with Chronic Chagas Disease J Am Heart Assoc 2023 12 12 e028810 10.1161/JAHA.122.028810 22. Hosenpud JD, Bennett LE. Mycophenolate Mofetil Versus Azathioprine in Patients Surviving the Initial Cardiac Transplant Hospitalization: An Analysis of the Joint UNOS/ISHLT Thoracic Registry. Transplantation. 2001;72(10):1662-5. doi: 10.1097/00007890-200111270-00015. Hosenpud JD Bennett LE Mycophenolate Mofetil Versus Azathioprine in Patients Surviving the Initial Cardiac Transplant Hospitalization: An Analysis of the Joint UNOS/ISHLT Thoracic Registry Transplantation 2001 72 10 1662 1665 10.1097/00007890-200111270-00015 23. Rossi JM Neto, Finger MA, Santos CC. Benznidazole as Prophylaxis for Chagas Disease Infection Reactivation in Heart Transplant Patients: A Case Series in Brazil. Trop Med Infect Dis. 2020;5(3):132. doi: 10.3390/tropicalmed5030132. Rossi JM Neto Finger MA Santos CC Benznidazole as Prophylaxis for Chagas Disease Infection Reactivation in Heart Transplant Patients: A Case Series in Brazil Trop Med Infect Dis 2020 5 3 132 10.3390/tropicalmed5030132

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto Dante Pazzanese sob o número de protocolo 5918442; CAAE: 67067923.3.0000.5462. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

 10.36660/abc.20230588i Original Article Absolute Lymphocyte Count: a Predictor of Positive Serum PCR for Trypanosoma cruzi in Patients with Chagas Disease Undergoing Heart Transplantation 0000-0001-7545-2683 Wolf Plínio José Whitaker Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 Finger Marco Aurelio Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 Rossi João Manoel Neto Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 Santos Carolina Casadei Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for content 1 Mattos Victor Bemfica de Mello Acquisition of data Writing of the manuscript 1 Rossi Raphael Acquisition of data Writing of the manuscript 1 0000-0002-5836-3379 Damiani Lucas Petri Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript 1 2 Brazil Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia, São Paulo, SP – Brazil Brazil Hospital Israelita Albert Einstein – ARO, São Paulo, SP – Brazil Mailing Address: Plínio José Whitaker Wolf • Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia – Miocárdio - Av. Doutor Dante Pazzanese, 500. Postal Code 04012-909, São Paulo, SP - Brazil E-mail: Pjwwolf@hotmail.com

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

: Absolute Lymphocyte Count: a Predictor of Positive Serum PCR for Trypanosoma cruzi in Patients with Chagas Disease Undergoing Heart Transplantation CI: confidence interval; HR: hazard rate ratio; HTx: heart transplantation; PCR: polymerase chain reaction.

Abstract Background

It is unknown whether lymphopenia is a risk factor for the reactivation of Chagas disease in heart transplantation (HTx), as recently described in the reactivation of cytomegalovirus in transplant patients.

 Objective

To evaluate whether lymphopenia in the perioperative period of heart transplantation is related to early Trypanosoma cruzi parasitemia.

 Methods

This observational, retrospective study analyzed a sample from January 2014 to January 2023). Parasitemia was evaluated in the first 3 months after HTx using serum polymerase chain reaction (PCR) and compared with the total lymphocyte count in the perioperative period of HTx using receiver operating characteristic curves. Baseline characteristics were compared with PCR for Chagas using independent Cox proportional hazards models. A significance level of 5% was adopted.

 Results

The sample (n = 35) had a mean age of 52.5 ± 8.1 years, and 22 patients (62.8%) had positive PCR for Chagas. The mean lowest lymphocyte values in the first 14 days after HTx were 398 ± 189 and 755 ± 303 cells/mm3 in patients with and without parasitemia, respectively, within 3 months after HTx (area under the curve = 0.857; 95% confidence interval: 0.996 to 0.718, sensitivity and specificity of 83.3% and 86.4%). A cutoff value of less than 550 lymphocytes/mm3 was determined as a risk factor for the presence of parasitemia. Patients with lymphocytes < 550 units/mm3 in the first 14 days after HTx presented positive PCR in 80% of cases. For every increase of 100 lymphocytes/mm3, the risk of PCR positivity was reduced by 26% (hazard rate ratio = 0.74; 95% confidence interval: 0.59 to 0.93, p = 0.009).

 Conclusion

There was an association between lymphopenia in the perioperative period of HTx and early T. cruzi parasitemia detected by PCR.

 Keywords Heart Transplantation Chagas Disease Lymphopenia Immunosuppression Therapy Introduction

Chagas disease affects approximately 1.9 to 4.6 million individuals in Brazil (1% to 2.4% of the population),1 considering the high prevalence and annual incidence of heart failure.2 It affects developed countries as well, due to current globalization and consequent emigration of people from Latin American.3,4 The disease is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi), and it is transmitted by insects of the Triatominae family (through inoculation of infected feces after a bite or orally through accidental ingestion of the insect and/or its feces). It can also be transmitted vertically, by transfusion, through transplantation of contaminated organs, or accidents with biological materials. The chronic form of Chagas disease can affect specific organs in 30% to 40% of infected patients, expressed in cardiac, digestive, or mixed forms.5 The cardiac form is the most common, manifesting with symptoms of heart failure, angina, thromboembolism, arrhythmias, or even sudden death.4 In patients with high risks according to the RASSI score, the prognosis is unfavorable, reaching a mortality rate of 84% in 10 years.6

In cases of refractory Chagas cardiomyopathy, heart transplantation (HTx) is an important therapeutic option (third leading cause of HTx in Brazil), since the prognosis of these patients, after transplantation, is favorable, as they are young patients, with few comorbidities and low rates of pulmonary hypertension, graft vascular disease, and reoperation.3,7

Immunosuppression, in turn, although it is essential to reduce rejection and consequently increase survival after HTx, can lead to important complications, such as reactivation of Chagas disease (RCD).3,7

Initially described in patients with hematological neoplasms in 1980 and, subsequently, in patients with HIV in 1990,8,9 RCD occurs in 26.4% to 40% of patients undergoing transplantation due to Chagas cardiomyopathy,9 reaching 61%, as demonstrated by Gray et al.10 Appropriate management of RCD is essential, due to the high morbidity and mortality when not treated adequately. However, when it is diagnosed early and the correct treatment is used (benznidazole as first line), the mortality rate is less than 1%.3,7,9

RCD presents cardiac and extracardiac manifestations, with myocarditis, whether symptomatic or not, being the most common.3,4 Diagnosis is based on clinical examination associated with evidence of the parasite in the tissues, by means of parasitological methods (direct search for T. cruzi), histological analysis of endomyocardial biopsies, or polymerase chain reaction (PCR) test on blood (or biopsy material);3,7,9 the latter is a non-invasive method, with high diagnostic precocity and accuracy.11,12

Due to the high prevalence and unfavorable prognosis, it is essential to determine risk factors for RCD. Similar to Chagas, in reactivation of cytomegalovirus (CMV), a common infection in HTx related to immunosuppression, lymphopenia is an important risk factor in the post-transplant period, as shown in recent studies.13-16 Even though the immunological response of Chagas disease and CMV is also closely dependent on lymphocytes,7,17 there are no studies that have evaluated lymphopenia as a risk factor for RCD until the present analysis, whose objective was to evaluate the relationship between absolute lymphocyte count in the perioperative period of HTx and early serum detection of T. cruzi by PCR, assisting in early diagnosis, screening, and treatment of RCD.

 Methods

This observational, retrospective, single-center study was conducted by collecting and analyzing data from physical/electronic medical records of patients with refractory Chagas heart disease who underwent HTx at the Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia (IDPC).

Sample selection

The patients selected for this sample were those with advanced refractory heart failure (confirmed during prior HTx assessment), secondary to Chagas heart disease (diagnosed by 2 serological tests using different methods), who were indicated and who underwent HTx at IDPC, during the period from January 2014 to January 2023.

Patients who survived at least 30 days after HTx were selected, and patients who died before this period were excluded.

From January 2014 to January 2023, 128 HTx were performed, 40 of which were in patients with Chagas disease, confirmed by 2 different methods. Of these patients, 5 died before 30 days (no deaths related to RCD), resulting in a total sample of 35 patients, whose qualitative PCR for Chagas was performed to evaluate serum detection of T. cruzi after HTx (Figure 1).

– Study sample selection. HTx: heart transplantation; PCR: polymerase chain reaction.

Definitions and data selection

In this study, serum detection of T. cruzi parasitemia was carried out using PCR for Chagas, analyzed at the Instituto Adolfo Lutz, using peripheral blood samples, in a conventional qualitative manner, detecting Trypanosoma cruzi DNA through specific amplification of a 330 bp fragment corresponding to the minicircle variable region of kDNA. In this study, PCR positivity for Chagas was evaluated up to the third month after HTx (initial period, marked by intense immunosuppression and, therefore, a higher incidence of RCD, as demonstrated by Diez et al. who observed a mean time to RCD of 71 days).12 The frequency of requesting PCR for Chagas followed the service protocol. In the period studied (first 3 months after HTx), at least one collection was requested by the first month and another by the third month or at any time when RCD was suspected (electrical, echocardiographic, or clinical changes suggestive of reactivation). There is no recommended universal protocol for requesting PCR; therefore, protocols must be adapted according to the characteristics and availability of each service.3

Absolute lymphocyte count was assessed by complete blood count of peripheral blood (cytochemical/isovolumetric method) at the Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa (AFIP) laboratory, immediately before HTx (D0) and at the following postoperative moments: 3, 7, 10, 14, 30, and 90 days (D3, D7, D10, D14, D30, and D90, respectively). The D0 and D7 intervals were based on prior studies that evaluated lymphopenia in CMV reactivation,14,16 and the other intervals were selected at the authors’ discretion. These data were available due to the service’s routine, in which laboratory tests are requested throughout the perioperative period of HTx (and during outpatient follow-up), including complete blood count, in the preoperative period and daily during the postoperative period, so that all patients had adequate lymphocyte dosage during these periods. Given the wide availability of data available in relation to lymphocyte counts, the value of lymphocytes collected and used in the study was exactly that of the determined days: D0, D3, D7, D10, D14, D30, and D90.

The mean lowest values of total lymphocytes found in the first 14 days after HTx was obtained and analyzed according to PCR reactivity for Chagas. The lowest lymphocyte value was used to evaluate the hypothesis that lymphopenia may be associated with serum detection of T. cruzi and RCD.

It is evident that, as expected in numerous cases of early HTx, the majority of patients included underwent some change in the immunosuppressive regimen (dose and type) during follow-up, altered in cases of rejection, infection, or adverse effects (acute kidney injury, for example), but the study did not evaluate the variation in immunosuppression and its possible impact on lymphocyte counts. Thus, immunosuppressive therapy was evaluated around the third month after transplantation, when the type and doses of immunosuppressants tend to stabilize and biopsies have already been performed to define the degree of immunosuppression. Furthermore, this period is close to the mean time to RCD of 71 days after HTx suggested by Diez et al.12

A CMV test was also previously conducted for the patients and analyzed in this study, within a period of 3 months after HTx, preemptively, according to the institutional protocol (2, 6, and 10 weeks), by means of quantitative PCR, carried out at the AFIP laboratory (detection defined as 50 copies/mL).

Other selected data were related to patients’ clinical, laboratory, and anatomopathological profile (on endomyocardial biopsy), which were extracted from medical records.

Patients’ baseline characteristics were collected, including age, sex, blood type, weight, height, body mass index (BMI), date of surgery, occurrence of death (if present), in addition to comorbidities that were present prior to HTx, such as systemic arterial hypertension, diabetes mellitus, dyslipidemia, and history of smoking.

Moreover, the presence and degree of cellular rejection were assessed in the sample (using the classification proposed by Stewart et al., in 200518) using endomyocardial biopsy performed according to the institutional protocol (second, fourth, eighth, and twelfth weeks after HTx).

 Statistical analysis

Continuous variables were described as mean ± standard deviation or median and interquartile range, according to data normality, evaluated through inspection of histograms. Categorical variables were shown as absolute and relative frequencies.

Comparisons of baseline characteristics in relation to the PCR results for Chagas, in the 3 months after HTx, were carried out using independent Cox proportional hazards models. Results were presented as hazard rate ratios with 95% confidence intervals.

The association between the absolute lymphocyte count in the perioperative period (by the mean lowest lymphocyte value up to 7 and 14 postoperative days) and the presence of positive PCR for Chagas within 3 months after HTx was evaluated using ROC curves. The areas under the curves (AUC) were described for each case.

Three time-to-event models, considering Cox proportional hazards models, were presented to show the chance of positive PCR results for Chagas according to the baseline lymphocyte values (D0) and minimum up to 7 days and up to 14 postoperative days. Adjusted sensitivity models (by age, mycophenolate dose, and rejection episodes with indication for pulse therapy) were also included. A Kaplan-Meier graph was constructed to evaluate the lymphocytes with better accuracy.

The analyses were conducted using R software, version 4.2.1. Hypothesis tests were performed at a 5% significance level.

 Ethical aspects

This study followed all required ethical principles. It was forwarded and approved, firstly, by the Research Ethics Committee of the Instituto Dante Pazzanese (ethics committee protocol number: 5331; opinion number: 5918442; CAAE: 67067923.3.0000.5462), and it was in compliance with the Brazilian General Data Protection Law and resolution 466/2012.

 Results

The study had a total sample of 35 patients, mean age of 52.5 ± 8.1 years, with mean BMI of 22.6 ± 2.8 kg/m2. During the 3-month follow-up, there were 4 deaths, 11% of the sample, which were not related to RCD. Table 1 summarizes the basic characteristics, according to the PCR analysis for Chagas. There was no association between the variables described and PCR positivity, including type of immunosuppressant, higher doses of mycophenolate, rejection episodes (> 2R with indication for pulse therapy), or CMV reactivation/viral load.

– Comparison of baseline characteristics according to PCR positivity for Chagas within 3 postoperative months after heart transplantation surgery (n = 35)
Variables Total Negative, N = 13 Positive, N = 22 Hazard risk ratio [95% CI] p*
Age, years, mean ± SD 52.5 ± 8.1 50.8 ± 8.8 53.5 ± 7.7 1.03 [0.97 –1.08] 0.358
Male sex, n/N (%) 22/35 (62.9%) 6/13 (46.2%) 16/22 (72.7%) 1.51 [0.63 – 3.65] 0.358
Blood type, n/N (%)
A 11/35 (31.4%) 5/13 (38.5%) 6/22 (27.3%) Reference
B 5/35 (14.3%) 2/13 (15.4%) 3/22 (13.6%) 1.43 [0.4 – 5.09] 0.579
AB 6/35 (17.1%) 1/13 (7.7%) 5/22 (22.7%) 2.1 [0.62 – 7.07] 0.232
O 13/35 (37.1%) 5/13 (38.5%) 8/22 (36.4%) 1.11 [0.39 – 3.13] 0.841
SAH, n/N (%) 11/35 (31.4%) 4/13 (30.8%) 7/22 (31.8%) 0.74 [0.31 – 1.8] 0.509
DM, n/N (%) 5/35 (14.3%) 2/13 (15.4%) 3/22 (13.6%) 0.64 [0.19 – 2.17] 0.474
DLP, n/N (%) 13/35 (37.1%) 5/13 (38.5%) 8/22 (36.4%) 0.7 [0.31 – 1.62] 0.408
Ex-smoker, n/N (%) 12/35 (34.3%) 3/13 (23.1%) 9/22 (40.9%) 1.52 [0.66 – 3.5] 0.324
Number of immunosuppressants in 3 PO months, n/N (%)
2 1/35 (2.9%) 0/13 (0.0%) 1/22 (4.5%) Reference
3 33/35 (94.3%) 13/13 (100.0%) 20/22 (90.9%) 0.31 [0.04 – 2.47] 0.270
4 1/35 (2.9%) 0/13 (0.0%) 1/22 (4.5%) 0.45 [0.03 – 7.61] 0.582
Mycophenolate, n/N (%) 34/35 (97.1%) 13/13 (100.0%) 21/22 (95.5%) 0.32 [0.04 – 2.5] 0.276
Dose > 1000 mg/day mycophenolate mofetil or > 720 mg/day mycophenolate sodium, n/N (%) 4/35 (11.4%) 0/13 (0.0%) 4/22 (18.2%) 1.75 [0.58 – 5.25] 0.321
Azathioprine, n/N (%) 0/35 (0.0%) 0/13 (0.0%) 0/22 (0.0%) - -
Tacrolimus, n/N (%) 15/35(42.9%) 3/13 (23.1%) 12/22 (54.5%) 1.51 [0.67 – 3.36] 0.318
Cyclosporine, n/N (%) 20/35 (57.1%) 10/13 (76.9%) 10/22 (45.5%) 0.66 [0.3 – 1.48] 0.318
Prednisone, n/N (%) 35/35 (100.0%) 13/13 (100.0%) 22/22 (100.0%) - -
mTOR inhibitor, n/N (%) 1/35 (2.9%) 0/13 (0.0%) 1/22 (4.5%) 1.4 [0.19 – 10.57] 0.743
Reactivation of CMV, n/N (%) 25/35 (71.4%) 8/13 (61.5%) 17/22 (77.3%) 1.54 [0.57 – 4.13] 0.391
Logarithm of maximum CMV viral load, log (copy/ml), median [quartiles] 7.3 [6.6; 9.0] 8.9 [7.3; 9.9] 8.6 [6.7; 9.9] 1.05 [0.89 – 1.24] 0.574
Rejection > 2R/pulse therapy, n/N (%) 19/35 (54.3%) 7/13 (53.8%) 12/22 (54.5%) 1.21 [0.53 – 2.73] 0.650

*Cox proportional hazards models for negative PCR within 3 months after transplantation. CI: confidence interval; CMV: cytomegalovirus; DLP: dyslipidemia; DM: diabetes mellitus; HTx: heart transplantation; mTOR: mammalian target of rapamycin protein; PCR: qualitative polymerase chain reaction; PO: postoperative; SAH: arterial hypertension; SD: standard deviation.

Within the period of 3 months after HTx, 22 patients had positive PCR for Chagas, that is, 62% of the sample, and the mean time to PCR reactivity was 45 ± 26.2 days. All patients who had positive PCR for Chagas received treatment with benznidazole for 60 days, according to the service protocol. They all had negative PCR results after treatment, and none of them presented complications linked to RCD afterwards. No other patients received benznidazole, besides those with positive PCR.

Table 2 and Figure 2 describe the lymphocyte values according to the PCR result for Chagas up to the third month after HTx. Table 2 also displays the AUC of lymphocytes for PCR positivity for T. cruzi (represented as a graph in Figure 3), in addition to the cutoff points suggested as a risk factor (for PCR reactivity) for baseline lymphocyte values (D0), the minimum by D7, and the minimum by D14.

– Mean and standard deviation of absolute lymphocyte count per day, according to PCR results for Chagas within 3 months after heart transplantation, with AUC and cutoff point for lymphocytes as a risk factor for PCR reactivity
Day (D) PCR for Chagas within 3 months after HTx Cutoff point ‡ Sensitivity Specificity
Negative Positive AUC
D0 1585 ± 713 1343 ± 508 0.621 1120 83.3% 42.9%
D3 922 ± 360 546 ± 241 0.808
D7 1238 ± 693 607 ± 412 0.795
D10 1504 ± 946 700 ± 390 0.778
D14 1160 ± 537 703 ± 395 0.771
Minimum* within 7 days 810 ± 342 438 ± 224 0.822 550 83.3% 71.4%
Minimum† within 14 days 755 ± 303 398 ± 189 0.857 550 83.3% 86.4%

* Considering the mean lowest lymphocyte values in assessments up to D7 (including D0, D3, and D7). † Mean lowest lymphocyte values in assessments up to D14 (including D0, D3, D7, D10, and D14). ‡ Lymphocytes/mm3. AUC: area under the receiver operating characteristic curve; HTx: heart transplantation; PCR: polymerase chain reaction.

– Mean and standard deviation of lymphocytes per day, according to PCR results for Chagas (up to 3 months after heart transplantation). PCR: polymerase chain reaction.

– ROC curves for mean baseline lymphocyte values (immediate preoperative period, D0) and mean lowest lymphocyte values within 7 days (D7) and 14 days (D14) after transplantation as a predictor of PCR negativity for Chagas within 3 months after heart transplantation. * Considering the mean lowest lymphocyte values in assessments up to D7 (including D0, D3, and D7). † Mean lowest lymphocyte values in assessments up to D14 (including D0, D3, D7, D10, and D14). AUC: area under the receiver operating characteristic curve; CI: confidence interval; D: day after heart transplantation.

There was an association between the mean lowest lymphocyte values observed in the first 7 and 14 days after HTx and PCR reactivity for Chagas that occurred in the first 3 months, highlighting the mean lowest lymphocyte values found in the first 14 days after transplantation (including D3, D7, D10, and D14), which presented predictive statistics (by AUC) of a greater relationship with PCR positivity within 3 months after HTx. In this case, the mean minimum value for lymphocytes was 755 ± 303 units/mm3 in patients with negative PCR, much higher than the mean value of 398 ± 189 units/mm3 in patients with positive PCR in the first 3 months after HTx, with AUC = 0.857. Based on these data, the cutoff point as a risk factor for PCR reactivity for Chagas was determined at 550 lymphocytes/mm3.

It is worth highlighting, in Figure 2, that the mean lymphocytes in patients with positive PCR after HTx was higher than in those with negative PCR, especially in periods from 3 to 14 days after transplantation, with lymphocyte values being similar after 90 days.

Furthermore, the time to PCR positivity for Chagas was evaluated based on survival analysis, as shown in Table 3. Considering the mean lowest lymphocyte values within 7 and 14 days, there were significant effects for each increase of 100 lymphocytes. For the minimum value up to 14 days, it is evident that, for each additional 100 units of lymphocytes, the risk of reactivation was reduced by 26% (hazard rate ratio = 0.74 [95% confidence interval: 0.59 to 0.93]). The model was adjusted for other variables (age, dose of immunosuppression with mycophenolate, and rejection with indication for pulse therapy, the latter two previously described as related to the RCD19), maintaining statistical significance. Other variables were not used to adjust the model due to the lack of association with PCR reactivity, as shown in Table 1.

– Cox models for time to reactivation according to continuous lymphocytes
Model for time to reactivation Hazard rate ratio [95%CI] p value Hazard rate ratio‡ [95%CI] p value
Immediate preoperative lymphocyte (D0) 0.79 [0.66 – 0.93] 0.006 0.75 [0.61 – 0.92] 0.007
Minimum lymphocytes up to D7* 0.74 [0.59 – 0.93] 0.009 0.73 [0.58 – 0.93] 0.010
Minimum lymphocytes up to D14† 0.74 [0.59 – 0.93] 0.009 0.73 [0.58 – 0.93] 0.010

* Considering the mean lowest lymphocyte values in assessments up to D7 (including D0, D3, and D7). † Mean lowest lymphocyte values in assessments up to D14 (including D0, D3, D7, D10, and D14). ‡ Models adjusted for age, number of rejection episodes > 2R/pulse therapy and higher doses of mycophenolate (> 1000 mg/day mycophenolate mofetil or > 720 mg/day mycophenolate sodium). CI: confidence interval; D: day after heart transplantation.

Figure 4 shows that patients who had lymphocyte values below 550 units/mm3 after transplantation had positive PCR in 80% of cases early, whereas, in patients with minimum lymphocytes above 550 units/mm3, only 30% tested positive for PCR later.

– Kaplan-Meier for positive PCR for Chagas according to minimum lymphocyte value less than or equal to 550 lymphocytes/mm3, presenting within 14 postoperative days after heart transplantation. CI: confidence interval; HR: hazard rate ratio; PCR: polymerase chain reaction.

Discussion

HTx in patients with refractory Chagas cardiomyopathy is common and has a favorable prognosis, but RCD secondary to immunosuppression is a severe complication. It is not known whether lymphopenia is related to RCD, as recently described in the reactivation of CMV after HTx.13-16

Qualitative PCR for Chagas and reactivation of Chagas disease

The study evaluated PCR reactivity for Chagas and its association with lymphopenia in the perioperative period of HTx. It is known that qualitative PCR has a high association with diagnosis of RCD, as demonstrated by Da Costa et al. in 2017, since this test presents sensitivity greater than 80% for RCD, resulting in AUC = 0.702, which is superior to conventional diagnostic methods for RCD, in addition to providing early identification of this complication (within 2 months).11 Therefore, it is reasonable that the association of perioperative lymphopenia with PCR reactivity for Chagas may also be related to RCD itself. Quantitative serum PCR, in turn, was not used in this study, and it is already known that no specific cutoff values exist for defining RCD, since, as proposed by Benvenuti et al., blood is not always capable of reflecting the degree to which other organs, such as the myocardium, are affected by T. cruzi.19,20

PCR for Chagas may also be positive in patients with advanced chronic Chagas cardiomyopathy prior to HTx (immunocompetent patients), conferring a greater cardiovascular risk.21 However, there is still no consensus regarding the etiological treatment of these patients,5 unlike patients undergoing HTx for Chagas disease with detection of T. cruzi and RCD, for whom antiparasitic treatment is strongly recommended.3 In other words, monitoring with PCR can alter the management of transplant recipients with Chagas disease due to the possibility of early diagnosis and treatment.

 Lymphopenia as a risk factor for parasitemia (detected by PCR for Chagas)

Initially, the sample presented, within the first 3 months after HTx, positive PCR for Chagas in 62% of patients, which is similar to the incidence of a study from the United States, in which reactivation reached a rate of 61% in transplant recipients,10 reflecting the high prevalence of this complication, which, associated with its severity, makes it necessary to identify risk factors for the appropriate management of RCD.

Some risk factors associated with RCD are already known, such as episodes of rejection, presence of neoplasia, and degree of immunosuppression with mycophenolate.19 However, it is not known whether lymphopenia is related to RCD.

The results of this study, in which the mean number of lymphocytes in patients who had positive PCR was lower than those whose PCR was negative (Figure 2), especially for the mean lowest lymphocyte values in the first 14 days after transplantation (Table 2, with means of 398 ± 189 and 755 ± 303 cells/mm3 in patients with positive and negative PCR, respectively, with sensitivity and specificity greater than 80%), shows that there was an association between lymphopenia and PCR reactivity and, similarly, with RCD, similarly to the findings of studies on CMV.13-16 In addition to this finding, as shown in Table 3, for each increase of 100 lymphocytes, there was a 26% reduction in the risk of PCR reactivity.

It is also worth highlighting the similarity between the cutoff value identified in this study as a risk factor for PCR positivity for Chagas, namely, 550 units/mm3, and the one described in previous studies for CMV reactivation after HTx, between 500 and 610 units/mm3,14,15 reinforcing the dependence on the immune response when facing these infections.

Early PCR positivity was observed, which occurred a mean of 45 days after HTx, a period slightly shorter than that demonstrated by Diez et al., approximately 71 days.12 When the number of lymphocytes was greater than 550 units/mm3 in the first 14 days, in addition to an evidently lower prevalence of positive PCR for Chagas, there was a delay in the time to test positivity.

 Immunosuppression and early detection of T. cruzi by PCR

In this study, as shown in Table 1, there was no statistically significant association between PCR reactivity and previous episodes of rejection, although this association has previously been reported,19 probably due to the limitations of this study, especially regarding the sample size. There was also no relationship with the number, type, and dose of immunosuppressants. It is worth highlighting the fact that the service where the study was conducted does not use azathioprine as the immunosuppressant of choice in patients with Chagas disease (as suggested by some authors3); therefore, there were no patients using this antiproliferative drug in the sample, opting for the lowest possible dose of mycophenolate, due to the evidence of its superiority in HTx outcomes in general.22

In relation to the immunological response against the protozoan, cellular immunity stands out, mainly through CD4 T lymphocytes, producers of lytic antibodies and cytokines (such as gamma interferon), which assist in the destruction of intracellular forms of the parasites, in addition to some role of CD8 T lymphocytes in this process.17 With immunosuppression in HTx, there is a reduction in the function/number of these cells, creating an environment conducive to RCD.7

Regarding confirmation of the importance of cellular immunity in controlling Chagas disease, it is known that, in patients with concomitant HIV and T. cruzi infections, there is an elevated frequency (greater than 80%) of RCD when CD4 T lymphocytes are less than 200 cells/mm3

 Contributions of the findings to medical practice

Knowing that lymphopenia is a risk factor for PCR reactivity for Chagas can promote better management of patients undergoing transplantation due to Chagas cardiomyopathy, since lymphocyte measurement is a widely available, low-cost, and easy-to-interpret laboratory test that can select patients with high risk for RCD. Accordingly, these individuals can have more rigorous surveillance regarding RCD, providing early diagnoses and treatments. This study confirmed the high efficacy of treating RCD with benznidazole, given that there was complete resolution of the parasitemia (confirmed by a new negative PCR) after appropriate treatment in all patients who had positive PCR for Chagas.

Finally, these patients may even benefit from prophylactic treatments and/or reduction in the intensity of immunosuppression. Although Rossi et al., demonstrated in a retrospective study, that there was benefit in reducing the incidence of RCD with the use of prophylactic benznidazole after HTx,23 currently, prophylactic treatment against RCD is not recommended by current guidelines, especially due to the adverse effects caused by this treatment.3 Nonetheless, the identification of high-risk patients with lymphopenia can guide more precise indication of possible drug prophylaxis, but further studies are certainly needed to evaluate the possible benefit of this type of conduct.

 Limitations

Evidently, the study has limitations inherent to the fact that it is retrospective and single-center, in addition to the reduced sample size and lack of internal and external validation.

Furthermore, it presents limited availability to perform qualitative serum PCR tests. Finally, there was no availability, at the service, to perform quantitative serum PCR for Chagas or PCR for Chagas on material obtained from myocardial biopsy.

 Conclusion

This study demonstrated that there was a relationship between low absolute lymphocyte count during the perioperative period of HTx and early serum detection of T. cruzi by PCR in the first 3 months after HTx.

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

This study was approved by the Ethics Committee of the Instituto Dante Pazzanese under the protocol number 5918442; CAAE: 67067923.3.0000.5462. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.

There were no external funding sources for this study.