Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC PdwV6KZLXbBVZghJjZC8HTk S0066-782X2024000400303 00303 10.36660/abc.20230236 Artigo Original Resposta Vascular da Triiodotironina sobre Anéis de Aortas Isoladas: Contribuição de Mecanismos Redox Pederiva Viviane Cristina Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante Obtenção de dados e Análise estatística; Redação do manuscrito 1 Castro Alexandre de Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante Obtenção de financiamento Redação do manuscrito 1 Belló-Klein Adriane Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante Obtenção de financiamento Redação do manuscrito 1 0000-0002-9482-7388 Araujo Alex Sander da Rosa Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante Obtenção de dados e Análise estatística Obtenção de financiamento Redação do manuscrito 1 0000-0001-5994-5218 Turck Patrick Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante Obtenção de dados e Análise estatística Redação do manuscrito 1 Universidade Federal do Rio Grande do Sul Departamento de Fisiologia Laboratório de Fisiologia Cardiovascular Porto Alegre RS Brasil Universidade Federal do Rio Grande do Sul - Departamento de Fisiologia, Laboratório de Fisiologia Cardiovascular, Porto Alegre, RS – Brasil Correspondência: Patrick Turck • Universidade Federal do Rio Grande do Sul - Sarmento Leite, 500. CEP 90050-170, Porto Alegre, RS - Brasil E-mail: p.turck@gmail.com

Editor responsável pela revisão: Marina Okoshi

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo

 26 04 2024 04 2024 121 4 e20230236 13 04 2023 28 10 2023 18 01 2024 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

: Resposta Vascular da Triiodotironina sobre Anéis de Aortas Isoladas: Contribuição de Mecanismos Redox A triiodotironina exerce um relaxamento vascular endotelial dependente e independente e diminui a vasocontração de anéis aórticos isolados, melhorando a homeostase redox vascular.

Resumo Fundamento

A disfunção vascular constitui a etiologia de diversas doenças, incluindo infarto do miocárdio e hipertensão, diante da ruptura da homeostase oxi-redutiva (“redox”), desempenhando um papel no desequilíbrio do mecanismo de controle vasomotor. Nosso grupo demonstrou anteriormente que os hormônios tireoidianos melhoram a sinalização da angiogênese, exercendo efeitos protetores sobre o tecido aórtico de ratos infartados.

 Objetivos

Investigar o papel da triiodotironina (T3) na resposta vascular, explorando seus efeitos em aortas isoladas e a presença de mecanismos redox vasculares.

 Métodos

Anéis aórticos isolados (endotélio intacto e desnudado) pré-contraídos com fenilefrina foram incubados com T3 (10-8, 10-7, 10-6, 10-5 e 10-4 M) e a tensão foi registrada usando um transdutor de deslocamento de força acoplado a um sistema de coleta. Para avaliar o envolvimento do estresse oxidativo, os anéis aórticos foram pré-incubados com T3 e posteriormente submetidos a um sistema de geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) in vitro. O nível de significância adotado na análise estatística foi de 5%.

 Resultados

A T3 (10-4 M) promoveu o vasorrelaxamento dos anéis aórticos pré-contraídos com fenilefrina em endotélio intacto e desnudado. Os anéis aórticos pré-incubados na presença de T3 (10-4 M) também mostraram diminuição da vasoconstrição provocada pela fenilefrina (1 µM) em preparações de endotélio intacto. Além disso, o efeito vasorrelaxante da T3 (10-4 M) persistiu em anéis aórticos pré-incubados com éster metílico de NG-nitro-L-arginina (L-NAME, 10 µM), um inibidor inespecífico da NO sintase (NOS). Por fim, a T3 (10-4 M) exibiu, in vitro, um papel antioxidante ao reduzir a atividade da NADPH oxidase e aumentar a atividade da SOD nos homogenatos aórticos.

 Conclusão

A T3 exerce efeitos dependentes e independentes de endotélio, o que pode estar relacionado ao seu papel na manutenção da homeostase redox.

 Tri-Iodotironina Hormônios Tireóideos Aorta Homeostase Introdução

Em doenças cardíacas e cerebrais, alterações significativas são observadas nos mecanismos de relaxamento vascular, resultando na diminuição do fluxo sanguíneo, a qual é frequentemente associada a eventos isquêmicos.1 Condições como hipertensão arterial sistêmica, infarto do miocárdio, hipertensão pulmonar e acidente vascular cerebral são alguns dos exemplos de lesões vasculares vinculadas à vasoconstrição e comprometimento do sistema circulatório.2 A resposta exacerbada às catecolaminas, mediadores inflamatórios e espécies reativas de oxigênio (ROS) desempenham um papel crucial na disfunção endotelial.3 Nesse contexto, o estresse oxidativo assume uma importância significativa, visto que as ROS induzem vasoconstrição e efeitos adversos no remodelamento vascular.4 Adicionalmente, o aumento do tônus vascular gera maior resistência ao fluxo sanguíneo, resultando em tensão de cisalhamento. Esta condição exerce efeitos críticos sobre a homeostase endotelial, causando produção elevada de ROS. Diversas fontes celulares podem promover a formação de ROS, como mitocôndrias, retículo endoplasmático e peroxissomos. Além disso, enzimas como a xantina oxidase e a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase (NADPH oxidase/Nox) também têm a capacidade de sintetizar essas espécies químicas.5

A NADPH oxidase é a principal enzima sintetizadora do radical ânion superóxido (O2•−) nos vasos.6 A molécula de O2•− pode ser convertida em peróxido de hidrogênio (H2O2) em uma reação catalisada pela superóxido dismutase (SOD). A partir dessa perspectiva, o H2O2 desempenha um papel duplo, sendo capaz de não somente produzir vasodilatação nas artérias cerebrais, coronárias e pulmonares,7 como também de atuar como vasoconstritor relevante nas artérias periféricas e na aorta.8 Além disso, o O2•− combina-se ao óxido nítrico (NO), resultando na formação de peroxinitrito (ONOO−).9 O ONOO− é um potente agente oxidante de membranas biológicas, capaz de induzir a morte celular. Assim, encontrar abordagens terapêuticas que combinem ações vasodilatadoras e antioxidantes é importante para o tratamento de doenças vasculares.10

Os hormônios tireoidianos (TH) demonstraram promover efeitos cardioprotetores e vasoprotetores em modelos experimentais de doenças cardíacas. No modelo de infarto, o TH não apenas melhorou o remodelamento cardíaco adverso pós-infarto, como também apresentou ação antioxidante sobre o tecido cardíaco e vascular11,12 além de melhorar a expressão de proteínas de angiogênese, como o fator 1α induzível por hipóxia (HIF-1α) e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).12 Além disso, a T3 induz o vasorrelaxamento por meio de diferentes mecanismos. Em um modelo experimental de dieta com sobrecarga de sal, os vasos incubados com T3 aumentaram sua vasodilatação e diminuíram a produção de ROS.13 Elevação dos níveis de NO e a ativação das vias da proteína quinase G (PKG)/fosfoproteína estimulada por vasodilatador (VASP) e fosfoinositídeo-3-quinase (PI3K)/ proteína quinase B (AKT) parecem ser o principal processo pelo qual o TH promove o vasorrelaxamento.14 No entanto, a T3 também exerce sua função vasodilatadora de maneira independente do endotélio, sugerindo uma ação direta do TH sobre as células musculares lisas.15

Apesar de estudos demonstrarem ação protetora do TH no coração e nos vasos,11,12 ainda se faz necessário elucidar o papel da T3 sobre o tônus vascular e sobre o estresse oxidativo nos vasos. Assim, é necessário explorar ainda mais o mecanismo vasodilatador da T3 e o impacto das ROS neste processo. Para tanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o impacto da T3 sobre a resposta vascular em vasos isolados quanto à influência do endotélio e o envolvimento dos parâmetros de estresse oxidativo neste contexto.

 Métodos Animais

Foram utilizados ratos Wistar machos com 45 dias de idade (pesando 202 ± 25 g) (N = 60), provenientes do Centro de Reprodução e Experimentação de Animais de Laboratório. Os animais foram alocados em condições padrão de biotério: ambiente com temperatura controlada (21 ± 2 °C), ciclo claro-escuro de 12 horas e umidade relativa de 70%; ofereceu-se água e ração padrão para roedores “ad libitum”. Os animais também foram aclimatados durante sete dias antes do início do protocolo experimental. Todos os procedimentos deste estudo estavam de acordo com as diretrizes para Pesquisa Biomédica Envolvendo Animais do Conselho de Organizações Internacionais de Ciência Médica (CIOMS) e foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (número do protocolo: 38964).

 Cálculo do tamanho da amostra

O cálculo do tamanho da amostra foi realizado utilizando o software G*Power 3.1.9.2 (Schleswig-Holstein, Alemanha). Foram consideradas probabilidade de erro α = 0,05, poder de teste estatístico = 0,80 e tamanho do efeito = 0,4.

 Preparação dos vasos para a reatividade vascular

Os ratos foram anestesiados com cetamina (90 mg/kg, intraperitoneal) e xilazina (10 mg/kg, intraperitoneal) simultaneamente e sacrificados por decapitação. Após a eutanásia, as aortas foram rapidamente isoladas e mantidas em solução tampão Krebs-Henseleit (NaCl 115 mM, CaCl2 2,5 mM, KCl 4,6 mM, KH2PO4 1,2 mM, MgSO4. 7 H2O 1,2 mM, NaHCO3 25 mM, dextrose 11,1 mM, Na2EDTA 3 mM), a 37 °C e pH 7,4, sob 95% O2–5% CO2. Os tecidos adiposo e conjuntivo foram cuidadosamente removidos e as aortas foram cortadas em segmentos cilíndricos de 4 mm de comprimento. Em alguns experimentos, o endotélio foi removido mecanicamente, esfregando-se suavemente a superfície interna dos segmentos da aorta com um fio de aço inoxidável. Dois ganchos de fio de aço inoxidável dobrados em um formato de L modificado foram utilizados para montar cada anel em câmaras de banho de órgãos (AVS Projetos, São Carlos, SP, Brasil). A porção curta e reta de cada gancho foi passada através do lúmen do anel. O gancho inferior foi preso à base da câmara de órgão preenchida com 10 mL de solução tampão Krebs-Henseleit e o gancho superior a um extensômetro. A tensão isométrica foi registrada por meio de um transdutor de deslocamento de força (TIM-100; AVS Projetos, São Carlos, SP, Brasil) conectado a um sistema de coleta (AQCAD 2.0.5; AVS Projetos, São Carlos, SP, Brasil). Os segmentos foram submetidos a uma tensão basal de 1,0 gf, ajustada a cada 15 minutos durante um período inicial de equilíbrio de 45 minutos.

A integridade do endotélio foi verificada pela incubação com acetilcolina (10 µM). Um relaxamento igual ou superior a 90% da contração máxima induzida pela fenilefrina (1 µM) foi considerado demonstrativo da integridade funcional do endotélio. Cada anel foi lavado sequencialmente com solução tampão de Krebs-Henseleit, reequilibrado por 45 minutos, e as tensões basais foram registradas.

 Estudos da reatividade vascular

O protocolo de incubação experimental é representado da seguinte forma: a) verificação de uma curva dose-resposta de T3 (10-8a 10-4 M) em segmentos aórticos com endotélio intacto e desnudado, pré-contraídos com fenilefrina 1µM; b) pré-exposição de vasos com endotélio intacto e desnudado a T3 (10-4 M), para mostrar a menor resposta contrátil induzida pela fenilefrina; c) verificação da T3 (10-4M) em segmentos aórticos com endotélio intacto pré-contraídos com fenilefrina 1µM e expostos a um inibidor inespecífico da NO sintase (NOS), éster metílico de NG-nitro-L-arginina (L-NAME; 10 µM) por 20 minutos. A T3 foi diluída em tampão de Krebs-Henseleit e as soluções foram preparadas diariamente, ao abrigo da luz. O grupo controle consistiu na adição dos mesmos volumes de solução tampão de Krebs-Henseleit, sem T3.

 Preparação da aorta para ensaios in vitro

As aortas foram homogeneizadas por 40 segundos (OMNI Tissue Homogeneizer, OMNI International, Kennesaw, GA, EUA) na presença de tampão de RIPA a 1:10 (5 ml/g de tecido) com fluoreto fenil-metil-sulfonil (PMSF) (100 mM) a 1 % (v/v). O homogenato foi centrifugado por 10 min a 8.000 xg em centrífuga refrigerada (4 °C) (Sorvall RC 5B – Rotor SM 24, Sorvall, Waltham, MA, EUA) e o sobrenadante foi coletado para análise subsequente.

 Sistema de geração de radical hidroxila

Para verificar o papel da T3 no equilíbrio redox, os sobrenadantes homogeneizados da aorta foram incubados com T3 (10-4 M) por 15 min a 37 °C. O grupo que não recebeu T3 foi incubado com água destilada no mesmo volume. Em seguida, as amostras foram incubadas por 30 min a 37 °C com FeCl2 (20 µM), H2O2 (50 mM) e ácido ascórbico (1 mM) para induzir estresse oxidativo (sistema de geração de radical hidroxila).16 Essas amostras foram utilizadas para avaliação bioquímica

 Análises bioquímicas Dosagem de proteínas

As proteínas foram quantificadas pelo método descrito por Lowry et al.17 e medidas em espectrofotômetro (Anthos Zenyth 200 rt, Biochrom, Cambridge, Reino Unido) a 625 nm. Os resultados foram expressos em mg/mL.

 Determinação do total de ROS

Os níveis totais de ROS nos homogenatos de vasos foram detectados usando diacetato de 2’,7’-dicloro-dihidro-fluoresceína (DCFH-DA), conforme descrito anteriormente.18 O DCFH-DA foi oxidado em 2,7-diclorofluoresceína fluorescente (DCF) na presença de ROS. As amostras foram excitadas a 488 nm e as emissões foram coletadas com um filtro de 525 nm (Espectrômetro de Fluorescência LS 55, Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA). Os resultados foram expressos em nmol DCF/mg de proteína.

 Peroxidação lipídica

A peroxidação lipídica foi avaliada por meio da produção de quimiluminescência iniciada pela adição de hidróxido de terc-butila (TBOOH).19 A quimiluminescência foi medida em um espectrômetro de cintilação (LKB Wallac Rack Beta Liquid Scintilla Spectrometer 1215, Austrália) operando como luminômetro e com fototubo sensor de emissão na faixa de 380–620 nm. Os resultados foram expressos como contagens por segundo cps/mg de proteína.

 Atividade da NADPH Oxidase

A atividade da NADPH oxidase foi baseada no monitoramento do consumo de NADPH a 340 nm (Anthos Zenyth 200 rt, Biochrom, Cambridge, Reino Unido). Os resultados foram expressos como nmol NADPH/min/mg de proteína.20

 Atividade da superóxido dismutase (SOD)

A determinação da atividade da SOD foi baseada na inibição da reação do ânion radical superóxido com o pirogalol.21 Os resultados foram expressos como U SOD/mg de proteína.

 Atividade da catalase

A atividade da catalase foi avaliada por meio da medição espectrofotométrica da taxa de decomposição do peróxido de hidrogênio a 240 nm.22 Os resultados foram expressos em nmol/min/mg de proteína.

 Análise estatística

Todos os conjuntos de dados foram submetidos ao teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Experimentos de diferentes doses de T3 ao longo do tempo, em comparação com o grupo Controle, foram analisados por ANOVA fatorial, complementada com teste post-hoc de Bonferroni para comparações múltiplas. Experimentos comparando o efeito de pré-incubação de dose fixa de T3 (10-4 M) sobre a vasoconstrição provocada pela fenilefrina e o efeito dA T3 (10-4 M) em anéis aórticos pré-incubados com L-NAME, em comparação com o grupo Controle, foram analisados por testes T não pareados. Experimentos do equilíbrio redox foram analisados por meio do método ANOVA bidirecional e complementados com o teste post-hoc de Bonferroni para comparações múltiplas além dos níveis totais de ROS, que, por sua vez, foram analisados por meio do teste de Kruskal-Walli, complementado com o teste post-hoc de Dunn para comparações múltiplas. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão para todos os conjuntos de dados, exceto os níveis totais de ROS, cujos resultados foram plotados como um gráfico de pontos de dispersão, representando a mediana e o intervalo interquartil para cada conjunto de dados. O software GraphPad Prism 8.0.2 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) foi utilizado para análise de dados. Os dados foram considerados significativos quando p < 0,05.

 Resultados A T3 promove relaxamento dos segmentos aórticos

Considerando o vaso intacto, a T3 a 10-4 M induziu o relaxamento das aortas pré-contraídas pela fenilefrina em comparação com o grupo controle (Figura 1A). A remoção do endotélio não anulou o efeito de vasorrelaxamento induzido pela T3 (10-4 M) (Figura 1B).

– Efeito da T3 sobre o relaxamento vascular dos segmentos aórticos (A) na presença de endotélio (END+) e (B) na ausência de endotélio (END-) pré-contraído com fenilefrina. Valores representados como média ± desvio padrão (DP), n = 6-8 anéis aórticos por grupo. ANOVA fatorial seguida de pós-teste de Bonferroni. *Diferença significativa entre os grupos Controle e T3 (10-4 M); p < 0,05.

A T3 diminui a resposta de vasocontração induzida pela fenilefrina

A pré-exposição dos segmentos aórticos intactos à T3 (10-4 M) resultou em uma redução da contração induzida pela fenilefrina em comparação com o grupo controle (Figura 2A). Porém, o mesmo resultado não foi observado nas preparações sem endotélio (Figura 2B).

– Efeito da pré-incubação de T3 (10-4 M) sobre a vasocontração dos segmentos aórticos, provocada pela fenilefrina (A) na presença de endotélio (END+) e (B) na ausência de endotélio (END-). Valores representados como média ± desvio padrão (DP), n = 6-10 por grupo. Teste t não pareado. *Diferença significativa entre os grupos Controle e T3; p < 0,05. ∆T/peso da aorta = razão da variação da tensão pelo peso do vaso.

A T3 exibe um efeito vasorrelaxante independente de NOS

Vasos com endotélio intacto foram pré-incubados com L-NAME, um inibidor inespecífico de NOS, antes da incubação de T3 (10-4 M). Mesmo na presença de L-NAME, a T3 (10-4 M) ainda resultou em relaxamento (~20%) dos segmentos aórticos pré-contraídos induzidos por fenilefrina em comparação com o grupo controle (Figura 3).

– Efeito da T3 (10-4 M) sobre o relaxamento vascular de anéis aórticos com endotélio intacto pré-incubados com L-NAME. Valores representados como média ± desvio padrão (DP), n = 6 por grupo. Teste t não pareado. *Diferença significativa entre os grupos Controle e T3; p < 0,05.

A T3 reduz a atividade da NADPH oxidase e melhora a atividade da SOD <italic>in vitro</italic>

Embora a concentração total de ROS e a oxidação lipídica não difiram entre os grupos (Figura 4A e 4B), a atividade da NADPH oxidase foi reduzida quando as amostras foram expostas à T3 (10-4 M) em comparação com os grupos controle (Figura 4C). Observou-se um aumento da atividade da SOD em vasos incubados com T3 (10-4 M) em comparação com os grupos controle (Figura 4D). A atividade da catalase estava aumentada apenas nos grupos que receberam a indução do estresse oxidativo (Figura 4E).

– Efeito da incubação de T3 (10-4 M) sobre (A) o nível de espécies reativas totais de oxigênio (ROS), (B) a oxidação lipídica, (C) a atividade da NADPH oxidase, (D) a atividade da superóxido dismutase (SOD) e (E) a atividade da catalase em homogenatos aórticos. Valores representados como mediana com intervalo interquartil para (A) e média ± desvio padrão (DP) para (B) a (E), n = 4-6 por grupo. Teste de Kruskal-Walli complementado com teste post-hoc de Dunn para (A) e ANOVA de dois fatores foi complementado com teste post-hoc de Bonferroni para (B) a (E). *Diferença significativa entre os grupos Controle e T3 na ANOVA de dois fatores; p < 0,05. #Diferença significativa entre os grupos (OS-) e (OS+); p < 0,05. OS- = grupos sem indução de estresse oxidativo (sistema de geração de radicais hidroxila); OS+ = grupos com indução de estresse oxidativo (sistema de geração de radicais hidroxila).

Discussão

Os principais resultados do presente estudo incluem a indução da vasodilatação de anéis aórticos com endotélio intacto e desnudado, pré-contraídos com fenilefrina em modelo experimental ex vivo, pela T3, cujo protocolo foi desenhado para avaliação da reatividade vascular. Além disso, a T3 desempenha um papel fundamental na homeostase redox, reduzindo a atividade da NADPH oxidase e aumentando a atividade da SOD dos vasos aórticos in vitro (Figura Central).

Estresse oxidativo, hipóxia, aterosclerose e inflamação são exemplos de desencadeadores de eventos vasoconstritores, os quais promovem desequilíbrio entre vasodilatação e vasoconstrição, remodelamento muscular vascular adverso e dano endotelial.23 Juntos, esses fatores promovem o aparecimento de diversas doenças como acidente vascular cerebral, infarto do miocárdio e hipertensão.24 Portanto, é importante explorar os mecanismos subjacentes à reatividade dos vasos de modo a propor alternativas terapêuticas que possam contribuir para o manejo das doenças vasculares. Nosso modelo experimental focou na avaliação da resposta vascular de aortas isoladas na presença de T3. A incubação com fenilefrina induziu a contração dos anéis aórticos, que foram posteriormente submetidos a diferentes doses de T3. Nossos resultados mostraram que a T3, na concentração de 10-4M, reduziu a vasoconstrição induzida pela fenilefrina. Corroborando com nossos dados, Carrillo-Sepulveda et al.,13 utilizando aortas de ratos Dahl (fêmeas) sensíveis ao sal, submetidos a uma dieta rica em sal, mostraram que a pré-incubação com T3 reduziu o estado hipercontrátil dos vasos e melhorou a resposta vasodilatadora. No modelo experimental de infarto do miocárdio, Ortiz et al.12 verificaram que o tratamento com T3 e T4 (2 e 8 μg/100 g/dia, respectivamente, por via oral por 12 dias) aumentou o imunoconteúdo de VEGF e HIF-1α (proteínas envolvidas na angiogênese em cenário hipóxico) na aorta de ratos infartados. Além disso, o VEGF também induz vasodilatação.25

Avaliando o envolvimento do endotélio sobre o efeito vasodilatador do TH, nossos resultados mostraram que a administração de T3 resultou em uma redução na constrição vascular induzida pela fenilefrina em aortas com e sem endotélio. Contudo, em aortas pré-incubadas com 10-4 M de T3, a ausência de endotélio afetou significativamente a capacidade de prevenir um aumento da tensão vascular evocada pela fenilefrina. Diante disso, é possível que, em vasos intactos, a T3 possa promover vasodilatação por meio de uma combinação de mecanismos dependentes e independentes do endotélio. Nos vasos sem endotélio, a vasodilatação é mantida por mecanismos independentes, mas a capacidade da T3 de reduzir a tensão vascular diminui. Estes resultados destacam a relevância do endotélio sobre o efeito total da T3 nos vasos. Devido a esse resultado, fez-se necessário investigar o papel do NO no processo de vasodilatação induzido pela T3, uma vez que o endotélio é uma importante fonte dessa molécula vasodilatadora.

O papel da T3 no endotélio e nos mecanismos vasodilatadores envolvidos nessa relação tem sido explorado nos últimos anos, destacando a relevância das vias de sinalização dependentes de NO.26 Além disso, o TH é capaz de aumentar a atividade da óxido nítrico sintase nos eritrócitos, favorecendo a produção de NO no sangue e melhorando a sua biodisponibilidade na circulação.27 No presente estudo, quando os anéis aórticos foram pré-incubados com L-NAME, um conhecido inibidor da NOS, a ação vasodilatadora da T3 persistiu. Esses dados corroboram a hipótese de que a T3 pode estar induzindo vasodilatação também por meio de um mecanismo independente do NO e do endotélio. Estes resultados não diminuíram a importância do endotélio sobre o efeito deste hormônio, eles demonstraram a capacidade da T3 em promover dilatação no contexto onde o endotélio é removido/danificado. Samuel et al.28 sugeriram que esse efeito independente do NO está associado à modulação da via da proteína quinase G/fosfoproteína, estimulada por vasodilatador (PKG/VASP) diretamente nas células musculares lisas vasculares. Além disso, o efeito antioxidante de baixas doses de hormônios tireoidianos também é capaz de melhorar a disfunção vascular e contribuir para um tônus vascular relaxado.12,13

Embora as ROS sejam importantes no controle do tônus vascular, quando suas concentrações excedem a capacidade antioxidante do tecido, o estresse oxidativo é estabelecido. A interrupção da homeostase redox resulta em danos vasculares, oxida lipoproteínas de baixa densidade e causa aterosclerose. O processo inflamatório associado a esses eventos leva ao remodelamento vascular adverso, à diminuição dos agentes vasodilatadores e ao aumento do nível de vasoconstrição.29 Nossos resultados mostram que a incubação com T3 reduziu a atividade do NADPH na aorta sob condições experimentais de estresse oxidativo estabelecidas in vitro. Além disso, a NADPH oxidase desempenha um papel importante na formação de ROS nos vasos sanguíneos. Essas espécies são capazes de promover um ambiente celular oxidado, levando ao desacoplamento da NOS e ao aumento da produção do radical ânion superóxido em vez do NO. Além disso, os radicais livres, como o ânion superóxido, muitas vezes atuam como sequestradores de NO, reduzindo sua biodisponibilidade e prejudicando a vasodilatação.30 Nesse sentido, Ortiz et al.12 também observaram uma redução na atividade da NADPH oxidase na aorta de ratos infartados tratados com hormônios tireoidianos, enquanto De Castro et al.11 mostraram que a administração de TH é capaz de reduzir ROS no coração de ratos infartados. Porém, em termos de níveis totais de ROS, o presente estudo não observou diferenças entre os grupos. Um resultado semelhante foi encontrado para avaliação da oxidação lipídica. Esses resultados podem ter surgido devido ao uso de aortas provenientes de animais saudáveis. Dentro deste contexto, essas amostras de vasos foram induzidas ao estresse oxidativo por meio da geração de modelo de hidroxila, no qual as amostras foram incubadas com FeCl2, H2O2 e ácido ascórbico por 30 min a 37°C. Entretanto, em estudo anterior avaliando a aorta de ratos infartados, a administração de TH promoveu diminuição dos níveis de ROS.12 Apesar disso, a capacidade da T3 de diminuir a atividade da NADPH oxidase já demonstra o efeito vasoprotetor desse hormônio. Além disso, quando avaliamos enzimas antioxidantes, a administração de T3 induziu aumento na atividade da SOD no tecido vascular. A SOD converte o ânion radical superóxido em peróxido de hidrogênio, reduzindo os níveis desse radical livre e sustentando um estado de aumento da biodisponibilidade de NO, melhorando assim a capacidade de vasorrelaxamento. Neste sentido, nossos resultados mostram que a T3 promove um cenário favorável à melhora da biodisponibilidade de NO, contribuindo para o mecanismo de vasodilatação dependente do endotélio. Esses dados corroboram outros estudos que mostram o papel vasoprotetor dos hormônios tireoidianos.12 Quando avaliamos a atividade da catalase, apenas as aortas submetidas ao estresse oxidativo apresentaram aumento na atividade dessa enzima. Estes resultados indicam um mecanismo compensatório do sistema antioxidante enzimático em resposta ao desequilíbrio redox; no entanto, a administração de T3 não modificou a atividade da catalase. Com relação a esse achado, um estudo investigando os efeitos dos TH em eritrócitos de ratos infartados revelou um aumento na atividade da catalase nas células sanguíneas dos animais tratados.27 Com base nisso, é plausível sugerir que, sob a influência da T3, os eritrócitos possam desempenhar um papel mais significativo na atividade dessa enzima antioxidante do que a própria parede vascular.

Limitação do estudo

A impossibilidade de explorar a expressão proteica diretamente nos anéis aórticos utilizados na reatividade vascular foi uma limitação do estudo. A avaliação da expressão de proteínas, como a sintase do óxido nítrico endotelial (eNOS) e a via de sinalização PIK3/AKT, bem como de proteínas antioxidantes, como o fator 2 relacionado ao fator nuclear eritróide 2 (NRF2), na mesma amostra incubada com T3 e submetida aos protocolos de vasoconstrição e vasodilatação, teria contribuído para a compreensão da mecânica dos resultados observados. No entanto, o tamanho reduzido dos anéis aórticos e dos fios utilizados no protocolo de reatividade vascular reduzem o grau de confiabilidade para experimentos subsequentes de biologia molecular utilizando a mesma amostra. Outro aspecto limitante deste artigo é a falta de avaliação de outros vasos de resistência, como pequenas artérias e arteríolas, para verificar se o efeito da T3 na aorta poderia ser extrapolado. Na realidade, o estado contrátil das pequenas artérias e arteríolas é responsável pela definição da resistência vascular, sendo um determinante chave da pressão arterial. Estruturalmente, as artérias de resistência possuem uma ou duas camadas de células musculares lisas vasculares (CMLV), enquanto as artérias condutoras, como a aorta, possuem cerca de 15 camadas de CMLV. Nesse contexto, as células endoteliais das artérias de resistência projetam a membrana plasmática para a camada CMLV por meio da lâmina elástica interna (projeções mioendoteliais). As projeções mioendoteliais conectam-se às CMLV por meio de junções comunicantes que facilitam a comunicação elétrica entre as duas camadas celulares.31 Nesse contexto, a hiperpolarização das células endoteliais é transmitida às CMLV, relaxando os vasos; portanto, este é o principal mecanismo para a vasodilatação dependente do endotélio das artérias de resistência. Por outro lado, tal mecanismo difere para a aorta, por exemplo, uma vez que as projeções mioendoteliais muitas vezes estão ausentes nos vasos condutores. Assim, a vasodilatação mediada por NO é o mecanismo primário neste cenário.

 Conclusão

Com base nos dados obtidos, é possível concluir que a T3 exerce um importante papel vasodilatador, que se mantém mesmo na ausência do endotélio. Além disso, é capaz de diminuir a atividade da enzima pró-oxidante NADPH e aumentar a atividade da enzima antioxidante SOD. Estes resultados apontam para um efeito benéfico deste hormônio sobre o equilíbrio redox vascular e a resistência periférica. Esse cenário favorece maior biodisponibilidade de NO, contribuindo também para o mecanismo de vasodilatação dependente do endotélio. Dentro deste contexto, esses dados endossam outros estudos que demonstram efeitos benéficos dos hormônios tireoidianos sobre o sistema circulatório.

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Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de mestrado de Viviane Pederiva pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) sob o número de protocolo 38964. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.

Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado pela CNPq/FAPERGS.

 10.36660/abc.20230236i Original Article Vascular Response of Triiodothyronine on Isolated Aortic Rings: Contribution of Redox Mechanisms Pederiva Viviane Cristina Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data and Critical revision of the manuscript for important intellectual content Acquisition of data and Statistical analysis Writing of the manuscript 1 Castro Alexandre de Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data and Critical revision of the manuscript for important intellectual content Obtaining financing Writing of the manuscript 1 Belló-Klein Adriane Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data and Critical revision of the manuscript for important intellectual content Obtaining financing Writing of the manuscript 1 0000-0002-9482-7388 Araujo Alex Sander da Rosa Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data and Critical revision of the manuscript for important intellectual content Acquisition of data and Statistical analysis Obtaining financing Writing of the manuscript 1 0000-0001-5994-5218 Turck Patrick Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data and Critical revision of the manuscript for important intellectual content Acquisition of data and Statistical analysis Writing of the manuscript 1 Brazil Universidade Federal do Rio Grande do Sul - Departamento de Fisiologia, Laboratório de Fisiologia Cardiovascular, Porto Alegre, RS – Brazil Mailing Address: Patrick Turck • Universidade Federal do Rio Grande do Sul - Sarmento Leite, 500. Postal Code 90050-170, Porto Alegre, RS - Brazil E-mail: p.turck@gmail.com

Potential conflict of interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Editor responsible for the review: Marina Okoshi

: Vascular Response of Triiodothyronine on Isolated Aortic Rings: Contribution of Redox Mechanisms Triiodothyronine exerts dependent- and independent-endothelium vascular relaxation and decreases vasocontraction of isolated aortic rings, improving vascular redox homeostasis.

Abstract Background

Vascular dysfunction constitutes the etiology of many diseases, such as myocardial infarction and hypertension, with the disruption of redox homeostasis playing a role in the imbalance of the vasomotor control mechanism. Our group previously has shown that thyroid hormones exert protective effects on the aortic tissue of infarcted rats by improving angiogenesis signaling.

 Objective

Investigate the role of triiodothyronine (T3) on vascular response, exploring its effects on isolated aortas and whether there is an involvement of vascular redox mechanisms.

 Methods

Isolated aortic rings (intact- and denuded-endothelium) precontracted with phenylephrine were incubated with T3 (10-8, 10-7, 10-6, 10-5, and 10-4 M), and tension was recorded using a force-displacement transducer coupled with an acquisition system. To assess the involvement of oxidative stress, aortic rings were preincubated with T3 and subsequently submitted to an in vitro reactive oxygen species (ROS) generation system. The level of significance adopted in the statistical analysis was 5%.

 Results

T3 (10-4 M) promoted vasorelaxation of phenylephrine precontracted aortic rings in both intact- and denuded-endothelium conditions. Aortic rings preincubated in the presence of T3 (10-4 M) also showed decreased vasoconstriction elicited by phenylephrine (1 µM) in intact-endothelium preparations. Moreover, T3 (10-4 M) vasorelaxation effect persisted in aortic rings preincubated with NG-nitro-L-arginine methylester (L-NAME, 10 µM), a nonspecific NO synthase (NOS) inhibitor. Finally, T3 (10-4 M) exhibited, in vitro, an antioxidant role by reducing NADPH oxidase activity and increasing SOD activity in the aorta’s homogenates.

 Conclusion

T3 exerts dependent- and independent-endothelium vasodilation effects, which may be related to its role in maintaining redox homeostasis.

 Triiodothyronine Thyroid Hormones Aorta Homeostasis Introduction

In cardiac and cerebral diseases, important alterations in the vascular relaxation mechanisms occur, promoting a blood flow reduction frequently associated with an ischemic situation.1 Systemic arterial hypertension, myocardial infarction, pulmonary hypertension, and stroke are examples of vascular injury conditions related to vasocontraction and impairment of circulatory system.2 The exacerbated response to catecholamines, inflammatory mediators, and reactive oxygen species (ROS) exert a relevant role in the endothelial dysfunction.3 In this context, oxidative stress plays an important role since ROS induce vasoconstriction and adverse vascular remodeling.4 Besides that, increased vascular tonus produces an augmented resistance to the blood flow, generating shear-stress. This condition has critical effects on endothelial homeostasis, causing elevated ROS production. Several cellular sources, such as mitochondria, endoplasmic reticulum, and peroxisomes, can promote ROS formation. In addition, enzymes such as xanthine oxidase and Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NADPH oxidase/Nox) also have the ability to synthesize these chemical species.5

NADPH oxidase is the main enzyme in the vessels that synthesizes superoxide anion radical (O2•−).6 O2•− molecule can be converted to hydrogen peroxide (H2O2) in a reaction catalyzed by superoxide dismutase (SOD). From this perspective, H2O2 plays a dual role since not only can it produce vasodilation in cerebral, coronary, and pulmonary arteries,7 but it can also act as a relevant vasoconstrictor in peripheral arteries and in the aorta.8 Besides that, O2•− can combine with nitric oxide (NO), resulting in peroxynitrite (ONOO−) formation.9 ONOO− is a potent oxidant agent of biological membranes and can induce cell death. On this basis, finding therapeutic approaches that combine both vasodilatation and antioxidant actions is important to treat vascular diseases.10

Thyroid hormones (TH) have been shown to promote cardioprotective and vasoprotective effects in experimental models of heart diseases. In the infarction model, TH not only improved post-infarction adverse cardiac remodeling, but also presented an antioxidant action in cardiac and vascular tissue.11,12 Additionally, TH improved the expression of angiogenesis proteins, such as hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF).12 Moreover, T3 induces vasorelaxation through different mechanisms. In an experimental model of a salt overload diet, the vessels incubated with T3 increased their vasodilatation and decreased ROS production.13 NO levels elevation and protein kinase G (PKG)/vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) and phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/ protein kinase B (AKT) pathways activation appear to be the main processes through which TH promotes vasorelaxation.14 Nevertheless, T3 also exerts its vasodilatory function through an endothelium-independent manner, suggesting a direct action of TH on smooth muscle cells.15

Despite studies demonstrating a protective action of TH in the heart and vessels,11,12 it is still necessary to better elucidate the role of T3 on vascular tone and oxidative stress in vessels. Accordingly, it is necessary to further explore the T3 vasodilator mechanism and the impact of ROS on this process. For this purpose, the objective of this study was to evaluate T3 impact on vascular response in isolated vessels regarding the influence of endothelium and the involvement of oxidative stress parameters in this context.

 Methods Animals

Forty-five-day-old male Wistar rats (weighing 202 ± 25 g) (N = 60) from the Laboratory Animal Reproduction and Experimentation Center were used. The animals were allocated under standard vivarium conditions: controlled temperature environment (21 ± 2 °C), 12-hour light-dark cycle and 70% relative humidity; water and standard rodent chow were offered “ad libitum.” The animals were also acclimatized for seven days before the start of the experimental protocol. All procedures in this study were in accordance with the guidelines for Biomedical Research Involving Animals from the Council for International Organizations of Medical Science (CIOMS) and approved by the Ethics Committee on the Use of Animals (protocol number: 38964).

 Sample size calculation

The calculation of the sample size was performed using the G*Power 3.1.9.2 software (Schleswig-Holstein, Germany). Probability of error α = 0.05, statistical test power = 0.80 and effect size = 0.4 were considered.

 Vessel preparation for vascular reactivity

Rats were anesthetized with ketamine (90 mg/kg, intraperitoneal) and xylazine (10 mg/kg, intraperitoneal) simultaneously and euthanized by decapitation. After euthanasia, the aortas were quickly isolated and kept in Krebs-Henseleit buffer solution (NaCl 115 mM, CaCl2 2.5 mM, KCl 4.6 mM, KH2PO4 1.2 mM, MgSO4. 7 H2O 1.2 mM, NaHCO3 25mM, dextrose 11.1 mM, Na2EDTA 3 mM), at 37 °C and pH 7,4, under 95% O2–5% CO2. Adipose and connective tissues were carefully removed, and the aortas were cut into cylindrical segments of 4 mm in length. In some experiments, the endothelium was mechanically removed by gently rubbing the inner surface of the aorta’s segments using a stainless-steel wire. Two hooks of stainless-steel wire bent in a modified L-shape were used to mount each ring in organ bath chambers (AVS Projetos, São Carlos, SP, Brazil). The short, straight portion of each hook passed through the lumen of the ring. The lower hook was attached to the base of the organ chamber filled with 10 mL of Krebs-Henseleit buffer solution, and the upper hook to a strain gauge. Isometric tension was recorded using a force-displacement transducer (TIM-100; AVS Projetos, São Carlos, SP, Brazil) connected to an acquisition system (AQCAD 2.0.5; AVS Projetos, São Carlos, SP, Brazil). The segments were subjected to a basal tension of 1.0 gf, which was adjusted every 15 minutes during an initial 45-minute equilibration period.

The integrity of the endothelium was verified through incubation with acetylcholine (10 µM). A relaxation equal to or greater than 90% of maximum contraction induced by phenylephrine (1 µM) was considered demonstrative of the functional integrity of the endothelium. Each ring was sequentially washed with Krebs-Henseleit buffer solution, re-equilibrated for 45 min and basal tensions were recorded.

 Vascular reactivity studies

The experimental incubation protocol is represented as follows: a) verification of a T3 dose-response curve (10-8 to 10-4 M) on both intact- and denuded-endothelium aortic segments precontracted with phenylephrine 1µM; b) pre-exposition of both intact- and denuded-endothelium vessels to T3 (10-4M), to show the lowest phenylephrine induced contractile response; c) verification of T3 (10-4M) on intact-endothelium aortic segments precontracted with phenylephrine 1µM and exposed to a nonspecific NO synthase (NOS) inhibitor, NG-nitro-L-arginine methylester (L-NAME; 10 µM) for 20 min. T3 was diluted in Krebs-Henseleit buffer, and solutions were prepared daily and protected from light. The control group consisted of the addition of the same volumes of Krebs-Henseleit buffer solution without T3.

 Preparation of aorta for in vitro assays

Aortas were homogenized for 40 seconds (OMNI Tissue Homogenizer, OMNI International, Kennesaw, GA, USA) in the presence of RIPA buffer 1:10 (5ml/g of tissue) with fluoride phenyl-methyl-sulfonyl (PMSF) (100 mM) 1% (v/v). The homogenate was centrifuged for 10 min at 8,000xg in a refrigerated centrifuge (4 °C) (Sorvall RC 5B – Rotor SM 24, Sorvall, Waltham, MA, USA), and the supernatant was collected for further analysis.

 Hydroxyl radical generation system

To verify the role of T3 on redox balance, the aorta’s homogenate supernatants were incubated with T3 (10-4M) for 15 min at 37°C. The group that did not receive T3 was incubated with distilled water in the same volume. After this, samples were incubated for 30 min at 37°C with FeCl2 (20µM), H2O2 (50mM), and ascorbic acid (1mM) to induce oxidative stress (hydroxyl radical generation system).16 These samples were used for biochemical evaluation.

 Biochemical analyses Dosage of proteins

Proteins were quantified using the method described by Lowry et al.17 and were measured in a spectrophotometer (Anthos Zenyth 200 rt, Biochrom, Cambridge, UK) at 625 nm. The results were expressed in mg/mL.

 Total ROS determination

Total ROS levels in the vessel homogenates were detected using 2′,7′-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), as previously described.18 DCFH-DA is oxidized to fluorescent 2,7-dichlorofluorescein (DCF) in the presence of ROS. Samples were excited at 488 nm, and the emissions were collected with a filter of 525 nm (LS 55 Fluorescence Spectrometer, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). Results were expressed in nmol DCF/mg protein.

 Lipid peroxidation

Lipid peroxidation was evaluated by the production of chemiluminescence initiated by the addition of tert-butyl hydroxide (TBOOH).19 Chemiluminescence was measured in a scintillation spectrometer (LKB Wallac Rack Beta Liquid Scintillation Spectrometer 1215, Australia) operating as a luminometer and with a phototube emission sensor in the range of 380–620 nm. Results were expressed as counts per second cps/mg protein.

 NADPH Oxidase Activity

NADPH oxidase activity was based on monitoring NADPH consumption at 340 nm (Anthos Zenyth 200 rt, Biochrom, Cambridge, UK). The results were expressed as nmol NADPH/min/mg protein.20

 Superoxide Dismutase (SOD) activity

Determination of SOD activity was based on the inhibition of the reaction of the superoxide radical anion with pyrogallol.21 The results were expressed as U SOD/mg protein.

 Catalase activity

Catalase activity was evaluated by measuring hydrogen peroxide decomposition rate spectrophotometrically at 240 nm.22 The results were expressed in nmol/min/mg protein.

 Statistical analysis

All data sets were submitted to Shapiro-Wilk normality test. Experiments testing different doses of T3 over time compared to Control were analyzed by factorial ANOVA complemented with Bonferroni’s post-hoc test for multiple comparisons. Experiments comparing fixed dose of T3 (10-4 M) pre-incubation effect on vasoconstriction elicited by phenylephrine and T3 (10-4 M) effect on aortic rings pre-incubated with L-NAME to Control group were analyzed by unpaired T-tests. Redox balance experiments were analyzed by two-way ANOVA complemented with Bonferroni’s post-hoc test for multiple comparisons apart from total ROS levels, which was analyzed using Kruskal-Walli’s test complemented with Dunn’s post-hoc test for multiple comparisons. Results were expressed as mean ± standard deviation for all data sets but total ROS levels, whose results were plotted as a scatter dot plot graphic depicting the median and the interquartile range for each data set. GraphPad Prism 8.0.2 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) was used to analyze data. Data were considered significant when p < 0.05.

 Results T3 promotes relaxation of aortic segments

Considering the intact vessel, T3 at 10-4M induced relaxation of phenylephrine-induced precontracted aortas compared to the control group (Figure 1A). Removal of endothelium did not abrogate the T3 (10-4M)-induced vasorelaxation effect (Figure 1B).

– Effect of T3 on vascular relaxation of aortic segments (A) in the presence of endothelium (END+) and (B) in the absence of endothelium (END-) precontracted with phenylephrine. Values represented as mean ± standard deviation (SD), n = 6-8 aortic rings per group. Factorial ANOVA followed by Bonferroni’s post-test. *Significant difference between Control and T3 (10-4 M) groups; p < 0.05.

T3 decreases vasocontraction response induced by phenylephrine

Pre-exposition of intact aortic segments to T3 (10-4M) resulted in a reduced phenylephrine-induced contraction compared to the control group (Figure 2A). Nevertheless, the same outcome was not observed in preparations without the endothelium (Figure 2B).

– Effect of T3 (10-4 M) pre-incubation on vasocontraction of aortic segments elicited by phenylephrine (A) in the presence of endothelium (END+) and (B) in the absence of endothelium (END-). Values represented as mean ± standard deviation (SD), n = 6-10 per group. Unpaired t-test. *Significant difference between Control and T3 groups; p < 0.05. ∆T/aorta weight = ratio of tension variation by vessel weight.

T3 exhibits a NOS-independent vasorelaxation effect

Intact-endothelium vessels were preincubated with L-NAME, an unspecific inhibitor of NOS, prior to T3 (10-4M) incubation. Even in the presence of L-NAME, T3 (10-4M) still resulted in relaxation (~20%) of phenylephrine-induced precontracted aortic segments as compared to the control group (Figure 3).

– Effect of T3 (10-4 M) on vascular relaxation of intact-endothelium aortic rings preincubated with L-NAME. Values represented as mean ± standard deviation (SD), n = 6 per group. Unpaired t-test. *Significant difference between Control and T3 groups; p < 0.05.

T3 reduces NADPH oxidase activity and improves SOD activity <italic>in vitro</italic>

Even though ROS total concentration and lipid oxidation were not different between the groups (Figure 4A and 4B), NADPH oxidase activity was reduced when samples were exposed to T3 (10-4M) compared to control groups (Figure 4C). SOD activity was increased in T3 (10-4M) incubated vessels compared to control groups (Figure 4D). Catalase activity was increased only in the groups that received the oxidative stress induction (Figure 4E).

– Effect of T3 (10-4 M) incubation on (A) level of total reactive oxygen species (ROS), (B) lipid oxidation, (C) NADPH oxidase activity, (D) superoxide dismutase (SOD) activity and (E) catalase activity in aorta’s homogenates. Values represented as median with interquartile range for (A) and mean ± standard deviation (SD) for (B) to (E), n = 4-6 per group. Kruskal-Walli’s test was complemented with Dunn’s post-hoc test for (A), and two-way ANOVA was complemented with Bonferroni’s post-hoc test for (B) to (E). *Significant difference between Control and T3 groups in two-way ANOVA; p<0.05. #Significant difference between (OS-) and (OS+) groups; p<0.05. OS- = groups without oxidative stress (hydroxyl radical generation system) induction; OS+ = groups with oxidative stress (hydroxyl radical generation system) induction.

Discussion

The main results of the present study comprise that T3 induced vasodilatation of intact- and denuded-endothelium aortic rings precontracted with phenylephrine in experimental model ex vivo, whose protocol was designed for vascular reactivity evaluation. Moreover, T3 plays a pivotal role in redox homeostasis, since this hormone reduces NADPH oxidase activity and increases SOD activity of aortic vessels in vitro (Central Illustration).

Oxidative stress, hypoxia, atherosclerosis, and inflammation are examples of triggers of vasoconstrictor events, which promote an imbalance between vasodilation and vasoconstriction, adverse vascular muscle remodeling and endothelial damage.23 Together, these factors support many diseases such as stroke, myocardial infarction, and hypertension.24 Therefore, it is important to explore the underlying mechanisms of vessel reactivity to propose therapeutic alternatives that may contribute to vascular disease management. Our experimental model focused on the evaluation of the vascular response of isolated aortas in the presence of T3. Incubation with phenylephrine induced contraction of aortic rings, which were subsequently subjected to different doses of T3. Our results showed that T3, at a concentration of 10-4 M, reduced phenylephrine-induced vasoconstriction. Corroborating with our data, Carrillo-Sepulveda et al.,13 using aortas from female Dahl salt-sensitive rats subjected to a high-salt diet, showed that the pre-incubation with T3 reduced the hypercontractile state of the vessels and improved the vasodilator response. In the experimental model of myocardial infarction, Ortiz et al.12 found that treatment with T3 and T4 (2 and 8 μg/100 g/day, respectively, orally for 12 days) augmented the immunocontent of VEGF and HIF-1α in the aorta of infarcted rats, which are proteins involved with angiogenesis in a hypoxic scenario. Additionally, VEGF also induces vasodilatation.25

Evaluating endothelium involvement in TH vasodilatation effect, our results showed that T3 administration caused a reduction in vascular constriction induced by phenylephrine in aortas with and without endothelium. However, in the aortas preincubated with 10-4 M T3, the absence of endothelium significantly affected its capability to prevent an increase of vascular tension evoked by phenylephrine. In view of that, it is possible that, in intact vessels, T3 can promote vasodilatation through a combination of endothelium-dependent and endothelium-independent mechanisms. In vessels without endothelium, vasodilation is maintained on account of independent mechanisms, but the ability of T3 to reduce vascular tension decreases. These results highlight the relevance of endothelium in the total effect of T3 on vessels. Due to this result, it was necessary to investigate the role of NO in the process of vasodilation induced by T3, since endothelium is an important source of this vasodilator molecule.

The role of T3 on the endothelium and the vasodilator mechanisms involved in this relationship have been explored in recent years, highlighting the relevance of NO-dependent signaling pathways.26 In addition, TH is capable of increasing the activity of nitric oxide synthase in erythrocytes, favoring the production of NO in the blood and improving NO bioavailability in the circulation.27 In the present study, when aortic rings were pre-incubated with L-NAME, a known NOS inhibitor, T3 vasodilatory action persisted. Such data support the hypothesis that T3 may also induce vasodilatation through a NO-independent and endothelium-independent mechanism. These results did not decrease the importance of the endothelium for the effect of this hormone; they demonstrated the capability of T3 to promote dilatation in the context where the endothelium is removed/damaged. Samuel et al.28 suggested that this NO-independent effect is associated with the modulation of the protein kinase G/vasodilator-stimulated phosphoprotein (PKG/VASP) pathway directly on the vascular smooth muscle cells. Furthermore, the antioxidant effect of low doses of thyroid hormones can also improve vascular dysfunction and contribute to a relaxed vascular tone.12,13

Although ROS are important in controlling vascular tone, when their concentrations exceed the tissue’s antioxidant capacity, oxidative stress is established. Disruption of redox homeostasis promotes vessel damage, oxidizes low-density lipoproteins, and causes atherosclerosis. The inflammatory process associated with these events leads to adverse vessel remodeling, decreasing vasodilator agents, and increasing the level of vasoconstriction.29 Our results show that incubation with T3 reduced NADPH activity in the aorta under experimental oxidative stress conditions established in vitro. In fact, NADPH oxidase plays an important role in the formation of ROS in blood vessels. These species can promote an oxidized cellular environment, leading to NOS uncoupling and increased production of superoxide anion radicals instead of NO. Furthermore, free radicals, such as superoxide anion, often act as NO scavengers, reducing their bioavailability and impairing vasodilatation.30 In this regard, Ortiz et al.12 also found a reduction in the activity of NADPH oxidase in the aorta of infarcted rats treated with thyroid hormones, while De Castro et al.11showed that TH administration is capable of reducing ROS in the heart of infarcted rats. In terms of total ROS levels, however, the present study did not find differences among groups. A similar result was found for lipid oxidation evaluation. These results may have arisen since aortas from healthy animals were used. Within this context, these vessel samples were induced to oxidative stress through the generation of a hydroxyl model, in which samples were incubated with FeCl2, H2O2 and ascorbic acid for 30 min at 37°C. In a previous study evaluating the aorta of infarcted rats, however, TH administration promoted a decrease in ROS levels.12 Nonetheless, the ability of T3 to decrease NADPH oxidase activity already demonstrates a vasoprotective effect of this hormone. Furthermore, when we evaluated antioxidant enzymes, T3 administration induced an increase in SOD activity in vascular tissue. SOD converts the radical superoxide anion into hydrogen peroxide, reducing the levels of this free radical, which supports a state of increased NO bioavailability, consequently improving the vessel’s relaxation capacity. In fact, our results show that T3 promotes a scenario that favors an improvement in NO bioavailability, contributing to the mechanism of endothelium-dependent vasodilation. These data corroborate other studies that show the vasoprotective role of thyroid hormones.12 When we evaluated catalase activity, only the aortas submitted to oxidative stress presented an increase in this enzyme activity. These results indicate a compensatory mechanism of the enzymatic antioxidant system in response to redox imbalance; however, T3 administration did not modify catalase activity. Concerning this result, a study evaluating the TH effects of erythrocytes of infarcted rats demonstrated an increase in catalase activity in the blood cells of treated animals.27 In view of this, it is possible that, under the effect of T3, erythrocytes will contribute more to the activity of this antioxidant enzyme than the vessel wall itself.

Limitation of the study

The impossibility of exploring protein expression directly in the aortic rings used in vascular reactivity was a limitation of the study. Evaluating the expression of proteins such as endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and signaling PIK3/AKT pathway, as well as antioxidant proteins, such as Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2), in the same sample incubated with T3 and subjected to vasoconstriction and vasodilation protocols, would have contributed to the mechanistic understanding of observed outcomes. However, the small size of the aortic rings and the wires used in the vascular reactivity protocol reduce the degree of reliability for subsequent molecular biology experiments using the same sample. Another limiting aspect of this article is the lack of evaluation of other resistance vessels, such as small arteries and arterioles, to check whether the effect of T3 on the aorta could be extrapolated. Indeed, the contractile state of small arteries and arterioles is responsible for defining vascular resistance, which is a key determinant of blood pressure. Structurally, resistance arteries have one or two layers of the vascular smooth muscle cell (VSMC), while conduit arteries, such as the aorta, have about 15 layers of VSMC. In this context, the endothelial cells of resistance arteries project the plasmatic membrane to the VSMC layer through internal elastic lamina (myoendothelial projections). The myoendothelial projections connect to the VSMC through gap junctions that facilitate electrical communication between the two cell layers.31 In this context, the hyperpolarization of endothelial cells is transmitted to the VSMC, consequently relaxing the vessels; therefore, this is the main mechanism for endothelium-dependent vasodilation of resistance arteries. On the other hand, such a mechanism differs for the aorta, for example, since myoendothelial projections are often absent in conduit vessels. Thus, NO-mediated vasodilatation is the primary mechanism in this scenario.

 Conclusion

Based on the data obtained, it is possible to conclude that T3 has an important vasodilator role, which is maintained even in the absence of the endothelium. In addition, this hormone can decrease the activity of the pro-oxidant enzyme NADPH and increase the activity of the antioxidant enzyme SOD. These results point to a beneficial effect of this hormone on vascular redox balance and peripheral resistance. This scenario favors a greater bioavailability of NO, which also contributes to the endothelium-dependent vasodilation mechanism. Within this context, these data endorse other studies that demonstrate the beneficial effects of thyroid hormones on the circulatory system.

Study association

This article is part of the thesis of master submitted by Viviane Pederiva, from Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) under the protocol number 38964. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.

Sources of funding: This study was partially funded by CNPq/FAPERGS.