Segundo estimativas da Organização Mundial da Saúde, a morte de aproximadamente 23,6 milhões de pessoas ocorrerá até 2030 em decorrência de doenças cardiovasculares.¹ Mesmo com a grande variedade de tratamentos existentes, a hipertensão arterial continua a ser a principal causa de morte cardíaca em todo o mundo, sendo responsável por 10,4 milhões de mortes por ano, com o maior número de indivíduos afetados pela hipertensão em países de baixa e média renda.^2-5

Embora existam diversas terapias modernas para o tratamento da hipertensão, ela continua sendo a principal causa de doenças cardiovasculares, como cardiopatia isquêmica, insuficiência cardíaca e acidente vascular cerebral, agravadas pelo envelhecimento populacional.^6-9

Devido ao caráter assintomático, a hipertensão arterial sistêmica pode evoluir com alterações estruturais e/ou funcionais em órgãos-alvo (coração, cérebro, rins e vasos).¹⁰ É importante buscar novas estratégias para a prevenção e o tratamento da hipertensão; dessa maneira, foram projetadas novas N-acilidrazonas, sintetizadas a partir da 3,4-metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona (LASSBio-294) para testar a atividade vasodilatadora. O LASSBio-294, caracterizado como agente inotrópico cardíaco positivo com atividade vasodilatadora, preveniu a disfunção cardíaca induzida por infarto do miocárdio em ratos normotensos e hipertensos, possivelmente devido à ativação de receptores de adenosina A_2A.^11-16 Para melhorar a interação entre a molécula e seu sítio de ação, os novos compostos possuem o átomo de enxofre (–S) em vez de selênio (–Se), o que confere uma conformação restrita, levando a uma melhor interação composto-receptor¹⁷ e, consequentemente, aumentando a potência vasodilatadora. Algumas alterações na estrutura molecular poderiam gerar compostos com mecanismos de ação multialvos, favorecendo a adesão dos pacientes à terapia, uma vez que a polifarmácia é comum para o controle da hipertensão arterial na maioria dos pacientes.¹⁸ A busca por novas terapias para hipertensão é uma tentativa de aumentar a adesão dos pacientes ao tratamento, pois este é um grande desafio para os cardiologistas, devido ao uso de múltiplos medicamentos e/ou administrações, alta incidência de efeitos adversos e doença primária não diagnosticada.^{19, 20}

O principal objetivo deste estudo foi identificar uma nova N-acilidrazona, na qual a substituição do átomo de enxofre pelo selênio pudesse aumentar a atividade vasodilatadora e produzir um efeito anti-hipertensivo. Com base nos resultados, foi selecionado o LASSBio-2062, que foi um vasodilatador potente através da ativação dos receptores de adenosina A₃ e dos canais K. O LASSBio-2062 poderia ser uma nova abordagem à monoterapia para hipertensão, uma vez que promoveu a normalização da pressão arterial em ratos espontaneamente hipertensos (SHR).

Os experimentos estavam de acordo com o Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio de Janeiro (017/19). Os animais incluídos neste estudo foram divididos aleatoriamente, com base no peso e/ou idade. Cinco ratos Wistar machos (220 a 250 g) ou quatro SHR machos (12 a 15 semanas e 220 a 250 g) foram utilizados para cada protocolo conduzido em experimentos in vitro e in vivo, respectivamente. Os SHR foram tratados com injeção intravenosa de dose única de LASSBio-2062 e foram eutanasiados com administração intraperitoneal (IP) de tiopental (120 mg/kg) imediatamente após a medição da pressão arterial.²¹ Todos os animais foram mantidos sob controle de temperatura e ciclo claro/escuro de 12 horas, com acesso a água e alimentos ad libitum.

A semelhança nas propriedades químicas do enxofre e do selênio incentivou o design, a síntese e a avaliação comparativa de uma ampla variedade de moléculas contendo selênio. Porém, existem diferenças nas propriedades físico-químicas entre substâncias que contêm enxofre ou selênio em suas estruturas, que constituem a base para a promoção de efeitos biológicos específicos. Entre as diversas funções biológicas promovidas pelo selênio, tem sido descrita a ação antioxidante.²³

As novas N-acilidrazonas testadas visaram identificar novos agentes anti-hipertensivos que pudessem, além de reduzir a pressão arterial, interferir no estresse oxidativo, que é uma condição comum na hipertensão arterial. A comparação entre os compostos demonstrou aumento da potência do relaxamento vascular independente do endotélio induzido pelo LASSBio-2062, que teve substituição do anel tiofênico pelo anel selenofênico. A N-metilação observada no LASSBio-2063 proporcionou não somente o aumento da potência da ação vasodilatadora, mas também a independência da integridade do endotélio vascular, semelhantemente ao observado para o LASSBio-785, que apresenta N-metilação em seu estrutura, mas com átomo de enxofre.²⁴ A N-metilação parece estar envolvida com o aumento da potência, possivelmente porque o grupo metil, ligado à ligação amida da N-acilidrazona, é capaz de induzir alteração na conformação da estrutura molecular da substância. Assim, a avaliação desses novos derivados reafirma que as modificações estruturais introduzidas pelo grupo metil são essenciais tanto para o aumento da eficácia e da potência vasodilatadora quanto para alterações nas vias envolvidas para o efeito vascular.²⁴ A abertura do anel benzodioxol, além da substituição do átomo de enxofre pelo selênio (LASSBio-2075) resultou em relaxamento vascular dependente da integridade endotelial, diferentemente do LASSBio-430, que possui um átomo de enxofre em sua estrutura.

Dentre todos os derivados testados, apenas o LASSBio-2084 não apresentou melhora na potência em comparação ao protótipo LASSBio-294, indicando que a para-metoxilação reduziu tanto a potência quanto a eficácia da substância para relaxamento vascular, características revertidas pela presença do átomo de selênio (LASSBio-2076). Os derivados metoxilados na meta-posição contendo átomo de enxofre (LASSBio-2092) ou selênio (LASSBio-2093) não apresentaram alteração significativa da potência.

A substituição do anel tiofênico pelo anel selenofênico proporcionou aumento ou manutenção da potência de relaxamento vascular, que foi mediada pela ativação de receptores presentes no endotélio vascular. Assim, a N-metilação proporciona relaxamento vascular diretamente relacionado à ação na musculatura lisa vascular, de forma semelhante ao LASSBio-785, que é N-metilado, com átomo de enxofre.²⁴ A ação direta na musculatura lisa vascular produzida pelo LASSBio-2063, LASSBio-430 e LASSBio-2092 pode ser vantajosa devido ao fato de que a disfunção endotelial e o remodelamento vascular que ocorrem na hipertensão arterial podem prejudicar a vasodilatação dependente do endotélio.²⁵

As modificações estruturais e os respectivos resultados principais quanto às alterações de potência dos derivados N-acilidrazônicos avaliados neste estudo estão resumidos na Figura 7.

Os mecanismos envolvidos na ação vasodilatadora e no efeito anti-hipertensivo induzidos pelo LASSBio-2062 foram investigados pelos seguintes motivos: (1) sua semelhança com a estrutura química do LASSBio-294 (protótipo) diferia apenas pela substituição do anel tiofênico pelo anel selenofênico; e (2) apresentou potência 4 vezes maior que o protótipo²⁶ em promover relaxamento vascular com ação no endotélio e na musculatura lisa vascular.

A ação vasodilatadora devido à ativação de receptores de adenosina subtipo A_2A, localizados tanto na musculatura lisa vascular quanto no endotélio, já foi demonstrada anteriormente para muitos derivados N-acilidrazônicos.^16,26,27 Assim, foi inicialmente investigado o envolvimento de receptores de adenosina A_2A para relaxamento vascular induzido pelo LASSBio-2062. A eficácia e a potência não foram alteradas na presença de um antagonista do receptor de adenosina A_2A, devido ao fato de que a relação entre a concentração e o relaxamento vascular permaneceu inalterada, sugerindo a não participação da ativação desses receptores no tecido vascular (Figura 3A).

Visto que a ativação dos receptores de adenosina A₃ também desempenha um papel importante no processo de relaxamento vascular,²⁸ a ação do LASSBio-2062 foi avaliada na presença do antagonista MRE 3008F20. A potência e a resposta máxima de relaxamento vascular foram reduzidas na presença do antagonista do receptor de adenosina A₃, indicando a participação da ativação desses receptores na vasodilatação induzida por esses derivados (Figura 3B). Nas artérias coronárias de ratos, a ativação de receptores de adenosina do subtipo A₃²⁹ pelos agonistas N₆-(3-iodobenzil)-adenosina-5’-N-metiluronamida (IB-MECA) e 2-cloro-N₆-(3-iodobenzil)-adenosina-5’-N-metilcarboxamida (Cl-IB-MECA) produz vasodilatação coronária.³⁰

A cardioproteção ocorre com a ativação dos receptores de adenosina A₃, que é abolida pela glibenclamida, um bloqueador do canal de potássio sensível a ATP, indicando que esse receptor pode interferir na ativação desses canais, resultando na sua abertura^31-33 e hiperpolarização celular. Não foi observado relaxamento vascular induzido pelo LASSBio-2062 após pré-incubação com glibenclamida em anéis aórticos sem endotélio funcional (Figura 4A). A ativação de canais de potássio sensíveis a ATP expressos na musculatura lisa vascular leva à hiperpolarização da membrana celular do músculo vascular, promovendo vasodilatação.³⁴ A ativação dos receptores de adenosina A₃ influencia a atividade dos canais de K+, especialmente dos canais de potássio sensíveis a ATP, podendo induzir sua abertura,^{35, 36} o que resulta em hiperpolarização e consequente bloqueio dos canais de Ca²⁺. A redução do influxo de cálcio leva à menor concentração intracelular de cálcio e resulta em vasodilatação³⁴ (Figura 8).

Dessa maneira, a ativação do receptor de adenosina A₃ promove a inibição da adenilato ciclase via proteína Gi e, consequentemente, leva à redução da produção de adenosina monofosfato cíclico. O receptor de adenosina A₃ também está acoplado à proteína Gq, que ativa a proteína quinase C, que interage com canais de cálcio no retículo sarcoplasmático e canais de potássio sensíveis a ATP para promover vasodilatação.^28,31,37,38 Além disso, através da ativação de proteínas Gi/o, via subunidades Gβγ, resulta na ativação de canais de potássio sensíveis a ATP e na redução da entrada de cálcio no ambiente intracelular.³⁹ A ativação de canais de potássio sensíveis a ATP pelo LASSBio-2062 pode ocorrer diretamente neste canal e/ou através da ativação do receptor de adenosina A₃. A ativação dos canais de potássio pelo LASSBio-2062 não se restringe ao canal de potássio sensível a ATP, uma vez que a vasodilatação foi inibida pela exposição aos antagonistas dos canais de potássio voltagem-dependentes e cálcio-dependentes (Figura 4B e 4C, respectivamente).^{40, 41} A ativação desses canais pode ser um alvo farmacológico alternativo ao tratamento da hipertensão arterial. O maior efluxo de potássio, através de diferentes canais de potássio ativados pelo LASSBio-2062, resultaria em hiperpolarização das células musculares lisas, o que poderia levar ao fechamento dos canais de cálcio e à consequente redução da concentração intracelular de cálcio e vasodilatação. De acordo com os resultados obtidos, o LASSBio-2062 pode promover vasodilatação ativando o receptor de adenosina A₃ e os canais de K+ e bloqueando diretamente os canais de Ca²⁺, conforme indicado na Figura 8.

Alterações estruturais dos receptores de adenosina A₃ ou alterações nos diferentes estágios da via de sinalização interferem no desenvolvimento da hipertensão arterial essencial. Os receptores de adenosina A₃ encontrados em humanos estão envolvidos em várias funções citoprotetoras, enquanto sua ativação está ligada a efeitos anti-inflamatórios e cardioprotetores.⁴² O agonista do receptor de adenosina A₃, namodenoson, tem efeitos anti-inflamatórios, antifibróticos e de anti-esteatose, uma vez que mostrou resultados promissores em um estudo de fase III para o tratamento do câncer de fígado e em um estudo de fase II para o tratamento da esteatohepatite não alcoólica. A namodenoson atua ativando os receptores de adenosina A₃, inibindo a produção de citocinas inflamatórias como fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina (IL)-12, interferon-ɣ, IL-17 e IL-23 e regulando negativamente o NF-κB.⁴³ Existe uma regulação negativa da expressão do receptor de adenosina A₃ no coração de animais hipertensos,²⁸ indicando que esses receptores são potenciais alvos farmacológicos para o tratamento da hipertensão arterial. O efeito vasodilatador do LASSBio-2062 pode ser mediado pela ativação do receptor de adenosina A₃ e sua administração intravenosa em SHR reduziu a pressão arterial média nas duas doses utilizadas, 10 e 30 μmol/kg (3 e 10 mg/kg). Quando comparamos o efeito anti-hipertensivo do LASSBio-2062 com alguns medicamentos clinicamente disponíveis, identificamos que a inibição dos efeitos da angiotensina II pelo inibidor da enzima conversora de angiotensina enalapril ocorre com a administração intravenosa de 8,2 μg/kg em ratos.⁴⁴ Em contrapartida, a ação anti-hipertensiva desse agonista do receptor de adenosina A₃ foi comparável à descrição da administração intravenosa em ratos hipertensos do anti-hipertensivo losartana (10 mg/kg de antagonista do receptor da angiotensina II).⁴⁵

A ocorrência de bradicardia após administração intravenosa de LASSBio-2062 pode ser benéfica devido à ausência das características de taquicardia reflexa de muitos medicamentos vasodilatadores.⁴⁶

Devido à ativação dos canais de potássio sensíveis a ATP induzida pelo LASSBio-2062, seria esperado o surgimento de efeitos colaterais adversos, como hiperglicemia, por causa da possível redução da liberação de insulina nas células beta pancreáticas.^{41, 47} Entretanto, há uma diferença entre as subunidades dos canais de potássio sensíveis a ATP nos vários tecidos onde são expressos, que incluem pâncreas, cérebro, coração e músculo liso e esquelético.⁴⁸ O LASSBio-2062 usado como agente anti-hipertensivo provavelmente não afetaria pacientes com diabetes, pois os canais de potássio sensíveis a ATP presentes nos vasos são diferentes daqueles localizados no pâncreas. A ausência de alteração no nível de glicose plasmática após injeção intravenosa de LASSBio-2062 reforça a falta de interferência nos distúrbios metabólicos. A glicemia foi de 139,5 ± 5,0 e 127,0 ± 11,0 mg/dL 10 e 30 minutos após a injeção intravenosa do veículo. O tratamento com LASSBio-2062 (30 umol/kg, intravenoso) não alterou significativamente esse parâmetro com 172,0 ± 24,0 e149,5 ± 24,0 mg/dL.

O novo agonista do receptor de adenosina A₃, LASSBio-2062, representa uma alternativa terapêutica para o tratamento da hipertensão arterial, indicando que o sistema de adenosina é um novo potencial alvo farmacológico. A ativação do receptor de adenosina A₃ tem efeitos benéficos no sistema cardiovascular, pois atenua a condição aterosclerótica,⁴⁹ previne lesão de isquemia/reperfusão miocárdica⁵⁰ e induz vasodilatação coronariana.²⁸ Além disso, a ativação desses receptores expressos em neutrófilos, basófilos, eosinófilos e mastócitos reduz a resposta inflamatória.^51-54 Assim, a ativação dos receptores de adenosina A₃ pode, além de produzir vasodilatação, reduzir o componente inflamatório da hipertensão arterial sistêmica, sugerindo múltiplos efeitos benéficos, que são fatores importantes, por se tratar de uma doença multifatorial. O LASSBio-2062 parece atuar em múltiplos alvos, o que poderia facilitar o uso em regime de monoterapia ou combinado com outros medicamentos, proporcionando interação medicamentosa ideal e reduzindo a dose utilizada. A combinação é capaz de reduzir os efeitos adversos e melhorar o controle da doença.⁵⁵

Com exceção do LASSBio-2084, todas as N-acilidrazonas apresentaram ação vasodilatadora mais potente que o protótipo LASSBio-294, provavelmente devido à substituição do anel tiofênico pelo anel selenofênico. O aumento da potência indica melhora na interação alvo molecular-substância. O relaxamento vascular induzido pelo LASSBio-2062 pode ocorrer através da ativação dos receptores de adenosina A₃ e da ativação direta/indireta dos canais de potássio. A administração intravenosa de LASSBio-2062 promoveu efeito anti-hipertensivo, sugerindo que o receptor de adenosina A₃ é um alvo farmacológico inovador para o tratamento da hipertensão arterial.