Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC mQdTL7Yvkg7VgkwgP4TBpRt S0066-782X2023001100302 00302 10.36660/abc.20230395 Artigo Original Relação entre Níveis Plasmáticos Aumentados de Legumain e Propriedades da Placa Aterosclerótica Coronária 0000-0002-3753-8352 Deng Yunpeng Concepção e desenho da pesquisa e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Obtenção de financiamento 1 2 Fan Yudong Obtenção de dados Obtenção de financiamento 2 Wu Di Análise e interpretação dos dados Obtenção de financiamento 2 Zhang Zilong Análise estatística 2 Zhang Miaomiao Obtenção de dados 2 Huang Zhiping Obtenção de dados Obtenção de financiamento 2 Gao Yuxia Concepção e desenho da pesquisa e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 Department of Cardiology Tianjin Medical University General Hospital Tianjin China Department of Cardiology, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin – China Department of Cardiology Emergency General Hospital Beijing China Department of Cardiology, Emergency General Hospital, Beijing – China Correspondência: Yuxia Gao • Department of Cardiology, Tianjin Medical - University General Hospital, No. 154, Anshan Road, Heping District, Tianjin - 300052, China E-mail: gaoyuxiatjykdx@sina.com

Editor responsável pela revisão: Gláucia Maria Moraes de Oliveira

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo

 30 10 2023 10 2023 120 11 e20230395 14 06 2023 10 08 2023 16 08 2023 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Figura Central

: Relação entre Níveis Plasmáticos Aumentados de Legumain e Propriedades da Placa Aterosclerótica Coronária

Resumo Fundamento

Muitos estudos clínicos confirmaram que a legumain está intimamente relacionada à aterosclerose. Infelizmente, chegaram-se a conclusões diferentes e ainda faltam análises e estudos sobre as características da placa aterosclerótica em pacientes com níveis plasmáticos aumentados de legumain.

 Objetivos

Este estudo teve como objetivo investigar a correlação entre as características da legumain e da placa aterosclerótica coronariana.

 Métodos

Um total de 81 pacientes com doença cardíaca aterosclerótica coronariana (DCAC), incluindo 43 pacientes com angina instável (AI) e 38 pacientes com angina estável (AE), foram examinados por angiografia coronária. Foi realizado ultrassom intravascular (IVUS) para avaliar as características das placas ateroscleróticas coronarianas, e os níveis plasmáticos de legumain também foram medidos. Valores de p < 0,05 foram considerados significativos.

 Resultados

A concentração de legumain foi significativamente maior nos dois subgrupos de doença coronariana do que no grupo controle (todos p<0,001). As concentrações de legumain no grupo AI foram significativamente maiores do que no grupo SA (p=0,001). A área de placa, o índice de remodelamento (IR) e o índice de excentricidade (IE) no grupo AI foram significativamente maiores do que no grupo AE (p<0,001, p=0,001, p=0,001, respectivamente). Houve uma correlação positiva significativa entre os níveis de legumain e IR e IE em pacientes com AI e AE (todos p<0,05).

 Conclusões

Níveis plasmáticos elevados de legumain estavam intimamente relacionados com a ocorrência e gravidade da doença coronariana, e as lesões tendiam a ser instáveis. Espera-se que a legumain seja um potencial biomarcador inflamatório para o diagnóstico de doença coronariana e a identificação precoce de lesões coronárias instáveis.

 Doença da Artéria Coronariana Aterosclerose Biomarcadores Introdução

Há evidências crescentes de que a inflamação desempenha um papel crucial na formação da aterosclerose, na progressão das placas e na degradação de placas vulneráveis.1 Várias células inflamatórias e fatores inflamatórios estão envolvidos na formação da aterosclerose.2 As concentrações sanguíneas periféricas desses fatores inflamatórios estão intimamente ligadas à ocorrência e ao prognóstico de eventos cardiovasculares. Fatores inflamatórios como a proteína C reativa (PCR-as) estão significativamente elevados nos níveis sanguíneos periféricos de pacientes com doença coronariana aterosclerótica (DCAC) na fase aguda e têm sido amplamente utilizados na prática clínica.3

A legumain, também conhecida como asparagina endopeptidase, é uma cisteína protease lisossomal que desempenha um papel vital na apresentação de antígenos durante a resposta inflamatória.4 Recentemente, descobriu-se que ativa proteases como a metaloproteinase de matriz-2, que induz a degradação da matriz extracelular, desempenha um papel importante na formação de aterosclerose e placas vulneráveis, e é provavelmente um potencial preditor de aterosclerose.5 Embora estudos sobre legumain e aterosclerose tenham concluído uma forte correlação entre as duas, faltam pesquisas sobre as características das placas ateroscleróticas em pacientes com níveis plasmáticos aumentados de legumain.6 Este estudo investigou a correlação entre as características da legumain e da placa aterosclerótica coronariana em pacientes com doença coronariana.7

 Métodos População do estudo

Foram selecionados 81 pacientes, na faixa etária de 35 a 80 anos, incluindo 38 homens e 43 mulheres, internados no Hospital Geral de Emergência com diagnóstico previsto de doença coronariana entre setembro de 2021 e outubro de 2022. Todos foram confirmados como portadores de doença coronariana por angiografia coronária, e foi realizada uma ultrassonografia intravascular (IVUS). Esses pacientes foram diagnosticados com angina estável (AE, 38 casos) ou angina instável (AI, 43 casos) e apresentavam estenose da artéria coronária com redução de pelo menos 50% no diâmetro do lúmen e pelo menos 2,25 mm de diâmetro na angiografia coronariana.8 Trinta e sete indivíduos correspondentes às características de gênero e idade dos grupos experimentais foram inscritos como controles saudáveis. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes antes do estudo. O protocolo do estudo concordou com as diretrizes aprovadas pelo comitê de ética de nossa instituição. (Número de aprovação ética: K22-6; Número do ensaio clínico: ChiCTR2200058185).

AE foi definida como nenhuma alteração na frequência, duração ou intensidade dos sintomas anginosos com enzimas cardíacas normais nas últimas 6 semanas. AI foi definida como 1) angina de repouso, 2) novo início de angina acelerada nos últimos 2 meses, ou 3) angina acelerada, mas angina crônica estável em pacientes que não tiveram angina de repouso nos 2 meses anteriores.9 Os controles saudáveis foram aqueles pacientes sem achados coronarianos anormais. Os critérios de exclusão foram infarto agudo do miocárdio (IAM), lesões oclusivas crônicas, lesões calcificadas ou difusas, doença infecciosa ou autoimune, intervenção coronária percutânea prévia ou cirurgia de revascularização miocárdica, valvopatia, insuficiência cardíaca congestiva (FEVE < 40%), malignidade, doença hematológica, doença renal (creatinina plasmática ≥ 2,2 mg/dL) e doença hepática grave (níveis plasmáticos de alanina transaminase >120 U/L).

 Medição de legumain plasmática

O sangue venoso foi coletado de todos os indivíduos em jejum. O plasma foi extraído e armazenado a -80°C. As concentrações plasmáticas de legumain foram quantificadas utilizando o Quality ELISA Assay Kit (Elisa Biotech Systems, Shanghai, PR China). Os intervalos de detecção dos ELISAs usados para medir legumain foram de 2,5 ng/mL a 80 ng/mL. O coeficiente de variação intraensaio (%) e o coeficiente de variação interensaio (%) foram < 15%.10 Além disso, PCR-as, homocisteína, lipoproteína de baixa densidade (LDL-c) e outros exames laboratoriais foram concluídos simultaneamente.

 Exame de ultrassom intravascular (IVUS)

Após a conclusão da angiografia coronária, foi realizado exame de IVUS nos principais vasos afetados. O exame foi realizado utilizando aparelho IVUS da Boston Scientific e equipamento acompanhante.11 O cateter do IVUS foi enviado distalmente ao vaso alvo e avançou até o segmento proximal a uma velocidade de 0,5 mm/s por meio de dispositivo de retração automático.12 As imagens de IVUS foram continuamente registradas e analisadas quantitativamente por dois investigadores independentes e experientes em IVUS, cegos para este estudo usando software. Os segmentos de referência proximais e distais foram as seções transversais de aparência mais normal dentro de 10 mm distais e proximais à lesão, sem qualquer ramo lateral significativo. A membrana elástica externa (MEE) e a área de secção transversal do lúmen (AST) foram medidas e, em seguida, a AST da placa foi calculada (AST da MEE - AST do lúmen). Carga de placa = (AST do MEE - AST do lúmen)/AST do MEE multiplicado por 100%.13 De acordo com a maior espessura de placa e a espessura mínima de placa, foi calculado o índice excêntrico de placa (IE) (espessura máxima de placa - espessura mínima de placa/espessura máxima de placa) multiplicado por 100%. IE<0,5 foi considerado placa concêntrica; IE≥0,5 foi considerado placa excêntrica. O índice de remodelamento (IR) é definido como a AST da membrana de remodelamento da lesão dividida pela média da AST do segmento de referência. Geralmente, IR>1,05 indica remodelamento positivo e IR<0,95 indica remodelamento negativo.14

 Análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o pacote de software SPSS 25. O teste de Kolmogorov-Smirnov testou a normalidade das variáveis contínuas. Variáveis contínuas com distribuição normal são apresentadas como média±desvio padrão(DP) e comparadas pelo teste t de Student não pareado ou análise de variância unidirecional (ANOVA). Não houve mais utilização de testes post hoc na ANOVA, uma vez que a variável relevante não era o indicador principal. Variáveis com distribuição não normal foram representadas como medianas e intervalos interquartis e comparadas usando o teste U de Mann-Whitney ou o teste de Kruskal-Wallis (teste KW). O método Bonferroni foi usado para post hoc análise no teste KW. As variáveis categóricas foram expressas como frequências e porcentagens e comparadas pelo teste do qui-quadrado ou pelo método exato de probabilidade de Fisher.

As correlações entre legumain e variáveis como IR e IE foram avaliadas pela análise de correlação de Pearson ou Spearman. O valor diagnóstico da legumain para AI foi avaliado por meio de curvas características de operação do receptor (ROC). Os fatores de risco cardiovascular para AI foram avaliados por meio de análise de regressão logística múltipla. Um valor p bilateral de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

 Resultados Informações e características de base

As informações iniciais e as características de todos os pacientes estão resumidas na Tabela 1. Houve diferenças significativas entre os três grupos nos níveis séricos de LDL-c e usuários de estatinas (%).

– Características demográficas e bioquímicas de todos os participantes
Característica AI (n=43) AE (n=38) Controle (n=37) p
Idade, anos 67,0(57,0,71,0) 67,0(52,8,73,0) 66,0(56,0,73,0) 0,624
Masculino, n (%) 22(51,2) 16(42,1) 18(48,6) 0,707
IMC (kg/m2) 23h40(20h70,27h10) 24,35(20,23,26,33) 25,00(22,60,26,95) 0,361
Hipertensão, n (%) 22(51,2) 16(42,1) 16(43,2) 0,669
Diabetes mellitus, n (%) 20(46,5) 12(31,6) 9(24,3) 0,102
Tabagismo, n (%) 18(41,9) 17(44,7) 15(40,5) 0,931
Álcool (%) 21(48,8) 14(36,8) 14(37,8) 0,473
LDL-C (mmol/L) 2,72±0,98 2,53±0,87 2,18±0,73 0,024
HDL-C (mmol/L) 1,04(0,86,1,41) 1,02(0,85,1,24) 0,98(0,77,1,11) 0,431
Homocisteína (μmol/L) 13.04(11.23,16.44) 14.10(12.17,16.85) 13,98(11,76,15,71) 0,480
PCRas (mg/L) 1,03(0,66,1,78) 1,03(0,59,1,59) 0,98(0,57,1,92) 0,856
Glicose de jejum (mmol/L) 6,12(5,57,7,56) 5,91(5,23,7,14) 6.02(5.17,7.21) 0,483
Triglicerídeo (mmol/L) 1,98(1,30,2,40) 1,87(1,38,2,67) 1,47(1,22,2,14) 0,342
Colesterol (mmol/L) Usuário de estatina, n (%) 4,15(3,59,5,01)29(67,4) 3,99(3,64,5,18)27(71,1) 3,99(3,59,4,73)15(40,5) 0,873 0,012

As variáveis contínuas são apresentadas como médias ± DP, mediana (intervalo interquartil). Variáveis categóricas foram expressas como frequências e porcentagens. AI: angina instável; AE: angina estável; IMC: índice de massa corporal; LDL-C: lipoproteína de baixa densidade; HDL-C: lipoproteína de alta densidade; PCRas: proteína C reativa de alta sensibilidade.

 Níveis plasmáticos de legumain em todas as populações do estudo

Os níveis de legumain nos três grupos foram 25,90 [14,11, 34,19] ng/ml, 14,83 [10,45, 19,64] ng/ml e 8,55[6,70,11,81] ng/ml, respectivamente. As diferenças entre os grupos AI e AE, entre os grupos AI e controle e entre os grupos AE e controle foram estatisticamente significativas (p=0,001, p<0,001, p<0,001, respectivamente; Figura 1).

– Comparações dos níveis de legumain entre os três grupos. AI: angina instável; AE: angina estável; *p<0,01, **p<0,001.

Parâmetros do IVUS

Não houve diferenças entre os dois grupos em relação ao comprimento da lesão, diâmetro mínimo do lúmen (DLM), área mínima do lúmen (AML) ou carga de placa. A área de placa, IR e IE no grupo AI foram significativamente maiores do que no grupo AE (p<0,001, p=0,001, p=0,003, respectivamente, mostrados na Tabela 2).

– Parâmetros de IVUS em pacientes com AI versus pacientes com AE
Variáveis AI (n=43) AE (n=38) p
Comprimento da lesão, mm 31,77±8,80 31,60±7,86 0,930
DML, mm 1,47(1,33,1,67) 1,44(1,31,1,67) 0,716
AML, mm2 2,66(2,38,2,95) 2,62(2,09,3,02) 0,936
Área da placa, mm2 13,25±2,19 11,06±1,95 0,000
Carga de placa, % 76,66(71,12,81,29) 73,61(69,44,78,77) 0,195
Índice de remodelamento 0,99±0,15 0,89±0,12 0,001
Remodelamento positivo[n (%)] 17(39,5) 4(10,5) 0,003
Remodelamento negativo [n (%)] 16(37,2) 26(68,4) 0,005
Índice de excentricidade 0,68±0,11 0,60±0,13 0,003
Lesão excêntrica [n (%)] 39(90,7) 28(73,7) 0,043
Lesão concêntrica [n (%)] 4(9,3) 10(26,3) 0,043

As variáveis contínuas são apresentadas como médias ± DP, mediana (intervalo interquartil). Variáveis categóricas foram expressas como frequências e porcentagens. AI: angina instável; AE: angina estável; DML: diâmetro mínimo do lúmen; AML: área mínima do lúmen.

 Correlações da concentração de legumain com parâmetros de IVUS

Os coeficientes de correlação entre concentração de legumain e IR nos grupos AI e AE foram 0,523 e 0,553, respectivamente (todos p<0,001). Os coeficientes de correlação entre concentração de legumain e IE nos grupos AI e AE foram 0,486 (p=0,001) e 0,651 (p<0,001), respectivamente. Os dados acima indicaram uma correlação positiva significativa entre legumain e RI e entre legumain e placa IE em ambos os grupos AI e AE (mostrados na Figura 2).

– Correlações da concentração de legumain com índice de remodelamento (A,B) índice de excentricidade (C,D) nos grupos AE e AI. AE: angina estável; AI: angina instável.

Análise de regressão logística múltipla de fatores de risco cardiovascular para pacientes com AI

Para investigar fatores de risco cardiovascular em pacientes com AI, após incluir fatores de risco cardiovascular tradicionais, como tabagismo e LDL-C, realizamos análises de regressão logística múltipla juntamente com parâmetros de IVUS que diferiram entre os grupos AI e AE. A análise de regressão mostrou que os fatores de risco cardiovascular independentes para pacientes com AI foram concentração de legumain e área de placa coronariana (Tabela 3).

– Análise de regressão logística múltipla dos fatores de risco cardiovascular para os pacientes com AI
Razão de probabilidade (IC 95%) Valor p
AI
Concentração de legumain 1.198 1.058-1.356 0,004
Área de placa coronária 1.652 1.150-2.375 0,007

A variável dependente foi a presença de AI. As variáveis covariáveis incluíram idade, sexo, hipertensão, tabagismo ou não, diabetes mellitus, IMC, homocisteína, LDL-Cl, glicemia de jejum, triglicerídeos, colesterol total, concentração de legumain, IR, IE, e área de placa. AI: angina instável.

 Legumain como fator de diagnóstico de AI

A análise ROC foi realizada para determinar a sensibilidade e especificidade dos níveis de legumain no diagnóstico de AI. A área sob a curva ROC (AUC) dos níveis de legumain para o diagnóstico de AI foi de 0,789 (IC 95%: 0,689-0,888, p<0,001). A análise ROC mostrou que o valor de corte ideal do nível de legumain foi de 21,68 ng/mL, e a sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de AI foram de 65,1% e 92,1%, respectivamente. Estes resultados sugerem que a legumain está altamente correlacionada com lesões instáveis. Espera-se que seja um fator inflamatório confiável para o diagnóstico de doença coronariana, especialmente AI, para orientar a detecção clínica precoce de pessoas com alto risco de lesões nas artérias coronárias (mostradas na Figura 3).

– Curvas ROC (Receiver Operating Characteristic) da legumain para diagnóstico de AI. A área sob a curva da legumain foi de 0,789 (intervalo de confiança [IC] de 95%, 0,689–0,888, p<0,001).

Discussão

A aterosclerose coronariana é uma doença sistêmica com mecanismos específicos, complexos e ainda não totalmente compreendidos.15 Entre eles, os fatores inflamatórios desempenham um papel crucial na progressão da aterosclerose coronariana e na formação de placas instáveis, o que foi confirmado em muitos estudos anteriores.16

Como fator inflamatório, a legumain está envolvida na apresentação de antígenos durante a aterosclerose e pode induzir a formação e progressão de placas instáveis, como foi provisoriamente demonstrado em muitos estudos. Já em 2006, Papaspyridonos et al. identificaram um aumento significativo na expressão do gene legumain em placas ateroscleróticas instáveis.17 Em 2020, Hui Yang et al. investigaram a associação da legumain com infarto agudo do miocárdio e concluíram que a legumain é um preditor de mortalidade por todas as causas e um potencial alvo terapêutico no infarto agudo do miocárdio.18 Ao mesmo tempo, Lunde et al. cheguei quase à conclusão oposta.19 Eles concluíram que a legumain é regulada positivamente em eventos cardiovasculares agudos e está associada a melhores resultados. As razões para os diferentes resultados de experiências anteriores podem ser as seguintes: Existe uma interação complexa entre legumain e macrófagos M1 e M2, de modo que os efeitos anti-inflamatórios e pró-inflamatórios dos macrófagos exercem diferentes graus de influência em diferentes fases da doença. e outros fatores externos.20 Além disso, a função plaquetária está associada à liberação de legumain, e uma alta proporção de pacientes com doenças cardiovasculares utiliza medicamentos antiplaquetários como a aspirina, um fenômeno que também pode influenciar os resultados do estudo.21 Nossos resultados mostraram que os níveis de legumain foram significativamente maiores em pacientes com AI e AE do que em controles saudáveis, enquanto as concentrações de legumain no grupo de AI foram significativamente maiores do que aquelas em indivíduos com AE, sugerindo que níveis mais elevados de legumain estão associados ao desenvolvimento de doença aterosclerótica coronariana e a formação de lesões instáveis.

Neste estudo, não encontramos diferenças significativas no comprimento da lesão, DLM e AML comparando os parâmetros do IVUS dos vasos da lesão coronariana em pacientes dos grupos AI e AE. Notavelmente, a área da placa, o IR coronário e o IE da placa foram significativamente maiores no grupo AI do que no grupo AE. Além disso, a incidência de remodelamento positivo e placa excêntrica foi significativamente maior no grupo AI do que no grupo AE, e a diferença foi estatisticamente significativa. Isto também indicou que a gravidade e o risco da doença coronariana estão intimamente relacionados com a instabilidade da lesão, mas não necessariamente relacionados diretamente com a taxa de estenose dos vasos coronários. Em geral, as placas excêntricas são mais vulneráveis que as placas concêntricas e têm maior probabilidade de romper sob vários estresses intraluminais, que são mais frequentemente encontrados em segmentos de lesão instáveis.22 Além disso, o remodelamento positivo está amplamente presente nos segmentos de lesão aterosclerótica. De acordo com estudos anteriores de IVUS, as alterações vasculares na síndrome coronariana aguda são propensas a remodelamento positivo em comparação com lesões vasculares AE, e o remodelamento positivo está intimamente associado a eventos adversos, como ruptura de placa e trombose.23 Além disso, descobrimos que a legumain foi significativamente correlacionada positivamente com o IR e o IE da placa nos grupos AI e AE. Em resumo, o risco de desenvolver doença cardiovascular aterosclerótica aumenta em pessoas sem doença coronariana à medida que os níveis de legumain aumentam. Na população com doença coronariana, níveis mais elevados de legumain indicam lesões vasculares mais graves e placas mais instáveis.

Muitos fatores inflamatórios estão associados à aterosclerose, mas poucos apresentam alta especificidade e podem ser amplamente utilizados na prática clínica. Por exemplo, fatores inflamatórios tradicionais, como PCR-as e homocisteína, têm muitos fatores de influência, incluindo baixa especificidade e aplicação clínica limitada. O fator inflamatório legumain estudado neste estudo está altamente correlacionado com a doença aterosclerótica coronariana e é atualmente um tema de pesquisa importante por estudiosos. A análise de regressão logística multivariada sobre fatores de risco cardiovascular em pacientes com AI neste estudo também sugeriu ainda que o nível plasmático de legumain era um fator de risco cardiovascular independente em pacientes com AI (OR = 1,198, p = 0,004). A AUC para o diagnóstico de AI com o nível de legumain neste estudo atingiu 0,789, e a sensibilidade e a especificidade de um nível de legumain de 21,68 ng/mL para o diagnóstico de AI foram de 65,1% e 92,1%, respectivamente. Os resultados acima sugerem a viabilidade, precisão e especificidade do legumain para o diagnóstico de AI. Pode-se dizer que se prevê que a legumain se torne um fator inflamatório para o diagnóstico da doença aterosclerótica coronariana.24

Devido à falta de estudos anteriores e relatos na literatura sobre a concentração de legumain em pacientes com doença arterial coronariana e AI, o tamanho da amostra foi determinado por um estudo piloto neste estudo. A partir dos pré-experimentos, concluímos que a concentração de legumain para os três grupos de indivíduos foi de 21,18±12,28 ng/ml no grupo AI, 14,94±6,14 ng/ml no grupo AE e 8,75±3,01 ng/ml no grupo controle. O tamanho geral da amostra foi calculado em 99 casos (33 casos por grupo) usando o software PASS, e o tamanho final da amostra foi determinado em 118 casos, considerando a perda de acompanhamento e dados incompletos.

Nosso estudo tem várias limitações. Primeiro, este é um estudo de caso-controle, unicêntrico, não randomizado, com amostra pequena, falta de acompanhamento e incapacidade de explicar a causalidade. Em segundo lugar, o IVUS utilizado neste estudo não tinha capacidade de VH-IVUS, por isso foi impossível classificar as lesões com mais precisão.25 Terceiro, um subgrupo de pacientes com IAM não foi estabelecido neste estudo porque a realização de IVUS prolonga o tempo de operação e pode afetar o prognóstico dos pacientes. Finalmente, o IVUS tem resolução limitada na identificação de lesões coronárias e é menos capaz de identificar algumas lesões específicas do que a OCT.26

 Conclusões

Altos níveis plasmáticos de legumain estão intimamente associados ao desenvolvimento de doença aterosclerótica coronariana e à progressão de lesões instáveis. A detecção da legumain plasmática pode ajudar a identificar mais cedo pacientes com alto risco de doença coronariana, para que a intervenção possa ocorrer mais cedo e o prognóstico possa ser melhorado.

 Agradecimentos

Queremos agradecer aos muitos coordenadores de estudo e voluntários que ajudaram a facilitar o recrutamento de pacientes e a coleta de amostras. Obrigado à AJE pela revisão meticulosa deste manuscrito. Obrigado a todos os autores que trabalharam neste experimento. Yuxia Gao e Yunpeng Deng contribuíram para o conceito e design do estudo e supervisionaram o projeto; Yunpeng Deng realizou a maioria dos experimentos, a análise estatística e escreveu o manuscrito; Yudong Fan e Di Wu participaram de partes dos experimentos; Zilong Zhang, Miaomiao Zhang e Zhiping Huang participaram da coleta de amostras. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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Fontes de financiamento: O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

 Original Article Relationship between Increased Plasma Levels of Legumain and Properties of Coronary Atherosclerotic Plaque 0000-0002-3753-8352 Deng Yunpeng Conception and design of the research and Critical revision of the manuscript for important intellectual content Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Obtaining financing Writing of the manuscript 1 2 Fan Yudong Acquisition of data Obtaining financing 2 Wu Di Analysis and interpretation of the data Obtaining financing 2 Zhang Zilong Acquisition of data Statistical analysis 2 Zhang Miaomiao Acquisition of data 2 Huang Zhiping Acquisition of data Obtaining financing 2 Gao Yuxia Conception and design of the research and Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 China Department of Cardiology, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin – China China Department of Cardiology, Emergency General Hospital, Beijing – China Mailing Address: Yuxia Gao • Department of Cardiology, Tianjin Medical - University General Hospital, No. 154, Anshan Road, Heping District, Tianjin - 300052, China E-mail: gaoyuxiatjykdx@sina.com

Potential conflict of interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Editor responsible for the review: Gláucia Maria Moraes de Oliveira

 Central Illustration

: Relationship between Increased Plasma Levels of Legumain and Properties of Coronary Atherosclerotic Plaque

Abstract Background

Many clinical studies have confirmed that legumain is closely related to atherosclerosis. Unfortunately, different conclusions have been reached, and analyses and studies on atherosclerotic plaque characteristics in patients with increased plasma levels of legumain are still lacking.

 Objectives

This study aimed to investigate the correlation between legumain and coronary atherosclerotic plaque characteristics.

 Methods

A total of 81 patients with coronary atherosclerotic heart disease (CHD), including 43 patients with unstable angina (UA) and 38 patients with stable angina (SA), were screened by coronary angiography. Intravascular ultrasound (IVUS) was performed to evaluate the characteristics of coronary atherosclerotic plaques, and plasma legumain levels were also measured. Values of p < 0.05 were considered significant.

 Results

Legumain concentration was significantly higher in the two CHD subgroups than in the control group (all p<0.001). Legumain concentrations in the UA group were significantly higher than in the SA group (p=0.001). The plaque area, remodeling index (RI), and eccentricity index (EI) in the UA group were significantly higher than those in the SA group (p<0.001, p=0.001, p=0.001, respectively). There was a significant positive correlation between legumain levels and RI and EI in both UA and SA patients (all p<0.05).

 Conclusions

High plasma levels of legumain were closely related to the occurrence and severity of CHD, and the lesions tended to be unstable. Legumain is expected to be a potential inflammatory biomarker for the diagnosis of CHD and the early identification of unstable coronary lesions.

 Coronary Artery Disease Atherosclerosis Biomarkers Introduction

There is growing evidence that inflammation plays a crucial role in the formation of atherosclerosis, the progression of plaques, and the breakdown of vulnerable plaques.1 Various inflammatory cells and inflammatory factors are involved in atherosclerosis formation.2 The peripheral blood concentrations of these inflammatory factors are closely linked to the occurrence and prognosis of cardiovascular events. Inflammatory factors such as C-reactive protein (hs-CRP) are significantly elevated in peripheral blood levels of patients with coronary atherosclerotic heart disease (CHD) in the acute phase and have been widely used in clinical practice.3

Legumain, also known as asparagine endopeptidase, is a lysosomal cysteine protease that plays a vital role in antigen presentation during the inflammatory response.4 Recently, it has been found to activate proteases such as matrix metalloproteinase-2, which induces extracellular matrix degradation, plays an important role in forming atherosclerosis and vulnerable plaques, and is most likely a potential atherosclerosis predictor.5 Although studies on legumain and atherosclerosis have concluded a strong correlation between the two, there is a lack of research on the characteristics of atherosclerotic plaques in patients with increased plasma levels of legumain.6 This study investigated the correlation between legumain and coronary atherosclerotic plaque characteristics in patients with CHD.7

 Methods Study population

A total of 81 patients, age range 35~80 years, including 38 males and 43 females, admitted to the Emergency General Hospital with a predicted diagnosis of CHD between September 2021 and October 2022 were selected. All were confirmed to have CHD by coronary angiography, and an intravascular ultrasound (IVUS) was also performed. These patients were diagnosed with stable angina (SA, 38 cases) or unstable angina (UA, 43 cases) and presented with coronary artery stenosis with at least 50% reduction in lumen diameter stenosis and at least 2.25 mm in diameter on coronary angiography.8 Thirty-seven subjects matching the gender and age characteristics of the experimental groups were enrolled as healthy controls. Written informed consent was obtained from all patients before the study. The study protocol agreed with the guidelines approved by the ethics committee at our institution. (Ethics Approval Number: K22-6;Clinical Trial Number: ChiCTR2200058185)

SA was defined as no change in frequency, duration, or intensity of anginal symptoms with normal cardiac enzymes in the past 6 weeks. UA was defined as 1) resting angina, 2) new onset accelerated angina within the past 2 months, or 3) accelerated angina but chronic stable angina in patients who had not had resting angina in the previous 2 months.9 Healthy controls were those patients without abnormal coronary findings. Exclusion criteria were acute myocardial infarction(AMI), chronic occlusive lesions, calcified or diffuse lesions, infectious or autoimmune disease, prior percutaneous coronary intervention or coronary artery bypass grafting, valvular heart disease, congestive heart failure (LVEF < 40%), malignancy, hematologic disease, renal disease (plasma creatinine ≥ 2.2 mg/dL), and severe liver disease (plasma alanine transaminase levels >120 U/L).

 Measurement of plasma legumain

Venous blood was drawn from all subjects in a fasting state. Plasma was extracted and stored at -80 °C. Plasma legumain concentrations were quantified using the Quality ELISA Assay Kit (Elisa Biotech Systems, Shanghai, PR China). The detection ranges of the ELISAs used to measure legumain were 2.5 ng/mL-80 ng/mL. The intra-assay coefficient of variation (%) and interassay coefficient of variation (%) were < 15%.10 In addition, hs-CRP, homocysteine, low-density lipoprotein (LDL-c), and other laboratory tests were completed simultaneously.

 Intravascular ultrasound (IVUS) examination

After the completion of coronary angiography, an IVUS examination was performed on the main diseased vessels. The examination was performed using Boston Scientific’s IVUS machine and accompanying equipment.11 The IVUS catheter was sent distal to the target vessel and advanced to the proximal segment at a speed of 0.5 mm/s using an automatic pullback device.12 The IVUS images were continuously recorded and quantitatively analyzed using software by two independent, experienced IVUS investigators blinded to this study. Proximal and distal reference segments were the most normal-looking cross-sections within 10 mm distal and proximal to the lesion without any significant side branch. The external elastic membrane (EEM) and lumen cross-sectional area (CSA) were measured, and then the plaque CSA was calculated (EEM CSA - lumen CSA). Plaque burden = (EEM CSA - lumen CSA)/EEM CSA multiplied by 100%.13 According to the largest plaque thickness and minimum plaque thickness, the plaque eccentric index (EI) was calculated (maximum plaque thickness - minimum plaque thickness/maximum plaque thickness) multiplied by 100%. EI<0.5 was considered concentric plaque; EI≥0.5 was considered eccentric plaque. The remodeling index (RI) is defined as the remodeling membrane CSA of the lesion divided by the mean CSA of the reference segment. Generally, RI>1.05 indicates positive remodeling, and RI<0.95 indicates negative remodeling.14

 Statistical analysis

Statistical analysis was performed using the SPSS 25 software package. The Kolmogorov-Smirnov test tested the normality of continuous variables. Continuous variables with normal distributions are shown as the mean±standard deviation(SD) and were compared by Student’s unpaired t-test or one-way analysis of variance (ANOVA). There was no further use of post hoc tests in the ANOVA since the relevant variable was not the main indicator. Nonnormally distributed variables were represented as medians and interquartile ranges and were compared using the Mann–Whitney U-test or the Kruskal–Wallis test(K-W test). The Bonferroni method was used for post hoc analysis in the K-W test. Categorical variables were expressed as frequencies and percentages and were compared using the chi-square test or Fisher’s exact probability method.

Correlations between legumain and variables such as RI and EI were evaluated using Pearson or Spearman correlation analysis. The diagnostic value of legumain for UA was evaluated using receiver operating characteristic (ROC) curves. Cardiovascular risk factors for UA were evaluated using multiple logistic regression analysis. A two-sided p-value of 0.05 was considered statistically significant.

 Results Baseline information and characteristics

The baseline information and characteristics of all patients are summarized in Table 1. There were significant differences among the three groups in serum LDL-c levels and statin users (%).

– Demographic and biochemical characteristics of all participants
Characteristic UA(n=43) SA(n=38) Control(n=37) p
Age, yrs 67.0(57.0,71.0) 67.0(52.8,73.0) 66.0(56.0,73.0) 0.624
Male, n(%) 22(51.2) 16(42.1) 18(48.6) 0.707
BMI (kg/m2) 23.40(20.70,27.10) 24.35(20.23,26.33) 25.00(22.60,26.95) 0.361
Hypertension, n (%) 22(51.2) 16(42.1) 16(43.2) 0.669
Diabetes mellitus, n (%) 20(46.5) 12(31.6) 9(24.3) 0.102
Smoking, n (%) 18(41.9) 17(44.7) 15(40.5) 0.931
Drinking, n (%) 21(48.8) 14(36.8) 14(37.8) 0.473
LDL-C (mmol/L) 2.72±0.98 2.53±0.87 2.18±0.73 0.024
HDL-C (mmol/L) 1.04(0.86,1.41) 1.02(0.85,1.24) 0.98(0.77,1.11) 0.431
Homocystein(μmol/L) 13.04(11.23,16.44) 14.10(12.17,16.85) 13.98(11.76,15.71) 0.480
hs-CRP (mg/L) 1.03(0.66,1.78) 1.03(0.59,1.59) 0.98(0.57,1.92) 0.856
Fasting glucose (mmol/L) 6.12(5.57,7.56) 5.91(5.23,7.14) 6.02(5.17,7.21) 0.483
Triglyceride (mmol/L) 1.98(1.30,2.40) 1.87(1.38,2.67) 1.47(1.22,2.14) 0.342
Cholesterol (mmol/L) Statin user, n (%) 4.15(3.59,5.01)29(67.4) 3.99(3.64,5.18)27(71.1) 3.99(3.59,4.73)15(40.5) 0.873 0.012

Continuous variables are presented as means ± SD, median (interquartile range). Categorical variables were expressed as frequencies and percentages. UA: unstable angina; SA: stable angina; BMI: body index mass; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol; HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol; hs-CRP: high-sensitivity C-reactive protein.

 Plasma levels of Legumain in all study populations

Legumain levels in the three groups were 25.90 [14.11, 34.19] ng/ml, 14.83 [10.45, 19.64] ng/ml, and 8.55[6.70,11.81] ng/ml, respectively. The differences between the UA and SA groups, between the UA and control groups, and between the SA and control groups were statistically significant (p=0.001, p<0.001, p<0.001, respectively; Figure 1).

– Comparisons of the legumain levels among the three groups. UA: unstable angina; SA: stable angina;*p<0.01, **p<0.001).

Parameters of IVUS

There were no differences between the two groups concerning lesion length, minimum lumen diameter (MLD), minimum lumen area (MLA), or plaque burden. The plaque area, RI, and EI in the UA group were significantly higher than in the SA group (p<0.001, p=0.001, p=0.003, respectively, shown in Table 2).

– IVUS parameters in UA versus SA patients
Variables UA(n=43) SA(n=38) p
Lesion length, mm 31.77±8.80 31.60±7.86 0.930
MLD, mm 1.47(1.33,1.67) 1.44(1.31,1.67) 0.716
MLA, mm2 2.66(2.38,2.95) 2.62(2.09,3.02) 0.936
Plaque area, mm2 13.25±2.19 11.06±1.95 0.000
Plaque burden,% 76.66(71.12,81.29) 73.61(69.44,78.77) 0.195
Remodeling index Positive remodeling [n (%)] 0.99±0.15 17(39.5) 0.89±0.12 4(10.5) 0.001 0.003
Negative remodeling [n (%)] Eccentricity index Eccentric lesion [n (%)] 16(37.2) 0.68±0.11 39(90.7) 26(68.4) 0.60±0.13 28(73.7) 0.005 0.003 0.043
Concentric lesion [n (%)] 4(9.3) 10(26.3) 0.043

Continuous variables are presented as means ± SD, median (interquartile range). Categorical variables were expressed as frequencies and percentages. UA: unstable angina; SA: stable angina; MLD: minimum lumen diameter; MLA: minimum lumen area.

 Correlations of legumain concentration with IVUS parameters

The correlation coefficients between legumain concentration and RI in the UA and SA groups were 0.523 and 0.553, respectively (all p<0.001). The correlation coefficients between legumain concentration and EI in the UA and SA groups were 0.486 (p=0.001) and 0.651 (p<0.001), respectively. The above data indicated a significant positive correlation between legumain and RI and between legumain and plaque EI in both the UA and SA groups (shown in Figure 2).

– Correlations of legumain concentration with remodeling index (A,B), eccentricity index (C,D) in SA and UA groups. SA: stable angina; UA: unstable angina.

Multiple logistic regression analysis of cardiovascular risk factors for patients with UA

To investigate cardiovascular risk factors in patients with UA, after including traditional cardiovascular risk factors such as smoking and LDL-C, we conducted multiple logistic regression analyses together with IVUS parameters that differed between the UA and SA groups. The regression analysis showed that the independent cardiovascular risk factors for patients with UA were legumain concentration and coronary plaque area (Table 3).

– Multiple logistic regression analysis of cardiovascular risk factors for the patients with UA
Odds ratio (95%CI) p value
UA
Legumain concentration 1.198 1.058-1.356 0.004
Coronary plaque area 1.652 1.150-2.375 0.007

The dependent variable was the presence of UA. The covariate variables included age, gender, hypertension, smoking or not, diabetes mellitus, BMI, homocysteine, LDL-Cl, fasting glucose, triglycerides, total cholesterol, legumain concentration, RI, EI, and plaque area. UA: unstable angina.

 Legumain as a factor for diagnosing UA

ROC analysis was performed to determine the sensitivity and specificity of legumain levels in diagnosing UA. The area under the ROC curve (AUC) of legumain levels for diagnosing UA was 0.789 (95% CI: 0.689-0.888, p<0.001). ROC analysis showed that the optimal cutoff value of the legumain level was 21.68 ng/mL, and the sensitivity and specificity for diagnosing UA were 65.1% and 92.1%, respectively. These results suggested that legumain is highly correlated with unstable lesions. It is expected to be a reliable inflammatory factor for diagnosing CHD, especially UA, to guide early clinical detection of people at high risk for coronary artery lesions(shown in Figure 3).

– Receiver operating characteristic (ROC) curves of legumain for diagnosing UA. The area under the curve of legumain was 0.789 (95% confidence interval [CI], 0.689–0.888, p<0.001).

Discussion

Coronary atherosclerosis is a systemic disease with specific mechanisms that are complex and still not fully understood.15 Among them, inflammatory factors play a crucial role in the progression of coronary atherosclerosis and the formation of unstable plaques, which has been confirmed in many previous studies.16

As an inflammatory factor, legumain is involved in antigen presentation during atherosclerosis and may induce the formation and progression of unstable plaques, as has been tentatively demonstrated in many studies. As early as 2006, Papaspyridonos et al. identified a significant increase in legumain gene expression within atherosclerotic unstable plaques.17 In 2020, Hui Yang et al. investigated the association of legumain with acute myocardial infarction and concluded that legumain is a predictor of all-cause mortality and a potential therapeutic target in acute myocardial infarction.18 At the same time, Lunde et al. reached almost the opposite conclusion.19 They concluded that legumain is upregulated in acute cardiovascular events and associated with improved outcomes. The reasons for the different results from previous experiments may be as follows: There is a complex interaction between legumain and M1 and M2 macrophages such that the anti-inflammatory and pro-inflammatory effects of macrophages exert different degrees of influence at different stages of the disease and other external factors.20 In addition, platelet function is associated with the release of legumain, and a high proportion of patients with cardiovascular disease use antiplatelet drugs such as aspirin, a phenomenon that may also influence the results of the trial.21 Our results showed that legumain levels were significantly higher in UA and SA patients than in healthy controls, while legumain concentrations in the UA group were significantly higher than those in SA subjects, suggesting that higher levels of legumain are associated with the development of coronary atherosclerotic disease and the formation of unstable lesions.

In this trial, we found no significant differences in lesion length, MLD, and MLA by comparing the IVUS parameters of coronary lesion vessels in patients in the UA and SA groups. Notably, the plaque area, coronary RI, and plaque EI were significantly higher in the UA group than in the SA group. Moreover, the incidence of positive remodeling and eccentric plaque was significantly higher in the UA group than in the SA group, and the difference was statistically significant. This also indicated that the severity and hazard of CHD are closely related to the instability of the lesion but not necessarily directly related to the stenosis rate of coronary vessels. In general, eccentric plaques are more vulnerable than concentric plaques and are likely to rupture under various intraluminal stresses, which are more often found within unstable lesion segments.22 In addition, positive remodeling is widely present within atherosclerotic lesion segments. According to previous IVUS studies, vascular changes in acute coronary syndrome are prone to positive remodeling compared with SA vascular lesions, and positive remodeling is closely associated with adverse events such as plaque rupture and thrombosis.23 Additionally, we found that legumain was significantly positively correlated with RI and plaque EI in both the UA and SA groups. In summary, the risk of developing atherosclerotic cardiovascular disease rises in people without CHD as legumain levels increase. In the CHD population, higher legumain levels indicate more severe vascular lesions and more unstable plaques.

Many inflammatory factors are associated with atherosclerosis, but few have high specificity and can be widely used in clinical practice. For example, traditional inflammatory factors such as hs-CRP and homocysteine have many influencing factors, including poor specificity and limited clinical application. The inflammatory factor legumain studied in this trial is highly correlated with coronary atherosclerotic disease and is currently a hot research topic by scholars. The multivariate logistic regression analysis on cardiovascular risk factors in patients with UA in this trial also further suggested that the plasma level of legumain was an independent cardiovascular risk factor in patients with UA (OR=1.198, p=0.004). The AUC for the diagnosis of UA with the legumain level in this study reached 0.789, and the sensitivity and specificity of a legumain level of 21.68 ng/mL for the diagnosis of UA were 65.1% and 92.1%, respectively. The above results suggest legumain’s feasibility, accuracy, and specificity for diagnosing UA. It can be said that legumain is predicted to become an inflammatory factor for the diagnosis of coronary atherosclerotic disease.24

Due to the lack of previous studies and reports in the literature on legumain concentration in patients with coronary artery disease and unstable angina, the sample size was determined by a pilot study in this trial. From the pre-experiments, we concluded legumain concentration for the three groups of subjects as 21.18±12.28 ng/ml in the UA group, 14.94±6.14 ng/ml in the SA group, and 8.75±3.01 ng/ml in the control group. The overall sample size was calculated to be 99 cases (33 cases per group) using PASS software, and the final sample size was determined to be 118 cases by considering loss to follow-up and incomplete data.

Our study has several limitations. First, this trial is a single-center, nonrandomized, case-control study with a small sample size, lack of follow-up, and inability to account for causality. Second, the IVUS used in this trial did not have VH-IVUS capability, so it was impossible to classify lesions more finely.25 Third, a subgroup of patients with AMI was not established in this trial because performing IVUS prolongs the operation time and may affect the prognosis of the patients. Finally, IVUS has limited resolution in identifying coronary lesions and is less able to identify some specific lesions than OCT.26

 Conclusions

High plasma levels of legumain are closely associated with the development of coronary atherosclerotic disease and the progression of unstable lesions. Detecting plasma legumain can help identify patients at high risk of CHD earlier so that intervention may occur earlier and the prognosis may be improved.

 Acknowledgments

We want to thank the many study coordinators and volunteers who helped facilitate patient enrolment and sample collections. Thanks to AJE for the meticulous polishing of this manuscript. Thank you to every author who worked hard on this experiment.Yuxia Gao and Yunpeng Deng contributed to the study concept and design and supervised the project; Yunpeng Deng performed most of the experiments, undertook the statistical analysis, and wrote the manuscript; Yudong Fan and Di Wu participated in parts of the experiments; Zilong Zhang, Miaomiao Zhang, and Zhiping Huang participated in sample collection. All authors have read and approved the final manuscript.

Sources of funding: There were no external funding sources for this study.