Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC 6FdHm6BMZFjqY39WJKxJcYj S0066-782X2023001100304 00304 10.36660/abc.20220822 Artigo Original Inflamação Coronária Avaliada pela Atenuação de Gordura Pericoronária na Tomografia Computadorizada e Elevação de Citocinas em Usuários Jovens de Esteroides Anabólicos Androgênicos 0000-0001-8709-8706 Souza Francis Ribeiro de Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 0000-0003-4505-3344 Rochitte Carlos E. Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 0000-0002-8550-6312 Silva Douglas Carli Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 2 Sampaio Barbara Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Obtenção de financiamento Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 3 Passarelli Marisa Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 4 5 Santos Marcelo R. dos Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 6 Fonseca Guilherme W. Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise estatística Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 Battaglia Antonio Carlos Filho Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito 1 Correa Kelly Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 do Val Renata Margarida Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de financiamento Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 Yonamine Maurício Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 7 Pereira Rosa Maria R. Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 2 Negrão Carlos Eduardo Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 Kalil-Filho Roberto Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 8 Alves Maria Janieire de Nazaré Nunes Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Obtenção de financiamento Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 Hospital das Clínicas Faculdade de Medicina Universidade de São Paulo São Paulo SP Brasil Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo , São Paulo , SP – Brasil Faculdade de Medicina Universidade de São Paulo São Paulo SP Brasil Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP), São Paulo , SP – Brasil Instituto de Medicina Tropical de São Paulo São Paulo SP Brasil Instituto de Medicina Tropical de São Paulo , São Paulo , SP – Brasil Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina Laboratório de Lípides São Paulo SP Brasil Universidade de São Paulo – Faculdade de Medicina – Laboratório de Lípides , São Paulo , SP – Brasil Universidade Nove de Julho São Paulo SP Brasil Universidade Nove de Julho , São Paulo , SP – Brasil Hospital Israelita Albert Einstein São Paulo SP Brasil Hospital Israelita Albert Einstein , São Paulo , SP – Brasil Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas São Paulo SP Brasil Universidade de São Paulo – Faculdade de Ciências Farmacêuticas , São Paulo , SP – Brasil Hospital Sírio Libanês São Paulo SP Brasil Hospital Sírio Libanês , São Paulo , SP – Brasil Correspondência: Francis Ribeiro Souza • Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo – Comissão Científica – Centro de Pesquisa Clínica Prof. Dr. Fulvio Pileggi – Av. Dr. Enéas Carvalho de Aguiar, 44, 1º andar, Sala 8. CEP 05403-900, São Paulo, SP – Brasil E-mail: francis.ribeiro@hc.fm.usp.br

Editor responsável pela revisão: Nuno Bettencourt

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo.

 20 11 2023 11 2023 120 11 e20220822 13 12 2022 09 08 2023 16 08 2023 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Figura Central

: Inflamação Coronária Avaliada pela Atenuação de Gordura Pericoronária na Tomografia Computadorizada e Elevação de Citocinas em Usuários Jovens de Esteroides Anabólicos Androgênicos

Resumo Fundamento

O uso abusivo de esteroides anabólicos androgênicos (EAA) tem sido associado à doença arterial coronariana (DAC). A atenuação de gordura pericoronária (AGp) é um marcador de inflamação coronária, a qual exerce um papel chave no processo aterosclerótico.

 Objetivo

Avaliar AGp e perfil inflamatório em usuários de EAA.

 Método

Vinte indivíduos que realizavam treinamento de força, usuários de EAA (UEAA), 20 não usuários de EAA (NUEAA), e 10 indivíduos sedentários controle (SC) foram avaliados. Inflamação coronária foi avaliada por atenuação de gordura pericoronária média (AGPm) artéria coronária direita (ACD), artéria descendente anterior esquerda (ADA) e artéria circunflexa (ACX). Interleucina (IL)-1 (IL-1), IL-6, IL-10, e TNF-alfa foram avaliados por densidade ótica (DO) em um espectrofotômetro com um filtro de 450 nm. Um p<0,05 indicou significância estatística.

 Resultados

Os UEAA apresentaram maior AGPm na ACD [-65,87 (70,51-60,70) vs. -78,07 (83,66-72,87) vs.-78,46 (85,41-71,99] unidades Hounsfield (HU), respectivamente, p<0,001) e AGPm na ADA [-71,47 (76,40-66,610 vs. -79,32 (84,37-74,59) vs. -82,52 (88,44-75,81) HU, respectivamente, p=0,006) em comparação aos NUEAA e CS. A AGPm na ACX não foi diferente entre os grupos UEAA, NUEAA e CS [-72,41 (77,17-70,37) vs. -80,13 (86,22-72,23) vs. -78,29 (80,63-72,29) HU, respectivamente, p=0,163). Em comparação aos NUEAA e aos CS, o grupo UEAA apresentaram maiores níveis de IL-1 [0,975 (0,847-1,250) vs. 0,437 (0,311-0,565) vs. 0,530 (0,402-0,780) DO, respectivamente, p=0,002), IL-6 [1,195 (0,947-1,405) vs. 0,427 (0,377-0,577) vs. 0,605 (0,332-0,950) DO, p=0,005) e IL-10 [1,145 (0,920-1,292) vs. 0,477 (0,382-0,591) vs. 0,340 (0,316-0,560) DO, p<0,001]. TNF-α não foi diferente entre os grupos UEAA, NUEAA e CS [0,520 (0,250-0,610) vs. 0,377 (0.261-0,548) vs. 0,350 (0,182-430)].

 Conclusão

Em comparação aos NUEAA e controles, os UEAA apresentam maior AGPm e maior perfil de citocinas inflamatórias sistêmicas, sugerindo que os EAA podem induzir aterosclerose por inflamação coronária e sistêmica.

 Doença da Artéria Coronariana Tomografia Computadorizada por Raios X Esteroide Anabólico Androgênico FAPESP 2012/10527-3 Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado pela Fundação Zerbini e FAPESP 2012/10527-3. Introdução

O uso abusivo de esteroides anabólicos androgênicos (EAA) tem sido associado a distúrbios no sistema cardiovascular. 1 - 5 Estudos prévios mostraram que o uso ilícito de EAA causa redução nos níveis plasmáticos de lipoproteína de alta densidade (HDL) e no efluxo de colesterol mediado pelo HDL, 6 e doença arterial coronariana (DAC) em usuários de EAA jovens, do sexo masculino. 6 - 8

A inflamação é a chave para o processo aterogênico associado à vulnerabilidade da placa aterosclerótica, que pode levar ao aumento do risco de eventos cardiovasculares, tais como síndrome coronária aguda e isquemia. 9 Em 2017, Antonopoulos et al. 10 desenvolveram uma métrica alternativa chamada Índice de Atenuação da Gordura perivascular (IAGp), que avalia inflamação coronária a partir do tecido adiposo vascular coronário. 10 Essa técnica permite a detecção fenotípica induzida pela inflamação vascular mesmo antes do início da doença aterosclerótica.

Gaibazzi et al. 11 mostraram que os pacientes com infarto do miocárdio e artérias coronárias não obstrutivas e valores do IAGp aumentados, apresentam, com maior frequência, placas nas artérias coronárias em comparação aos indivíduos sadios controle. 11 Em um estudo prévio, 9 observamos que 25% dos usuários de EAA apresentavam pelo menos duas artérias coronárias com placas. Assim, podemos especular que o uso abusivo de EAA poderia levar a uma maior atenuação de gordura perivascular. Ainda, citocinas pró-inflamatórias, tais como interleucinas 1 e 6 (IL-1 e IL-6) e Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α), estão associadas com alteração fenotípica no tecido perivascular coronariano. 10 No entanto, a associação entre Atenuação de Gordura Pericoronária (AGP) e citocinas pró-inflamatórias em usuários de EAA não é conhecida.

A hipótese do presente estudo é que EAA causa DAC por inflamação sistêmica e da artéria coronária. Nosso objetivo foi investigar a associação da inflamação da artéria coronária, avaliada pela AGP média (AGPm), com inflamação sistêmica, avaliada pelos níveis de citocinas no sangue periférico, em usuários e em não usuários de EAA.

 Materiais e métodos População do estudo

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética local para pesquisa envolvendo seres humanos (4958/19/177).

Este estudo é uma análise secundária, com delineamento transversal, de um estudo prévio. 6 Cinquenta participantes pareados por idade entre 18 e 45 anos de idade foram incluídos no estudo: 20 usuários de EAA (grupo UEAA) e 20 não usuários de EAA (grupo NUEAA). Ambos os grupos (grupos UEAA e NUEAA) eram levantadores de peso ou fisioculturistas, recrutados de academias. Além disso, 10 homens sedentários, pareados por idade (que não praticavam esportes e/ou exercício físico regularmente, ou atividade física como caminhada com intensidade leve/moderada <150 minutos por semana), sem doença cardiovascular – hipertensão, diabetes, hipercolesterolemia, obesidade [Índice de Massa Corporal (IMC) > 30 Kg/m 2 ] foram incluídos no grupo controle. Critérios de exclusão foram tabagismo, consumo de álcool, uso de diuréticos, estatinas e/ou anti-hipertensivos, doença hepática, e doença renal.

Os grupos UEAA e NUEAA haviam se envolvido em treinamento de força por pelo menos dois anos. Os UEAA deveriam autoadministrar EAA em ciclos periódicos com duração de oito a 12 semanas por pelo menos dois anos, com 2-4 ciclos por ano. Todos os usuários estavam em um ciclo durante o estudo.

 Medidas e procedimentos

Todos os participantes se abstiveram de suplementos esportivos, produtos contendo cafeína, e treino de exercício físico por 48 horas antes dos exames.

 Atenuação de gordura pericoronária

Previamente, todos os participantes foram submetidos a uma angiotomografia computadorizada de acordo com as diretrizes da Sociedade de Tomografia Computadorizada Cardiovascular ( Society of Cardiovascular Computed Tomography, SCCT ). 12 Todas as imagens de Tomografia Computadorizada (TC) foram adquiridas em um tomógrafo com 320 fileiras de detectores (Aquillion OneTM – Toshiba Medical Systems Corporation, Otawara, Japão) com cortes de 0,5 mm de espessura conforme descrito anteriormente. 6 Para a análise da atenuação de gordura perivascular média, utilizamos o programa TeraRecon (TeraRecon Aquarius 4.4.12.249 inc.), e usamos a fluxo pós-processamento da artéria coronária. Para melhor visualização, utilizamos a melhor fase diastólica, sem artefatos de movimento; eventualmente, necessitamos usar outras fases para uma melhor definição da parede do vaso. Com um pacote de fluxo de trabalho cardíaco, mudamos os parâmetros para acompanhar a visualização perivascular conforme sugerido na literatura; analisamos 5mm ao redor da parede do vaso (parede mais externa) e definimos 40mm de extensão da artéria descendente anterior (ADA) esquerda, artéria circunflexa (ACX) esquerda, e artéria coronária direita (ACD). Na ACD, nós excluímos 10mm proximal à aorta para evitar invasão da região perivascular da aorta. Para análise da AGPm, selecionamos os limiares -190 à -30HU. 10 , 13 - 17 As análises foram realizadas por dois observadores cegos (C.E.R., 20 anos de experiência, e D.C.S., três anos de experiência). Discrepâncias foram resolvidas por consenso entre os dois observadores experientes.

 Perfil inflamatório

As amostras de sangue foram coletadas pela manhã (entre 8h e 10h) após 12 horas de jejum e após 30 minutos de repouso. Kits de ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) foram usados para medir IL-1, IL-6, IL-10 e TNF-α. As placas de ELISA foram sensibilizadas com os marcadores, em tampão carbonato, 50µL por poço, e incubado durante a noite a 4 o C. O marcador foi usado a uma concentração de 2μg/mL; 50 μL de anticorpo foi adicionado a cada poço a uma concentração de 0,5μg/mL, preparado em solução de lavagem, e incubado por uma hora a 37 o C. Os resultados foram obtidos com base na leitura da densidade ótica em um espectrofotômetro com um filtro de 450nm como descrito anteriormente. 18 As análises de interleucina foram realizadas em duplicata, e a média entre as medidas foi usada no estudo.

 Composição corporal

A composição corporal foi avaliada por Absorciometria de Fóton Duplo (DXA, Discovery DXA system, Hologic Inc) para medir massa livre de gordura, massa de gordura, e porcentagem de gordura em todos os participantes. Todas as medidas do DXA foram realizadas pelo mesmo técnico, e o erro de precisão foi estabelecido de acordo com os padrões do International Society for Clinical Densitometry . O DXA foi usado para excluir possível viés do IMC entre os participantes.

 Análise estatística

Os dados são apresentados em média ± Desvio Padrão (DP) ou mediana [Intervalo Interquartil (IIQ) 25-75%], de acordo com a normalidade dos dados. O teste Kolmogorov-Smirnov foi usado para avaliar a distribuição normal das variáveis estudadas. Os dados paramétricos foram comparados pelo teste ANOVA one-way . Quando uma diferença significativa foi encontrada, o teste comparativo de Scheffé foi usado. Os testes de comparação múltipla Kruskal Wallis e de Dunn foram usados para os dados não paramétricos. O teste de correlação bivariada (Spearman) também foi usado, e um p<0,05 foi usado para indicar significância estatística. O programa SPSS ( Statistical Package for the Social Sciences ), versão 23, foi usado para realizar as análises.

 Resultados

As características físicas e o perfil lipídico dos pacientes estão descritos na Tabela 1 . O grupo UEAA apresentou maior peso corporal, IMC, e massa magra em comparação aos grupos NUEAA e controle. Não foi encontrada diferença significativa de idade ou altura entre os grupos UEAA, NUEAA e controle. Além disso, o grupo UEAA apresentou concentrações plasmáticas de lipoproteína de alta densidade (HDL) mais baixas e de lipoproteína de baixa densidade (LDL) mais altas em comparação ao grupo NUEAA e grupo controle.

– Características físicas e perfil lipídico de usuários de esteroides anabólicos androgênicos (UEAA), não usuários de esteroides anabólicos androgênicos (NUEAA), e controles sedentários (CS)
Variáveis UEAA = 20 NUEAA = 20 CS = 10 p
Idade (anos) 29 ± 5 29 ± 5 29 ± 3 0,861
Altura (m) 1,78 ± 0,04 1,80 ± 0,09 1,76± 0,08 0,841
Peso (Kg) 97,4 (90,1-104,9) *† 82,0 (74,0-88,0) 74,8 (70,0-87,5) <0,001
IMC (Kg/m 2 ) 31,11 ± 3,45 *† 25,45 ± 1,92 25,70 ± 3,38 <0,001
Massa de gordura (%) 13,18 ± 5,62 *† 19,27 ± 4,33 * 27,59 ± 7,49 0,005
Massa magra (kg) 82,05 ± 9,18 *† 62,81 ± 7,15 * 53,94 ± 7,38 <0,001
CT (mg/dL) 186 (143-208) 155 (135-188) 189 (175-200) 0,070
HDL-c (mg/dL) 19 (13-25) *† 44 (41-54) 50 (40-55) <0,001
LDL-c (mg/dL) 144 (105-179) *† 96 (81-125) 122 (105-132) 0,001
TG (mg/dL) 74 ± 23 75 ± 35 98 ± 45 0,151
Glicose (mg/dL) 90 ± 7 90 ± 6 92 ± 8 0,661

IMC: índice de massa corporal; CT: colesterol total; HDL-c: lipoproteína de alta densidade; LDL-c: lipoproteína de baixa densidade; TG: triglicerídeos; * p <0,05 vs. CS; † p< 0.05 vs. NUEAA.

O grupo UEAA apresentou maior AGPm na ACD em comparação aos grupos NUEAA e controle [-65,87 (70,51-60,70) vs. -78,07 (83,66-72,87) vs. -78,46 (85,41-71,99) HU, respectivamente, p<0,05] (Figura 1A). Além disso, a AGPm na ADA foi mais alta em comparação a NUEAA e ao grupo controle [-71,47 (76,40-66,61) vs. -79,32 (84,37-74,59) vs. -82,52 (88,44-75,81) HU, respectivamente, p<0,05] (Figura 1B). Contudo, não observamos diferença na AGPm na ACX entre os grupos UEAA, NUEAA, e controle [-72,41 (77-70) vs. -80,13 (86,22-72,23) vs. -78,29 (80,63-72,29) HU, respectivamente, p>0,05] (Figura 1C). Análise da gordura pericoronária proximal da ADA pode ser vista na Figura Central .

– A) Atenuação de gordura pericoronária média (AGPm) na artéria coronária direita (ACD); B) Artéria descendente anterior (ADA) esquerda; C) e artéria circunflexa (ACX) em usuários de esteroides anabólicos androgênicos (UEAA), Não usuários de esteroides anabólicos androgênicos (NUEAA), e controles sedentários (CS) * = p<0,05.

Níveis de IL-1, IL-6, e IL-10 foram significativamente maiores no grupo UEAA em comparação aos níveis nos grupos NUEAA e controle (Figura 2A-C, respectivamente). No entanto, os níveis de TNF-α não foram diferentes entre os três grupos (Figura 2D). Outras análises mostraram uma correlação positiva entre IL-1 e AGPm na ACD; IL-1 e AGPm na ADA; IL-6 e AGPm na ACD; e IL-6 e AGPm na ADA (Figuras 3A-D, respectivamente).

– A) Concentração de interleucina (IL)-1 (IL-1); B) IL-6, C) IL-10, e D) fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) usuários de esteroides anabólicos androgênicos (UEAA), não usuários de esteroides anabólicos androgênicos (NUEAA), e controles sedentários (CS) * = p<0,05.

– A) Correlação positiva entre Interleucina-1 (IL-1) e atenuação de gordura pericoronária média (AGPm) na artéria coronária direita (ACD); B) IL-1 e AGPm na artéria descendente anterior (ADA) esquerda; C) IL-6 e AGPm na ACD; e D) AGPm na ADA esquerda; DO: densidade ótica.

Além disso, o tempo médio de uso de EAA no grupo UEAA foi 8 ± 6 anos. No grupo NUAEE, 20%, 40%, 35%, e 5% deles usavam dois três, quatro, e cinco diferentes tipos de AEE, respectivamente. Os tipos mais comuns de EAA usados foram testosterona (enantato, propionato, undecilato, e cipionato), nandrolona, boldenona, trembolona, e estanozolol. A razão testosterona/epitestosterona foi mais alta no grupo UEAA que nos grupos NUEAA e controle (63,8±44,6 vs. 0,9±1,2 vs. 0,9±0,9, respectivamente, p <0,05). Os grupos UEAA e NUEAA se envolveram em treinamento de força por aproximadamente 10 anos.

 Discussão

Neste estudo caso-controle comparando a AGPm e citoquinas periféricas nos grupos UEAA, NUEAA e controle, encontramos: i. AGPm elevada no grupo UEAA; citocinas elevadas no grupo UEAA, e iii. AGPm foi associada com citocinas periféricas no grupo UEAA.

A inflamação vascular é o gatilho para o desenvolvimento de placa aterosclerótica coronária e é uma característica típica de ruptura da placa aterosclerótica. 9 Antonopoulos et al. 10 relataram que a artéria coronária inflamada se difunde ao tecido adiposo perivascular, que altera a composição da gordura perivascular ao redor das artérias inflamadas. Essas alterações levam à atenuação ao redor das artérias coronárias da atenuação lipídica típica – valores de HU mais negativos (por exemplo, mais próximo a -190 HU) – à fase mais aquosa – valores de HU menos negativos (por exemplo, mais próximo a -30 HU). 10 Embora sejam necessários mais estudos para confirmar os valores de HU como um marcador de inflamação coronária, um estudo prévio sugeriu que um valor de -70HU parece ser um ponto de corte razoavelmente robusto para definir inflamação das artérias coronárias. 11 Ainda, Oikonomou et al. 19 sugeriram que valores de IAGp (ponto de corte - 70 HU) são um indicador de mortalidade cardíaca aumentada. 19

Gaibazzi et al. 11 mostraram que pacientes com infarto do miocárdio, na ausência de estenose coronária obstrutiva e valores de IAGp menores que -70HU (aproximadamente -68,37 HU), apresentam placas na artéria coronária com maior frequência em comparação a controles sadios que apresentam IAGp maior que -70 (aproximadamente -78,03HU). Em nosso estudo, encontramos que UEAA apresentaram uma AGPm (ACD e ADA) de aproximadamente -68,71HU. Esse dado está de acordo com nossas observações prévias de que cerca de um a quatro fisiculturistas (25%) que usaram EAA apresentaram sinais de DAC subclínica na angiotomografia computadorizada. Em contraste, nenhum dos NUEAA ou dos participantes sedentários apresentaram DAC subclínica. 6

A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica. 9 Está bem estabelecido que os marcadores de inflamação sistêmica, tais como IL-1, IL-6, e TNF-α, são os principais fatores que atuam ao longo da cascata inflamatória vascular. 20 , 21 Em nosso estudo, encontramos concentrações mais altas de IL-1 e IL-6 no grupo UEAA em comparação aos grupos NUEAA e controle. Apesar do aumento das citocinas pró-inflamatórias, o IL-10 foi mais alto em UEAA que em NUEAA e controles. A IL-10 é a principal citocina anti-inflamatória com um importante papel na modulação e na produção de TNF-α. 22 Nossos resultados sugerem que a IL-10 pode equilibrar o perfil pró-inflamatório/anti-inflamatório. Essa hipótese deve ser abordada em estudos futuros.

O uso abusivo de EAA tem sido associado com diminuição no efluxo de colesterol mediado pelo HDL e nos níveis plasmáticos de HDL, e aumento nas concentrações de LDL plasmática. Esse metabolismo lipídico alterado é um dos mecanismos envolvidos no processo aterogênico. Ainda, uma alteração na taxa de cisalhamento, caracterizada por uma taxa retrógrada e oscilatória, está associada com inflamação, aterosclerose, e disfunção endotelial. 23 A proteína C reativa ultrassensível (PCR-us) também é um marcador de inflamação vascular. 24 Nós relatamos em um estudo prévio 25 que UEAA apresentam uma taxa de cisalhamento retrógrada e oscilatória na artéria braquial e níveis mais altos de PCR-us em comparação a NUEAA. 25 Todas essas alterações podem estar associadas à inflamação coronária e ao desenvolvimento prematuro de doença aterosclerótica em UEAA jovens.

Implicação clínica

A implicação clínica de nossos resultados é que a atenuação de gordura pericoronária, medida por angiotomografia coronária pode ser usada para avaliar a carga de inflamação coronária e, assim, avaliar o risco cardiovascular de uma população específica. A inflamação coronária pode ser identificada por AGPm mesmo antes que placas ateroscleróticas possam ser detectadas. Assim, a AGPm é um potencial biomarcador precoce de DAC em UEAA. Serão necessários estudos maiores, longitudinais, para avaliar a aplicação clínica rotineira dessa nova tecnologia.

 Limitações

Reconhecemos as limitações em nosso estudo. Estudamos uma amostra pequena, e os resultados são uma subanálise de um estudo anterior. 6 Utilizamos a AGPm pelo TeraRecon conforme descrito por Nomura et al. 26 e os valores não podem ser comparados diretamente com outras abordagens à inflamação pericoronária. Os mecanismos envolvidos na atenuação de gordura pericoronária estavam foram do escopo de nosso estudo. A correlação observada em nosso estudo deve ser interpretada com cuidado, e o mecanismo de atenuação de gordura pericoronária deve ser abordada em estudos futuros.

 Conclusão

Este estudo indica que o uso abusivo de EAA está associado com inflamação coronária e níveis mais altos de citocinas inflamatórias sistêmicas. Ainda, a atenuação de gordura pericoronária pode ser usada para rastrear inflamação coronária (como um biomarcador de DAC) mesmo antes do desenvolvimento de placas visíveis.

 Agradecimentos

É com muita tristeza que soubemos do falecimento da Professora Rosa Maria Rodrigues Pereira em 03 de outubro de 2022. Seu trabalho sobre metabolismo ósseo, osteoporose, e doenças reumáticas contribuiu imensamente à área de reumatologia no Brasil e sempre servirá como guia para novos pesquisadores no mundo.

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Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de Pós-doutorado de Francis Ribeiro de Souza pelo departamento de cardiopneumologia da Faculdade de Medicina, Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital das Clínicas de Medicina da Universidade de São Paulo sob o número de protocolo 28156320.6.0000.0068. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.

Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado pela Fundação Zerbini e FAPESP 2012/10527-3.

 Original Article Coronary Inflammation by Computed Tomography Pericoronary Fat Attenuation and Increased Cytokines in Young Male Anabolic Androgenic Steroid Users 0000-0001-8709-8706 Souza Francis Ribeiro de Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 0000-0003-4505-3344 Rochitte Carlos E. Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 0000-0002-8550-6312 Silva Douglas Carli Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for important intellectual content 2 Sampaio Barbara Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Obtaining financing Critical revision of the manuscript for important intellectual content 3 Passarelli Marisa Conception and design of the research Acquisition of data Critical revision of the manuscript for important intellectual content 4 5 Santos Marcelo R. dos Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 6 Fonseca Guilherme W. Conception and design of the research Acquisition of data Statistical analysis Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 Battaglia-Filho Antonio Carlos Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript 1 Correa Kelly Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 do Val Renata Margarida Conception and design of the research Obtaining financing Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 Yonamine Maurício Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for important intellectual content 7 Pereira Rosa Maria R. Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for important intellectual content 2 Negrão Carlos Eduardo Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 Kalil-Filho Roberto Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 8 Alves Maria Janieire de Nazaré Nunes Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Obtaining financing Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 Brazil Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP – Brazil Brazil Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP), São Paulo, SP – Brazil Brazil Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, São Paulo, SP – Brazil Brazil Universidade de São Paulo – Faculdade de Medicina – Laboratório de Lípides, São Paulo, SP – Brazil Brazil Universidade Nove de Julho, São Paulo, SP – Brazil Brazil Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP – Brazil Brazil Universidade de São Paulo – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, São Paulo, SP – Brazil Brazil Hospital Sírio Libanês, São Paulo, SP – Brazil Mailing Address: Francis Ribeiro Souza • Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo – Comissão Científica – Centro de Pesquisa Clínica Prof. Dr. Fulvio Pileggi – Av. Dr. Enéas Carvalho de Aguiar, 44, 1º andar, Sala 8. Postal Code 05403-900, São Paulo, SP – Brazil E-mail: francis.ribeiro@hc.fm.usp.br

Editor responsible for the review: Nuno Bettencourt

Potential conflict of interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Central Illustration

: Coronary Inflammation by Computed Tomography Pericoronary Fat Attenuation and Increased Cytokines in Young Male Anabolic Androgenic Steroid Users

Abstract Background

Anabolic androgenic steroid (AAS) abuse has been associated with coronary artery disease (CAD). Pericoronary fat attenuation (pFA) is a marker of coronary inflammation, which is key in the atherosclerotic process.

 Objective

To evaluate pFA and inflammatory profile in AAS users.

 Methods

Twenty strength-trained AAS users (AASU), 20 AAS nonusers (AASNU), and 10 sedentary controls (SC) were evaluated. Coronary inflammation was evaluated by mean pericoronary fat attenuation (mPFA) in the right coronary artery (RCA), left anterior descending coronary artery (LAD), and left circumflex (LCx). Interleukin (IL)-1 (IL-1), IL-6, IL-10, and TNF-alpha were evaluated by optical density (OD) in a spectrophotometer with a 450 nm filter. P<0.05 indicated statistical significance.

 Results

AASU had higher mPFA in the RCA (-65.87 [70.51-60.70] vs. -78.07 [83.66-72.87] vs.-78.46 [85.41-71.99] Hounsfield Units (HU), respectively, p<0.001) and mPFA in the LAD (-71.47 [76.40-66.61] vs. -79.32 [84.37-74.59] vs. -82.52 [88.44-75.81] HU, respectively, p=0.006) compared with AASNU and SC. mPFA in the LCx was not different between AASU, AASNU, and SC (-72.41 [77.17-70.37] vs. -80.13 [86.22-72.23] vs. -78.29 [80.63-72.29] HU, respectively, p=0.163). AASU compared with AASNU and SC, had higher IL-1, (0.975 [0.847-1.250] vs. 0.437 [0.311-0.565] vs. 0.530 [0.402-0.780] OD, respectively, p=0.002), IL-6 (1.195 [0.947-1.405] vs. 0.427 [0.377-0.577] vs. 0.605 [0.332-0.950] OD, p=0.005) and IL-10 (1.145 [0.920-1.292] vs. 0.477 [0.382-0.591] vs. 0.340 [0.316-0.560] OD, p<0.001). TNF-α was not different between the AASU, AASNU, and SC groups (0.520 [0.250-0.610] vs. 0.377 [0.261-0.548] vs. 0.350 [0.182-430]), respectively.

 Conclusion

Compared with ASSNU and controls, AASU have higher mPFA and higher systemic inflammatory cytokines profile suggesting that AAS may induce coronary atherosclerosis through coronary and systemic inflammation.

 Coronary Artery Disease Pericoronary Fat Attenuation Anabolic Androgenic Steroids Introduction

Anabolic androgenic steroid (AAS) abuse has been associated with disturbances in the cardiovascular system. 1 - 5 Previous studies have shown that illicit use of AAS leads to decreased high-density lipoprotein (HDL) plasma concentration and cholesterol efflux mediated by HDL, 6 and coronary artery disease (CAD) in young male AAS users. 6 - 8

Inflammation is the key to the atherogenic process associated with atherosclerotic plaque vulnerability, which can lead to higher risk of cardiovascular events, such as acute coronary syndrome and ischemia. 9 In 2017, Antonopoulos et al. 10 developed an alternative metric called perivascular fat attenuation index (pFAI), that evaluate coronary inflammation by coronary perivascular adipose tissue. 10 This technique allows the phenotypic detection induced by vascular inflammation even before the onset of atherosclerotic disease.

Gaibazzi et al. 11 showed that patients with myocardial infarction with non-obstructive coronary arteries and increased pFAI values, more frequently have coronary artery plaques compared with healthy controls. 11 Previously, 9 we reported that 25% of AAS users had at least two coronary arteries with plaques. Thus, it is possible to speculate that AAS abuse could lead to higher perivascular fat attenuation. Furthermore, pro-inflammatory cytokines, such as interleukins 1 and 6 (IL-1 and IL-6) and tumour necrosis factor alpha (TNF-α), are associated with phenotypic alteration in the coronary perivascular tissue. 10 However, the association between pericoronary fat attenuation (PFA) and pro-inflammatory cytokines in AAS users is unknown.

The present study hypothesized that AAS leads to CAD through coronary and systemic inflammation. We aimed to investigate the association of coronary inflammation, assessed by mean PFA (mPFA), with systemic inflammation, assessed by peripheral blood cytokines in AAS users and non-users.

 Materials and methods Study population

The local committee for the Protection of Human Subjects approved this study (4958/19/177).

This is a cross-sectional, secondary analysis from a previous study. 6 Fifty age-matched participants between 18 and 45 years were included in the study: 20 AAS users (group AASU) and 20 AAS nonusers (group AASNU). Both groups (AASU and AASNU) were recreational weightlifters or amateur bodybuilding athletes who were recruited from gyms. In addition, 10 age-matched sedentary men (without regular exercise training and/or sports, <150 min/week of physical activity such as walking with light/moderate intensity) without cardiovascular disease – hypertension, diabetes, hypercholesterolemia, obesity (body mass index [BMI] >30 Kg/m 2 ) were included as the control group. Exclusion criteria were smoking, alcohol consumption, use of diuretics, statins and/or anti- hypertensive medications, liver disease, and kidney disease.

AASU and AASNU groups had been involved in strength training for at least two years. AASU should be self-administering AAS in periodic cycles lasting from eight to 12 weeks for at least two years with 2-4 cycles per year. All AASU were on a cycle over the course of the study.

 Measures and procedures

All the participants refrained from sports supplements, caffeine-containing products, and exercise training for 48 hours before the exams.

 Pericoronary fat attenuation

Previously, all participants underwent coronary computed tomography angiography according to the guidelines of the Society of Cardiovascular Computed Tomography (SCCT). 12 All computed tomography (CT) scans were acquired in a 320-row detector scanner (Aquillion One TM – Toshiba Medical Systems Corporation, Otawara, Japan) with 0.5-mm thick slices as described previously. 6 For the mPFA analysis, we used the dedicated software TeraRecon (TeraRecon Aquarius 4.4.12.249 inc.) and applied it to the coronary post-processing workflow. For a better view, we used the best diastolic phase with no motion artifacts; eventually we needed to use other phases to improve vessel wall definition. With a cardiac workflow package and plaque analysis, we changed the parameters to follow the reference perivascular visualization as suggested by the literature; we looked 5mm around the vessel wall (outer vessel wall) and defined the 40mm proximal vessel extension of left anterior descending coronary artery (LAD), left circumflex artery (LCx), and right coronary artery (RCA). On the RCA, we excluded 10mm proximal to the aorta to avoid encroachment on the perivascular aorta region. To check mPFA, we selected the -190 to -30 HU threshold. 10 , 13 - 17 The analyses were performed by two blinded observers (C.E.R., 20 years of experience and D.C.S., three years of experience). Discrepancies were solved by consensus between the two experienced observers.

 Inflammatory profile

Blood samples were collected in the morning (between 8:00-10:00 A.M.) after 12h fasting and after 30 minutes of resting. High-sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits were used to measure IL-1, IL-6, IL-10, and TNF-α. The ELISA plates were sensitized with the markers, in carbonate buffer, 50 μL per well, and incubated overnight at 4º Celsius. The marker was used at a concentration of 2μg/mL; 50 μL of detector antibody was added to each well to a concentration of 0.5μg/mL, prepared in washing liquid, and incubated for one hour at 37º Celsius. The results were obtained based on the reading of the optical density in a spectrophotometer with a 450 nm filter as described previously. 18 The interleukin analyses were performed in duplicate, and the mean was used in this study.

 Body composition

Body composition was assessed by dual-energy X-ray absorptiometry (DXA), (Discovery DXA system, Hologic Inc) to measure total fat-free mass, fat mass, and fat percentage in all participants. All DXA measurements were performed by the same experienced technician and the precision error was established according to the International Society for Clinical Densitometry’s standards. DXA was used to exclude possible bias of BMI among the participants.

 Statistical analysis

Data are presented as mean ± standard deviation (SD) or median (interquartile range [IQR] 25-75%) according to data normality. The Kolmogorov-Smirnov test was used to evaluate the normal distribution of the variables studied. The parametric data were compared through one-way ANOVA. When a significant difference was found, the Scheffé post-hoc comparison test was used. Kruskal Wallis and Dunn’s multiple comparison tests were used for nonparametric data. Bivariate correlation test (Spearman) was also used. A P<0.05 indicated statistical significance. The Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23 was used to perform all the statistical analyses.

 Results

Physical characteristics and lipid profile are described in Table 1 . AASU had higher weight, BMI, and lean mass compared with AASNU and controls. Body fat was lower in AASU compared with that in AASNU and controls. No significant difference was found in age and height between AASU, AASNU, and control groups. In addition, the AASU had lower high-density lipoprotein cholesterol (HDL-c) plasma levels and higher low density lipoprotein cholesterol (LDL-c) plasma levels compared with AASNU and controls.

– Physical characteristics and lipid profile in anabolic androgenic steroid users (AASU), anabolic androgenic steroid nonusers (AASNU), and sedentary control (SC)
Variables AASU = 20 AASNU = 20 SC = 10 p
Age (years) 29 ± 5 29 ± 5 29 ± 3 0.861
Height (m) 1.78 ± 0.04 1.80 ± 0.09 1.76± 0.08 0.841
Weight (kg) 97.4 (90.1-104.9) *† 82.0 (74.0-88.0) 74.8 (70.0-87.5) <0.001
BMI (kg/m 2 ) 31.11 ± 3.45 *† 25.45 ± 1.92 25.70 ± 3.38 <0.001
Fat mass (%) 13.18 ± 5.62 *† 19.27 ± 4.33 * 27.59 ± 7.49 0.005
Lean mass (kg) 82.05 ± 9.18 *† 62.81 ± 7.15 * 53.94 ± 7.38 <0.001
TC (mg/dL) 186 (143-208) 155 (135-188) 189 (175-200) 0.070
HDL-c (mg/dL) 19 (13-25) *† 44 (41-54) 50 (40-55) <0.001
LDL-c (mg/dL) 144 (105-179) *† 96 (81-125) 122 (105-132) 0.001
TG (mg/dL) 74 ± 23 75 ± 35 98 ± 45 0.151
Glucose (mg/dL) 90 ± 7 90 ± 6 92 ± 8 0.661

AASU: anabolic androgenic steroids users; AASNU: anabolic androgenic steroids nonusers; SC: sedentary control; BMI: body mass index; TC: total cholesterol; HDL-c: high-density lipoprotein cholesterol; LDL-c: low-density lipoprotein cholesterol. TG: triglycerides * p <0.05 vs. SC; † p< 0.05 vs. AASNU.

AASU had higher mPFA in RCA compared with AASNU and controls [-65.87 (70.51-60.70) vs. -78.07 (83.66-72.87) vs.-78.46 (85.41-71.99) HU, respectively, p<0.05] (Figure 1A). Additionally, the mPFA in the LAD was higher in AASU compared with AASNU and controls [-71.47 (76.40-66.61) vs. -79.32 (84.37-74.59) vs. -82.52 (88.44-75.81) HU, respectively, p<0.05] (Figure 1B). However, no difference was found in mPFA in the LCx between AASU, AASNU, and controls [-72.41 (77-70) vs. -80.13 (86.22-72.23) vs. -78.29 (80.63-72.29) HU, respectively, p>0.05] (Figure 1C). Analysis of proximal perivascular fat atternuation in the LAD can be seen in Central Illustration .

– A) Mean pericoronary fat attenuation (mPFA) in the right coronary artery (RCA); B) left anterior descending coronary artery (LAD); C) and left circumflex artery (LCx) in anabolic androgenic steroid users (AASU), anabolic androgenic steroid nonusers (AASNU), and sedentary control (SC). * = p<0.05.

IL-1, IL-6, and IL-10 were significantly higher in AASU compared with that in AASNU and SC (Figure 2A-C, respectively). However, TNF-α was not different between the three groups (Figure 2D). Further analysis showed a positive correlation between IL-1 and RCA pFAM; IL-1 and LAD pFAM; IL-6 and RCA pFAM; IL-6 and LAD mPFA (Figures 3A-D, respectively).

– A) Concentration of interleukin (IL)-1 (IL-1); B) IL-6, C) IL-10, and D) tumor necrosis factors alpha (TNF-α) in anabolic androgenic steroid users (AASU), anabolic androgenic steroid nonusers (AASNU), and sedentary control (SC); OD: optical density * = p<0.05.

– A) Positive correlation between interleucin-1 (IL-1) and right coronary artery (RCA) mean pericoronary fat attenuation (mPFA); B) IL-1 and mPFA in the left anterior descending coronary artery (LAD); C) IL-6 and mPFA in the RCA; IL-6, and D) mPFA in the LAD; OD: optical density.

In addition, the average time of AAS use in the AASU group was 8±6 years. Within the AASU group, 20%, 40%, 35%, and 5% of them were using two, three, four, and five different types of AAS, respectively. Testosterone (enanthate, propionate, undecylate, and cypionate), nandrolone, boldenone, trenbolone, and stanozolol were the most common types of AAS used in AASU. The testosterone/epitestosterone (T/E) ratio was higher in AASU compared with that in AASNU and SC (63.8±44.6 vs. 0.9±1.2 vs. 0.9±0.9, respectively, p <0.05). The AASU and AASNU groups had been involved in strength training for approximately 10 years.

 Discussion

In this case-control study comparing mPFA and peripheral cytokines in AASU, AASNU and controls, we found: i. High mPFA in AASU; ii. High cytokines in AASU, and iii. mPFA was associated with peripheral cytokines.

Vascular inflammation is the trigger for coronary atherosclerotic plaque development and is a typical feature of atherosclerotic plaque rupture. 9 Antonopoulos et al. 10 reported that the inflamed coronary artery diffuses to the perivascular adipose tissue, which changes the composition of perivascular fat around inflamed arteries. These changes lead to attenuation around coronary arteries from typical lipid attenuation (more negative HU values [e.g., closer to –190 HU]) to the more aqueous phase (less negative HU values [e.g., closer to –30 HU]). 10 Although more studies are needed to confirm the HU values as a marker of coronary inflammation, a previous study 11 suggested that -70 HU appears to be a reasonably robust cutoff to define the inflammation of coronary arteries. Moreover, Oikonomou et al. 19 suggested that high perivascular FAI values (cutoff ≥ -70.1 HU) are an indicator of increased cardiac mortality. 19

Gaibazzi et al. 11 showed that patients with myocardial infarction in the absence of obstructive coronary stenosis and pFAI values lower than -70 HU values (approximately -68.37 HU) more frequently have coronary artery plaques compared with healthy controls who have pFAI higher than -70 (approximately -78.03 HU). 11 In our study, we found that AASU had a mPFA (RCA and LAD) of approximately -68.71 HU. Interestingly, this finding is in line with our previous observations that about 1 in 4 weightlifters (25%) who used AAS had signs of subclinical CAD in the computed tomography angiography. In contrast, none of the AASNU or the sedentary participants had subclinical CAD. 6

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease. 9 It is well established that markers of systemic inflammation, such as IL-1, IL-6, and TNF-α, are the major players in the downstream vascular inflammatory cascade. 20 , 21 In our study, we found a higher IL-1 and IL-6 concentration in AASU compared with AASNU and sedentary controls. However, no difference in TNF-α was found among groups. Despite the increased pro-inflammatory cytokines, IL-10 was higher in AASU compared with AASNU and sedentary controls.IL-10 is the main anti-inflammatory cytokine that plays an important role in modulating the production of TNF-α. 22 Our results suggest that IL-10 may balance the pro/anti-inflammatory profile. This hypothesis should be addressed in future studies.

AAS abuse has been associated with reduced cholesterol efflux mediated by HDL and HDL plasma concentration, and increased LDL plasma concentration. This altered lipid metabolism is one of the mechanisms involved in the atherogenic process. Furthermore, disturbed shear rate (SR), characterized by increased retrograde and oscillatory SR, is associated with inflammation, atherosclerosis, and endothelial dysfunction. 23 High-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP) is also a marker of vascular inflammation. 24 We have previously 25 reported that AASU have increased retrograde and oscillatory SR in the brachial artery and higher hs-CRP compared with AASNU. 25 Taken together, all these alterations may be associated with coronary inflammation and premature development of atherosclerotic disease in young AASU.

Clinical implication

The clinical implication of our results is that pericoronary fat attenuation measured by coronary computed tomography angiography can be used to assess the coronary inflammation burden and therefore assess the cardiovascular risk of a specific population. Coronary inflammation by mPFA can be detected even before detectable atherosclerotic plaque formation and, therefore, has the potential to become an early biomarker of CAD in AASU. The routine clinical application of this new technology will warrant further and larger longitudinal studies.

 Limitations

We recognize limitations in our study. We studied a small sample size, and the results are a subanalysis from a previous study. 6 We used mPFA by TeraRecon as previously described by Nomura et al. 26 and the values cannot be compared directly to other approaches to pericoronary inflammation. The mechanisms involved in pericoronary fat attenuation were out of the scope of our study. The correlation observed in our study should be interpreted with caution, and the mechanism of pericoronary fat attenuation should be addressed in future studies.

 Conclusion

This study indicates that AAS abuse is linked to coronary inflammation and higher systemic inflammatory cytokines profile. In addition, the pericoronary fat attenuation can be used to track coronary inflammation (as a biomarker of CAD) even before visible plaques develop.

 Acknowledgment

It is with great sadness that we learned of the passing of Professor Rosa Maria Rodrigues Pereira on 3 October 2022. Her work on bone metabolism, osteoporosis, and rheumatic diseases immensely contributed to the field of rheumatology in Brazil and will always serve as a guide for new researchers globally.

Study association

This article is part of the thesis of post doctoral submitted by Francis Ribeiro de Souza, from departamento de cardiopneumologia da Faculdade de Medicina, Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Hospital das Clínicas de Medicina da Universidade de São Paulo under the protocol number 28156320.6.0000.0068. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.

Sources of funding: This study was partially funded by Fundação Zerbini and FAPESP 2012/10527-3.