Todos os procedimentos de manejo dos animais foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de São Paulo (número 9073161118). Os ratos foram obtidos no Centro para o Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Biologia e Medicina e alojados em instalações institucionais em um ciclo claro/escuro de 12 horas com comida e água disponíveis ad libitum .

Um método de sorteio simples foi utilizado para dividir aleatoriamente ratos Wistar machos com quatro semanas de idade e peso aproximado de 100 g em dois grupos: grupo controle (CTRL) e o grupo experimental (MCT). Após o sorteio, os animais foram reagrupados e identificados em seus respectivos grupos: 1) CTRL, que recebeu uma única dose i.p. de solução veículo de dimetilsulfóxido (DMSO, Synth®) (1 ml/kg); e 2) Grupo MCT, que recebeu uma única injeção i.p. de MCT (50 mg/kg - SIGMA Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) dissolvido em DMSO no dia 0, conforme descrito anteriormente. ^{22 , 23} Os animais foram observados por 20 dias após a administração de MCT e DMSO.

Os ratos foram anestesiados por inalação de isoflurano 1,5–2,0% (Isoforine®, Cristália, SP, Brasil) e colocados em posição supina para a realização dos experimentos de eletrocardiograma (ECG). O registro do ECG de cinco minutos foi realizado utilizando equipamento eletrocardiográfico (ECG-PC versão 2.07 ®-TEB, MG, Brasil) antes da administração da MCT ou veículo e após 20 dias de tratamento. Os parâmetros avaliados foram duração da onda P, duração do complexo QRS, intervalos PR, intervalo QT e frequência cardíaca. Os valores do intervalo QT foram corrigidos pela fórmula de Bazett (QTc = QT/√RR). Todos os traçados de ECG foram analisados offline. Após o cálculo da média de, pelo menos, dez ciclos elétricos sucessivos para cada animal, os parâmetros foram analisados.

O peso corporal dos ratos dos grupos CTRL e MCT foi medido no dia 0 e no dia 20. Ao final do estudo, os ratos foram decapitados para coleta do coração. Utilizamos o índice de Fulton para expressar o grau de hipertrofia do ventrículo direito (VD), calculado a partir da razão do peso do VD pela soma do ventrículo esquerdo (VE) e septo (S), conforme descrito anteriormente. ^{23 , 24} Além disso, a relação entre o peso do coração e o comprimento da tíbia foi avaliada para determinação da hipertrofia cardíaca geral.

O processamento histológico dos corações foi realizado conforme descrito anteriormente. ²⁵ Os tecidos foram fixados por imersão em paraformaldeído a 4% por 24 horas a uma temperatura de 4 °C. Posteriormente, o tecido cardíaco foi desidratado com uma série crescente de etanol (70, 80, 90 e 100%), seguido de clarificação em xilol e inclusão em parafina. Em seguida, cortes transversais de 8 µm de espessura foram feitos utilizando um micrótomo (modelo HM335E; Microm, Inc., Minneapolis, MN, EUA). Após desparafinização com xileno e reidratação por meio de concentrações graduadas de etanol (100, 90, 80 e 70%), as lâminas foram coradas com Tricromo de Masson para avaliação da morfologia cardíaca, bem como da extensão da fibrose. A análise morfométrica da classificação foi realizada utilizando o software ImageJ ®, versão 1.44 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA). Nesta análise, utilizamos uma grade predefinida e uma ferramenta de contagem de células para medição, configurada com 1.000 pontos de intersecção por rato, a partir de 20 quadros, conforme descrito anteriormente. ²⁵

O AE foi cortado perpendicularmente e montado em cuba para órgãos isolados, contendo solução de Tyrode (mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl ₂ , 0,5 MgCl ₂ , 0,33 NaH ₂ PO ₄ , 11 Dextrose e 5 HEPES continuamente gaseificados com 100% de O ₂ , como descrito anteriormente. ^{22 , 23 , 26} As extremidades do AE foram suspensas horizontalmente por ganchos de aço inoxidável e equilibradas sob uma tensão de repouso de 0,5 gf (4,9 mN) por, no mínimo, 40 minutos antes do registro. O AE foi estimulado a 1 Hz.

A susceptibilidade do AE ao desenvolvimento de arritmia foi testada aplicando-se um único trem de 50 pulsos na frequência de 30 Hz através de um par de eletrodos de prata (Ag/AgCl) posicionados a 90º e conectados a um estimulador (Myopacer, IonOptix), conforme descrito anteriormente. ²⁷

Todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). A normalidade da variável dependente foi testada com o teste de Shapiro-Wilk. As comparações entre os grupos foram realizadas usando um teste t de Student não pareado bicaudal. As variáveis contínuas foram analisadas por meio do teste t de Student pareado. O teste exato de Fisher foi utilizado para os dados categóricos (incidência de arritmias). A legenda das figuras identificam o teste estatístico utilizado. O nível de significância para rejeição de hipótese nula foi p < 0,05. A quantidade de animais, indicada na legenda da figura, é representada por (n). Os dados foram analisados utilizando Excel® (Microsoft, EUA) e Origin 8.0® (OriginLab, EUA).

Primeiramente, foi realizada uma análise morfofuncional cardíaca para observar marcadores clássicos de doença cardíaca no modelo de ratos com HP-MCT ( Figura 1 ). Inicialmente, avaliamos o peso do coração (Figura 1A), o peso do coração normalizado pelo peso corporal (Figura 1B), o peso do ventrículo direito (VD) normalizado pelo comprimento da tíbia (Figura 1C) e o índice de Fulton (Figura 1D). Todos esses parâmetros estavam aumentados no grupo MCT em comparação com o grupo CTRL, indicando remodelação do lado direito do coração, como já demonstrado em estudos anteriores. ^{5 , 22 , 23 , 28} Além disso, observamos que os pesos do AE (Figura 1E) e do VE (Figura 1F) também estavam aumentados no grupo MCT em comparação com o grupo CTRL, sugerindo remodelamento estrutural do lado esquerdo do coração. Para caracterizar melhor o modelo de MCT, realizamos uma avaliação histológica do lado esquerdo do coração ( Figura 2 ).

Figura 1

Figura 2

Por meio da avaliação histológica, observamos que a área transversal dos miócitos do AE e do VE no grupo experimental foi aumentada em comparação ao grupo CTRL (Figuras 2A-B) e quantificada na (Figura 2C). Curiosamente, o aumento da área transversal foi observado em um cenário de aumento do conteúdo de colágeno no AE e no VE (Figura 2D) e redução da ocupação total de miócitos (Figura 2E).

Assim, o modelo de HP-MCT recapitula a maior parte do fenótipo morfológico do coração observado em outros estudos. ^{5 , 22 , 23 , 28} Para confirmar esse resultado, verificamos se o modelo de HP-MCT em nosso estudo apresenta as mesmas alterações esperadas no eletrocardiograma, conforme relatadas anteriormente neste modelo animal. ^{5 , 22 , 23 , 28} O eletrocardiograma de superfície foi realizado nos grupos CTRL e MCT, e está resumido na ( Figura 3 ). Traços representativos de ECG são mostrados na (Figura 3A). Após 20 dias da administração de MCT, a duração da onda P (Figura 3B), o intervalo PR (Figura 3C) e o intervalo QT (Figura 3E) aumentaram. Não foram observadas alterações no intervalo QRS (Figura 3D). Assim, o ECG associado à análise morfométrica e histológica do coração demonstra que o modelo de rato com HP-MCT desenvolve um fenótipo cardíaco associado a estrutura e função prejudicadas, conforme descrito anteriormente. ^{5 , 22 , 23 , 28}

Figura 3

Em seguida, conduzimos uma série de experimentos para estudar a função do AE ex vivo estimulado a 1 Hz. A Figura 4 resume nossos achados. Uma curva normalizada média sobreposta é mostrada na (Figura 4A) para os grupos experimentais CTRL e MCT. Não houve diferença no AE do modelo de HP-MCT quanto à frequência de estimulação (Figura 4B) e a amplitude máxima (Figura 4C). Uma diferença modesta, mas significativa, foi observada no tempo até a contração máxima (Figura 4D), medido como o tempo entre 10 e 90% para o pico da contração. Não foi observada alteração no tempo de relaxamento (Figura 4E).

Figura 4

Um relato anterior descobriu que o AD isolado de animais com HP-MCT, após 14 dias de administração de MCT, é suscetível ao desenvolvimento de arritmias após protocolo de estimulação ex vivo . ^{22 , 23} Aqui, exploramos a suscetibilidade do AE de animais com HP-MCT para o desenvolvimento de arritmias após 20 dias da administração de MCT. Nossos achados foram resumidos na ( Figura 5 ). Após o protocolo de estimulação intermitente ( burst ), o AE do grupo CTRL desenvolveu algumas extrassístoles, conforme evidenciadas no traço representativo (Figura 5A), traço esquerdo, e o AE do grupo HP-MCT, representado na (Figura 5A), traço direito. Conforme mostrado na (Figura 5B), eventos arrítmicos foram observados na mesma frequência no grupo MCT (3/10) em comparação com o grupo CTRL (5/10) após estimulação intermitente ( burst ). Além disso, a maioria dos eventos arrítmicos observados foram extrassístoles e foi detectada fibrilação não atrial.

Figura 5