Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC NFJWgk3gfRkfJNhkV83StJs S0066-782X2023001000308 00308 10.36660/abc.20220750 Artigo Original O Pré-Condicionamento com Dexmedetomidina Atenua a Lesão de Isquemia/Reperfusão Miocárdica em Ratos, Suprimindo a Mitofagia Via Ativação do Receptor Α2-Adrenérgico 0000-0001-5959-1851 Chen YaHua Concepção e desenho da pesquisa e Redação do manuscrito Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística 1 2 Chen Hui Concepção e desenho da pesquisa e Redação do manuscrito Obtenção de financiamento Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 2 Chen YuJiao Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 3 Yang ZaiQun Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 4 Zhou Tao Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados 2 Xu Wei Obtenção de dados 2 Guizhou Aerospace Hospital Zunyi Guizhou China Guizhou Aerospace Hospital, Zunyi, Guizhou – China Zunyi Medical University Zunyi Guizhou China Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi, Guizhou – China North Sichuan Medical College NanChong Sichuan China Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, NanChong, Sichuan – China People’s Hospital of Qiandongnan Miao Dong Autonomous Prefecture Qiandongnan Guizhou China People’s Hospital of Qiandongnan Miao and Dong Autonomous Prefecture, Qiandongnan, Guizhou – China Correspondência: Hui Chen • Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, No.149 Dalian road, Zunyi 563000, Guizhou, China E-mail: chenhui522524@163.com

Editor responsável pela revisão: Marina Okoshi

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo

 30 10 2023 10 2023 120 10 e20220750 12 11 2022 20 04 2023 16 08 2023 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Figura Central

: O Pré-Condicionamento com Dexmedetomidina Atenua a Lesão de Isquemia/Reperfusão Miocárdica em Ratos, Suprimindo a Mitofagia Via Ativação do Receptor Α2-Adrenérgico

Resumo Fundamento

A dexmedetomidina (DEX), um agonista específico do receptor α2-adrenérgico, é protetora contra lesão de isquemia/reperfusão miocárdica (I/R). No entanto, a associação entre a cardioproteção induzida pelo pré-condicionamento DEX e a supressão da mitofagia permanece pouco clara.

 Objetivo

Portanto, nosso objetivo foi investigar se o pré-condicionamento com DEX alivia a I/R, suprimindo a mitofagia via ativação do receptor α2-adrenérgico.

 Método

Sessenta corações de ratos isolados foram tratados com ou sem DEX antes de induzir isquemia e reperfusão; um antagonista do receptor α2-adrenérgico, a ioimbina (YOH), também foi administrado antes da isquemia, isoladamente ou com DEX. A frequência cardíaca (FC), pressão diastólica do ventrículo esquerdo (PDVE), pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE), taxa máxima e mínima de desenvolvimento da pressão ventricular esquerda (±dp/dtmax) e tamanho do infarto do miocárdio foram medidos. A ultraestrutura mitocondrial e as autofagossomas foram avaliadas por microscopia eletrônica de transmissão. O potencial de membrana mitocondrial e os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) foram medidos usando os ensaios JC-1 e diacetato de diclorodi hidrofluoresceína, respectivamente. Os níveis de expressão das proteínas associadas à mitofagia Beclin1, relação LC3II/I, p62, PINK1 e Parkin foram detectados por western blotting.

 Resultados

Em comparação com o grupo controle, no grupo isquemia/reperfusão, a FC, PDVE e ±dp/dtmax foram notavelmente diminuídas (p<0,05), enquanto os tamanhos da PDFVE e do infarto aumentaram significativamente (p<0,05). O pré-condicionamento com DEX melhorou significativamente a disfunção cardíaca, reduziu o tamanho do infarto do miocárdio, manteve a integridade estrutural mitocondrial, aumentou o potencial de membrana mitocondrial, inibiu a formação de autofagossomas e diminuiu a produção de ROS e a relação Beclin1, relação LC3II/I, expressão PINK1, Parkin e p62(p<0,05). Quando DEX e YOH foram combinados, o YOH cancelou o efeito da DEX, enquanto o uso de YOH sozinha não teve efeito.

 Conclusão

Portanto, o pré-condicionamento DEX foi cardioprotetor contra I/R em ratos, suprimindo a mitofagia por meio da ativação do receptor α2-adrenérgico.

 Dexmedetomidina Traumatismo por Reperfusão Ratos Mitofagia Science and Technology Planning Project of Zunyi [2018]94 Fontes de financiamento Introdução

O infarto do miocárdio é um grande problema de saúde associado a alta morbidade e mortalidade em todo o mundo.1A melhor maneira de restaurar o miocárdio isquêmico é a reperfusão precoce para restaurar o fluxo sanguíneo e o suprimento de oxigênio à artéria coronária ocluída.2No entanto, além de reduzir a lesão isquêmica e limitar o tamanho do infarto, a reperfusão também pode causar independentemente uma lesão adicional chamada “lesão de reperfusão”.3Estudos experimentais sugeriram que uma lesão de reperfusão leva à perda da função cardíaca e à morte das células miocárdicas e contribui para até 50% do tamanho final do infarto.4Atualmente, nenhuma intervenção não farmacológica ou farmacológica eficaz está disponível para reduzir a lesão de isquemia/reperfusão miocárdica (I/R). Os mecanismos da I/R envolvem principalmente sobrecarga de cálcio, resposta inflamatória, estresse oxidativo, apoptose, disfunção mitocondrial e mitofagia,5-13 entre os quais a mitofagia desempenha um papel vital.

A autofagia é um processo de degradação relacionado ao lisossoma altamente conservado, ativado por hipoxemia, estresse oxidativo e organelas ou proteínas danificadas. É uma função de manutenção celular que remove organelas danificadas, incluindo as mitocôndrias, e mantém a sobrevivência celular.14A mitofagia, um tipo de autofagia seletiva, degrada mitocôndrias disfuncionais para manter uma rede mitocondrial normal e funcional.15As mitocôndrias são vulneráveis à lesão de isquemia/reperfusão (I/R), e as mitocôndrias danificadas são um elemento fisiopatológico do I/R.16Além disso, os cardiomiócitos são altamente dependentes da energia produzida pelas mitocôndrias e são mais sensíveis ao dano mitocondrial.17Assim, mais atenção está sendo dada à mitofagia devido à sua estreita correlação com o controle da quantidade e função mitocondrial durante a I/R. No entanto, a mitofagia pode ser excessivamente ativada após a reperfusão, resultando em diminuição da massa mitocondrial e agravamento da lesão cardíaca. Portanto, permanece controverso se a ativação da mitofagia é protetora ou prejudicial durante a I/R.

Dexmedetomidina (DEX), um agonista seletivo do adrenoceptor α2 (AR), é amplamente utilizado em anestesia cirúrgica e unidades de terapia intensiva devido ao seu efeito sedativo e à ausência de depressão respiratória.18Estudos anteriores sugeriram que o tratamento com DEX melhora os resultados cardíacos após cirurgia não cardíaca19 e reduz as taxas de mortalidade pós-operatória e complicações após cirurgia cardíaca humana. Estudos em animais também demonstraram que o pré-condicionamento com DEX protege contra lesões de I/R, reduzindo a incidência de arritmias ventriculares e a área de infarto.20,21Os atuais mecanismos moleculares da DEX têm se concentrado na inibição do estresse oxidativo, na redução da apoptose e na resposta inflamatória.22-24 No entanto, a associação entre DEX e mitofagia não está totalmente elucidada na I/R. Dada a importância da mitofagia na I/R, levantamos a hipótese de que o pré-condicionamento com DEX poderia suprimir a mitofagia após I/R em ratos, ativando os receptores α2-adrenérgicos.

Para testar nossa hipótese, estudamos 1) se o pré-condicionamento com DEX é cardioprotetor em um modelo animal de lesão I/R induzida pelo sistema de perfusão Langendorff e 2) se o efeito protetor é exercido por meio da supressão da mitofagia via a ativação de receptores α2-adrenérgicos.

 Métodos Animais

Nosso estudo aderiu às regras de pesquisa animal, revisadas e aprovadas por um comitê aprovado institucionalmente. Ratos Sprague-Dawley machos foram aprovados pelo Laboratory Animal Center da Tianjin Biological Company, Changsha, China (número do certificado: SYXK2019-0014). Todos os animais foram mantidos sob um ciclo claro/escuro de 12 horas a 22°C e receberam comida e água suficientes.

 Modelo de I/R miocárdica

Os ratos foram anestesiados com pentobarbital via injeção intraperitoneal (45 mg/kg). Posteriormente foi realizada toracotomia. Quando o coração foi exposto e a aorta cortada, o coração foi imediatamente isolado e imerso em solução nutritiva cardíaca gelada Krebs-Henseleit (KH) (NaCl, 119 mM; CaCl2, 1,24 mM; KCl, 6,0 mM; KH2PO4, NaHCO3, 20,1 mM; 1,24 mM; MgSO4, 1,24 mM; glicose, 11,2 mM). Foi então fixado no equipamento de perfusão Langendorff e perfundido com solução de KH mantida a uma pressão constante de 75–80 mmHg a 37°C. Um balão de látex cheio de água foi colocado no ventrículo esquerdo através da válvula mitral, e a outra extremidade do balão foi conectada a um transdutor de pressão para monitorar a função cardíaca, incluindo frequência cardíaca (FC), pressão diastólica do ventrículo esquerdo (PDVE), pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE), e a taxa máxima e mínima de desenvolvimento da pressão ventricular esquerda (±dp/dtmax).

 Grupos experimentais

Após um equilíbrio de 15 minutos, se o nível de PDVE e FC foram >80 mmHg e > 200 batimentos/min, respectivamente, os corações foram alocados aleatoriamente em cinco grupos (n = 12/grupo) por meio de uma randomização em envelope lacrado: o grupo controle (perfundido com solução de KH por 190 min), o grupo isquemia/reperfusão (I/R) (perfundido com solução de KH por 30 min seguido de 40 min de isquemia global e posterior reperfusão com solução de KH por 120 min), o grupo DEX (pré-condicionado com DEX 10nM por 30 min seguido de I/R), o grupo Ioimbina (YOH) (pré-condicionado com 1μM YOH por 30 min seguido de I/R), e o Grupo DEX + YOH (pré-condicionado com 10nM DEX + 1μM YOH por 30min seguido por I/R). Doses de DEX e YOH foram usadas conforme relatado anteriormente (Figura1A).25

– Protocolo experimental para o coração de rato perfundido por Langendorff. Após um equilíbrio de perfusão de 15 minutos, os corações foram perfundidos durante 30 minutos adicionais e submetidos a 40 minutos de isquemia seguidos de 120 minutos de reperfusão. I/R: grupo isquemia/reperfusão; DEX: grupo Dexmedetomidina; YOH: grupo ioimbina.

Coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC)

A área do infarto foi avaliada pela coloração TTC. O coração foi colhido e congelado a -20°C ao final da reperfusão. Depois disso, todo o coração foi cortado em cinco seções iguais de cima para baixo e posteriormente incubado com TTC a 1% (Proteintech Group, Wuhan, China) por 30 min a 37°C no escuro. Finalmente, os corações foram fixados com formaldeído a 10% por 24 horas. As áreas não isquêmicas foram coradas de vermelho e as áreas infartadas foram coradas de branco. As áreas infartadas e normais foram fotografadas utilizando Image-Pro Plus 6.0. O tamanho do infarto foi calculado como uma porcentagem da área miocárdica total.

 Microscopia eletrônica de transmissão (MET)

O ventrículo esquerdo foi removido, cortado em formato de cubo de 1×1×1mm, rapidamente fixado com glutaraldeído a 2,5% por 24 horas e depois fixado com ósmio a 1% em temperatura ambiente por 2 horas. Posteriormente, o tecido foi lavado com solução salina tamponada com fosfato (PBS), desidratado em um gradiente de acetona e incorporado em uma mistura de resina epóxi. O tecido foi cortado em 50 fatias de nm de espessura usando um micrótomo manual Leica e depois duplamente corado com urânio e chumbo. A ultraestrutura e as autofagossomas no tecido miocárdico foram observadas e fotografadas usando um MET.

 Potencial de membrana mitocondrial (MMP)

As mitocôndrias foram extraídas do tecido ventricular esquerdo utilizando um Kit de Isolamento de Mitocôndrias de Tecido (Solarbio, Pequim, China) de acordo com as instruções do fabricante. Posteriormente, as mitocôndrias foram marcadas com JC-1 (Solarbio, Pequim, China), uma sonda fluorescente sensível. A fluorescência JC-1 foi detectada por microscopia de fluorescência. Mitocôndrias normais com alto potencial apresentaram fluorescência vermelha, enquanto mitocôndrias com baixo potencial exibiram fluorescência verde. Mudanças na despolarização mitocondrial foram refletidas na proporção das intensidades de fluorescência vermelha/verde.

 Produção de espécies reativas de oxigênio mitocondriais (ROS)

Para avaliar a produção de ROS, tecidos ventriculares esquerdos frescos e congelados foram incubados com solução de trabalho de diacetato de diclorodi hidrofluoresceína (DCFH-DA) (Servicebio, Wuhan, China) em PBS no escuro por 30 min a 37°C.

Após três lavagens com PBS, as seções foram continuamente incubadas com uma solução corante 4’,6-diamido-2-fenilindol (Servicebio, Wuhan, China) e seladas com um comprimido anti-fluorescência. As seções foram então observadas e analisadas usando um microscópio de fluorescência.

 Western blotting

O tecido cardíaco foi lisado com tampão de lisado proteico e o sobrenadante foi coletado. As concentrações de proteína foram medidas usando o ensaio de proteína do ácido bicinconínico (Servicebio, G2026). As amostras foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio a 10% e transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno. Depois disso, a membrana foi bloqueada com leite desnatado a 5% por 30 min em temperatura ambiente e posteriormente incubada a 4°C por uma noite com os anticorpos primários, incluindo Beclin-1(Servicebio, GB112053, 1:1000), LC3 (Proteintech Grupo, 14600-1-AP, 1:1000), P62 (Servicebio, GB11239-1, 1:1000), PINK1 (Affinity, DF7742, 1:1000) e Parkin (Servicebio, GB11596, 1:1000) anticorpos policlonais de coelho. No dia seguinte, a membrana foi lavada com solução salina tamponada com Tris com tampão Tween e incubada por 30 min com anticorpos secundários (GB23303, Servicebio, 1:5000) em temperatura ambiente. O conteúdo destas proteínas foi determinado utilizando o software Alpha (alphaEaseFC, Alpha Innotech).

 Análise estatística

O tamanho da amostra deste estudo foi baseado no experimento preliminar. As médias da PDFVE no grupo controle, grupo DEX e grupo I/R após reperfusão por 120 minutos foram 12,52, 16,23 e 22,39, respectivamente, e os desvios padrão foram 1,45, 2,44 e 145, respectivamente. O teste do nível α foi considerado 0,05, Z0,05/2 = 1,96. O nível de poder, 1 − β, foi considerado 0,8. Para os grupos controle e DEX, foi necessário um tamanho de amostra de seis para cada grupo. Para os grupos I/R e DEX, foi necessário um tamanho de amostra de quatro para cada grupo. Assim, foi determinado um tamanho amostral de seis por grupo.

Os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP). O software SPSS19.0 (International Business Machines, Corp) foi utilizado para análise estatística. A comparação dos dados de medição entre os grupos foi realizada utilizando ANOVA unidirecional. O teste Shapiro-Wilk foi empregado para verificar a normalidade. O método da Diferença Menos Significativa foi utilizado quando a variância era uniforme; de outra forma, foi utilizado o método T3 de Dunnett. A significância estatística foi estabelecida em p<0,05.

 Resultados O pré-condicionamento DEX melhorou a função cardíaca contra lesão de I/R

Para investigar o efeito da DEX na função cardíaca, medimos os índices hemodinâmicos cardíacos em ratos com ou sem DEX. Nossos resultados mostraram que não houve diferenças significativas hemodinâmicas entre os grupos no início (T1) e no início da isquemia (T2) (p>0,05). Porém, ao final do período de reperfusão (T3), FC, PDVE,e ±dp/dtmax diminuíram e a PDFVE aumentou significativamente no grupo I/R comparado como grupo controle (p<0,05). O pré-condicionamento com DEX aumentou significativamente os valores de PDVE e ±dp/dtmax e diminuiu a PDFVE em comparação como grupo I/R (p<0,05). A adição de YOH reverteu bastante a melhora hemodinâmica alcançada pelo tratamento com DEX (p<0,05), enquanto a YOH sozinha não mostrou qualquer impacto na hemodinâmica (p>0,05) (Figura 2).

– Efeitos do T3 na lesão miocárdica mediada por I/R. (A-E): Efeitos cardioprotetores da DEX sobre FC, PDVE, PDFVE, +dp/dt e -dp/dt. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão. n=12.•p<0,05, vs. ponto inicial de isquemia, #p<0,05, vs. grupo controle na reperfusão por 120 minutos.∆p<0,05, vs. grupo I/R na reperfusão por 120 minutos.<bold>#</bold>p<0,05, vs. grupo DEX na reperfusão por 120 minutos. I/R: grupo isquemia/reperfusão; DEX: grupo Dexmedetomidina; YOH: grupo ioimbina. Painel A: FC: Frequência cardíaca. Painel B: PDVE: pressão diastólica do ventrículo esquerdo. Painel C: PDFVE: pressão diastólica final do ventrículo esquerdo. Painel D: +dp/dt: taxa máxima de desenvolvimento da pressão ventricular esquerda. Painel E: -dp/dt: taxa mínima de desenvolvimento de pressão ventricular esquerda.

O pré-condicionamento com DEX reduziu o tamanho do infarto do miocárdio

Para confirmar ainda que a DEX induz efeitos cardioprotetores contra o I/R, o tamanho do infarto foi determinado pela coloração com TTC. Como esperado, a I/R causou infarto do miocárdio significativo em comparação com o grupo controle (p<0,05). No entanto, o pré-condicionamento com DEX reduziu significativamente o tamanho do infarto em comparação como grupo I/R (p<0,05). A administração de YOH reverteu significativamente a diminuição no tamanho do infarto induzida por DEX (p<0,05). Além disso, comparado como grupo I/R, não houve diferenças entre os grupos YOH e DEX + YOH (p>0,05) (Figura 3).

– DEX reduziu o tamanho do infarto cardíaco após lesão de I/R(n=6). Imagens representativas de amostras coradas com TTC mostrando a área de infarto (branco), a área sem infarto (vermelho) e a porcentagem de área infartada do coração no controle e coração isolado induzido por I/R. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão, n=6. #p<0,05 νs. Grupo de controle; ∆P<0,05 νs. grupo I/R; ★p<0,05 νs. Grupo DEX. I/R: grupo isquemia/reperfusão; DEX: grupo Dexmedetomidina; YOH: Grupo ioimbina. TTC: técnica de coloração com cloreto de trifeniltetrazólio.

O pré-condicionamento DEX reduziu a desordem e disfunção mitocondrial

Para explorar se a DEX melhorou a ultraestrutura mitocondrial, foi utilizado o MET. Os resultados mostraram que a I/R levou a danos mitocondriais acentuados, evidenciados por mitocôndrias inchadas e vacuolizadas com mais ruptura de cristas e ruptura de membrana mitocondrial em comparação com o grupo controle (p<0,05). Contrariamente, o dano mitocondrial foi mitigado e a integridade mitocondrial foi restaurada no grupo DEX em comparação com o grupo I/R (p<0,05). O co-tratamento com DEX e YOH reverteu significativamente o efeito protetor da DEX na ultraestrutura mitocondrial, o que foi equivalente ao do grupo I/R (p<0,05). A YOH sozinha não afetou as alterações ultraestruturais mitocondriais induzidas por I/R (Figura 4A, p> 0,05).

– DEX melhorou o distúrbio mitocondrial e a função mitocondrial. A) Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de mitocôndrias (ampliação 2.000×, 6.000×): Setas vermelhas representam autofagossomas. B) Potencial de membrana mitocondrial detectado pela coloração JC-1 e a proporção da intensidade de mitocôndrias normais (fluorescência vermelha) /mitocôndrias hipopotenciais (fluorescência verde). Barra de escala: 100mm. C) ROS foi indicado pelo DCFH-DA, e os percentuais de intensidade de ROS (fluorescência vermelha) foram calculados em diferentes grupos, barra de escala: 50mm. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. n=6. #p<0,05 νs. Grupo de controle; ∆p<0,05 νs. grupo I/R; ★p<0,05 νs. Grupo DEX. I/R: grupo isquemia/reperfusão; DEX: grupo dexmedetomidina; YOH: Grupo ioimbina; ROS: Espécies reativas de oxigênio; DCFH-DA: diacetato diclorodi hidrofluoresceína.

Depois disso, examinamos a alteração no potencial de membrana mitocondrial usando o ensaio JC-1 para avaliar a função mitocondrial. Nossos resultados mostraram que a I/R induziu uma diminuição severa no potencial de membrana, aumentando significativamente a fluorescência verde em comparação com o grupo controle (p<0,05). No entanto, a DEX aliviou o declínio do potencial de membrana, que apareceu como maior relação de fluorescência vermelha/verde do que em I/R (p<0,05). Da mesma forma, este efeito pode ser bloqueado por YOH (Figura 4B, p<0,05).

A solução de trabalho DCFH-DA foi usada para medir os níveis de ROS. Os resultados mostraram que os níveis de ROS estavam notavelmente elevados no grupo I/R comparado com o grupo de controle (p<0,05). O pré-condicionamento DEX reduziu significativamente a geração de ROS no grupo DEX (p<0,05). Da mesma forma, a YOH preveniu a inibição da produção de ROS induzida por DEX (Figura 4C, p <0,05).

 O pré-condicionamento DEX suprimiu a mitofagia excessiva após I/R

Para estudar ainda mais o mecanismo protetor da DEX na lesão I/R, marcadores bem conhecidos para proteínas relacionadas à formação de autofagossoma (relação Beclin1, LC3II/I) e proteínas de depuração de autofagossoma (p62) foram detectados por western blotting. Comparada com o grupo controle, a I/R aumentou os níveis da relação Beclin1 e LC3II/I, indicando aumento da formação de autofagossoma (p<0,05). O nível de p62 foi acentuadamente aumentado no grupo I/R em grau comparável ao do grupo controle (p<0,05). Comparado com o grupo I/R o pré-tratamento com DEX reduziu a expressão de Beclin1 e a relação LC3II/I (p<0,05), indicando que a DEX inibiu autofagia excessiva. Além disso, os níveis de proteína p62 diminuíram significativamente no grupo DEX comparado com o grupo I/R (p<0,05), indicando depuração eficiente do autofagossoma no grupo DEX. Consistentemente, a MET mostrou que a DEX reduziu o número de autofagossomas em comparação com o grupo I/R (Figura 3A). Contudo a YOH preveniu os efeitos da DEX na expressão Beclin1 LC3II/I e p62 (Figura 5A, p<0,05), e no número de autofagossomas (Figura 3A).

– Corações protegidos por DEX contra mitofagia excessiva induzida por I/R. A,C) Níveis de proteína de Beclin1, LC3II/I, p62, PINK1 e Parkin em diferentes grupos. B) Micrografia eletrônica representativa do coração obtida com aumento de 6.000 vezes. A seta vermelha indica autofagossoma engolindo mitocôndrias. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão, n=6. #p<0,05 νs. Grupo de controle; ∆p<0,05 νs. grupo I/R; ★p<0,05 νs. Grupo DEX. I/R: grupo isquemia/reperfusão; DEX: grupo Dexmedetomidina; YOH: grupo Ioimbina; GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. Painel A: LC3: cadeia leve 3 da proteína 1 associada a microtúbulos, p62: Sequestossoma-1; Painel C: PINK1: suposta quinase 1 induzida por PTEN.

Curiosamente, as imagens MET revelaram autofagossomas contendo mitocôndrias. Para explorar ainda mais o papel da DEX na autofagia, medimos a expressão de PINK1 e Parkin usando western blotting. Os resultados demonstraram que as proteínas PINK1 e Parkin estavam significativamente aumentadas no grupo I/R quando comparado com o grupo controle (p<0,05), e o pré-condicionamento com DEX inibiu a expressão de PINK1 e Parkin no grupo DEX (p<0,05). O tratamento com YOH reverteu o efeito inibitório da DEX na expressão de PINK1 e Parkin (Figura 5C, p <0,05).

 Discussão

As descobertas deste estudo ampliam ainda mais nossa compreensão da DEX como um mecanismo de proteção contra a I/R. Primeiro, a DEX melhorou a função cardíaca, reduziu o tamanho do infarto do miocárdio e melhorou o comprometimento mitocondrial após I/R em modelo de rato in vitro. Além disso, o mecanismo protetor do pré-condicionamento de DEX pode envolver a supressão da mitofagia excessiva e a recuperação da depuração da autofagossoma, o que foi evidenciado pela inibição da formação da autofagossoma, pela diminuição de Beclin1, LC3II/I, PINK1 e Parkin, e pela redução de p62. No entanto, estes efeitos poderiam ser anulados pela adição de YOH. No geral, estes dados mostraram o papel protetor fundamental do pré-condicionamento de DEX na I/R, regulando a mitofagia através da ativação de α2-AR.

As mitocôndrias, como fonte de energia, desempenham um papel significativo no funcionamento e na sobrevivência dos cardiomiócitos.26Em nosso estudo, visualizamos mitocôndrias com microscopia eletrônica e mostramos que o pré-condicionamento DEX preservou a integridade mitocondrial, que foi mais semelhante ao grupo controle do que ao grupo I/R, em que as cristas mitocondriais foram obviamente rompidas. Também observamos um aumento no potencial de membrana mitocondrial e uma diminuição nas ROS mitocondriais no grupo DEX em comparação com aqueles no grupo I/R. As mitocôndrias normais são o principal local de produção de grandes quantidades de trifosfato de adenosina para as células e conduzem muitos processos biológicos.27No entanto, a estrutura e a função das mitocôndrias são complexas, variáveis e sensíveis. Assim, pequenas alterações nos fatores intracelulares ou extracelulares podem levar a anormalidades estruturais e disfunções mitocondriais. Além disso, estudos demonstraram que mitocôndrias danificadas e disfuncionais são a principal fonte de ROS intracelulares, que causam danos ao miocárdio.28 Além disso, a geração excessiva de ERO diminui o potencial da membrana mitocondrial, resultando em mitocôndrias mais danificadas. Acima de tudo, estas descobertas sugeriram que a remoção de mitocôndrias danificadas e a preservação da qualidade mitocondrial são a chave para proteger contra lesões de I/R e apoiaram ainda mais os papéis protetores críticos do pré-condicionamento de DEX nas mitocôndrias contra I/R.

Demonstrou-se que uma diminuição no potencial da membrana mitocondrial desencadeia a mitofagia após lesão de I/R.29 Portanto, determinamos se o efeito protetor da DEX nas mitocôndrias estava relacionado à regulação da mitofagia. A formação de autofagossoma é o padrão ouro para ativação de autofagia na mitofagia. Usando microscopia eletrônica, descobrimos que as autofagossomas eram mais abundantes no grupo I/R do que nos grupos DEX e de controle, e a imagem MET mostrou autofagossomas contendo mitocôndrias. Além disso, detectamos as proteínas conhecidas por desempenharem um papel fundamental na mitofagia, e os resultados mostraram que o pré-condicionamento com DEX reduziu Belin1, LC3II/I, PINK1, Parkin e a expressão da proteína p62 em comparação com o grupo I/R. As proteínas Beclin1 e LC3II/I facilitam a formação do autofagossoma e interagem com a p62 para mover as mitocôndrias danificadas para a autofagossoma.30 Sabe-se que as proteínas PINK1 e Parkin induzem mitofagia e limpam mitocôndrias excessivas e danificadas.31 Além disso, o acúmulo de autofagossomas, LC3II/I e p62 indica depuração prejudicada da autofagossoma.32 Assim, nossos dados sugeriram que a mitofagia foi excessivamente aumentada após I/R, enquanto o pré-condicionamento com DEX suprimiu a mitofagia excessiva e resgatou a depuração da autofagossoma para remover eficientemente as mitocôndrias danificadas. Zhang et al. reportaram que o bloqueio da depuração do autofagossoma causa acúmulo de autofagossoma e contribui à morte de cardiomiócitos.33 Nossos resultados apoiaram esse ponto de vista. A maioria dos estudos nesta área descreveram o papel protetor da mitofagia no infarto do miocárdio ou na lesão I/R.34,35 Em contraste com estes estudos, nossos resultados indicaram que a mitofagia foi excessivamente ativada e prejudicial ao coração após I/R. Em apoio às nossas descobertas, vários estudos anteriores mostraram que a mitofagia excessiva diminui as mitocôndrias, o que subsequentemente causa privação de energia e agrava a lesão miocárdica após I/R.36,37 Assim, o papel da mitofagia no I/R pode ser paradoxal.38,39 Finalmente, combinados com esses estudos, nossos achados sugeriram que altos níveis de atividade mitofágica e comprometimento da depuração da autofagossoma podem estar envolvidos no desenvolvimento de I/R em ratos. No entanto, a mitofagia leve induzida por DEX agiu como um mecanismo pró-sobrevivência para limpar eficientemente as mitocôndrias danificadas e prevenir I/R.

YOH, um bloqueador α2-AR, foi usado para explorar os efeitos da DEX no I/R. No presente estudo, a YOH reverteu os efeitos protetores do pré-tratamento com DEX no miocárdio de ratos, o que resultou em diminuição da função cardíaca e aumento do tamanho do infarto do miocárdio; além disso, os níveis de expressão das proteínas da via da mitofagia aumentaram. Juntos, esses resultados indicaram que o efeito protetor do pré-condicionamento com DEX no miocárdio de ratos pode ser antagonizado pelos bloqueadores α2-AR, o que é consistente com um estudo anterior.40 Os bloqueadores α2-AR podem dilatar o músculo liso vascular, diminuir o tônus simpático e aumentar o tônus parassimpático periférico . Uma investigação anterior de Okada et al. mostrou que a administração de DEX antes da isquemia e reperfusão global diminuiu o fluxo coronariano e o tamanho do infarto do miocárdio. Os autores propuseram que a vasoconstrição coronariana induzida por DEX pela estimulação de α2-AR diminuiu o fluxo coronariano, induziu isquemia miocárdica e desencadeou o pré-condicionamento cardíaco isquêmico. Assim, a DEX pode desempenhar um papel protetor no miocárdio, alterando o fluxo sanguíneo coronariano para induzir o pré-condicionamento isquêmico.41

Existem algumas limitações neste estudo. Não utilizamos agonistas da mitofagia ou uma tecnologia específica de nocaute genético para compreender completamente a atividade da mitofagia, embora esses métodos possam ser usados para confirmar definitivamente o mecanismo de proteção miocárdica da DEX na mitofagia. Portanto, mais estudos intensivos são necessários para esclarecer o mecanismo de proteção da DEX, que poderá fornecer suporte teórico para a aplicação da DEX no I/R.

 Conclusão

Este estudo apoiou a hipótese de que o pré-condicionamento com DEX exerceu um efeito protetor contra a I/R, suprimindo a mitofagia excessiva e limpando eficientemente as mitocôndrias danificadas ativando α2-AR, restaurando assim a função mitocondrial.

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Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Experimental Animal Care and Use committee of Zunyi Medical University sob o número de protocolo 1492, 2001. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado por Science and Technology Planning Project of Zunyi (grant no. [2018]94).

 Original Article Dexmedetomidine Preconditioning Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury in Rats by Suppressing Mitophagy Via Activating Α2-Adrenergic Receptor 0000-0001-5959-1851 Chen YaHua Conception and design of the research and Writing of the manuscript Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis 1 2 Chen Hui Conception and design of the research and Writing of the manuscript Obtaining financing Critical revision of the manuscript for important intellectual content 2 Chen YuJiao Critical revision of the manuscript for important intellectual content 3 Yang ZaiQun Critical revision of the manuscript for important intellectual content 4 Zhou Tao Acquisition of data Analysis and interpretation of the data 2 Xu Wei Acquisition of data 2 China Guizhou Aerospace Hospital, Zunyi, Guizhou – China China Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi, Guizhou – China China Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, NanChong, Sichuan – China China People’s Hospital of Qiandongnan Miao and Dong Autonomous Prefecture, Qiandongnan, Guizhou – China Mailing Address: Hui Chen • Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, No.149 Dalian road, Zunyi 563000, Guizhou, China E-mail: chenhui522524@163.com

Potential conflict of interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Editor responsible for the review: Marina Okoshi

 Central Illustration

: Dexmedetomidine Preconditioning Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury in Rats by Suppressing Mitophagy Via Activating Α2-Adrenergic Receptor

Abstract Background

Dexmedetomidine (DEX), a specific α2-adrenergic receptor agonist, is protective against myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). However, the association between DEX preconditioning-induced cardioprotection and mitophagy suppression remains unclear.

 Objective

Hence, we aimed to investigate whether DEX preconditioning alleviates MIRI by suppressing mitophagy via α2-adrenergic receptor activation.

 Method

Sixty isolated rat hearts were treated with or without DEX before inducing ischemia and reperfusion; an α2-adrenergic receptor antagonist, yohimbine (YOH), was also administered before ischemia, alone or with DEX. The heart rate (HR), left ventricular diastolic pressure (LVDP), left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP), maximal and minimal rate of left ventricular pressure development (±dp/dtmax), and myocardial infarction size were measured. The mitochondrial ultrastructure and autophagosomes were assessed using transmission electron microscopy. Mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species (ROS) levels were measured using JC-1 and dichloride hydrofluorescein diacetate assays, respectively. The expression levels of the mitophagy-associated proteins Beclin1, LC3II/I ratio, p62, PINK1, and Parkin were detected by western blotting.

 Results

Compared with the control group, in the ischemia/reperfusion group, the HR, LVDP, and ±dp/dtmax were remarkably decreased (p< 0.05), whereas LVEDP and infarct sizes were significantly increased (p< 0.05). DEX preconditioning significantly improved cardiac dysfunction reduced myocardial infarction size, maintained mitochondrial structural integrity, increased mitochondrial membrane potential, inhibited autophagosomes formation, and decreased ROS production and Beclin1, LC3II/I ratio, PINK1, Parkin, and p62 expression(p< 0.05). When DEX and YOH were combined, YOH canceled the effect of DEX, whereas the use of YOH alone had no effect.

 Conclusion

Therefore, DEX preconditioning was cardioprotective against MIRI in rats by suppressing mitophagy via α2-adrenergic receptor activation.

 Dexmedetomidine Reperfusion Injury Rats Mitophagy Introduction

Myocardial infarction is a major health concern associated with high morbidity and mortality worldwide.1 The best way to restore the ischemic myocardium is early reperfusion to restore blood flow and oxygen supply to the occluded coronary artery.2 However, aside from reducing ischemic injury and limiting infarct size, reperfusion can also independently cause an additional injury called a “reperfusion injury”.3 Experimental studies have suggested that a reperfusion injury leads to cardiac function loss and myocardial cell death and contributes to up to 50% of the final infarct size.4 Currently, no effective non-pharmacological or pharmacological interventions are available to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). The mechanisms of MIRI mainly involve calcium overload, inflammatory response, oxidative stress, apoptosis, mitochondrial dysfunction, and mitophagy,5-13 among which mitophagy plays a vital role.

Autophagy is a highly conserved lysosomal-related degradation process activated by hypoxemia, oxidative stress, and damaged organelles or proteins. It is a cellular housekeeping function that removes damaged organelles, including the mitochondria and maintains cell survival.14 Mitophagy, a type of selective autophagy, degrades dysfunctional mitochondria to maintain a normal and functional mitochondrial network.15 Mitochondria are vulnerable to ischemia/reperfusion (I/R) injury, and damaged mitochondria are a pathophysiological element of MIRI.16 Moreover, cardiomyocytes are highly dependent on the energy produced by the mitochondria and are more sensitive to mitochondrial damage.17 Thus, more attention is being paid to mitophagy because of its close correlation with controlling mitochondrial quantity and function during MIRI. However, mitophagy may be excessively activated after reperfusion, resulting in decreased mitochondrial mass and aggravation of cardiac injury. Therefore, it remains controversial whether mitophagy activation is protective or detrimental during MIRI.

Dexmedetomidine(DEX), a selective α2-adrenoceptor(AR) agonist, is widely used in surgical anesthesia and intensive care units because of its sedative effect and lack of respiratory depression.18 Previous studies have suggested that DEX treatment improves cardiac outcomes after non-cardiac surgery19 and reduces postoperative mortality rates and complications after human cardiac surgery. Animal studies have also shown that DEX preconditioning protects against I/R injury by reducing the incidence of ventricular arrhythmias and the infarct area.20,21 The current molecular mechanisms of DEX have focused on inhibiting oxidative stress, reducing apoptosis, and the inflammatory response.22-24 However, the association between DEX and mitophagy is not fully elucidated in MIRI. Given the importance of mitophagy in I/R, we hypothesized that DEX preconditioning could suppress mitophagy after MIRI in rats by activating α2-adrenergic receptors.

To test our hypothesis, we studied 1) if DEX preconditioning is cardioprotective in an animal I/R injury model induced by the Langendorff perfusion system and 2) if the protective effect is exerted through the suppression of mitophagy via the activation of α2-adrenergic receptors.

 Methods Animals

Our study adhered to animal research rules as reviewed and approved by an institutionally approved committee. Male Sprague-Dawley rats were approved by the Laboratory Animal Center of Tianjin Biological Company, Changsha, China (certificate number: SYXK2019-0014). All animals were kept under a 12 h light/dark cycle at 22℃ and received sufficient food and water.

 Myocardial I/R model

The rats were anesthetized with pentobarbital via intraperitoneal injection (45 mg/ kg). Subsequently, a thoracotomy was performed. When the heart was exposed and the aorta was cut, the heart was immediately isolated and immersed in ice-cold cardiac nutrient solution Krebs-Henseleit (KH) (NaCl, 119 mM; CaCl2, 1.24 mM; KCl, 6.0 mM; KH2 PO4, NaHCO3, 20.1 mM; 1.24 mM; MgSO4, 1.24 mM; glucose, 11.2 mM). It was then fixed on the Langendorff perfusion setup and perfused with KH solution maintained at a constant pressure of 75–80 mmHg at 37℃. A latex balloon filled with water was placed in the left ventricle through the mitral valve, and the other end of the balloon was connected to a pressure transducer to monitor cardiac function, including heart rate (HR), left ventricular diastolic pressure (LVDP), left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP), and the maximal and minimal rate of left ventricular pressure development (±dp/dtmax).

 Experimental groups

After a 15-minute equilibration, if the levels of LVDP and HR were > 80 mmHg and > 200 beats/min, respectively, the hearts were randomly allocated into five groups (n = 12/group) by a sealed envelope randomization assignment: the control group (perfused with KH solution for 190 min), the ischemia /reperfusion(I/R) group (perfused with KH solution for 30 min followed by 40 min of global ischemia and subsequent reperfusion with KH solution for 120 min), the DEX group (preconditioned with 10nM DEX for 30 min followed by I/R), the Yohimbine (YOH)group (preconditioned with1μM YOH for 30 min followed by I/R), and the DEX + YOH group (preconditioned with 10nM DEX + 1μM YOH for 30 min followed by I/R). Doses of DEX and YOH were used as previously reported (Figure1A).25

– Experimental protocol for the Langendorff perfused rat heart. After a 15-minute equilibration of perfusion, hearts were perfused for 30 additional minutes and subjected to 40 min of ischemia followed by 120 min of reperfusion. I/R: Ischemia/reperfusion group; DEX: Dexmedetomidine group; YOH: Yohimbine group.

2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining

The infarction area was assessed using TTC staining. The heart was harvested and frozen at −20℃ at the end of reperfusion. After that, the whole heart was cut into five equal sections from top to bottom and subsequently incubated with 1% TTC (Proteintech Group, Wuhan, China) for 30 min at 37°C in the dark. Finally, the hearts were fixed with 10% formaldehyde for 24 hours. Non-ischemic areas were stained red, and infarcted areas were stained white. The infarcted and normal areas were photographed using Image-Pro Plus 6.0. Infarct size was calculated as a percentage of the total myocardial area.

 Transmission electron microscopy (TEM)

The left ventricle was removed, cut into a 1×1×1 mm cube, rapidly fixed with 2.5% glutaraldehyde for 24 h, and then fixed with 1% osmium at room temperature for 2 h. Subsequently, the tissue was washed with phosphate-buffered saline (PBS), dehydrated in an acetone gradient, and embedded in an epoxy resin mixture. The tissue was cut into 50 nm thick slices using a manual Leica microtome and then double-stained with uranium and lead. The ultrastructure and autophagosomes in the myocardial tissue were observed and photographed using a TEM.

 Mitochondrial membrane potential (MMP)

Mitochondria were extracted from the left ventricular tissue using a Tissue Mitochondria Isolation Kit (Solarbio, Beijing, China) according to the manufacturer’s instructions. Subsequently, mitochondria were labeled with JC-1 (Solarbio, Beijing, China), a sensitive fluorescent probe. JC-1 fluorescence was detected by fluorescence microscopy. Normal mitochondria with a high potential showed red fluorescence, while mitochondria with a low potential exhibited green fluorescence. Changes in mitochondrial depolarization were reflected in the ratio of red/green fluorescence intensities.

 Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production

To evaluate the production of ROS, fresh and frozen left ventricular tissues were incubated with dichlorodi hydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) working solution (Servicebio, Wuhan, China) in PBS in the dark for 30 min at 37°C. Following three washes with PBS, the sections were continuously incubated with a 4’,6-diamido-2-phenylindole (Servicebio, Wuhan, China) dye solution and sealed with an anti-fluorescence-quenched tablet. The sections were then observed and analyzed using a fluorescence microscope.

 Western blotting

The heart tissue was lysed with protein lysate buffer, and the supernatant was collected. Protein concentrations were measured using the bicinchoninic acid protein assay (Servicebio, G2026). The samples were separated using 10% sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a polyvinylidene fluoride membrane. After that, the membrane was blocked with 5% skim milk for 30 min at room temperature and subsequently incubated at 4°C for a night with the primary antibodies, including Beclin-1(Servicebio, GB112053, 1:1000), LC3 (Proteintech Group, 14600-1-AP, 1:1000), P62 (Servicebio, GB11239-1, 1:1000), PINK1 (Affinity, DF7742, 1:1000), and Parkin (Servicebio, GB11596, 1:1000) rabbit polyclonal antibodies. The next day, the membrane was washed with Tris-buffered saline with Tween buffer and incubated for 30 min with secondary antibodies (GB23303, Servicebio, 1:5000) at room temperature. The content of these proteins was determined using Alpha (alphaEaseFC, Alpha Innotech) software.

 Statistical analysis

The sample size of this study was based on the preliminary experiment. Means of LVEDP in the control group, the DEX group, and the I/R group following reperfusion for 120 minutes were 12.52, 16.23, and 22.39, respectively, and standard deviations were 1.45, 2.44, and 145, respectively. The α-level test was considered as 0.05, Z0.05/2 = 1.96. The power level, 1 − β, was considered as 0.8. For the control and the DEX groups, a sample size of six was required for each group. For the I/R and the DEX groups, a sample size of four was required for each group. Thus, a sample size of six was determined per group.

Data are expressed as mean ± standard deviation (SD). SPSS19.0 (International Business Machines, Corp) software was used for statistical analysis. The comparison of measurement data between groups was carried out using one-way ANOVA. The Shapiro-Wilk test was employed to verify normality. The Least Significant Difference method was used when the variance was uniform; otherwise, Dunnett’s T3 method was used. Statistical significance was set at p< 0.05.

 Results DEX preconditioning improved cardiac function against I/R injury

To investigate the effect of DEX on cardiac function, we measured the cardiac hemodynamic indices in rats with or without DEX. Our results showed that there were no significant differences in hemodynamics between the groups at baseline (T1) and the beginning of ischemia (T2) (p>0.05). However, at the end of the reperfusion period (T3), HR, LVDP, and ±dp/dtmax were decreased, and LVEDP was significantly increased in the I/R group compared with the control group (p<0.05). DEX preconditioning significantly increased the LVDP and ±dp/dtmax values and decreased LVEDP compared with the I/R group (p<0.05). The addition of YOH greatly reversed the improvement in hemodynamics achieved by the DEX treatment (p<0.05), while YOH alone did not show any impact on hemodynamics (p>0.05) (Figure 2).

– Effects of T3 on I/R-mediated myocardial injury. A-E) Cardioprotective effects of DEX on the HR, LVDP, LVEDP, +dp/dt, and -dp/ dt. Data were presented as the mean ± standard deviation. n=12. •p<0.05, vs. ischemia beginning point, #p<0.05, vs. control group at reperfusion for 120 minutes. ∆p<0.05, vs. I/R group at reperfusion for 120 minutes. #p<0.05, vs. DEX group at reperfusion for 120 minutes. I/R: Ischemia/reperfusion group; DEX: Dexmedetomidine group; YOH: Yohimbine group. Panel A: HR: Heart rate. Panel B: LVDP: left ventricular diastolic pressure. Panel C: LVEDP: left ventricular end-diastolic pressure. Panel D: +dp/dt: maximal left ventricular pressure development rate. Panel E: -dp/dt: minimal left ventricular pressure development rate.

DEX preconditioning reduced the myocardial infarct size

To further confirm that DEX induces cardioprotective effects against MIRI, infarction size was determined by TTC staining. As expected, I/R caused significant myocardial infarction compared with the control group (p<0.05). However, DEX preconditioning significantly reduced infarct size compared to the I/R group (p<0.05). YOH administration significantly reversed the decrease in infarct size induced by DEX (p<0.05). Additionally, compared with the I/R group, there were no differences between the YOH and DEX + YOH groups (p>0.05) (Figure 3).

– DEX reduced cardiac infarct size after I/R injury (n=6). Representative images of TTC stained samples showing the infarct area (white), the non-infarct area (red), and the infarcted area percentage of heart in control and I/R-induced isolated heart. Data are presented as the mean ± standard deviation, n=6. #p<0.05 νs. Control group; ∆p<0.05 νs. I/R group; ★p<0.05 νs. DEX group. I/R: Ischemia/reperfusion group; DEX: Dexmedetomidine group; YOH: Yohimbine group; TTC: triphenyltetrazolium chloride staining technique.

DEX preconditioning reduced mitochondrial disorder and dysfunction

To explore whether DEX improved mitochondrial ultrastructure, TEM was used. The results showed that I/R led to marked mitochondrial damage, evidenced by swollen and vacuolated mitochondria with more cristae disruption and mitochondrial membrane rupture than the control group (p<0.05). Contrarily, mitochondrial damage was mitigated, and mitochondrial integrity was restored in the DEX group compared with the I/R group (p<0.05). Co-treatment with DEX and YOH significantly reversed the protective effect of DEX on the mitochondrial ultrastructure, which was equivalent to that in the I/R group (p<0.05). YOH alone did not affect the mitochondrial ultrastructural changes induced by I/R (Figure 4A, p>0.05).

– DEX ameliorated mitochondrial disorder and improved mitochondrial function. A) Transmission electron microscopy images of mitochondria (magnification 2 000×, 6 000×): Red arrows represent autophagosomes. B) Mitochondrial membrane potential detected by JC-1 staining and the ratio of the normal mitochondria (red fluorescence)/hypopotential mitochondria (green fluorescence) intensity. Scale bar: 100mm. C) ROS was indicated by DCFH-DA, and the percentages of ROS (red fluorescence) intensity were calculated in different groups, scale bar: 50mm. Data are presented as the mean ± standard deviation. n=6. #p<0.05 νs. Control group; ∆p<0.05 νs. I/R group; ★p<0.05 νs. DEX group. I/R: Ischemia/reperfusion group; DEX: Dexmedetomidine group; YOH: Yohimbine group. Panel C: ROS: Reactive oxygen species; DCFH-DA: dichlorodi hydrofluorescein diacetate.

After that, we examined alterations in mitochondrial membrane potential using the JC-1 assay to assess mitochondrial function. Our results showed that I/R induced a severe decrease in membrane potential, significantly increasing green fluorescence compared with the control group (p<0.05). Nevertheless, DEX alleviated the decline in membrane potential, which appeared as a higher ratio of red/green fluorescence than that in I/R (p<0.05). Similarly, this effect can be blocked by YOH (Figure 4B, p<0.05).

DCFH-DA working solution was used to measure ROS levels. The results showed that ROS levels were remarkably elevated in the I/R group compared with the control group (p<0.05). DEX preconditioning significantly reduced ROS generation in the DEX group (p<0.05). Similarly, YOH prevented DEX-induced inhibition of ROS production (Figure 4C, p<0.05).

 DEX preconditioning suppressed the excessive mitophagy following I/R

To further study the protective mechanism of DEX in I/R injury, well-known markers for autophagosome formation-related proteins (Beclin1, LC3II/I ratio) and autophagosome clearance proteins (p62) were detected by western blotting. Compared with the control group, I/R increased the Beclin1 and LC3II/I ratio levels, indicating increased autophagosome formation (p<0.05). The level of p62 was markedly increased in the I/R group to a degree comparable to that in the control group (p<0.05). Compared with the I/R group, DEX pre-treatment reduced the expression of Beclin1 and the LC3II/I ratio (p<0.05), indicating that DEX inhibited excessive autophagy. Additionally, p62 protein levels were significantly decreased in the DEX group compared with the I/R group (p<0.05), indicating efficient autophagosome clearance in the DEX group. Consistently, TEM showed that DEX reduced the number of autophagosomes compared with that in the I/R group (Figure 3A). However, YOH prevented the effects of DEX on Beclin1, LC3II/I and p62 expression (Figure 5A, p<0.05), and the number of autophagosomes (Figure 3A).

– DEX protected hearts against I/R-induced excessive mitophagy. A, C) Protein levels of Beclin1, LC3II/I, p62, PINK1, and Parkin in different groups. B) Representative electron micrograph of the heart obtained at a magnification of 6000 times. The red arrow indicates autophagosome engulfing mitochondria. Data are presented as the mean ± standard deviation, n=6. #p<0.05 νs. Control group; ∆p<0.05 νs. I/R group; ★p<0.05 νs. DEX group. I/R: Ischemia/reperfusion group; DEX: Dexmedetomidine group; YOH: Yohimbine group; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Panel A: LC3: microtubule-associated protein 1 light chain 3, p62: Sequestosome-1; Panel C: PINK1: PTEN-induced putative kinase 1.

Interestingly, TEM images revealed autophagosomes containing mitochondria. To further explore the role of DEX in autophagy, we measured the expression of PINK1 and Parkin using western blotting. The results demonstrated that PINK1 and Parkin proteins were significantly increased in the I/R group when compared with the control group (p<0.05), and DEX preconditioning inhibited the expression of PINK1 and Parkin in the DEX group (p<0.05). Treatment with YOH reversed the inhibitory effect of DEX on PINK1 and Parkin expression (Figure 5C, p<0.05).

 Discussion

The findings of this study further extend our understanding of DEX as a protective mechanism against MIRI. First, DEX improved cardiac function, reduced myocardial infarction size, and ameliorated mitochondrial impairment following MIRI in a vitro rat model. In addition, the protective mechanism of DEX preconditioning may involve suppressing excessive mitophagy and rescoring autophagosome clearance, which was evidenced by the inhibition of autophagosome formation, the decrease of Beclin1, LC3II/I, PINK1, and Parkin, and by reducing p62. However, these effects could be canceled by the addition of YOH. Overall, these data showed the pivotal protective role of DEX preconditioning in MIRI by regulating mitophagy through activating α2- AR.

Mitochondria, as a source of energy, play a significant role in the functioning and survival of cardiomyocytes.26 In our study, we imaged mitochondria with electron microscopy and showed that DEX preconditioning preserved mitochondrial integrity, which was more similar to the control group than the I/R group, wherein mitochondrial cristae were obviously disrupted. We also observed an increase in mitochondrial membrane potential and a decrease in mitochondrial ROS in the DEX group compared with those in the I/R group. Normal mitochondria are the main site for producing large quantities of adenosine triphosphate for cells and drive many biological processes.27 However, the structure and function of mitochondria are complex, variable, and sensitive. Thus, slight changes in intracellular or extracellular factors can lead to structural abnormalities and mitochondrial malfunctions. In addition, studies have demonstrated that damaged and dysfunctional mitochondria are the major source of intracellular ROS, which causes myocardial damage.28 Moreover, excessive ROS generation decreases mitochondrial membrane potential, resulting in more damaged mitochondria. Above all, these findings suggested that removing damaged mitochondria and preserving mitochondrial quality is the key to protecting against I/R injury and further supported the critical protective roles of DEX preconditioning on mitochondria against MIRI.

A decrease in mitochondrial membrane potential has been shown to trigger mitophagy after I/R injury.29 Therefore, we determined whether the protective effect of DEX on mitochondria was related to the regulation of mitophagy. Autophagosome formation is the gold standard for autophagy activation in mitophagy. Using electron microscopy, we found that autophagosomes were more abundant in the I/R group than in the DEX and control groups, and the TEM image showed autophagosomes containing mitochondria. Furthermore, we detected the proteins known to play a key role in mitophagy, and the results showed that DEX preconditioning reduced Belin1, LC3II/I, PINK1, Parkin, and p62 protein expression compared with the I/R group. Beclin1 and LC3II/I proteins facilitate autophagosome formation and interact with p62 to move damaged mitochondria to the autophagosome.30 PINK1 and Parkin proteins are known to induce mitophagy and clear excessive and damaged mitochondria.31 In addition, the accumulation of autophagosomes, LC3II/I, and p62 indicates impaired autophagosome clearance.32 Thus, our data suggested that mitophagy was excessively enhanced after I/R, whereas DEX preconditioning suppressed excessive mitophagy and rescored autophagosome clearance to remove damaged mitochondria efficiently. Zhang et al. reported that the blockade of autophagosome clearance causes autophagosome accumulation and contributes to cardiomyocyte death.33 Our results supported this standpoint. Most studies in this area have described the protective role of mitophagy on myocardial infarction or I/R injury.34,35 In contrast to these studies, our results indicated that mitophagy was excessively activated and detrimental to the heart after I/R. In support of our findings, several previous studies have shown that excessive mitophagy decreases mitochondria, which subsequently causes energy deprivation and aggravates myocardial injury following I/R.36,37 Thus, the role of mitophagy in MIRI may be paradoxical.38,39 Finally, combined with these studies, our findings suggested that high levels of mitophagy activity and impaired autophagosome clearance may be involved in developing MIRI in rats. However, DEX-induced mild mitophagy acted as a pro-survival mechanism to efficiently clear damaged mitochondria and prevent MIRI.

YOH, an α2-AR blocker, was used to explore the effects of DEX on MIRI. In the present study, YOH reversed the protective effects of DEX pre-treatment in the myocardium of rats, which resulted in decreased cardiac function and increased myocardial infarct size; in addition, the expression levels of the mitophagy pathway proteins were increased. Together, these results indicated that the protective effect of DEX preconditioning in rat myocardium may be antagonized by α2- AR blockers, which is consistent with a previous study.40 α2-AR blockers can dilate vascular smooth muscle, decrease sympathetic tone, and increase peripheral parasympathetic tone. A previous investigation by Okada et al. showed that DEX administration prior to global ischemia and reperfusion decreased coronary flow and myocardial infarct size. The authors proposed DEX-induced coronary vasoconstriction by α2-AR stimulation decreased coronary flow, induced myocardial ischemia, and triggered ischemic heart preconditioning. Thus, DEX may play a protective role in the myocardium by altering coronary blood flow to induce ischemic preconditioning.41

There are some limitations in this study. We did not use mitophagy agonists or a specific gene knockout technology to fully understand mitophagy activity, though these methods could be used to confirm the myocardial protective mechanism of DEX in mitophagy definitively. Therefore, further intensive studies are required to clarify the protective mechanisms of DEX, which may provide theoretical support for the application of DEX in MIRI.

 Conclusion

This study supported the hypothesis that DEX preconditioning exerted a protective effect against MIRI by suppressing excessive mitophagy and efficiently clearing damaged mitochondria by activating α2-AR, thereby restoring mitochondrial function.

Study association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee Experimental Animal Care and Use committee of Zunyi Medical University under the protocol number 1492, 2001. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.

Sources of funding

This study was partially funded by Science and Technology Planning Project of Zunyi (grant no. [2018]94).