Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC gg6ZzVFy9Ssm97ZyvGP3MRv S0066-782X2023000800303 00303 10.36660/abc.20230017 Artigo Original Zonulina e Presepsina Poderiam ser Biomarcadores e Alvos Terapêuticos para Miocardite Aguda? 0000-0001-8923-8709 Toprak Kenan Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Obtenção de financiamento Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 0000-0003-1784-3584 Inanır Mehmet Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Obtenção de financiamento Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 2 Memioğlu Tolga Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Obtenção de financiamento Redação do manuscrito 2 0000-0002-4297-1820 Kaplangoray Mustafa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Obtenção de financiamento 3 0000-0001-6560-8031 Palice Ali Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Obtenção de financiamento 3 0000-0002-9008-6631 Tascanov Mustafa Begenc Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados, Análise estatística Obtenção de financiamento Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 Harran University Faculty of Medicine Department of Cardiology Sanliurfa Turquia Harran University Faculty of Medicine – Department of Cardiology, Sanliurfa – Turquia Abant Izzet Baysal University Hospital Bolu Turquia Abant Izzet Baysal University Hospital – Cardiology, Bolu – Turquia Sanliurfa Mehmet Akif Inan Training and Research Sanliurfa Turquia Sanliurfa Mehmet Akif Inan Training and Research – Cardiology, Sanliurfa – Turquia Correspondência: Kenan Toprak • Harran University Faculty of Medicine – Department of Cardiology – viranşehir yolu Sanliurfa 63300 – Turquia E-mail: kentoprak@hotmail.com

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo.

 07 08 2023 07 2023 120 8 e20230017 17 01 2023 28 04 2023 17 05 2023 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

O diagnóstico de miocardite aguda geralmente é feito diante de parâmetros clínicos e laboratoriais, podendo, por vezes, ser confundido com doenças que compartilham de características clínicas semelhantes, o que dificulta o diagnóstico. Sendo assim, o uso de biomarcadores mais específicos, para além dos clássicos como a troponina, acelerará o diagnóstico. Além disso, esses biomarcadores podem nos ajudar a compreender melhor o mecanismo de desenvolvimento da miocardite e, assim, prever resultados clínicos imprevisíveis.

 Objetivo

Este estudo tem como objetivo revelar a possível relação entre permeabilidade intestinal e miocardite aguda.

 Métodos

Neste estudo, buscamos avaliar os níveis séricos de zonulina e presepsina em 138 indivíduos consecutivos, incluindo 68 pacientes com miocardite e outros 70 usados como grupo controle, pareados por idade, sexo e fatores de risco cardiovascular. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

 Resultados

Em comparação com o grupo controle, zonulina e presepsina foram significativamente maiores no grupo de pacientes com miocardite (p < 0,001, para todos). Os níveis de zonulina foram positivamente correlacionados com presepsina, pico de CK-MB e níveis máximos de troponina (r = 0,461, p < 0,001; r = 0,744, p < 0,001; r = 0,627, p < 0,001; respectivamente). Na análise de regressão, presepsina e zonulina foram determinadas como preditores independentes para miocardite (OR de 1,002, IC de 95% 1,001-1,003, p = 0,025; OR de 12,331, IC de 95% 4,261-35,689; p < 0,001; respectivamente). O valor preditivo de miocardite aguda de presepsina e zonulina na análise da curva ROC foi estatisticamente significativo (p < 0,001, para ambos).

 Conclusão

Este estudo mostrou que a zonulina e a presepsina podem ser biomarcadores para o diagnóstico de miocardite e também podem ser alvos terapêuticos para esclarecer o mecanismo de desenvolvimento da miocardite.

 Biomarcadores Miocardite Permeabilidade

: Zonulina e Presepsina Poderiam ser Biomarcadores e Alvos Terapêuticos para Miocardite Aguda?

Introdução

A miocardite geralmente se refere às manifestações clínicas e histológicas de uma ampla variedade de processos cardíacos imunopatológicos que podem ocorrer devido à ativação secundária do sistema imunológico após infecções do trato respiratório e gastrointestinais.1 Embora tenham sido indicados vários mecanismos no processo de desenvolvimento da doença, sabe-se que, mesmo que o mecanismo exato não seja totalmente compreendido, a doença pode ser causada pelo efeito direto do agente infeccioso, mas é causada principalmente pelo desencadeamento da reação imunológica pós-infecção.2 - 4 A miocardite pode ser aguda, subaguda ou crônica e pode envolver áreas focais ou difusas do miocárdio. As manifestações clínicas da miocardite são heterogêneas, variando desde condições assintomáticas até a destruição miocárdica grave por vírus e células imunes, causando choque cardiogênico e arritmias.5

A miocardite pode ser causada por uma ampla variedade de agentes microbianos, incluindo vírus, bactérias entéricas e protozoários, bem como por desencadeantes não microbianos, como toxinas e reações de hipersensibilidade.6 Entre as causas, infecções virais, especialmente de vírus coxsackie e parvovírus B19 , estão entre as principais causas de miocardite7 e, nos últimos anos, o vírus da Covid-19 e a vacina contra a Covid-19 têm sido intimamente associados à miocardite.8 , 9 Além disso, bactérias enteropatogênicas como salmonela, shigella e campylobacter são algumas das principais causas de miocardite identificadas em séries de casos.10

O diagnóstico da miocardite aguda continua sendo complexo e desafiador na prática de rotina, uma vez que pode ser clinicamente confundido com apresentações clínicas semelhantes, como infarto do miocárdio, vasoespasmo coronariano, amiloidose cardíaca e cardiomiopatia hipertrófica.1 O diagnóstico padrão-ouro atual envolve a demonstração histológica de biópsia endomiocárdica, de acordo com os critérios de Dallas para “inflamação miocárdica” sem necrose miocárdica e isquemia.3 No entanto, além da impraticabilidade da biópsia endomiocárdica, a definição de miocardite de acordo com esses critérios demonstra baixa sensibilidade e especificidade. Isso se deve ao erro de amostragem frequentemente relacionado à distribuição focal de lesões histológicas específicas do tecido cardíaco e à variabilidade na interpretação patológica. Além disso, a classificação de Dallas não considera a quantificação e a diferenciação local das células inflamatórias, e a infecção viral e a regulação autoimune nos tecidos cardíacos são ignoradas.11 , 12 Por esses motivos, a ressonância magnética cardíaca (RMC) com contraste e parâmetros laboratoriais, juntamente com a avaliação clínica, são os métodos mais frequentemente utilizados no diagnóstico.6 No entanto, apresentações clínicas semelhantes, como infarto do miocárdio e vasoespasmo coronariano, complicam a abordagem diagnóstica.1 Nesse caso, a determinação de biomarcadores auxiliares mais específicos, para além da isoenzima creatina quinase-MB (CK-MB) e da troponina, que são marcadores frequentemente utilizados de destruição cardíaca em pacientes com sinais clínicos ruins, se torna necessária para orientar diagnósticos e modalidades de tratamento.

Acredita-se que a miocardite e suas complicações sejam imunomediadas. A miocardite aguda geralmente se desenvolve após uma infecção recente do trato respiratório ou queixas gastrointestinais, como gastroenterite.5 Nas etiologias infecciosas, quando o agente microbiano entra pelo sistema respiratório ou gastroentérico, ele pode se ligar ao seu receptor específico no coração e causar dano celular e lise. Posteriormente, as partículas celulares liberadas da célula miocárdica após a lesão desencadeiam a autoimunidade na qual o mimetismo molecular desempenha um papel importante, ao mesmo tempo em que causa danos cardíacos.13

O envolvimento de patógenos gastrointestinais na etiologia da miocardite aguda nos leva a crer que o aumento da permeabilidade intestinal decorrente da inflamação do trato gastrointestinal pode desempenhar um papel na patogênese da doença. As junções de oclusão (JO) das células epiteliais intestinais desempenham um papel fundamental na prevenção da invasão intestinal por patógenos.14 A zonulina (precursor da haptoglobina 2) é o único modulador endógeno especificamente identificado para as JOs.15 A zonulina modula a integridade da barreira epitelial, desencadeando uma sinalização em cascata que resulta em fosforilação e deslocamento de proteínas da junção de oclusão, e os enteropatógenos aumentam muito a expressão do gene zonulina.16 O aumento da permeabilidade gastrointestinal por um mecanismo mediado por zonulina permite a passagem paracelular de desencadeadores antigênicos da luz intestinal para a mucosa e, eventualmente, para a circulação sistêmica. O aumento da permeabilidade intestinal mediado pela zonulina foi indicado como o mecanismo responsável pela fisiopatologia de algumas doenças autoimunes e hiperinflamatórias crônicas.17 Isso mostrou que a regulação positiva da zonulina em indivíduos geneticamente suscetíveis pode levar a doenças imunomediadas, e esse mecanismo da via da zonulina pode desempenhar um papel na fisiopatologia da miocardite, que é principalmente uma entidade imunomediada.4 Além disso, buscamos entender o papel da endotoxemia de baixo grau, uma espécie de confirmação do aumento da permeabilidade intestinal, na patogênese da miocardite.18 Até onde sabemos, não há dados na literatura avaliando o papel da zonulina, um biomarcador de aumento da permeabilidade intestinal, e da presepsina, um biomarcador de endotoxemia de baixo grau, em pacientes com miocardite. Este estudo teve como objetivo descobrir o papel da zonulina e da presepsina em pacientes com miocardite aguda.

 Métodos População do estudo

Neste estudo transversal observacional, foram incluídos 68 pacientes, admitidos em nosso centro entre janeiro de 2021 e março de 2022, diagnosticados com miocardite; como grupo controle, 70 pacientes foram incluídos no estudo, sendo pareados em termos de idade, sexo e fatores de risco cardiovascular. O grupo controle foi selecionado por meio do recrutamento consecutivo de voluntários saudáveis, pareados por idade, sexo e doença cardiovascular, que foram admitidos no hospital para exames de rotina. Pacientes com suspeita de infarto do miocárdio, suspeita de angina vasoespástica, doença inflamatória crônica, doença autoimune, infecção ativa, insuficiência renal e hepática avançadas e história de câncer foram excluídos do estudo. A biópsia endomiocárdica não é realizada em nossa clínica para pacientes com miocardite limítrofe caracterizada apenas por infiltrados inflamatórios, sem evidência de necrose de miócitos, e, portanto, nossa população de pacientes consistia apenas de pacientes com necrose de miócitos confirmada por biomarcadores cardíacos.

 Protocolo de estudo e definições

Os pacientes foram divididos em dois grupos: aqueles com miocardite aguda e o grupo controle. Os casos de miocardite com início dos sintomas no mês anterior foram considerados miocardite aguda.19 A inflamação cardíaca foi confirmada pela ressonância magnética cardíaca (RMC) com contraste em todos os pacientes. A coronariografia foi realizada para excluir causas isquêmicas nos pacientes que estavam no meio, simulando infarto do miocárdio.

 Análise laboratorial

As análises de sangue foram feitas a partir de amostras de sangue venoso dos pacientes e do grupo controle no momento da admissão no hospital. Amostras de plasma e soro foram obtidas após centrifugação a 2750 × g por 10 minutos. Análises bioquímicas de rotina, hemograma completo e testes de coagulação foram realizados em amostras de sangue. As amostras de soro para análise de presepsina e zonulina foram congeladas e mantidas a -20 °C até o teste. Os níveis de presepsina e zonulina foram medidos por meio de kits comerciais de Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA) (kit ELISA de presepsina humana: Abbexa, Cambridge, Reino Unido; Kit ELISA de zonulina humana: Immundiagnostik AG, Bensheim, Alemanha). Os resultados são apresentados em pg/mL para presepsina e ng/mL para zonulina. Para valores de pico de CK-MB e troponina, amostras de sangue foram coletadas a cada 12 horas durante a internação.

 Análise estatística

O Statistical Program for Social Sciences 20 (IBM SPSS, Chicago, IL, EUA) foi utilizado para todos os cálculos estatísticos. O teste de Kolmogorov-Smirnov foi usado para determinar se os dados correspondiam à distribuição normal. As variáveis contínuas que se ajustaram à distribuição normal foram expressas como média ± desvio padrão (DP) e as que não se ajustaram à distribuição normal foram expressas como mediana com intervalo interquartil (IIQ). As variáveis categóricas são expressas como um número de pessoas por cento (n, %). As comparações entre pacientes com miocardite e grupo controle foram analisadas usando o teste U de Mann-Whitney, teste t independente e análise de variância (ANOVA) de uma via, conforme apropriado. A análise do teste post hoc de Bonferroni foi realizada para entender completamente as diferenças de grupo na ANOVA. O teste post hoc de Kruskal-Wallis e Brown-Forsythe foi usado para comparações de grupos múltiplos que não se ajustavam à distribuição normal. O teste Qui-quadrado foi aplicado para variáveis categóricas. O coeficiente de correlação de Pearson foi usado para determinar a relação entre o nível de zonulina e os níveis de presepsina, CK-MB e troponina. Análises de regressão logística univariada e multivariada foram realizadas para determinar os preditores independentes de miocardite. As variáveis basais com significância considerável (p < 0,05) pela análise de regressão logística univariada foram incluídas na análise de regressão logística multivariada. A análise da Curva Característica de Operação do Receptor (Curva ROC) foi realizada para identificar preditores de miocardite aguda e comparar os valores preditivos de zonulina e presepsina com outros biomarcadores. O tamanho da amostra necessário para este estudo foi calculado com um pacote R de “poder” usando alfa = 0,05, poder = 0,80 e o tamanho do efeito estimado calculado a partir de relatórios anteriores e o tamanho mínimo da amostra necessário para este estudo foi de 48. Portanto, o número de pacientes em nosso estudo foi suficiente. Também calculamos uma análise de poder post hoc para nossa pesquisa, que resultou em 99% do poder. Valores de p bicaudais < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

 Resultados

Um total de 68 pacientes diagnosticados com miocardite aguda e 70 voluntários saudáveis pareados por idade, sexo e fatores de risco cardiovascular participaram do estudo. A média de idade dos pacientes foi de 24,75 ± 6,86, sendo 43 (63,2%) do sexo masculino. Não houve diferença entre as características demográficas básicas dos pacientes e do grupo controle ( Tabela 1 ). O histórico de COVID-19 ou vacinação contra COVID-19 nos últimos seis meses foi significativamente maior no grupo de miocardite do que no grupo controle. Os níveis de proteína C-reativa (PCR), fibrinogênio, pico de CK-MB e pico de troponina-I foram significativamente maiores no grupo de miocardite do que no grupo controle. Os níveis de zonulina e presepsina foram estatisticamente maiores no grupo de pacientes em comparação com o grupo controle ( Figura 1 ). Dividimos os pacientes em 3 grupos, de acordo com seus quartis de zonulina (T) (T1 [zonulina ≤ 1,50], T2 [1,50 < zonulina ≤ 2,90], T3 [zonulina > 2,90]) ( Tabela 2 ). Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos quanto a idade, sexo e tabagismo. O grupo 1 foi tomado como referência na comparação dos grupos. Os pacientes do grupo 3 apresentaram menor fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) do que os grupos 1 e 2, e apresentaram mais distúrbios do ritmo cardíaco. Aqueles que relataram queixas gastrointestinais nas quatro semanas anteriores à internação foram significativamente mais comuns no grupo 3 do que nos grupos 1 e 2. Além disso, os valores de pico de CK-MB, pico de troponina-I e presepsina foram significativamente maiores no grupo 3 em comparação com os outros grupos. No grupo de pacientes, os níveis de zonulina foram positivamente correlacionados com presepsina, pico de CK-MB e pico de troponina ( Figura 2 ). Presepsina e zonulina foram preditores independentes de miocardite aguda na análise de regressão logística binária multivariada ( Tabela 3 ).

– Distribuição das características demográficas, clínicas e laboratoriais básicas de pacientes com miocardite e grupo controle
Variáveis Pacientes com miocardite (n = 68) Grupo controle (n = 70) p
Dados demográficos e história médica
Idade, anos 24,75 ± 6,86 25,43 ± 5,38 0,495
Gênero, masculino, n (%) 43 (63,2) 44 (62,8) 0,552
IMC, Kg/m2 27,3 ± 1,8 27,1 ± 2,1 0,513
Tabagismo, n (%) 14 (20,5) 8 (11,4) 0,142
FEVE, (%) 60,0 (55,0-60,0) 60,0 (55,7-61,0) 0,315
História de COVID-19 ou vacina contra a COVID-19 nos últimos seis meses 26 (38,2) 14 (20,0) 0,015*
Resultados Laboratoriais
Hemoglobina, (mg/dL) 14,72 ± 3,59 14,60 ± 1,74 0,480
Hematócrito, (%) 43,66 ± 6,43 44,84 ± 5,68 0,372
Leucócitos, (x1000/mm3) 10,9 (9,1-13,6) 10,9 (9,0-14,9) 0,631
Linfócitos, (x1000/mm3) 2,00 (1,50-2,69) 2,10 (1,56-2,72) 0,599
Monócitos, (x1000/mm3) 0,68 (0,49-0,89) 0,60 (0,42-0,80) 0,280
Neutrófilos, (x1000/mm3) 7,77 (5,22-11,00) 7,70 (5,37-11,0) 0,868
PG, (mg/dL) 103,00 (127,00-71,40) 110,00 (93,75-159,75) 0,100
Creatinina, (mg/dL) 0,84 ± 0,31 0,85 ± 0,21 0,176
Ácido úrico, (mg/dL) 5,05 (5,98-6,47) 5,25 (4,20-6,10) 0,858
Albumina, (mg/dL) 4,35 ± 0,45 4,38 ± 0,34 0,560
LDH, U/L 266 (216-409) 251 (213-356) 0,651
Triglicerídeos, (mg/dL) 149,5 (95,7-213,7) 147,5 (102,2-237,0) 0,519
TC, (mg/dL) 187,0 (147,7-221,5) 181,5 (137,0-221,0) 0,368
HDL-C, (mg/dL) 32,0 (27,3-38,0) 34,0 (28,0-42,0) 0,410
LDL-C, (mg/dL) 119,8 (87,2-146,5) 106,3 (84,7-126,1) 0,174
CRP, (mg/dL) 0,94 (1,86-2,19) 0,40 (0,14-0,80) 0,002**
TSH, uIU/mL 1,23 (0,74-1,88) 1,46 (1,08-2,02) 0,160
FT3, ng/mL 3,34 (3,24-3,60) 3,04 (2,68-3,17) 0,068
FT4, ng/mL 1,15 (1,03-1,29) 1,10 (1,01-1,34) 0,937
e-GFR, (ml/min) 105,0 (85,0-117,0) 107,0 (100,2-114,2) 0,641
RDW, fL 12,70 (12,30-13,42) 12,75 (11,45-13,77) 0,642
MPV, fL 8,19 (7,42-9,32) 7,98 (7,20-8,67) 0,141
Bilirrubina total, (mg/dL) 0,60 (0,48-0,80) 0,60 (0,50-0,92) 0,738
Fósforo, (mg/dL) 3,10 (2,50-3,70) 3,10 (2,32-3,70) 0,934
Cálcio, (mg/dL) 9,20 (8,78-9,60) 9,20 (9,00-9,70) 0,809
ALT, (U/L) 28,00 (20,25-41,75) 32,0 (22,25-44,00) 0,496
AST, (U/L) 35,00 (24,00-51,00) 34,00 (25,50-49,00) 0,790
ALP, (U/L) 79,0 (65,0-86,0) 83,0 (73,0-97,0) 0,053
GGT, (U/L) 23,50 (16,00-39,50) 26,00 (18,00-45,00) 0,289
Contagem de plaquetas, (x1000/mm3) 283,0 (230,0-333,0) 254,5 (219,7-318,0) 0,642
Fibrinogênio, (mg/dL) 429,2 (475,0-283,0) 283,0 (228,7-440,7) 0,004**
Presepsina, (pg/mL) 1.257,9 (1197,8-602,9) 479,1 (451,3-569,0) <0,001**
Zonulina, (ng/mL) 2,75 (1,85-3,50) 1,60 (1,30-1,92) <0,001**
Pico de CK-MB, (ng/mL) 23,50 (6,72-57,50) 3,00 (2,00-6,22) <0,001**
Pico de Troponina-I, (pg/mL) 4.660,0 (352,5-12458,0) 57,0 (42,25-1130,8) <0,001**

Salvo indicação em contrário, os valores são média ± DP, n (%) ou mediana (intervalo interquartil). Não houve comparações estatisticamente significativas após análise com o teste t de Student. *p <0,05 vs. controle: Significativo após análise do teste qui-quadrado. **p <0,05 vs. controle: Significativo após análise do teste U de Mann-Whitney. ALP: fosfatase alcalina; ALT: Alanina Aminotransferase; AST: Aspartato aminotransferase; CT: colesterol total; e-GFR: taxa de filtração glomerular estimada; FEVE: fração de ejeção do ventrículo esquerdo; FT3: T3 livre; FT4: T4 livre; GGT: gama glutamil transferase; HDL-C: colesterol de lipoproteína de alta densidade; IMC: índice de massa corporal; LDH: lactato desidrogenase; LDL-C: colesterol de lipoproteína de baixa densidade; PCR: Proteína C-reativa; PG: glicose plasmática; RDW: largura de distribuição das hemácias; TSH: hormônio estimulante da tireoide; VPM: volume plaquetário médio; WBC: glóbulos brancos.

– Níveis de zonulina (A) e presepsina (B) em pacientes com miocardite em comparação com o grupo controle.

– Distribuição das características demográficas e clínicas de pacientes com miocardite de acordo com os grupos de zonulina
Variáveis *Grupo 1 n = 22 Grupo 2 n = 23 Grupo 3 n = 23 p
Dados demográficos e história médica
Idade, anos 22,91 ± 6,43 27,17 ± 6,42 24,09 ± 7,24 0,095
Gênero, masculino, n (%) 15 (68,2) 13 (56,5) 15 (65,2) 0,699
Tabagismo, n (%) 4 (18,2) 5 (21,7) 5 (21,7) 0,944
História de COVID-19 ou vacina contra a COVID-19 nos últimos seis meses 3 (13,6) 7 (30,4) 16 (69,6) <0,001**
Ecocardiografia e ECG
FEVE, (%) 59,5 ± 2,0 57,9 ± 7,4 49,7 ± 13,7 0,001**
Distúrbios do ritmo cardíaco 1 (4,5) 3 (13,0) 8 (34,7) <0,001**
Sintomas nas últimas quatro semanas, n (%)
Queixas respiratórias 7 (31,8) 9 (39,1) 9 (39,1) 0,251
Queixas gastrointestinais 6 (27,2) 7 (30,4) 12 (52,2) <0,001**
Queixas respiratórias e gastrointestinais 2 (9,0) 1 (4,3) 2 (8,7) 0,324
Nenhuma 9 (40,9) 6 (26,1) - -
Resultados Laboratoriais
CRP, (mg/dL) 1,42 (0,68-2,17) 1,80 (0,85-2,75) 2,35 (1,22-3,48) 0,369
Fibrinogênio, (mg/dL) 357,2 (295,9-418,5) 407,8 (352,5-463,0) 399,4 (369,3-429,5) 0,124
Pico de CK-MB, (ng/mL) 13,86 (4,21-23,51) 29,86 (19,86-33,87) 56,34 (48,86-63,83) <0,001***
Pico de Troponina-I, (pg/mL) 2.573,9 (3.104,2-4.362,2) 6.495,0 (4.256,6-8.733,3) 26.737,8 (2.973,8-50.501,8) <0,001***
Presepsina, (pg/mL) 942,8 (682,5-1.203,1) 1.139,8 (941,4-1.338,2) 1.561,5 (1.306,5-1.816,6) 0,001***

Salvo indicação em contrário, os valores são média ± DP, n (%) ou mediana (intervalo interquartil). * Grupo 1 usado como referência. **p<0,05 vs. controle: Significativo após análise do teste One-Way ANOVA. ***p <0,05 vs. controle: Significativo após análise do teste de Kruskal-Wallis. CK-MB: creatina quinase-MB; ECG: eletrocardiografia.

– Correlação positiva entre Zonulina e Presepsina (A), Zonulina e CK-MB (B), Zonulina e Troponina (C) em pacientes com miocardite.

– Preditores independentes de miocardite aguda
Análises multivariadas de regressão logística
Nagelkerke R2 na etapa final = 0,643
Odds ratio CI de 95% Valor de p
Zonulina 12,331 4,261-35,689 <0,001*
Presepsina 1,001 1,000-1,002 0,025*

* Valor-p significativo. Variáveis inseridas: Proteína C-reativa, História de COVID-19 ou vacinação contra COVID-19 nos últimos seis meses, Fibrinogênio, Queixas gastrointestinais, Distúrbios do ritmo cardíaco, Fração de ejeção do ventrículo esquerdo, Presepsina, Zonulina.

Quando a análise da curva Característica de Operação do Receptor (ROC) foi realizada, o valor de corte ideal de presepsina para prever miocardite aguda é ≥ 584,13; esse valor foi preditivo para miocardite aguda com sensibilidade de 79,4% e especificidade de 80% e zonulina ≥ 1,85; sendo preditivo para miocardite aguda com sensibilidade de 82% e especificidade de 91% ( Figura 3 ). Além disso, as curvas ROC foram comparadas para identificar se houve benefício adicional do uso de presepsina e zonulina sobre CK-MB e Troponina-I ( Figura 3 ). Quando a presepsina e a zonulina foram comparadas, elas não se mostraram superiores entre si como preditores de miocardite aguda (p = 0,105).

– Curva Característica de Operação do Receptor (ROC) de presepsina, zonulina, troponina e CK-MB como preditores de miocardite aguda. Como a ASC da CK-MB e a ASC da troponina são 1,0, elas se sobrepõem.

Discussão

Atualmente, o diagnóstico e o tratamento da miocardite permanecem desafiadores entre os médicos devido à incapacidade de prever complicações de longo prazo, como a cardiomiopatia dilatada. No entanto, os mecanismos que desencadeiam a miocardite ainda não são totalmente compreendidos. Neste estudo, buscamos compreender o papel da zonulina, que mostra permeabilidade intestinal aumentada, e da presepsina, um biomarcador de endotoxemia de baixo grau, na fisiopatologia da miocardite e se eles podem ser biomarcadores de miocardite aguda. Em nosso estudo, quantidades aumentadas de zonulina e presepsina, em comparação com o grupo controle, mostraram que o aumento da permeabilidade intestinal pode exercer um papel desencadeador importante na patogênese da miocardite. Sendo assim, zonulina e presepsina podem ser biomarcadores úteis para o diagnóstico de miocardite aguda.

O diagnóstico de miocardite aguda continua sendo um desafio para os médicos devido a apresentações clínicas semelhantes em vários distúrbios cardiovasculares, como infarto do miocárdio, vasoespasmo coronariano, amiloidose cardíaca e cardiomiopatia hipertrófica.5 Se o agente infeccioso for rapidamente eliminado e o processo inflamatório for encerrado, a doença é curada com apenas pequenas alterações no miocárdio. Esses pacientes geralmente se recuperam completamente em semanas ou meses. Por outro lado, quando o diagnóstico e o tratamento são iniciados tardiamente, a infecção viral não é eliminada e a resposta imune antiviral é diminuída, podendo ocorrer consequências clínicas irreversíveis que podem resultar em cardiomiopatia dilatada. Portanto, os dados disponíveis contestam a necessidade de identificar pacientes em um estágio inicial e ainda reversível de doença cardíaca associada a vírus.20 Embora a biópsia endomiocárdica (BEM) seja o diagnóstico padrão-ouro, o uso da BEM varia muito, dependendo do médico e do quadro clínico dos pacientes. Embora a BEM não possa ser aplicada em todos os centros para diagnosticar miocardite, a sensibilidade da BEM para detectar miocardite é bastante baixa.11 , 12 Embora o uso de RMC para pacientes com miocardite tenha aumentado recentemente, a RMC não pode ser realizada em todos os centros, nem pode determinar a extensão da inflamação miocárdica, e a avaliação depende, em grande parte, da experiência clínica. Embora a RMC tenha se tornado útil na obtenção não invasiva de informações preliminares precisas e confiáveis, os dados disponíveis sobre a precisão diagnóstica da RMC são atualmente limitados.13 , 21

Muitos casos de miocardite passam despercebidos devido a apresentações assintomáticas ou sintomas inespecíficos. Sendo assim, os pacientes incluídos em nosso estudo, em sua maioria, chegaram ao pronto-socorro com sintomas inespecíficos e marcadores cardíacos elevados, como creatina quinase (CK-MB) e troponina. Embora a CK-MB seja um biomarcador preferencial para miocardite, a sensibilidade da creatina quinase no diagnóstico tardio é baixa, uma vez que os estudos mostram que ela cai consistentemente para níveis basais nos primeiros 3-5 dias.22 A confiabilidade da medição dos níveis de biomarcadores cardíacos em pacientes com a suspeita de miocardite é baixa, mas ainda ajudam a confirmar o diagnóstico de miocardite.23 Marcadores sorológicos inespecíficos de inflamação, como fibrinogênio e proteína C-reativa, podem estar elevados em casos de miocardite suspeita. Ainda assim, os níveis normais desses testes falham em excluir uma resposta inflamatória no miocárdio e, assim, testes sorológicos convencionais e biomarcadores cardíacos para miocardite têm baixo valor prognóstico no diagnóstico de miocardite.24 Devido a todas essas desvantagens, é importante usar biomarcadores que possam ser prognóstico para miocardite, além de marcadores convencionais no diagnóstico e tratamento precoces. A zonulina e a presepsina podem ser biomarcadores promissores neste campo.

Pacientes com miocardite geralmente relatam problemas respiratórios ou gastrointestinais recentes sem sintomas inespecíficos aparentes.5 Ao examinarmos as causas da miocardite, encontramos, principalmente, vírus enteropatogênicos, como coxsackievirus, parvovírus B19, adenovírus ou COVID-19, e as causas bacterianas geralmente ocorrem após gastroenterite de bactérias enteropatogênicas, como salmonela, shigella e campylobacter.7 - 10 Essa situação sugere que a permeabilidade intestinal prejudicada por qualquer motivo pode desempenhar um papel na patogênese da miocardite por causar translocação viral.

As junções de oclusão são importantes na prevenção da invasão de patógenos para dentro das células epiteliais intestinais e, consequentemente, da circulação sanguínea e linfática.14 A zonulina é o único modulador fisiológico conhecido das junções de oclusão intercelulares, e a perda da função de barreira devido à regulação positiva da zonulina leva a um fluxo descontrolado de antígenos dietéticos e microbianos na circulação sanguínea e linfática através da submucosa, e este mecanismo tem sido implicado na patogênese de diversas doenças inflamatórias crônicas e autoimunes.25 , 26 A autoimunidade desempenha um papel importante na fisiopatologia do desenvolvimento da miocardite.4 , 27 Além de autoimunidade, a ativação do complemento também desempenha um papel na patogênese da miocardite.28 Estudos demonstraram que a zonulina ativa a via do complemento,29 o que sugere que a ativação do complemento mediado pela zonulina pode desempenhar um papel no desenvolvimento da miocardite.

Sugerimos que o aumento da permeabilidade epitelial do trato respiratório29 e gastrointestinal15 - 17 mediado por zonulina, por várias razões, pode ser a patogênese desencadeadora do desenvolvimento de miocardite, assim como em outras doenças inflamatórias e autoimunes.4 , 25 , 26

O Coxsackie B3 e o parvovírus B19 são as causas mais comuns de miocardite em todo o mundo.3 Os Coxsackievirus invadem a partir dos enterócitos ligando-se ao receptor de adenovírus e coxsackievirus (CAR, sigla em inglês para coxsackievirus and adenovirus receptor ) localizado em complexos de junções de oclusão do intestino.30 , 31 Isso pode sugerir que patógenos como coxsackievirus, que muitas vezes desempenham um papel na patogênese da miocardite, desencadeiam o desenvolvimento da miocardite interrompendo a função das junções de oclusão via receptores CAR localizados em complexos de junções de oclusão, regulados via zonulina no epitélio intestinal, e este mecanismo pode explicar o possível aumento da permeabilidade intestinal após infecções por coxsackievirus. Estudos demonstraram que o parvovírus B19, uma das causas mais comuns de miocardite, coloniza células epiteliais intestinais e as usa como reservatório.32 O parvovírus B19 foi considerado responsável pela síndrome da fadiga crônica por permanecer em um reservatório no intestino32 e o aumento da permeabilidade intestinal em pacientes com síndrome da fadiga crônica tem sido enfatizado por seu papel importante na patogênese da doença.33 Isso pode esclarecer a associação do aumento da permeabilidade intestinal com o parvovírus B19 em pacientes com miocardite. Além de patógenos clássicos, como parvovírus B19 e coxsackievírus, casos de miocardite relacionados a COVID-19 começaram a ser observados recentemente diante da epidemia de COVID-19.8 , 9 Embora muitos mecanismos fisiopatológicos tenham sido sugeridos no desenvolvimento de miocardite devido à COVID-19, o principal fator desencadeante da doença, ainda não é conhecido.8 Além de afetar diversos sistemas, a COVID-19 afeta o sistema gastrointestinal com frequência.34 Ao mesmo tempo, estudos descobriram que a permeabilidade intestinal é aumentada em pessoas com COVID -19, e altos níveis de zonulina, um biomarcador de permeabilidade intestinal, foram encontrados nesses pacientes.35 Embora o efeito da permeabilidade intestinal não tenha sido demonstrado em pacientes com miocardite por COVID-19, os níveis mais altos de zonulina observados em pacientes com miocardite com história recente de COVID-19, como ocorre em nosso estudo, pode corroborar nossa ideia de que a COVID-19 desencadeia o desenvolvimento de miocardite por aumentar a permeabilidade intestinal. Além disso, embora observado com menor frequência do que os agentes virais, o desenvolvimento de miocardite após gastroenterite de bactérias enteropatogênicas indica que a permeabilidade intestinal prejudicada pode estar associada ao desenvolvimento de miocardite.36

Estudos demonstraram que os lipopolissacarídeos (endotoxinas) aumentam a permeabilidade intestinal.18 A presepsina (um grupo solúvel de diferenciação subtipo 14 [CD14]) é um marcador confiável e indireto de endotoxemia.37 Ela aumenta na sepse bacteriana e também em infecções virais como a COVID-19.38 Tudo isso mostra que a presepsina pode ser um biomarcador indireto que pode mostrar um aumento da permeabilidade intestinal.

Em nosso estudo, a correlação de altos níveis de zonulina com picos de CK-MB e picos de troponina-I indica que uma maior carga de antígeno desencadeia maior destruição cardíaca à medida que a permeabilidade intestinal aumenta. O fato de os níveis de zonulina e presepsina estarem elevados em pacientes com miocardite pode ser epifenomenal ou indicar uma interação complexa, com um papel no aumento da permeabilidade intestinal. O aumento da permeabilidade intestinal, confirmado pelos níveis de zonulina, pode levar a mais bacteremia e viremia, o que pode ser explicado pelo aumento da presepsina em correlação com os níveis de zonulina. Além disso, ao considerarmos o papel da zonulina na patogênese da miocardite, ela pode ser um potencial biomarcador, bem como um alvo terapêutico em casos graves de miocardite, como em outras doenças inflamatórias.39 Os vírus entéricos utilizam micróbios intestinais para replicação e transmissão,40 o que pode explicar por que o aumento da permeabilidade intestinal na enterite gastrointestinal bacteriana causa transmissão de vírus entéricos e predispõe ao desenvolvimento de miocardite. O fato de a presepsina e a zonulina estarem elevadas simultaneamente em casos de miocardite corrobora essa visão.

Como resultado, levantamos a hipótese de que o aumento da permeabilidade do sistema gastrointestinal pode ser um dos principais mecanismos desencadeantes no desenvolvimento da miocardite. A zonulina e a presepsina podem ser usadas como biomarcadores, além dos biomarcadores convencionais, quando avaliados pela clínica. Isso visa o manejo precoce de modalidades de diagnóstico e tratamento em miocardite, em que ferramentas de diagnóstico padrão-ouro, como BEM e RMC, não estão disponíveis.

Se essa relação for claramente demonstrada, o diagnóstico e o tratamento precoces podem ajudar a prevenir complicações crônicas da miocardite, como a cardiomiopatia dilatada. Além disso, em casos com apresentações clínicas semelhantes, o uso desses dois biomarcadores em adição aos biomarcadores tradicionais é uma opção mais econômica na prática clínica, uma vez que reduz a aplicação de métodos diagnósticos caros, como BEM, RMC e coronariografia, que são usados para o diagnóstico e exclusão de miocardite aguda e requerem um conhecimento especializado para a sua aplicação e interpretação de resultados.

Com base nesses achados, estudos mais extensos nessa área podem esclarecer a patogênese desencadeante da miocardite e auxiliar no desenvolvimento de novos modelos farmacológicos para reduzir a probabilidade de desfechos clínicos ruins, como a cardiomiopatia dilatada.

Limitações do estudo

Nosso estudo apresentou algumas limitações. Primeiramente, nosso tamanho de amostra foi relativamente pequeno e tratou-se de um estudo transversal. Em segundo lugar, apenas pacientes com miocardite aguda, com biomarcadores cardíacos elevados, foram incluídos em nosso estudo. A exclusão de pacientes com miocardite limítrofe e subclínica e pacientes com miocardite crônica pode afetar os resultados. Os resultados de PCR ou isolamento dos vírus causadores não puderam ser incluídos no estudo devido à inadequação técnica. Ainda assim, a avaliação combinada da história dos pacientes, resultados de RMC, marcadores biológicos como troponina e CK-MB e métodos invasivos e não invasivos de angiografia coronária foram suficientes para excluir outras causas. Por fim, a biópsia endomiocárdica, ferramenta diagnóstica padrão-ouro, não foi utilizada no diagnóstico, o que pode ter afetado nossos resultados.

 Conclusão

A miocardite pode se apresentar, de forma semelhante à cardiopatia isquêmica, com dor torácica, anormalidades nos eletrocardiogramas e biomarcadores cardíacos elevados, podendo ser confundida com patologias cardíacas que são semelhantes em sintomas e achados laboratoriais, incluindo amiloidose cardíaca e cardiomiopatia hipertrófica. Portanto, casos suspeitos de miocardite permanecem um diagnóstico desafiador para os médicos em termos de apresentação, características e curso. A esse respeito, quando ferramentas diagnósticas padrão-ouro, como BEM e RMC, não estão disponíveis, biomarcadores auxiliares, além de CK-MB e troponina cardíaca, podem ser usados para diagnóstico rápido de casos de miocardite e exclusão de outras causas cardíacas. Além disso, o aumento do trato respiratório e da permeabilidade intestinal pode ser um dos principais mecanismos desencadeantes do desenvolvimento da miocardite. Sendo assim, a zonulina e a presepsina podem ser biomarcadores promissores tanto para o diagnóstico quanto para o tratamento de acompanhamento em pacientes com miocardite.

 Referências 1. Sagar S, Liu PP, Cooper LT Jr. Myocarditis. Lancet. 2012;379(9817):738-47. doi: 10.1016/S0140-6736(11)60648-X. Sagar S Liu PP Cooper LT Jr Myocarditis Lancet 2012 379 9817 738 747 10.1016/S0140-6736(11)60648-X 2. Chow LH, Beisel KW, McManus BM. Enteroviral Infection of Mice with Severe Combined Immunodeficiency. Evidence for Direct Viral Pathogenesis of Myocardial Injury. Lab Invest. 1992;66(1):24-31. Chow LH Beisel KW McManus BM Enteroviral Infection of Mice with Severe Combined Immunodeficiency. Evidence for Direct Viral Pathogenesis of Myocardial Injury Lab Invest 1992 66 1 24 31 3. Huber SA. Viral Myocarditis and Dilated Cardiomyopathy: Etiology and Pathogenesis. Curr Pharm Des. 2016;22(4):408-26. doi: 10.2174/1381612822666151222160500. Huber SA Viral Myocarditis and Dilated Cardiomyopathy: Etiology and Pathogenesis Curr Pharm Des 2016 22 4 408 426 10.2174/1381612822666151222160500 4. Fairweather D, Kaya Z, Shellam GR, Lawson CM, Rose NR. From Infection to Autoimmunity. J Autoimmun. 2001;16(3):175-86. doi: 10.1006/jaut.2000.0492. Fairweather D Kaya Z Shellam GR Lawson CM Rose NR From Infection to Autoimmunity J Autoimmun 2001 16 3 175 186 10.1006/jaut.2000.0492 5. Leone O, Pieroni M, Rapezzi C, Olivotto I. The Spectrum of Myocarditis: From Pathology to the Clinics. Virchows Arch. 2019;475(3):279-301. doi: 10.1007/s00428-019-02615-8. Leone O Pieroni M Rapezzi C Olivotto I The Spectrum of Myocarditis: From Pathology to the Clinics Virchows Arch 2019 475 3 279 301 10.1007/s00428-019-02615-8 6. Kindermann I, Barth C, Mahfoud F, Ukena C, Lenski M, Yilmaz A, et al. Update on Myocarditis. J Am Coll Cardiol. 2012;59(9):779-92. doi: 10.1016/j.jacc.2011.09.074. Kindermann I Barth C Mahfoud F Ukena C Lenski M Yilmaz A et al Update on Myocarditis J Am Coll Cardiol 2012 59 9 779 792 10.1016/j.jacc.2011.09.074 7. Andréoletti L, Lévêque N, Boulagnon C, Brasselet C, Fornes P. Viral Causes of Human Myocarditis. Arch Cardiovasc Dis. 2009;102(6-7):559-68. doi: 10.1016/j.acvd.2009.04.010. Andréoletti L Lévêque N Boulagnon C Brasselet C Fornes P Viral Causes of Human Myocarditis Arch Cardiovasc Dis 2009 102 6-7 559 568 10.1016/j.acvd.2009.04.010 8. Siripanthong B, Nazarian S, Muser D, Deo R, Santangeli P, Khanji MY, et al. Recognizing COVID-19-Related Myocarditis: The Possible Pathophysiology and Proposed Guideline for Diagnosis and Management. Heart Rhythm. 2020;17(9):1463-71. doi: 10.1016/j.hrthm.2020.05.001. Siripanthong B Nazarian S Muser D Deo R Santangeli P Khanji MY et al Recognizing COVID-19-Related Myocarditis: The Possible Pathophysiology and Proposed Guideline for Diagnosis and Management Heart Rhythm 2020 17 9 1463 1471 10.1016/j.hrthm.2020.05.001 9. Bozkurt B, Kamat I, Hotez PJ. Myocarditis with COVID-19 mRNA Vaccines. Circulation. 2021;144(6):471-84. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.121.056135. Bozkurt B Kamat I Hotez PJ Myocarditis with COVID-19 mRNA Vaccines Circulation 2021 144 6 471 484 10.1161/CIRCULATIONAHA.121.056135 10. Wanby P, Olsen B. Myocarditis in a Patient with Salmonella and Campylobacter Enteritis. Scand J Infect Dis. 2001;33(11):860-2. doi: 10.1080/003655401753186213. Wanby P Olsen B Myocarditis in a Patient with Salmonella and Campylobacter Enteritis Scand J Infect Dis 2001 33 11 860 862 10.1080/003655401753186213 11. Baughman KL. Diagnosis of Myocarditis: Death of Dallas Criteria. Circulation. 2006;113(4):593-5. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.105.589663. Baughman KL Diagnosis of Myocarditis: Death of Dallas Criteria Circulation 2006 113 4 593 595 10.1161/CIRCULATIONAHA.105.589663 12. Chow LH, Radio SJ, Sears TD, McManus BM. Insensitivity of Right Ventricular Endomyocardial Biopsy in the Diagnosis of Myocarditis. J Am Coll Cardiol. 1989;14(4):915-20. doi: 10.1016/0735-1097(89)90465-8. Chow LH Radio SJ Sears TD McManus BM Insensitivity of Right Ventricular Endomyocardial Biopsy in the Diagnosis of Myocarditis J Am Coll Cardiol 1989 14 4 915 920 10.1016/0735-1097(89)90465-8 13. Baessler B, Luecke C, Lurz J, Klingel K, von Roeder M, Waha S, et al. Cardiac MRI Texture Analysis of T1 and T2 Maps in Patients with Infarctlike Acute Myocarditis. Radiology. 2018;289(2):357-65. doi: 10.1148/radiol.2018180411. Baessler B Luecke C Lurz J Klingel K von Roeder M Waha S et al Cardiac MRI Texture Analysis of T1 and T2 Maps in Patients with Infarctlike Acute Myocarditis Radiology 2018 289 2 357 365 10.1148/radiol.2018180411 14. Paradis T, Bègue H, Basmaciyan L, Dalle F, Bon F. Tight Junctions as a Key for Pathogens Invasion in Intestinal Epithelial Cells. Int J Mol Sci. 2021;22(5):2506. doi: 10.3390/ijms22052506. Paradis T Bègue H Basmaciyan L Dalle F Bon F Tight Junctions as a Key for Pathogens Invasion in Intestinal Epithelial Cells Int J Mol Sci 2021 22 5 2506 10.3390/ijms22052506 15. Martinez EE, Lan J, Konno T, Miranda-Ribera A, Fiorentino M, Mehta NM, et al. Novel Role of Zonulin in the Pathophysiology of Gastro-Duodenal Transit: A Clinical and Translational Study. Sci Rep. 2021;11(1):22462. doi: 10.1038/s41598-021-01879-y. Martinez EE Lan J Konno T Miranda-Ribera A Fiorentino M Mehta NM et al Novel Role of Zonulin in the Pathophysiology of Gastro-Duodenal Transit: A Clinical and Translational Study Sci Rep 2021 11 1 22462 10.1038/s41598-021-01879-y 16. Fasano A. Intestinal Permeability and its Regulation by Zonulin: Diagnostic and Therapeutic Implications. Clin Gastroenterol Hepatol. 2012;10(10):1096-100. doi: 10.1016/j.cgh.2012.08.012. Fasano A Intestinal Permeability and its Regulation by Zonulin: Diagnostic and Therapeutic Implications Clin Gastroenterol Hepatol 2012 10 10 1096 1100 10.1016/j.cgh.2012.08.012 17. Fasano A. All Disease Begins in the (Leaky) gut: Role of Zonulin-Mediated gut Permeability in the Pathogenesis of Some Chronic Inflammatory Diseases. F1000Res. 2020;9:F1000FacultyRev-69. doi: 10.12688/f1000research.20510.1. Fasano A All Disease Begins in the (Leaky) gut: Role of Zonulin-Mediated gut Permeability in the Pathogenesis of Some Chronic Inflammatory Diseases F1000Res 2020 9 F1000FacultyRev-69 10.12688/f1000research.20510.1 18. Guo S, Al-Sadi R, Said HM, Ma TY. Lipopolysaccharide Causes an Increase in Intestinal Tight Junction Permeability in Vitro and In Vivo by Inducing Enterocyte Membrane Expression and Localization of TLR-4 and CD14. Am J Pathol. 2013;182(2):375-87. doi: 10.1016/j.ajpath.2012.10.014. Guo S Al-Sadi R Said HM Ma TY Lipopolysaccharide Causes an Increase in Intestinal Tight Junction Permeability in Vitro and In Vivo by Inducing Enterocyte Membrane Expression and Localization of TLR-4 and CD14 Am J Pathol 2013 182 2 375 387 10.1016/j.ajpath.2012.10.014 19. Caforio AL, Pankuweit S, Arbustini E, Basso C, Gimeno-Blanes J, Felix SB, et al. Current State of Knowledge on Aetiology, Diagnosis, Management, and Therapy of Myocarditis: A Position Statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. Eur Heart J. 2013;34(33):2636-48. doi: 10.1093/eurheartj/eht210. Caforio AL Pankuweit S Arbustini E Basso C Gimeno-Blanes J Felix SB et al Current State of Knowledge on Aetiology, Diagnosis, Management, and Therapy of Myocarditis: A Position Statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases Eur Heart J 2013 34 33 2636 2648 10.1093/eurheartj/eht210 20. Ammirati E, Frigerio M, Adler ED, Basso C, Birnie DH, Brambatti M, et al. Management of Acute Myocarditis and Chronic Inflammatory Cardiomyopathy: An Expert Consensus Document. Circ Heart Fail. 2020;13(11):e007405. doi: 10.1161/CIRCHEARTFAILURE.120.007405. Ammirati E Frigerio M Adler ED Basso C Birnie DH Brambatti M et al Management of Acute Myocarditis and Chronic Inflammatory Cardiomyopathy: An Expert Consensus Document Circ Heart Fail 2020 13 11 e007405 10.1161/CIRCHEARTFAILURE.120.007405 21. Friedrich MG, Sechtem U, Schulz-Menger J, Holmvang G, Alakija P, Cooper LT, et al. Cardiovascular Magnetic Resonance in Myocarditis: A JACC White Paper. J Am Coll Cardiol. 2009;53(17):1475-87. doi: 10.1016/j.jacc.2009.02.007. Friedrich MG Sechtem U Schulz-Menger J Holmvang G Alakija P Cooper LT et al Cardiovascular Magnetic Resonance in Myocarditis: A JACC White Paper J Am Coll Cardiol 2009 53 17 1475 1487 10.1016/j.jacc.2009.02.007 22. Puleo PR, Guadagno PA, Roberts R, Scheel MV, Marian AJ, Churchill D, et al. Early Diagnosis of Acute Myocardial Infarction Based on Assay for Subforms of Creatine Kinase-MB. Circulation. 1990;82(3):759-64. doi: 10.1161/01.cir.82.3.759. Puleo PR Guadagno PA Roberts R Scheel MV Marian AJ Churchill D et al Early Diagnosis of Acute Myocardial Infarction Based on Assay for Subforms of Creatine Kinase-MB Circulation 1990 82 3 759 764 10.1161/01.cir.82.3.759 23. Smith SC, Ladenson JH, Mason JW, Jaffe AS. Elevations of Cardiac Troponin I Associated with Myocarditis. Experimental and Clinical Correlates. Circulation. 1997;95(1):163-8. Smith SC Ladenson JH Mason JW Jaffe AS Elevations of Cardiac Troponin I Associated with Myocarditis Circulation 1997 95 1 163 168 24. Lauer B, Niederau C, Kühl U, Schannwell M, Pauschinger M, Strauer BE, et al. Cardiac Troponin T in Patients with Clinically Suspected Myocarditis. J Am Coll Cardiol. 1997;30(5):1354-9. doi: 10.1016/s0735-1097(97)00317-3. Lauer B Niederau C Kühl U Schannwell M Pauschinger M Strauer BE et al Cardiac Troponin T in Patients with Clinically Suspected Myocarditis J Am Coll Cardiol 1997 30 5 1354 1359 10.1016/s0735-1097(97)00317-3 25. Sturgeon C, Fasano A. Zonulin, a Regulator of Epithelial and Endothelial Barrier Functions, and its Involvement in Chronic Inflammatory Diseases. Tissue Barriers. 2016;4(4):e1251384. doi: 10.1080/21688370.2016.1251384. Sturgeon C Fasano A Zonulin, a Regulator of Epithelial and Endothelial Barrier Functions, and its Involvement in Chronic Inflammatory Diseases Tissue Barriers 2016 4 4 e1251384 10.1080/21688370.2016.1251384 26. Fasano A. Zonulin and its Regulation of Intestinal Barrier Function: The Biological Door to Inflammation, Autoimmunity, and Cancer. Physiol Rev. 2011;91(1):151-75. doi: 10.1152/physrev.00003.2008. Fasano A Zonulin and its Regulation of Intestinal Barrier Function: The Biological Door to Inflammation, Autoimmunity, and Cancer Physiol Rev 2011 91 1 151 175 10.1152/physrev.00003.2008 27. Bracamonte-Baran W, Čiháková D. Cardiac Autoimmunity: Myocarditis. Adv Exp Med Biol. 2017;1003:187-221. doi: 10.1007/978-3-319-57613-8_10. Bracamonte-Baran W Čiháková D Cardiac Autoimmunity: Myocarditis Adv Exp Med Biol 2017 1003 187 221 10.1007/978-3-319-57613-8_10 28. Kaya Z, Afanasyeva M, Wang Y, Dohmen KM, Schlichting J, Tretter T, et al. Contribution of the Innate Immune System to Autoimmune Myocarditis: A Role for Complement. Nat Immunol. 2001;2(8):739-45. doi: 10.1038/90686. Kaya Z Afanasyeva M Wang Y Dohmen KM Schlichting J Tretter T et al Contribution of the Innate Immune System to Autoimmune Myocarditis: A Role for Complement Nat Immunol 2001 2 8 739 745 10.1038/90686 29. Rittirsch D, Flierl MA, Nadeau BA, Day DE, Huber-Lang MS, Grailer JJ, et al. Zonulin as Prehaptoglobin2 Regulates Lung Permeability and Activates the Complement System. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2013;304(12):L863-72. doi: 10.1152/ajplung.00196.2012. Rittirsch D Flierl MA Nadeau BA Day DE Huber-Lang MS Grailer JJ et al Zonulin as Prehaptoglobin2 Regulates Lung Permeability and Activates the Complement System Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2013 304 12 L863 L872 10.1152/ajplung.00196.2012 30. Kesisoglou F, Schmiedlin-Ren P, Fleisher D, Zimmermann EM. Adenoviral Transduction of Enterocytes and M-Cells Using in Vitro Models Based on Caco-2 Cells: The Coxsackievirus and Adenovirus Receptor (CAR) Mediates Both Apical and Basolateral Transduction. Mol Pharm. 2010;7(3):619-29. doi: 10.1021/mp9001377. Kesisoglou F Schmiedlin-Ren P Fleisher D Zimmermann EM Adenoviral Transduction of Enterocytes and M-Cells Using in Vitro Models Based on Caco-2 Cells: The Coxsackievirus and Adenovirus Receptor (CAR) Mediates Both Apical and Basolateral Transduction Mol Pharm 2010 7 3 619 629 10.1021/mp9001377 31. Drummond CG, Bolock AM, Ma C, Luke CJ, Good M, Coyne CB. Enteroviruses Infect Human Enteroids and Induce Antiviral Signaling in a Cell Lineage-Specific Manner. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114(7):1672-7. doi: 10.1073/pnas.1617363114. Drummond CG Bolock AM Ma C Luke CJ Good M Coyne CB Enteroviruses Infect Human Enteroids and Induce Antiviral Signaling in a Cell Lineage-Specific Manner Proc Natl Acad Sci USA 2017 114 7 1672 1677 10.1073/pnas.1617363114 32. Frémont M, Metzger K, Rady H, Hulstaert J, De Meirleir K. Detection of Herpesviruses and Parvovirus B19 in Gastric and Intestinal Mucosa of Chronic Fatigue Syndrome Patients. In Vivo. 2009;23(2):209-13. Frémont M Metzger K Rady H Hulstaert J De Meirleir K Detection of Herpesviruses and Parvovirus B19 in Gastric and Intestinal Mucosa of Chronic Fatigue Syndrome Patients In Vivo 2009 23 2 209 213 33. Morris G, Berk M, Carvalho AF, Caso JR, Sanz Y, Maes M. The Role of Microbiota and Intestinal Permeability in the Pathophysiology of Autoimmune and Neuroimmune Processes with an Emphasis on Inflammatory Bowel Disease Type 1 Diabetes and Chronic Fatigue Syndrome. Curr Pharm Des. 2016;22(40):6058-75. doi: 10.2174/1381612822666160914182822. Morris G Berk M Carvalho AF Caso JR Sanz Y Maes M The Role of Microbiota and Intestinal Permeability in the Pathophysiology of Autoimmune and Neuroimmune Processes with an Emphasis on Inflammatory Bowel Disease Type 1 Diabetes and Chronic Fatigue Syndrome Curr Pharm Des 2016 22 40 6058 6075 10.2174/1381612822666160914182822 34. Galanopoulos M, Gkeros F, Doukatas A, Karianakis G, Pontas C, Tsoukalas N, et al. COVID-19 Pandemic: Pathophysiology and Manifestations from the Gastrointestinal Tract. World J Gastroenterol. 2020;26(31):4579-88. doi: 10.3748/wjg.v26.i31.4579. Galanopoulos M Gkeros F Doukatas A Karianakis G Pontas C Tsoukalas N et al COVID-19 Pandemic: Pathophysiology and Manifestations from the Gastrointestinal Tract World J Gastroenterol 2020 26 31 4579 4588 10.3748/wjg.v26.i31.4579 35. Giron LB, Dweep H, Yin X, Wang H, Damra M, Goldman AR, et al. Plasma Markers of Disrupted Gut Permeability in Severe COVID-19 Patients. Front Immunol. 2021;12:686240. doi: 10.3389/fimmu.2021.686240. Giron LB Dweep H Yin X Wang H Damra M Goldman AR et al Plasma Markers of Disrupted Gut Permeability in Severe COVID-19 Patients Front Immunol 2021 12 686240 10.3389/fimmu.2021.686240 36. Ferrero P, Piazza I, Lorini LF, Senni M. Epidemiologic and Clinical Profiles of Bacterial Myocarditis. Report of Two Cases and Data from a Pooled Analysis. Indian Heart J. 2020;72(2):82-92. doi: 10.1016/j.ihj.2020.04.005. Ferrero P Piazza I Lorini LF Senni M Epidemiologic and Clinical Profiles of Bacterial Myocarditis. Report of Two Cases and Data from a Pooled Analysis Indian Heart J 2020 72 2 82 92 10.1016/j.ihj.2020.04.005 37. Velissaris D, Zareifopoulos N, Karamouzos V, Karanikolas E, Pierrakos C, Koniari I, et al. Presepsin as a Diagnostic and Prognostic Biomarker in Sepsis. Cureus. 2021;13(5):e15019. doi: 10.7759/cureus.15019. Velissaris D Zareifopoulos N Karamouzos V Karanikolas E Pierrakos C Koniari I et al Presepsin as a Diagnostic and Prognostic Biomarker in Sepsis Cureus 2021 13 5 e15019 10.7759/cureus.15019 38. Zaninotto M, Mion MM, Cosma C, Rinaldi D, Plebani M. Presepsin in Risk Stratification of SARS-CoV-2 Patients. Clin Chim Acta. 2020;507:161-3. doi: 10.1016/j.cca.2020.04.020. Zaninotto M Mion MM Cosma C Rinaldi D Plebani M Presepsin in Risk Stratification of SARS-CoV-2 Patients Clin Chim Acta 2020 507 161 163 10.1016/j.cca.2020.04.020 39. Yonker LM, Swank Z, Gilboa T, Senussi Y, Kenyon V, Papadakis L, et al. Zonulin Antagonist, Larazotide (AT1001), As an Adjuvant Treatment for Multisystem Inflammatory Syndrome in Children: A Case Series. Crit Care Explor. 2022;10(2):e0641. doi: 10.1097/CCE.0000000000000641. Yonker LM Swank Z Gilboa T Senussi Y Kenyon V Papadakis L et al Zonulin Antagonist, Larazotide (AT1001), As an Adjuvant Treatment for Multisystem Inflammatory Syndrome in Children: A Case Series Crit Care Explor 2022 10 2 e0641 10.1097/CCE.0000000000000641 40. Kuss SK, Best GT, Etheredge CA, Pruijssers AJ, Frierson JM, Hooper LV, et al. Intestinal Microbiota Promote Enteric Virus Replication and Systemic Pathogenesis. Science. 2011;334(6053):249-52. doi: 10.1126/science.1211057. Kuss SK Best GT Etheredge CA Pruijssers AJ Frierson JM Hooper LV et al Intestinal Microbiota Promote Enteric Virus Replication and Systemic Pathogenesis Science 2011 334 6053 249 252 10.1126/science.1211057

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Harran University sob o número de protocolo HRJ/20/21/35. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.

Fontes de financiamento: O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

 Original Article Could Zonulin and Presepsin Be Biomarkers and Therapeutic Targets for Acute Myocarditis? 0000-0001-8923-8709 Toprak Kenan Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Obtaining financing Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 0000-0003-1784-3584 Inanır Mehmet Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Obtaining financing Critical revision of the manuscript for important intellectual content 2 Memioğlu Tolga Conception and design of the research Acquisition of data Obtaining financing Writing of the manuscript 2 0000-0002-4297-1820 Kaplangoray Mustafa Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Obtaining financing 3 0000-0001-6560-8031 Palice Ali Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Obtaining financing 3 0000-0002-9008-6631 Tascanov Mustafa Begenc Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Obtaining financing Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 Turkey Harran University Faculty of Medicine – Department of Cardiology, Sanliurfa – Turkey Turkey Abant Izzet Baysal University Hospital – Cardiology, Bolu – Turkey Turkey Sanliurfa Mehmet Akif Inan Training and Research – Cardiology, Sanliurfa – Turkey Mailing Address: Kenan Toprak • Harran University Faculty of Medicine – Department of Cardiology – viranşehir yolu Sanliurfa 63300 – Turkey E-mail: kentoprak@hotmail.com

Potential conflict of interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background

The diagnosis of acute myocarditis is usually made with clinical and laboratory parameters. This can sometimes be mixed up with diseases that have similar clinical features, making the diagnosis difficult. Therefore, the use of more specific biomarkers, in addition to the classically used biomarkers such as troponin, will accelerate the diagnosis. In addition, these biomarkers may help us to understand the mechanism of myocarditis development and thus predict unpredictable clinical outcomes.

 Objective

This study aims to reveal the possible relationship between intestinal permeability and acute myocarditis.

 Methods

In this study, we wanted to evaluate serum levels of zonulin and presepsin in 138 consecutive subjects, including 68 patients with myocarditis and another 70 as the control group, matched for age, gender, and cardiovascular risk factors. P-values <0.05 were considered to be statistically significant.

 Results

Compared to the control group, zonulin and presepsin were significantly higher in the patient group with myocarditis (p < 0.001, for all). Zonulin levels were positively correlated with presepsin, peak CK-MB, and peak troponin levels (r = 0.461, p < 0.001; r = 0.744, p < 0.001; r = 0.627, p < 0.001; respectively). In regression analysis, presepsin and zonulin were determined as independent predictors for myocarditis (OR 1.002, 95% CI 1.001-1.003, p = 0.025; OR 12.331, 95% CI 4.261-35.689; p < 0.001; respectively). The predictive value of acute myocarditis of presepsin and zonulin in ROC curve analysis was statistically significant (p < 0.001, for both).

 Conclusion

This study showed that zonulin and presepsin could be biomarkers that can be used in the diagnosis of myocarditis, and they can also be therapeutic targets by shedding light on the developmental mechanism of myocarditis.

 Biomarkers Myocarditis Permeability

: Could Zonulin and Presepsin Be Biomarkers and Therapeutic Targets for Acute Myocarditis?

Introduction

Myocarditis generally refers to the clinical and histological manifestations of a wide variety of pathological immune processes in the heart that may occur due to secondary immune system activation after respiratory tract and gastrointestinal infections.1 Although various mechanisms have been suggested in the development process of the disease, it is known that although the exact mechanism is not fully understood, the disease may be caused by the direct effect of the infective agent, but it is mostly caused by the triggering of the immune reaction after the infection.2 - 4 Myocarditis can be acute, subacute, or chronic and may either involve focal or diffuse areas of the myocardium. The clinical manifestations of myocarditis are heterogeneous, ranging from asymptomatic conditions to severe myocardial destruction by viruses and immune cells causing cardiogenic shock and arrhythmias.5

Myocarditis can be caused by a wide variety of microbial agents, including viruses, enteric bacteria, and protozoa, as well as by non-microbial triggers such as toxins and hypersensitive reactions.6 Among these causes, viral infections, especially coxsackie virus and parvovirus B19, are among the leading causes of myocarditis,7 and in recent years, the Covid-19 virus and the Covid-19 vaccine have been closely associated with myocarditis.8 , 9 In addition, enteropathogenic bacteria such as salmonella, shigella and campylobacter are some of the major causes of myocarditis in case series.10

Acute myocarditis remains a complex and challenging diagnosis in routine practice, as it can be clinically mixed up with similar clinical presentations such as myocardial infarction, coronary vasospasm, cardiac amyloidosis and hypertrophic cardiomyopathy.1 The current gold standard diagnosis involves histological demonstration of endomyocardial biopsy according to the Dallas criteria for “myocardial inflammation” without myocardial necrosis and ischemia.3 However, both endomyocardial biopsy is impractical and the definition of myocarditis according to these criteria shows poor sensitivity and specificity. This is due to sampling error often related to the focal distribution of specific histological lesions from heart tissue, and variability in pathological interpretation. Also, the Dallas classification does not consider the local quantification and differentiation of inflammatory cells, and viral infection and autoimmune regulation in heart tissues are ignored in this classification.11 , 12 For these reasons, contrast-enhanced cardiac magnetic resonance imaging (cMRI) and laboratory parameters are the most frequently used methods in the diagnosis, together with the clinical diagnosis.6 However, similar clinical presentations, such as myocardial infarction and coronary vasospasm, complicate the diagnostic approach.1 In this case, the determination of more specific auxiliary biomarkers in addition to creatine kinase-MB isoenzyme (CK-MB) and troponin, which are frequently used markers of cardiac destruction in patients with faint clinical signs, increases the necessity for guiding diagnoses and treatment modalities.

Myocarditis and its complications are believed to be immune-mediated. Acute myocarditis usually develops after a recent respiratory tract infection or gastrointestinal complaints such as gastroenteritis.5 In infectious etiologies, when the microbial agent enters through the respiratory or gastroenteric system, it may bind to its specific receptor in the heart and cause cell damage and lysis. Subsequently, cellular particles released from the myocardial cell after myocardial injury trigger autoimmunity in which molecular mimicry plays an important role while also causing cardiac damage.13

The involvement of gastrointestinal pathogens in the etiology of acute myocarditis led us to believe that increased intestinal permeability as a result of inflammation of the gastrointestinal tract may play a role in the pathogenesis of the disease. Tight junctions (TJ) in intestinal epithelial cells play a key role in preventing intestinal invasion of pathogens in the intestine.14 Zonulin (haptoglobin 2 precursor) is the only endogenous modulator specifically identified for TJs.15 Zonulin modulates epithelial barrier integrity by triggering a signaling cascade that results in phosphorylation and displacement of tight junction proteins, and enteropathogens greatly increase zonulin gene expression.16 Increased gastrointestinal permeability by a zonulin-mediated mechanism allows paracellular passage of antigenic triggers from the intestinal lumen to the mucosa and eventually to the systemic circulation. The zonulin-mediated increase in intestinal permeability in the gastrointestinal tract has been suggested as the mechanism responsible for the pathophysiology of some chronic autoimmune and hyperinflammatory diseases.17 This showed that up-regulation of zonulin in genetically susceptible individuals can lead to immune-mediated diseases, and this zonulin pathway mechanism may play a role in the pathophysiology of myocarditis, which is mainly an immune-mediated entity.4 In addition, we aimed to uncover the role of low-grade endotoxemia, a kind of confirmation of increased intestinal permeability, in the pathogenesis of myocarditis.18 To the best of our knowledge, there is no literature evaluating the role of zonulin, a biomarker of increased intestinal permeability, and presepsin, a low-grade endotoxemia biomarker, in patients with myocarditis. This study aimed to uncover the role of zonulin and presepsin in patients with acute myocarditis.

 Methods Study population

In this observational cross-sectional study, 68 patients admitted to our center between January 2021 and March 2022 and diagnosed with myocarditis were included; as a control group, 70 patients were included in the study by matching them in terms of age, gender, and cardiovascular risk factors. The control group was selected by consecutively recruiting healthy volunteers, matched for age, sex, and cardiovascular disease, who were admitted to the hospital for routine examinations. Those with suspected myocardial infarction, suspected vasospastic angina, chronic inflammatory disease, autoimmune disease, active infection, advanced kidney and liver failure, and a history of cancer were excluded from the study. Since we did not perform endomyocardial biopsy in our clinic for borderline myocarditis patients characterized only by inflammatory infiltrates without evidence of myocyte necrosis, our patient population consisted only of patients with myocyte necrosis confirmed by cardiac biomarkers.

 Study protocol and definitions

The patients were divided into two groups: those with acute myocarditis and the control group. Myocarditis cases with symptoms that started within the last month were considered acute myocarditis.19 Cardiac inflammation was confirmed by contrast-enhanced cardiac magnetic resonance imaging (cMRI) in all patients. Coronary angiography was performed to exclude ischemic causes in the patients who were in the middle, mimicking myocardial infarction.

 Laboratory analysis

Blood measurements were taken from venous blood samples from the patients and control groups at the time of admission to the hospital. Plasma and serum specimens were obtained after centrifugation at 2750 × g for 10 minutes. Routine biochemistry analyses, complete blood counts and coagulation tests were conducted on blood samples. Serum samples for presepsin and zonulin analysis were frozen and kept at -20 °C until testing. Presepsin and zonulin levels were measured by using commercial Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kits (Human presepsin ELISA kit: Abbexa, Cambridge, UK; Human zonulin ELISA kit: Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany). Results are presented in pg/mL for presepsin and ng/mL for zonulin. For peak CK-MB and troponin values, blood samples were taken every 12 hours during hospitalization.

 Statistical analysis

The Statistical Program for Social Sciences 20 (IBM SPSS, Chicago, IL, USA) was used for all statistical calculations. The Kolmogorov-Smirnov test was used to determine whether the data matched the normal distribution. Continuous variables that fit the normal distribution were expressed as means ± standard deviation (SD), and those that did not fit the normal distribution were expressed as median with interquartile range (IQR). Categorical variables are expressed as a number of people-percent (n, %). Comparisons between patients with myocarditis and control group were analyzed using the Mann-Whitney U test, independent t-test, and one-way analysis of variance (ANOVA), where appropriate. Bonferroni post hoc test analysis was performed to fully understand group differences in ANOVA. Kruskal-Wallis and then Brown-Forsythe post hoc test were used for multiple group comparisons that did not fit the normal distribution. The Chi-square test was applied to categorical variables. Pearson correlation coefficient was used to determine the relationship between zonulin level and presepsin, CK-MB and troponin levels. Univariate and multivariate logistic regression analyses were performed to determine the independent predictors of myocarditis. Baseline variables with considerable significance (p < 0.05) by univariate logistic regression analyses were included in the multivariate logistic regression analysis. Receiver Operating Characteristic (ROC) curve analysis was performed to identify predictors of acute myocarditis and to compare the predictive values of zonulin and presepsin with other biomarkers. We calculated the required sample size for this study with a “power” R package using alpha=0.05, power=0.80, and the estimated effect size calculated from previous reports and the minimum sample size required for this study was 48. Therefore, the number of patients in our study was sufficient. We also calculated a post hoc power analysis for our research, which resulted in 99% of the power. Two-tailed p-values of < 0.05 were considered to be statistically significant.

 Results

A total of 68 patients diagnosed with acute myocarditis and 70 healthy volunteers matched for age, sex, and cardiovascular risk factors participated in the study. The mean age of the patients was 24.75 ± 6.86, and 43 (63.2%) were male. There was no difference between the basic demographic characteristics of the patients and the control group ( Table 1 ). The history of having COVID-19 disease or being vaccinated against COVID-19 in the last six months was significantly higher in the myocarditis group than in the control group. C-reactive protein (CRP), fibrinogen, peak CK-MB, and peak troponin-I levels were significantly higher in the myocarditis group than in the control group. Zonulin and presepsin levels were statistically higher in the patient group than in the control group ( Figure 1 ). We divided the patients into 3 groups according to their zonulin quartiles (T) (T1 [zonulin ≤ 1.50], T2 [1.50 < zonulin ≤ 2.90], T3 [zonulin > 2.90]) ( Table 2 ). There was no statistically significant difference between groups in terms of age, gender, and smoking. Group 1 was taken as a reference in the comparison of groups. Patients in group 3 had lower left ventricular ejection fraction (LVEF) than groups 1 and 2, and had more rhythm disturbances. Those who described gastrointestinal complaints within the last four weeks of admission were significantly more common in group 3 than in groups 1 and 2. In addition, Peak CK-MB, peak Troponin-I, and presepsin values were significantly higher in group 3 compared to other groups. In the patient group, zonulin levels were positively correlated with presepsin, peak CK-MB, and peak troponin levels ( Figure 2 ). Presepsin and zonulin were found to be independent predictors of acute myocarditis in multivariate binary logistic regression analysis ( Table 3 ).

– Distribution of basic demographic, clinical and laboratory characteristics of patients with myocarditis and control group
Variables Patients with myocarditis (n = 68) Control group (n = 70) p
Demographics and medical history
Age, years 24.75 ± 6.86 25.43 ± 5.38 0.495
Gender, male, n (%) 43 (63.2) 44 (62.8) 0.552
BMI, Kg/m2 27.3 ± 1.8 27.1 ± 2.1 0.513
Smoking, n (%) 14 (20.5) 8 (11.4) 0.142
LVEF, (%) 60.0 (55.0-60.0) 60.0 (55.7-61.0) 0.315
History of COVID-19 or COVID-19 vaccination in the last six months 26 (38.2) 14 (20.0) 0.015*
Laboratory Results
Hemoglobin, (mg/dL) 14.72 ± 3.59 14.60 ± 1.74 0.480
Hematocrit, (%) 43.66 ± 6.43 44.84 ± 5.68 0.372
WBC, (x1000/mm3) 10.9 (9.1-13.6) 10.9 (9.0-14.9) 0.631
Lymphocyte, (x1000/mm3) 2.00 (1.50-2.69) 2.10 (1.56-2.72) 0.599
Monocytes, (x1000/mm3) 0.68 (0.49-0.89) 0.60 (0.42-0.80) 0.280
Neutrophil, (x1000/mm3) 7.77 (5.22-11.00) 7.70 (5.37-11.0) 0.868
PG, (mg/dL) 103.00 (127.00-71.40) 110.00 (93.75-159.75) 0.100
Creatinine, (mg/dL) 0.84 ± 0.31 0.85 ± 0.21 0.176
Uric acid, (mg/dL) 5.05 (5.98-6.47) 5.25 (4.20-6.10) 0.858
Albumin, (mg/dL) 4.35 ± 0.45 4.38 ± 0.34 0.560
LDH, U/L 266 (216-409) 251 (213-356) 0.651
Triglycerides, (mg/dL) 149.5 (95.7-213.7) 147.5 (102.2-237.0) 0.519
TC, (mg/dL) 187.0 (147.7-221.5) 181.5 (137.0-221.0) 0.368
HDL-C, (mg/dL) 32.0 (27.3-38.0) 34.0 (28.0-42.0) 0.410
LDL-C, (mg/dL) 119.8 (87.2-146.5) 106.3 (84.7-126.1) 0.174
CRP, (mg/dL) 0.94 (1.86-2.19) 0.40 (0.14-0.80) 0.002**
TSH, uIU/mL 1.23 (0.74-1.88) 1.46 (1.08-2.02) 0.160
FT3, ng/mL 3.34 (3.24-3.60) 3.04 (2.68-3.17) 0.068
FT4,ng/mL 1.15 (1.03-1.29) 1.10 (1.01-1.34) 0.937
e-GFR, (ml/min) 105.0 (85.0-117.0) 107.0 (100.2-114.2) 0.641
RDW, fL 12.70 (12.30-13.42) 12.75 (11.45-13.77) 0.642
MPV, fL 8.19 (7.42-9.32) 7.98 (7.20-8.67) 0.141
Total bilirubin, (mg/dL) 0.60 (0.48-0.80) 0.60 (0.50-0.92) 0.738
Phosphorus, (mg/dL) 3.10 (2.50-3.70) 3.10 (2.32-3.70) 0.934
Calcium, (mg/dL) 9.20 (8.78-9.60) 9.20 (9.00-9.70) 0.809
ALT, (U/L) 28.00 (20.25-41.75) 32.0 (22.25-44.00) 0.496
AST, (U/L) 35.00 (24.00-51.00) 34.00 (25.50-49.00) 0.790
ALP, (U/L) 79.0 (65.0-86.0) 83.0 (73.0-97.0) 0.053
GGT, (U/L) 23.50 (16.00-39.50) 26.00 (18.00-45.00) 0.289
Platelet count, (x1000/mm3) 283.0 (230.0-333.0) 254.5 (219.7-318.0) 0.642
Fibrinogen, (mg/dL) 429.2 (475.0-283.0) 283.0 (228.7-440.7) 0.004**
Presepsin, (pg/mL) 1.257.9 (1197.8-602.9) 479.1 (451.3-569.0) <0.001**
Zonulin, (ng/mL) 2.75 (1.85-3.50) 1.60 (1.30-1.92) <0.001**
Peak CK-MB, (ng/mL) 23.50 (6.72-57.50) 3.00 (2.00-6.22) <0.001**
Peak Troponin-I, (pg/mL) 4.660.0 (352.5-12458.0) 57.0 (42.25-1130.8) <0.001**

Unless otherwise stated, values are mean ± SD, n (%), or median (interquartile range). There were no statistically significant comparisons after analysis with Student’s t-test. *p <0.05 vs. control: Significant after analysis Chi-square test. **p <0.05 vs. control: Significant after analysis of Mann-Whitney U test. ALT: Alanine Aminotransferase; AST: Aspartate aminotransferase; ALP: alkaline phosphatase; BMI: body mass index; CRP: C- reactive protein; PG: plasma glucose; GGT: gamma glutamyl transferase; LDH: lactate dehydrogenase; LVEF: left ventricular ejection fraction; e-GFR: estimated glomerular filtration rate; TSH: thyroid stimulating hormone; FT3 : free T3; FT4: free T4; TC: total cholesterol; HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol; MPV: mean platelet volume; RDW: red cell distribution width; WBC: white blood cell.

– Zonulin (A) and presepsin (B) levels in patients with myocarditis compared to the control group.

– Distribution of demographic and clinical characteristics of patients with myocarditis according to zonulin groups
Variables *Group 1 n = 22 Group 2 n = 23 Group 3 n = 23 p
Demographics and medical history
Age, years 22.91 ± 6.43 27.17 ± 6.42 24.09 ± 7.24 0.095
Gender, male, n (%) 15 (68.2) 13 (56.5) 15 (65.2) 0.699
Smoking, n (%) 4 (18.2) 5 (21.7) 5 (21.7) 0.944
History of COVID-19 or COVID-19 vaccination in the last six months 3 (13.6) 7 (30.4) 16 (69.6) <0.001**
Echocardiography and EKG
LVEF, (%) 59.5 ± 2.0 57.9 ± 7.4 49.7 ± 13.7 0.001**
Rhythm disturbances 1 (4.5) 3 (13.0) 8 (34.7) <0.001**
Symptoms in the last four weeks, n (%)
Respiratory tract complaints 7 (31.8) 9 (39.1) 9 (39.1) 0.251
GIS complaints 6 (27.2) 7 (30.4) 12 (52.2) <0.001**
Respiratory tract and GIS complaints 2 (9.0) 1 (4.3) 2 (8.7) 0.324
None 9 (40.9) 6 (26.1) - -
Laboratory Results
CRP, (mg/dL) 1.42 (0.68-2.17) 1.80 (0.85-2.75) 2.35 (1.22-3.48) 0.369
Fibrinogen, (mg/dL) 357.2 (295.9-418.5) 407.8 (352.5-463.0) 399.4 (369.3-429.5) 0.124
Peak CK-MB, (ng/mL) 13.86 (4.21-23.51) 29.86 (19.86-33.87) 56.34 (48.86-63.83) <0.001***
Peak Troponin-I, (pg/mL) 2.573.9 (3.104.2-4.362.2) 6.495.0 (4.256.6-8.733.3) 26.737.8 (2.973.8-50.501.8) <0.001***
Presepsin, (pg/mL) 942.8 (682.5-1.203.1) 1.139.8 (941.4-1.338.2) 1.561.5 (1.306.5-1.816.6) 0.001***

Unless otherwise stated, values are mean ± SD, n (%), or median (interquartile range). * Group 1 taken as reference. **p<0.05 vs. control: Significant after analysis of One-Way ANOVA test. ***p <0.05 vs. control: Significant after analysis of Kruskal-Wallis test. EKG: electrocardiography; GIS: gastrointestinal system; CK-MB: creatine kinase- MB.

– Positive correlation between Zonulin and Presepsin (A), Zonulin and CK-MB (B), Zonulin and Troponin (C) in patients with myocarditis.

– Independent predictors of acute myocarditis
Multivariate logistic regression analyses
Nagelkerke R2 in final step = 0.643
Odds ratio 95% CI p-value
Zonulin 12.331 4.261-35.689 <0.001*
Presepsin 1.001 1.000-1.002 0.025*

* Significant p-value. Entered variables: C- reactive protein, History of COVID-19 or COVID-19 vaccination in the last six months, Fibrinogen, GIS complaints, Rhythm disturbances, Left ventricular ejection fraction, Presepsin, Zonulin.

When Receiver Operating Characteristic (ROC) curve analysis was performed, the optimal cut-off value of presepsin to predict acute myocarditis is presepsin ≥ 584.13; it was predictive for acute myocarditis with 79.4% sensitivity and 80% specificity, and zonulin ≥ 1.85; it was predictive for acute myocarditis with 82% sensitivity and 91% specificity ( Figure 3 ). In addition, the ROC curves were compared to identify if there was an additional benefit of using presepsin and zonulin on CK-MB and Troponin-I ( Figure 3 ). When presepsin and zonulin were compared, they were not found to be superior to each other in terms of predicting acute myocarditis (p = 0.105).

– Receiver Operating Characteristics (ROC) curve of presepsin, zonulin, troponin and CK-MB for predicting acute myocarditis. Since the AUC of CK-MB and the AUC of Troponin are 1.0, they overlayed each other.

Discussion

Today, the diagnosis and treatment of myocarditis remain challenging among clinicians due to the inability to predict long-term complications such as dilated cardiomyopathy. However, the mechanisms that trigger myocarditis are still not fully understood. In this study, we wanted to uncover the role of zonulin, which shows increased intestinal permeability, and presepsin, a low-grade endotoxemia biomarker, in the pathophysiology of myocarditis and whether they can be biomarkers for acute myocarditis. In our study, increased zonulin and presepsin amounts compared to the control group showed that increased intestinal permeability might have a triggering role in the pathogenesis of myocarditis. Therefore, zonulin and presepsin may be useful biomarkers that can be used in the diagnosis of acute myocarditis.

Acute myocarditis remains a diagnostic challenge for clinicians due to similar clinical presentations in various cardiovascular disorders such as myocardial infarction, coronary vasospasm, cardiac amyloidosis, and hypertrophic cardiomyopathy.5 If the infectious agent is quickly eliminated and the inflammatory process is terminated, the disease will heal with only minor changes in the myocardium. These patients usually recover completely within weeks or months. Conversely, when diagnosis and treatment are started too late, the viral infection is not eliminated, and the antiviral immune response is diminished, irreversible clinical consequences may be encountered, which may result in dilated cardiomyopathy. Therefore, available data dispute the need to identify patients at an early and still reversible stage of virus-associated heart disease.20 Although endomyocardial biopsy (EMB) is the diagnostic gold standard, the use of EMB varies widely depending on the physician and the clinical presentation of the patients. Although EMB cannot be applied in every center for diagnosing myocarditis, the sensitivity of EMB for detecting myocarditis is quite low.11 , 12 Although the use of cardiac MRI for myocarditis patients has recently increased, cardiac MRI cannot be performed in every center nor can it determine the extent of myocardial inflammation, and assessment is largely dependent on clinical experience. Although cMRI has become useful in noninvasively obtaining accurate and reliable preliminary information, available data on the diagnostic accuracy of cMRI is currently limited.13 , 21

Many cases of myocarditis go undetected because of asymptomatic presentations or nonspecific symptoms. Therefore, the patients included in our study mostly consisted of patients who arrived at the emergency department with nonspecific symptoms and had high cardiac markers such as creatine kinase (CK-MB) and troponin. Although CK-MB is a preferred biomarker for myocarditis, the sensitivity of creatine kinase in late diagnosis is poor because studies show that it consistently drops to basal levels in the early 3-5 days.22 The reliability of measuring cardiac biomarker levels in patients with suspected myocarditis is low, but they still help confirm the diagnosis of myocarditis.23 Nonspecific serological markers of inflammation, such as fibrinogen and C-reactive protein, may be elevated in the case of suspected myocarditis. Still, normal levels of these tests fail to exclude an inflammatory response in the myocardium, so conventional serological tests and cardiac biomarkers for myocarditis are of poor prognostic value in diagnosing myocarditis.24 Because of all these handicaps, it is important to use biomarkers that can be prognostic for myocarditis in addition to conventional markers in early diagnosis and treatment. Zonulin and presepsin may be promising biomarkers in this field.

Patients with myocarditis often report recent respiratory or gastrointestinal issues without apparent nonspecific symptoms.5 When we look at the causes of myocarditis, it is mostly caused by enteropathogenic viruses such as coxsackievirus, parvovirus B19, adenovirus, or COVID-19, and it is seen that bacterial causes often occur after gastroenteritis of enteropathogenic bacteria such as salmonella, shigella and campylobacter.7 - 10 This situation suggested that impaired intestinal permeability in the gastrointestinal tract for any reason may play a role in the pathogenesis of myocarditis by causing viral translocation.

Tight junctions are important in preventing pathogen invasion in intestinal epithelial cells and thus into blood and lymph circulation.14 Zonulin is the only known physiological modulator of intercellular tight junctions, and loss of barrier function due to upregulation of zonulin leads to an uncontrolled flow of dietary and microbial antigens into blood and lymph circulation through the submucosa, and this mechanism has been implicated in the pathogenesis of many chronic inflammatory and autoimmune diseases.25 , 26 Autoimmunity plays an important role in the pathophysiology of myocarditis development.4 , 27 In addition to autoimmunity, complement activation also plays a role in the pathogenesis of myocarditis.28 Studies have shown that zonulin activates the complement pathway.29 This suggests that zonulin-mediated complement activation may play a role in the development of myocarditis.

We suggest that the zonulin-mediated increase in epithelial permeability in respiratory29 and gastrointestinal tract15 - 17 for various reasons may be the pathogenesis that triggers the development of myocarditis, as in other inflammatory and autoimmune diseases.4 , 25 , 26

Coxsackie B3 and parvovirus B19 are the most common causes of myocarditis worldwide.3 Coxsackieviruses invade from the enterocytes by binding to the coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR), which is located in tight junctional complexes in the intestine.30 , 31 This may suggest that pathogens such as coxsackieviruses, which often play a role in the pathogenesis of myocarditis, trigger the development of myocarditis by disrupting the function of tight junctions via CAR receptors located in tight junction complexes, which is regulated via zonulin in the intestinal epithelium and this mechanism may explain the possible increase in intestinal permeability after coxsackievirus infections. Studies have shown that parvovirus B19, one of the most common causes of myocarditis, colonizes intestinal epithelial cells and uses intestinal cells as a reservoir.32 Parvovirus B19 has been held responsible for chronic fatigue syndrome by remaining at a reservoir in the intestine,32 and it has been emphasized that the increase in intestinal permeability in patients with chronic fatigue syndrome has an important role in the pathogenesis of the disease.33 This may shed light on the association of increased intestinal permeability with parvovirus B19 in patients with myocarditis. In addition to classical pathogens such as parvovirus B19 and coxsackievirus, myocarditis cases related to COVID-19 have recently started to be seen frequently with the COVID-19 epidemic.8 , 9 Although many pathophysiological mechanisms have been suggested in the development of myocarditis due to COVID-19, the main triggering factor of the disease is not yet known.8 Besides affecting many systems, COVID-19 affects the gastrointestinal system frequently.34 At the same time, studies have found that intestinal permeability is increased in those who have COVID-19, and high zonulin levels, a biomarker of intestinal permeability, has been found in these patients.35 Although the effect of intestinal permeability has not been demonstrated in patients with myocarditis due to COVID-19, the higher zonulin levels observed in myocarditis patients with a recent history of COVID-19, as in our study, may support our idea that COVID-19 triggers the development of myocarditis by increasing intestinal permeability. In addition, although it is seen less frequently than viral agents, the development of myocarditis after gastroenteritis of enteropathogenic bacteria from bacterial causes indicates that impaired intestinal permeability may be associated with the development of myocarditis.36

Studies have shown that lipopolysaccharides (endotoxin) increase intestinal permeability.18 Presepsin (a soluble cluster of differentiation subtype 14 [CD14]) is a reliable and indirect marker of endotoxemia.37 It has been shown to increase in bacterial sepsis and also in viral infections such as COVID-19.38 All this shows that presepsin may be an indirect biomarker that can show an increase in intestinal permeability.

In our study, the correlation of high zonulin levels with peak CK-MB and peak troponin-I levels indicates that a greater antigen load triggers greater cardiac destruction as intestinal permeability increases. The fact that zonulin and presepsin levels were high in patients with myocarditis may be epiphenomenal or indicate a complex interaction that plays a role in increased intestinal permeability. The increase in intestinal permeability, confirmed by zonulin levels, may lead to more bacteremia and viremia, which can be explained by an increase in presepsin in correlation with zonulin levels. Furthermore, considering the role of zonulin in the pathogenesis of myocarditis, zonulin may be a potential biomarker for myocarditis, as well as a therapeutic target in severe myocarditis cases, as in other inflammatory diseases.39 Enteric viruses utilize gut microbes for replication and transmission,40 which may explain why increased intestinal permeability in bacterial gastrointestinal enteritis causes enteric virus transmission and predisposes to myocarditis development. The fact that presepsin and zonulin were found to be high together in myocarditis cases supports this view.

As a result, we hypothesize that increased permeability in the gastrointestinal system may be one of the main triggering mechanisms in the development of myocarditis. Zonulin and presepsin can be used as biomarkers in addition to conventional biomarkers when evaluated by the clinic. This is for the early management of diagnosis and treatment modalities in myocarditis where gold standard diagnostic tools such as EMB and cMRI are unavailable.

If this relationship is clearly demonstrated, early diagnosis and treatment may help prevent chronic complications of myocarditis such as dilated cardiomyopathy. In addition, in cases with similar clinical presentations, the use of these two biomarkers in addition to traditional biomarkers is a cost-effective option in clinical practice by reducing the application of expensive diagnostic methods such as EMB, cMRI and coronary angiography, which are used for the diagnosis and exclusion of acute myocarditis and require special expertise for their application and interpretation of results.

Based on these findings, more extensive studies in this area may shed light on the triggering pathogenesis of myocarditis and assist in the development of new pharmacological models to reduce the likelihood of poor clinical outcomes such as dilated cardiomyopathy.

Limitations of the study

Our study had some limitations. Firstly, our sample size was relatively small, and it was a cross-sectional study. Secondly, only acute myocarditis patients with high cardiac biomarkers were included in our study. The exclusion of patients with borderline and subclinical myocarditis and patients with chronic myocarditis may affect the results. Patients’ PCR or isolation results of causative viruses could not be included in the study due to technical inadequacy. Still, the combined evaluation of patients’ histories, cMRI results, biological markers such as troponin and CK-MB, and invasive and non-invasive coronary angiographic methods were sufficient to exclude other causes. Finally, endomyocardial biopsy, the gold standard diagnostic tool, was not used in the diagnosis, which may have affected our results.

 Conclusion

Myocarditis may present, similarly to ischemic heart disease, with chest pain, abnormalities in electrocardiograms and elevated cardiac biomarkers. It may be mixed up with these cardiac pathologies that are similar in symptoms and laboratory findings, including cardiac amyloidosis and hypertrophic cardiomyopathy. Therefore, suspected cases of myocarditis remain a challenging diagnosis for clinicians in terms of its presentation, features, and course. In this respect, when gold standard diagnostic tools such as EMB and cMRI are not available, auxiliary biomarkers that can be used in addition to CK-MB and cardiac troponin for rapid diagnosis of myocarditis cases and exclusion of other confounding cardiac causes. In addition, increased respiratory tract and intestinal permeability may be one of the main mechanisms triggering the development of myocarditis. Therefore, zonulin and presepsin may be promising biomarkers for both diagnosis and follow-up treatment in myocarditis patients.

Study association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Harran University under the protocol number HRJ/20/21/35. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.

Sources of funding: There were no external funding sources for this study.