Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC pWV8CTcxJZdn5L5GV638xNc S0066-782X2023000700203 00203 10.36660/abc.20220479 Artigo Original Comparação de Soluções Cardioplégicas em Cirurgia de Revascularização Miocárdica sobre Mecanismos de Autofagia e Apoptose 0000-0002-5644-5442 Sener Elif Funda Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 2 0000-0002-0711-4014 Hamurcu Zuhal Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 2 0000-0001-5806-8241 Taheri Serpil Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 2 0000-0002-1347-0939 Tahtasakal Reyhan Obtenção de dados Redação do manuscrito 1 2 0000-0002-8879-1112 Delibasi Nesrin Obtenção de dados Redação do manuscrito 3 0000-0003-0992-1415 Elcik Deniz Análise estatística Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 4 0000-0002-4597-6811 Mehmetbeyoglu Ecmel Obtenção de dados Análise estatística 2 0000-0001-8877-2547 Tuncay Aydin Obtenção de dados Redação do manuscrito 5 0000-0003-2035-3981 Dal Fatma Obtenção de dados 2 0000-0002-1228-1298 Bayram Keziban Korkmaz Obtenção de dados 6 0000-0001-6438-8153 Gunes Isın Obtenção de dados Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 7 0000-0003-2980-8364 Emirogullari Omer Naci Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Obtenção de financiamento Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 5 Erciyes University Medical Faculty Department of Medical Biology Kayseri Turquia Erciyes University Medical Faculty Department of Medical Biology, Kayseri – Turquia Erciyes University Genome and Stem Cell Center Kayseri Turquia Erciyes University Genome and Stem Cell Center (GENKOK), Kayseri – Turquia Cappadocia University Cappadocia Vocational College Department of Medical Laboratory Techniques Nevsehir Turquia Cappadocia University Cappadocia Vocational College Department of Medical Laboratory Techniques, Nevsehir – Turquia Erciyes University Medical Faculty Department of Cardiology Kayseri Turquia Erciyes University Medical Faculty Department of Cardiology, Kayseri – Turquia Erciyes University Medical Faculty Department of Cardiovascular Surgery Kayseri Turquia Erciyes University Medical Faculty Department of Cardiovascular Surgery, Kayseri – Turquia Ankara Yildirim Beyazit University Medical Faculty Department of Medical Genetics Ankara Turquia Ankara Yildirim Beyazit University Medical Faculty Department of Medical Genetics, Ankara – Turquia Erciyes University Medical Faculty Department of Anesthesiology and Reanimation Kayseri Turquia Erciyes University Medical Faculty Department of Anesthesiology and Reanimation, Kayseri – Turquia Correspondência: Elif Funda Sener • Erciyes University – Erciyes University Medical Faculty Departmen of Medical Biology Erciyes University Medical Faculty Departmen of Medical Biology Talas 38280 – Turquia E-mail: efefunda@yahoo.com

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo

 17 07 2023 06 2023 120 7 e20220479 05 07 2022 03 03 2023 05 04 2023 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

A doença arterial coronariana (DAC) devido à isquemia miocárdica causa perda permanente de tecido cardíaco.

 Objetivos

Nosso objetivo foi demonstrar o possível dano ao miocárdio em nível molecular através dos mecanismos de autofagia e apoptose em pacientes submetidos à cirurgia de revascularização miocárdica.

 Métodos

Um grupo recebeu uma solução de cardioplegia Custodiol e o outro grupo uma solução de cardioplegia sanguínea. Duas amostras miocárdicas foram coletadas de cada paciente durante a operação, imediatamente antes da parada cardíaca e após a liberação do pinçamento aórtico. Foram avaliadas as expressões de marcadores de autofagia e apoptose. O nível de significância estatística adotado foi de 5%.

 Resultados

A expressão do gene BECLIN foi significativa nos tecidos miocárdicos do grupo CS (p=0,0078). Os níveis de expressão dos genes CASPASE 3, 8 e 9 foram significativamente menores no grupo CC. Os níveis pós-operatórios de TnT foram significativamente diferentes entre os grupos (p=0,0072). As expressões dos genes CASPASE 8 e CASPASE 9 foram semelhantes antes e depois do pinçamento aórtico (p=0,8552, p=0,8891). No grupo CC, os níveis de expressão gênica de CASPASE 3, CASPASE 8 e CASPASE 9 não foram significativamente diferentes em amostras de tecido coletadas após pinçamento aórtico (p=0,7354, p=0,0758, p=0,4128, respectivamente).

 Conclusões

Com nossos achados, acreditamos que as soluções CC e CS não apresentam diferença significativa em termos de proteção miocárdica durante as operações de by-pass.

 Doença Arterial Coronariana Revascularização Miocárdica Isquemia Miocárdica Soluções Cardioplégicas Ponte de Artéria Coronária Autofagia Apoptose Erciyes University TCD-2016-6339 Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado por Erciyes University (Project number: TCD-2016-6339). Introdução

As soluções de cardioplegia são usadas para parar o coração e reduzir o dano isquêmico no miocárdio quando o fluxo sanguíneo coronário é interrompido durante as operações cardíacas.1 , 2 Como o Custodiol e a cardioplegia sanguínea são soluções altamente eficazes, elas têm sido usadas há muito tempo em cirurgias de coração aberto. Durante a circulação extracorpórea (CEC), o coração é parado e protegido com soluções de cardioplegia. Este período está associado à privação de oxigênio; o coração fica isquêmico durante a CEC. O coração é reperfundido ao final da CEC e a ação cardíaca continua.3 No entanto, a CEC pode levar a danos adicionais ao miocárdio causados por reperfusão global e morte celular por meio de indução de autofagia miocárdica e apoptose.4

Acredita-se que a autofagia desempenhe um papel absoluto no tecido cardíaco durante a isquemia/reperfusão. Enquanto a indução de autofagia em cardiomiócitos durante a isquemia tem um efeito protetor, acredita-se que a autofagia induzida durante a reperfusão leve à morte dos cardiomiócitos. Em condições normais, o estresse metabólico normalmente estimula a apoptose. No entanto, em células onde o mecanismo de apoptose é prejudicado, a célula continua a viver em condições hipóxicas. A sobrevivência dessas células se deve à autofagia, mas quando a apoptose e a autofagia são suprimidas, a viabilidade celular falha e morre.5 A autofagia ocorre em níveis basais, mas pode ser ainda mais induzida por estresse, como hipóxia e depleção de nutrientes.6 A proteína LC3B é um jogador importante no processo autofágico. A ativação da autofagia é refletida por aumentos na abundância de proteínas-chave dos genes relacionados à autofagia (ATG5-12), cadeia leve 3 (LC3), Beclin-1 e p62.7 As regiões miocárdicas com atividade autofágica aumentada exibem menos células apoptóticas, sugerindo que a estimulação da autofagia pode prevenir a apoptose.8

A apoptose é necessária durante o desenvolvimento do coração e tem sido associada a muitas doenças cardiovasculares.9 A apoptose é mediada pela ativação de Caspases normalmente encontradas como zimogênios inativos na célula.10 As Caspases também podem desempenhar funções na proliferação celular, diferenciação, controle do ciclo celular e vias de sobrevivência. A via apoptótica extrínseca é iniciada pela ligação de ligantes a receptores de superfície celular que recrutam e ativam a Caspase 8, que ativa a Caspase 3 executora chave. A Caspase 3, uma das Caspases executoras mais importantes na convergência das vias apoptóticas intrínseca e extrínseca, é o principal indicador de apoptose.11 Como a Caspase iniciadora na via da apoptose do receptor de morte (extrínseco), a Caspase-8 ativa proteoliticamente Caspases a jusante e BID. A via intrínseca é iniciada pela liberação do citocromo c da mitocôndria. A Caspase 9, a Caspase iniciadora na via apoptótica mitocondrial (intrínseca), também participa da maioria dos processos de diferenciação nos quais a Caspase 3 foi implicada.12 , 13 A sinalização apoptótica nos cardiomiócitos de seres humanos é desconhecida.13 A apoptose dos cardiomiócitos é desencadeada por numerosos vias de sinalização e reguladas por ligantes intrínsecos e extrínsecos multicomplexos.8 , 14 , 15

Este estudo visa explicar como os níveis das soluções de cardioplegia Custodiol (CC) e cardioplegia sanguínea (CS) usadas para proteger o miocárdio durante a cirurgia de revascularização do miocárdio ativam os mecanismos de autofagia e apoptose ao nível do mRNA e da proteína. Assim, procuramos avaliar o dano miocárdico intraoperatório e pós-operatório imediato por autofagia e apoptose.16

 Material e métodos Seleção do paciente

Um total de 30 pacientes com CEC foram incluídos no estudo ( Figura Central ). Este estudo é caso-controle. Os pacientes foram divididos em dois grupos de acordo com a ordem de internação. Os pacientes foram divididos em dois grupos, atentando para o tipo de procedimento cirúrgico, idade e sexo. Aplicamos CS a um grupo e CC ao outro grupo. ( Figura 1 ). Ambos os grupos consistiram em 15 pacientes. Considerando nosso trabalho anterior, o tamanho da amostra utilizado no estudo foi por conveniência.17 A cirurgia de revascularização miocárdica foi realizada com essas soluções cardioplégicas. Todos os pacientes estavam tomando aspirina. Nove pacientes do grupo CS e 11 pacientes do grupo CC faziam uso de β-bloqueador; 3 pacientes do grupo CS e 1 paciente do grupo CC faziam uso de bloqueadores de canais de cálcio; 4 pacientes do grupo CS e 2 pacientes do grupo CC faziam uso de medicação diabética oral; 1 paciente do grupo CS e 3 pacientes do grupo CC faziam uso de inibidor da enzima conversora de angiotensina; 1 paciente do grupo CC fazia uso de α e β bloqueadores. O grupo de controle saudável não foi usado porque os pacientes foram comparados dentro e entre os grupos. Todos os pacientes registrados pelo Departamento de Cirurgia Cardiovascular da Universidade Erciyes foram avaliados para este estudo. Pacientes com síndrome coronariana aguda, cirurgia de revascularização do miocárdio (CRM) de emergência, insuficiência renal crônica, história de cirurgia cardíaca prévia, endocardite infecciosa, doenças vasculares periféricas e doença inflamatória crônica foram excluídos do estudo. O comitê de ética da Universidade Erciyes aprovou este estudo. Formulários de consentimento informado por escrito foram recebidos dos pacientes. Este estudo respeitou as declarações éticas da Declaração de Helsinki.

: Comparação de Soluções Cardioplégicas em Cirurgia de Revascularização Miocárdica sobre Mecanismos de Autofagia e Apoptose

– Diagrama de fluxo da seleção do paciente no estudo. PCR: reação em cadeia da polimerase; RNA: ácido ribonucléico.

Manejo da anestesia

O mesmo protocolo de anestesia foi aplicado a todos os pacientes. Foram realizados ECG de cinco canais, oximetria de pulso, pressão arterial não invasiva, oximetria cerebral e monitoramento de entropia nos pacientes levados para a sala de cirurgia. Após injeção de 1,5 mg de dormicum e 50 microgramas de fentanil, um cateter arterial invasivo foi colocado na artéria radial e uma medição invasiva da pressão arterial foi realizada. Após pré-oxigenação, 1 mg/kg de propofol, 10 microgramas/kg de fentanil e 1 mg/kg de rocurônio foram usados na indução. Os pacientes com valores de entropia adequados foram intubados. O cateter venoso central guiado por ultrassom foi inserido. A infusão de ácido tranexâmico na dose de 15 mg/kg em 1 hora foi seguida de infusão de manutenção na dose de 1,5 mg/kg/h durante todo o caso. Dez microgramas/kg/h de fentanil, 4 mg/kg/h de propofol, e 1 mg/kg/h de rocurônio foram usados no manejo da anestesia. A profundidade da anestesia foi ajustada entre 45 e 60 de entropia; se necessário, desflurano foi usado como agente inalatório. As configurações do ventilador foram TV 6 ml/kg, frequência respiratória 12/min, PEEP de 5 cm/volume de água, com modo de controle de volume. Caso houvesse diminuição da oximetria cerebral, as intervenções necessárias eram realizadas.

 Abordagem cirúrgica

Em todos os casos, o procedimento operatório incluiu esternotomia mediana e circulação extracorpórea com oxigenador de membrana. A proteção miocárdica consistiu em hipotermia moderada (30–32°C), resfriamento tópico com solução salina fria e sangue frio ou cardioplegia Custodiol (4–10°C) administrado de forma anterógrada. A cardioplegia Custodiol [1000 cc, contendo histidina 180 (mmol/L), triptofano (2 mmol/L), manitol (30 mmol/L), KCl (9 mmol/L), NaCl (15 mMol/L)] foi administrada em uma única dose. As doses de cardioplegia sanguínea [contendo 700 cc de sangue, 2 ampolas de HCO3 (840 mg), 1 ampola de Mg (1500 mg), 2 ampolas de KCl (750 mg)] foram repetidas a cada 20 minutos. A última dose foi administrada morna (37°C) imediatamente antes da liberação do pinçamento aórtico. Todas as anastomoses distais foram realizadas primeiro, após pinçamento cruzado da aorta e infusão da solução cardioplégica. As anastomoses proximais foram feitas após a liberação do pinçamento.

 Preparação de amostras de tecido

Duas amostras de tecido miocárdico do mesmo local no apêndice atrial direito foram retiradas de cada paciente imediatamente antes do pinçamento aórtico e após a liberação da pinça (final da circulação extracorpórea). As amostras de tecido foram então congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C.

 Isolamento de RNA e estudos de expressão gênica

Duas amostras de tecido miocárdico (pré e pós-condicionamento) foram coletadas de cada paciente e o RNA total foi isolado com o reagente TRIZOL (Roche, Alemanha). A quantidade e a qualidade das amostras de RNA foram medidas com um Espectrofotômetro BioSpec-Nano. Os RNAs foram armazenados a -80°C até o uso. Os níveis de expressão de mRNA dos genes Beta-actina (ACTB), Beclin, LC3, Caspase 3, Caspase 8 e Caspase 9 foram determinados usando PCR em tempo real LightCycler 480 II (Roche, Alemanha). Cada amostra foi processada em duplicata. Os níveis de expressão dos genes foram calculados usando o método 2−Ct.

 Isolamento de proteínas e Western Blot

O isolamento de proteínas foi realizado a partir de amostras de tecido miocárdico.16 A concentração total de proteínas para cada amostra foi determinada com um kit de ensaio de proteína compatível com detergente (kit DC; Bio-Rad, Hercules, CA). Alíquotas contendo 40 μg de proteína total de cada amostra foram analisadas por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio (SDS)-poliacrilamida com um gradiente de 4–20% para separação de proteínas e eletrotransferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno. As membranas foram bloqueadas com um tampão de bloqueio (0,1 Triton X-100 com 5% de leite em pó em solução salina tamponada com Tris-Tween 20) [TBS-T] por 60 min. Depois de lavadas com TBS-T, as membranas foram sondadas com os seguintes anticorpos primários: LC3, Beclin-1, Caspase 3, Caspase 8 e Caspase 9 (Cell Signaling Technology). As demais etapas do western blot foram realizadas conforme indicado no estudo de Hamurcu et al.16 Os blots foram então visualizados com um Chemidoc MP Imaging System (Biorad) e quantificadas com um densitômetro usando o programa de aplicação de imagens (Bio-Rad Image Lab 5).

 Análise estatística

As variáveis categóricas foram apresentadas como números e porcentagens, e as comparações de grupo foram feitas usando os testes qui-quadrado, correção de Yates e Fisher. A conformidade dos dados com a distribuição normal foi avaliada com histograma, q-q plots e teste de Shapiro-Wilk. As comparações intergrupos de variáveis numéricas foram realizadas com os testes t de Student não pareados ou testes U de Mann-Whitney. A homogeneidade da variância foi avaliada com o teste de Levene. Duas amostras dependentes e o teste de Wilcoxon foram aplicados para comparar as diferenças entre os resultados de expressão gênica de mRNA e os níveis de expressão de proteína em amostras de tecido coletadas no pré e pós-operatório. Duas amostras independentes e o teste U de Mann-Whitney foram aplicados para comparar os dados do grupo cardioplegia sanguínea e cardioplegia Custodiol. Os dados foram obtidos usando GraphPad Prism 8.0. (versão 8.0.1, San Diego, CA, EUA). Valores de p <5% foram considerados estatisticamente significativos.

 Resultados Características do paciente e achados laboratoriais

Quinze pacientes foram incluídos nos grupos cardioplegia sanguínea (CS) e cardioplegia Custodiol (CC). Homens (9, 60%) e mulheres (6, 40%) foram iguais em ambos os grupos. A média de idade do grupo CS foi 59,9 ± 9,8 anos, e o grupo CC foi de 52,7 ± 19,5 anos; essa diferença não foi significativa (p=0,2135). As características clínicas e cirúrgicas dos pacientes são apresentadas na Tabela 1 e os achados laboratoriais na Figura 2 (A, B) .

– Características clínicas e demográficas do grupo de estudo
Achados clínicos Cardioplegia sanguínea (n=15, média±DP) Cardioplegia Custodiol (n=15, média±DP) Valor-p
Idade (ano médio ± SEM) 59,9±9,8 52,7±19,5 p=0,5
Sexo (masculino n, %) 9 (60%) 9 (60%) p=0,645
Diabetes Mellitus (n, %) 4 (27%) 2 (13%) p=0,075
Hipertensão (n, %) 4 (27%) 2 (13%) p=0,075
Fumante (n, %) 5 (33%) 7 (47%) p=0,224
Altura (cm) 164±9,5 167,5±10,1 p=0,7
Peso (kg) 76,5±12,4 76,2±15 p>0,9999
ASC (m2) 1,8±0,2 1,8±2 p>0,9999
Parâmetros hemodinâmicos
Pressão arterial sistólica 121,8 ± 16,5 123,8 ± 19,1 p=0,664
Pressão sanguínea diastólica 79,2 ± 11,6 77,7 ± 13,1 p=0,778
Ecocardiografia
Fração de ejeção 54,7 ± 5,4 55,7 ± 6,3 p=0,647
Diâmetros sistólicos 3,49 ± 0,56 3,32 ± 0,3 p=0,310
Diâmetros diastólicos 5,18 ± 0,72 4,99 ± 0,44 p=0,379
Duração do Pinçamento cruzado (média min±SEM) 58,4±8,6 63,7±36,4 p=0,9931
Duração total do bypass (média min±SEM) 119±28 134,5±53,9 p=0,9423
TnT (ng/mL) 0,8 (0,5-1,6) 0,2 (0,16-1,8) p=0,0072
CK-MB (u/L) 60,3 (39,5-145) 41 (28-50) p=0,0731
Cirurgia
CRMX1 (n) 2 2
CRMX2 (n) 2 1
CRMX3 (n) 6 6
CRMX4 (n) 5 6

CRMxN: número de by-pass; ASC: área de superfície corporal; DP: desvio padrão; SEM: erro padrão da média.

– A, B) Comparação dos achados laboratoriais pós-operatórios dos pacientes dos grupos Cardioplegia Custodiol e Cardioplegia Sanguínea. A) Os níveis de TnT foram significativamente diferenciados entre os grupos (p=0,0072). B) Os níveis de CK-MB não foram diferentes entre os grupos (p=0,0731). Figuras 2C-E) Gráficos de expressão. C) Imagens de Western Blot de membrana de marcadores de autofagia no grupo Cardioplegia Sanguínea e Cardioplegia Custodiol. D) Gráficos dos níveis de expressão dos genes Beclin e LC3 nas amostras de tecido miocárdico dos grupos (n=15, BO: Antes do pinçamento aórtico, AO: após a liberação do pinçamento aórtico). (*p<0,05). E) Expressões proteicas de Beclin e LC3 em ambos os grupos.

Os níveis de CK-MB e TnT foram medidos nas amostras de sangue pré e pós-operatórias do paciente para parâmetros bioquímicos e comparados nos grupos CC e CS ( Figura 2A, 2B ). Os níveis pré-operatórios de CK-MB e TnT não foram significativamente diferentes. Nossos dados mostraram que os níveis pós-operatórios de TnT diferiram significativamente entre os grupos (p=0,0072).

 Resultados de expressão gênica autofágica e apoptótica em tecido miocárdico

A expressão gênica de BECLIN em amostras de tecido miocárdico foi significativa e diminuiu após pinçamento aórtico no grupo CS ( Figura 2D ) (p=0,0078). A expressão do gene LC3 diminuiu após o pinçamento aórtico, mas não foi significativa ( Figura 2D ). A expressão do gene BECLIN em amostras de tecido miocárdico coletadas após o pinçamento aórtico não foi diferenciada das amostras de tecido miocárdico coletadas antes do pinçamento aórtico no grupo CC. A expressão do gene LC3 na amostra de tecido miocárdico coletada antes do pinçamento aórtico mostrou-se diminuída quando comparada à amostra de tecido miocárdico coletada após pinçamento aórtico, mas essa diminuição não foi estatisticamente significativa (p=0,7263, Figura 2E ).

A expressão de CASPASE 3 no grupo CS foi significativamente menor na amostra de tecido coletada após pinçamento aórtico (p=0,0188, Figura 3B ). As expressões dos genes CASPASE 8 e CASPASE 9 foram semelhantes antes e depois do pinçamento aórtico (p=0,8552, p=0,8891). No grupo CC, os níveis de expressão gênica de CASPASE 3, CASPASE 8 e CASPASE 9 não foram significativamente diferentes em amostras de tecido coletadas após pinçamento aórtico (p=0,7354, p=0,0758, p=0,4128, respectivamente).

– Resultados de Western Blot. A. Imagens de Western Blot de membrana de marcadores apoptóticos no grupo Cardioplegia Sanguínea e Cardioplegia Custodiol. B. Gráficos do nível de expressão dos genes das Caspases 3, 8 e 9 nas amostras de tecido miocárdico dos grupos (n=15, BO: Antes do pinçamento aórtico, AO: após liberação do pinçamento aórtico). (*p<0,05).

Quando os níveis de expressão de mRNA de amostras de tecido miocárdico foram comparados antes e depois do pinçamento aórtico, os níveis de expressão gênica de BECLIN e LC3 não foram diferentes no grupo CS em comparação ao grupo CC ( Tabela 2 ).

– Comparação dos níveis de expressão gênica entre amostras de tecido miocárdico de pacientes com Cardioplegia Sanguínea e Cardioplegia Custodiol
Genes CS (BO) (n=15) CC (BO) (n=15) CS (AO) (n=15) CC (AO) (n=15) valor-p (BO/AO)
BECLIN 0,8(0,3-1,6) 0,6(0,5-1,4) 0,6(0,3-0,9) 0,5(0,3-1) 0,8943/ 0,8123
LC3 1(0,6-1,3) 0,6(0,4-1,1) 0,5(0,4-0,7) 0,6(0,3-1,4) 0,3821/ 0,6934

Os valores pré-operatórios (BO) dos grupos CS e CC foram comparados com o teste de Mann-Whitney. Os valores pós-operatórios (AO) dos grupos CS e CC foram comparados com o teste de Mann-Whitney. Os dados são expressos em mediana (1º e 3º trimestre). CS: cardioplegia sanguínea; CC: cardioplegia custodiol; BO: antes do pinçamento aórtico; AO: após liberar o pinçamento aórtico.

 Resultados do estudo de Western Blot em tecido miocárdico

O nível de expressão da proteína Beclin em amostras de tecido miocárdico coletadas após pinçamento aórtico mostrou-se aumentado, e esse valor foi estatisticamente significativo em comparação com amostras de tecido coletadas antes do pinçamento aórtico no grupo CS (p<0,05) ( Figura 2C, E ). Os níveis de expressão da proteína LC3-II diminuíram após o pinçamento aórtico, mas a diferença não foi significativa. Não houve diferença nos níveis de expressão da proteína Beclin na amostra de tecido miocárdico coletada antes do pinçamento aórtico de pacientes com CC (p>0,05), mas a expressão da proteína LC3-II foi estatisticamente significativa e diminuiu após o pinçamento aórtico (p< 0,05) ( Figura 2C, 2E ). Em ambos os grupos, os níveis de proteínas das Caspases 3, 8 e 9 clivadas diminuíram em amostras de tecido coletadas após pinçamento aórtico. Os níveis de proteína total de Caspase 3, 8 e 9 não foram alterados entre os grupos ( Figura 3A, 3B ).

 Discussão

Este estudo investigou os efeitos dos principais marcadores de autofagia e apoptose-Caspases, LC3 e Beclin, no miocárdio. Além disso, foi discutida neste estudo a questão da extensão da proteção oferecida por duas soluções cardioplégicas diferentes usadas para proteção miocárdica durante a cirurgia. Detectamos diferenças na abundância de proteínas-chave da autofagia no miocárdio atrial direito de pacientes submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio. Ao nosso conhecimento, este é o primeiro estudo deste tipo na literatura. Numerosos estudos estão sendo conduzidos para a manutenção da homeostase durante a cirurgia cardíaca. Os estudos mais notáveis neste campo estão relacionados a marcadores inflamatórios e vias gênicas além dos mecanismos de morte celular, como autofagia e apoptose.8

Os níveis de troponina e CK-MB indicam necrose e isquemia nos tecidos. A elevação desses dados clínicos também é proporcional ao grau de isquemia. Apenas uma diferença no nível de troponina foi encontrada entre os grupos a partir da comparação dos dados bioquímicos no soro (p=0,0072). Tanto a TnT quanto a CK-MB são os marcadores mais importantes de dano miocárdico. Este estudo investigou os níveis de proteção cardíaca de duas soluções de cardioplegia para determinar o dano miocárdico no pós-operatório imediato com esses marcadores. A diferença na troponina pode surgir em um pequeno número de pacientes; considera-se que o efeito exato pode ser obtido com um número maior de pacientes. Além disso, pode ser útil planejar estudos maiores para determinar a causa da diferenciação para revelar dano estrutural no miocárdio no nível de troponina.

Prathanee et al.,18 conduziram um estudo retrospectivo de caso-controle em pacientes com CRM. Os pacientes foram divididos em dois grupos, aplicando CS frio e solução de cardioplegia Custodiol-HTK. Houve significativamente mais fibrilação ventricular espontânea após a liberação do clampeamento cruzado no grupo Custodiol. O desfecho clínico de doses únicas de solução de CC anterógrada em cirurgia de revascularização miocárdica protegeu igualmente o CS anterógrado frio repetitivo.18 No total, foram identificados 1.900 procedimentos cirúrgicos cardíacos, dos quais 126 (7%) utilizaram o Custodiol e 1.774 (93%) utilizaram a CS como principal agente cardioplégico no estudo de Viana et al. Os resultados mostraram que Custodiol pode ser conveniente e pelo menos tão seguro quanto a CS para proteção miocárdica em cirurgia cardíaca complexa.1 Elcik et al.,17 mostraram que os resultados do mRNA sanguíneo deram melhores resultados na cardioplegia sanguínea. Nesse estudo, ao contrário do nosso estudo, o fato de os tempos de pinçamento serem diferentes e mais longos também podem motivar a comparação dos dados no sangue. Isso pode ser devido aos curtos tempos de clampeamento e à falta de isquemia clara completa no tecido miocárdico.17

A apoptose pode ser responsável por uma quantidade significativa de morte de cardiomiócitos, contribuindo para o desenvolvimento e progressão da insuficiência cardíaca. Os dados disponíveis mostram que a apoptose dos cardiomiócitos é controversa.13 , 19 Em cirurgia cardíaca congênita, Busro et al. usaram um grupo controle composto por 55 pacientes com apenas histidina-triptofano-cetoglutarato e um grupo de tratamento de 54 pacientes com histidina-triptofano-cetoglutarato e cardioplegia terminal de sangue quente. Uma técnica de imuno-histoquímica foi usada para examinar Caspase 3 em amostras do átrio direito. Os resultados de troponina I e Caspase-3 não diferiram significativamente entre os grupos.20 Dois tecidos do átrio direito foram obtidos de 24 pacientes submetidos à revascularização do miocárdio no início da enxertia e 10 minutos após a liberação da pinça aórtica. Caspase 9 e Caspase 8 ativas foram detectadas por imunocoloração para identificar as vias de indução da apoptose. Os investigadores concluíram que a parada cardioplégica com sangue quente induz apoptose de cardiomiócitos mediada por mitocôndrias.10 Em nosso grupo CS, a expressão da Caspase 3 diminuiu no tecido removido após pinçamento aórtico, e esse dado foi estatisticamente significativo. No grupo CC, as expressões de Caspase 8 e Caspase 9 diminuíram após o pinçamento aórtico, mas isso foi insignificante. Isso indica que o CC suprime a morte celular apoptótica e acredita-se que proteja contra a morte celular apoptótica. Além disso, pensamos que a via intrínseca pode ser desencadeada no grupo CS, e ambas as vias intrínseca e extrínseca são desencadeadas no grupo CC. Conforme resumido acima, não há estudos na literatura comparando as soluções cardioplégicas utilizadas para proteção miocárdica em nível molecular. Este é o primeiro estudo a investigar o mecanismo da apoptose no tecido miocárdico, tanto no nível do transcriptoma quanto no nível da proteína.

Garcia et al. estudaram se a autofagia atrial é ativada em pacientes que desenvolvem fibrilação atrial (FAPO) pós-operatória. LC3B foi acentuadamente reduzido em pacientes com FAPO. A autofagia cardíaca prejudicada está presente em pacientes que desenvolvem FAPO após cirurgia de revascularização do miocárdio.21 Foi demonstrado que LC3 e BECLIN não foram diferenciados no tecido miocárdico ventricular esquerdo de pacientes submetidos à cirurgia de circulação extracorpórea. Quando o mecanismo de autofagia está avançado, as proteínas autofágicas também são degradadas, explicando potencialmente a depleção de proteínas autofágicas durante CEC mais longa.7 Apoiando essa informação, os níveis de proteína e transcrição de proteínas autofágicas (Beclin-1 e LC3-II) também diminuíram na falha miocárdio do ventrículo esquerdo (VE) de pacientes com cardiomiopatia dilatada idiopática após explantação de um dispositivo de assistência do VE.22 Foi relatado na literatura que o mecanismo de autofagia desempenha um papel significativo na proteção do miocárdio. Este estudo examinou os mRNAs e a expressão de proteínas de Caspases, LC3 e Beclin no tecido do miocárdio durante a cirurgia de revascularização do miocárdio para determinar quaisquer diferenças entre as duas soluções cardioprotetoras (Cardioplegia sanguínea versus cardioplegia Custodiol). Nos grupos submetidos à cardioplegia sanguínea e à cardioplegia Custodiol, foi feita uma comparação na proteção do miocárdio via mecanismo de autofagia. As expressões dos genes LC3 e Beclin não foram estatisticamente significativas em ambos os grupos neste estudo. Além disso, de acordo com o resultado do Western Blot, a expressão da proteína Beclin foi maior nos grupos de CS e CC. Além disso, Beclin tem um papel anti-autofágico na interação com BCL-2; portanto, pode nem sempre atuar com LC3. Afirma-se também que Beclin tem um papel protetor contra doenças cardíacas em outros mecanismos dentro da célula (supressão tumoral, desenvolvimento, imunidade), além de seu papel na autofagia.23 , 24 Além disso, descobriu-se que Beclin é armazenado em diferentes áreas dentro do celular.22 Assim, podemos considerar que o aumento da expressão da proteína é um indicador de que a Beclin está armazenada na célula, embora a expressão do mRNA da Beclin tenha diminuído no pós-operatório. Não houve diferença quanto à proteção miocárdica na comparação entre as duas soluções cardioplégicas. Nem os grupos de cardioplegia de sangue nem de Custodiol mostraram qualquer diferença na proteção miocárdica em relação aos marcadores autofágicos.

A busca na literatura indicou que o número de estudos sobre amostras de miocárdio colhidas durante a cirurgia é escasso. O número de estudos realizados com transcriptoma e Western Blot é muito pequeno. Além disso, não há nenhum estudo sobre o uso e comparação de duas soluções cardioplégicas diferentes semelhante a este estudo. Portanto, este estudo se diferencia de outros devido a esses aspectos. Nossos achados foram relacionados à proteção miocárdica no pós-operatório imediato. Seria conveniente planejar novos estudos que suportassem os resultados de nosso estudo com um número maior de pacientes nos grupos. A maior limitação deste estudo é o pequeno número de pacientes. Os resultados podem ser diferentes com um estudo multicêntrico. A segunda grande limitação são os curtos tempos de pinçamento cruzado. Longos tempos de pinçamento exigirão cardioplegia adicional, e esses resultados podem variar.

 Conclusão

Este estudo pode iluminar estudos futuros sobre o tratamento cirúrgico das cardiopatias e contribuir para o desenvolvimento científico no tratamento dessas doenças. A autofagia tem efeitos bidirecionais como mecanismo de morte celular. Não encontramos nenhuma diferença entre as soluções CS e CC usadas neste estudo ao examinar a morte ou sobrevivência celular. Por isso, acreditamos que ambas as soluções cardioprotetoras podem ser utilizadas durante as operações, e os resultados do nosso estudo podem fazer a diferença em futuras cirurgias cardíacas com esse método.

 Agradecimentos

Este estudo foi financiado pelo Fundo de Pesquisa da Universidade Erciyes (Número do Projeto: TCD-2016-6339).

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Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Erciyes University sob o número de protocolo 2015/360. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.

Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado por Erciyes University (Project number: TCD-2016-6339).

 Original Article Comparison of Cardioplegic Solutions in Coronary Bypass Surgery Over Autophagy and Apoptosis Mechanisms 0000-0002-5644-5442 Sener Elif Funda Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 2 0000-0002-0711-4014 Hamurcu Zuhal Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 2 0000-0001-5806-8241 Taheri Serpil Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 2 0000-0002-1347-0939 Tahtasakal Reyhan Acquisition of data Writing of the manuscript 1 2 0000-0002-8879-1112 Delibasi Nesrin Acquisition of data Writing of the manuscript 3 0000-0003-0992-1415 Elcik Deniz Statistical analysis Critical revision of the manuscript for important intellectual content 4 0000-0002-4597-6811 Mehmetbeyoglu Ecmel Acquisition of data Statistical analysis 2 0000-0001-8877-2547 Tuncay Aydin Acquisition of data Writing of the manuscript 5 0000-0003-2035-3981 Dal Fatma Acquisition of data 2 0000-0002-1228-1298 Bayram Keziban Korkmaz Acquisition of data 6 0000-0001-6438-8153 Gunes Isın Acquisition of data Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for important intellectual content 7 0000-0003-2980-8364 Emirogullari Omer Naci Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Obtaining financing Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for important intellectual content 5 Turkey Erciyes University Medical Faculty Department of Medical Biology, Kayseri – Turkey Turkey Erciyes University Genome and Stem Cell Center (GENKOK), Kayseri – Turkey Turkey Cappadocia University Cappadocia Vocational College Department of Medical Laboratory Techniques, Nevsehir – Turkey Turkey Erciyes University Medical Faculty Department of Cardiology, Kayseri – Turkey Turkey Erciyes University Medical Faculty Department of Cardiovascular Surgery, Kayseri – Turkey Turkey Ankara Yildirim Beyazit University Medical Faculty Department of Medical Genetics, Ankara – Turkey Turkey Erciyes University Medical Faculty Department of Anesthesiology and Reanimation, Kayseri – Turkey Mailing Address: Elif Funda Sener • Erciyes University – Erciyes University Medical Faculty Departmen of Medical Biology Erciyes University Medical Faculty Departmen of Medical Biology Talas 38280 – Turkey E-mail: efefunda@yahoo.com

Potential conflict of interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background

Coronary artery disease (CAD) due to myocardial ischemia causes permanent loss of heart tissue.

 Objectives

We aimed to demonstrate the possible damage to the myocardium at the molecular level through the mechanisms of autophagy and apoptosis in coronary bypass surgery patients.

 Methods

One group was administered a Custodiol cardioplegia solution, and the other group was administered a Blood cardioplegia solution. Two myocardial samples were collected from each patient during the operation, just before cardiac arrest and after the aortic cross-clamp was released. The expressions of autophagy and apoptosis markers were evaluated. The level of statistical significance adopted was 5%.

 Results

The expression of the BECLIN gene was significant in the myocardial tissues in the BC group (p=0.0078). CASPASE 3, 8, and 9 gene expression levels were significantly lower in the CC group. Postoperative TnT levels were significantly different between the groups (p=0.0072). CASPASE 8 and CASPASE 9 gene expressions were similar before and after aortic cross-clamping (p=0.8552, p=0.8891). In the CC group, CASPASE 3, CASPASE 8, and CASPASE 9 gene expression levels were not found to be significantly different in tissue samples taken after aortic cross-clamping (p=0.7354, p=0.0758, p=0.4128, respectively).

 Conclusions

With our findings, we believe that CC and BC solutions do not have a significant difference in terms of myocardial protection during bypass operations.

 Coronary Artery Disease Myocardial Revascularization Myocardial Ischemia Cardioplegic Solutions Autophagy Apoptosis Introduction

Cardioplegia solutions are used to arrest the heart and reduce ischemic damage in the myocardium when coronary blood flow is stopped during cardiac operations.1 , 2 Since Custodiol and blood cardioplegia are highly effective solutions, they have been used for a long time in open-heart surgeries. During cardiopulmonary bypass (CPB), the heart is arrested and protected with cardioplegia solutions. This period is associated with oxygen deprivation; the heart is ischemic during CPB. The heart is reperfused at the end of CPB, and cardiac action continues.3 However, CPB may lead to further myocardial damage caused by global reperfusion and cell death through the induction of myocardial autophagy and apoptosis.4

Autophagy is thought to play an absolute role in heart tissue during ischemia/reperfusion. While induction of autophagy in cardiomyocytes during ischemia has a protective effect, autophagy induced during reperfusion is thought to lead to cardiomyocyte death. Under normal conditions, metabolic stress typically stimulates apoptosis. However, in cells where the mechanism of apoptosis is impaired, the cell continues to live under hypoxic conditions. The survival of these cells is due to autophagy, but when both apoptosis and autophagy are suppressed, cell viability fails and dies.5 Autophagy occurs at basal levels but can be further induced by stress, such as hypoxia and nutrient depletion.6 The protein LC3B is an important player in the autophagic process. The activation of autophagy is reflected by increases in the abundance of key proteins of the autophagy-related genes (ATG5-12), light chain 3 (LC3), Beclin-1, and p62.7 Myocardial regions with increased autophagic activity exhibit fewer apoptotic cells, suggesting that the stimulation of autophagy may prevent apoptosis.8

Apoptosis is required during heart development and has long been associated with many cardiovascular diseases.9 Apoptosis is mediated by activating caspases normally found as inactive zymogens in the cell.10 Caspases can also play roles in cell proliferation, differentiation, cell cycle control, and survival pathways. The extrinsic apoptotic pathway is initiated by binding ligands to cell surface receptors that recruit and activate Caspase 8, which activates the key executioner Caspase 3. Caspase 3, one of the most important executioner caspases in the convergence of the intrinsic and extrinsic apoptotic pathways, is the main indicator of apoptosis.11 As the initiator caspase in the death receptor (extrinsic) apoptosis pathway, Caspase 8 proteolytically activates downstream caspases and BID. The intrinsic pathway is initiated by cytochrome c release from the mitochondrion. Caspase 9, the initiator caspase in the mitochondrial (intrinsic) apoptotic pathway, also participates in most differentiation processes in which caspase 3 has been implicated.12 , 13 Apoptotic signaling in the cardiomyocytes of human subjects is unknown.13 Cardiomyocyte apoptosis is triggered by numerous signaling pathways and regulated by multi-complex intrinsic and extrinsic ligands.8 , 14 , 15

This study aims to explain how levels of Custodiol cardioplegia (CC) and blood cardioplegia (BC) solutions used to protect the myocardium during coronary bypass surgery activate the mechanisms of autophagy and apoptosis at the level of mRNA and protein. Thus, we tried to evaluate intraoperative and early postoperative myocardial damage through autophagy and apoptosis.16

 Material and Methods Patient Selection

A total of 30 CBP patients were included in the study ( Central Illustration ). This study is case-controlled. Patients were divided into two groups according to the order of hospitalization. The patients were divided into two groups paying attention to the type of operation procedure, age, and gender. We applied BC to one group and CC to the other group. ( Figure 1 ). Both groups consisted of 15 patients. Considering our previous work, the sample size used in the study was for convenience.17 Coronary bypass surgery was performed with these cardioplegic solutions. All patients were taking aspirin. Nine patients in the BC group and 11 patients in the CC group were using β-blocker; 3 patients in the BC group and 1 patient in the CC group were using Ca channel blockers; 4 patients in the BC group and 2 patients in the CC group were taking oral diabetic medication; 1 patient in the BC group and 3 patients in the CC group were using angiotensin-converting enzyme inhibitor; 1 patient in the CC group was using α and β blockers. The healthy control group was not used because the patients were compared within and between the groups. All patients registered by the Erciyes University Department of Cardiovascular Surgery were evaluated for this study. Patients with acute coronary syndrome, emergency coronary artery bypass grafting (CABG), chronic renal failure, previous heart surgery history, infective endocarditis, peripheral vascular diseases, and chronic inflammatory disease were excluded from the study. The ethical committee of Erciyes University approved this study. Written informed consent forms were received from the patients. This study complied with the ethical statements in the Helsinki Declaration.

: Comparison of Cardioplegic Solutions in Coronary Bypass Surgery Over Autophagy and Apoptosis Mechanisms

– Flow diagram of the patient selection in the study. PCR: polymerase chain reaction; RNA: ribonucleic acid.

Anesthesia management

The same anesthesia protocol was applied to all patients. Five-channel ECG, pulse oximetry, noninvasive blood pressure, cerebral oximetry, and entropy monitoring were performed on the patients taken to the operating room. After 1.5 mg dormicum and 50 microgram fentanyl push, an invasive arterial catheter was placed in the radial artery, and an invasive blood pressure measurement was performed. After preoxygenation, 1 mg/kg propofol, 10 micrograms/kg fentanyl, and 1 mg/kg rocuronium were used in the induction. Patients with adequate entropy values were intubated. The ultrasound-guided central venous catheter was inserted. Tranexamic acid infusion at a dose of 15 mg/kg in 1 hour was followed by maintenance infused at 1.5 mg/kg/h throughout the case. Ten micrograms/kg/h fentanyl, 4 mg/kg/h propofol, and 1 mg/kg/h rocuronium were used in anesthesia management. The depth of anesthesia was adjusted between 45 and 60 entropy; if necessary, desflurane was used as an inhalation agent. Ventilator settings were TV 6 ml/kg, respiratory rate 12/min, PEEP of 5 cm/water volume, with volume control mode. If there was a decrease in cerebral oximetry, necessary interventions were performed.

 Surgical approach

In all cases, the operative procedure included median sternotomy and cardiopulmonary bypass with a membrane oxygenator. Myocardial protection consisted of moderate hypothermia (30–32°C), topical cooling with cold saline solution, and cold blood or CC (4–10°C) administered in an antegrade fashion. CC [1000 cc, containing histidine 180 (mmol/L), tryptophan (2 mmol/L), mannitol (30 mmol/L), KCl (9 mmol/L), NaCl (15 mMol/L)] was given in a single dose. BC [containing 700 cc blood, 2 ampules of HCO3(840 mg), 1 ampule of Mg (1500 mg), 2 ampules of KCl (750 mg)] doses were repeated every 20 minutes. The last dose was given warm (37°C) just before releasing the aortic cross-clamp. All distal anastomoses were performed first, after cross-clamping the aorta and infusion of the cardioplegic solution. The proximal anastomoses were done after the release of the cross-clamp.

 Tissue sample preparation

Two myocardial tissue samples from the same site on the right atrial appendage were taken from each patient immediately before aortic cross-clamping and after releasing the clamp (end of the cardiopulmonary bypass). Tissue samples were then frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C.

 RNA isolation and gene expression studies

Two myocardial tissue samples (pre and post-conditioning) were taken from each patient, and total RNA was isolated using TRIZOL reagent (Roche, Germany). The quantity and quality of RNA samples were measured with a BioSpec-Nano Spectrophotometer. RNAs were stored at −80°C until use. mRNA expression levels of Beta-actin ( ACTB ), Beclin, LC3, Caspase 3, Caspase 8, and Caspase 9 genes were determined using LightCycler 480 II (Roche, Germany) Real-Time PCR. Each sample was run in duplicate. The expression levels of the genes were calculated by using the 2−Ctmethod.

 Protein isolation and Western Blot

Protein isolation was performed from myocardial tissue samples.16 The total protein concentration for each sample was determined with a detergent-compatible protein assay kit (DC kit; Bio-Rad, Hercules, CA). Aliquots containing 40 μg of total protein from each sample were analyzed by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis with a 4–20% gradient for protein separation and electrotransferred to polyvinylidene difluoride membranes. The membranes were blocked with a blocking buffer (0.1 Triton X-100 with 5% dry milk in Tris-buffered saline–Tween 20) [TBS-T] for 60 min. After being washed with TBS-T, the membranes were probed with the following primary antibodies: LC3, Beclin-1, Caspase 3, Caspase 8, and Caspase 9 (Cell Signaling Technology). The remaining stages of the western blot were performed as stated in the study of Hamurcu et al.16 The blots were then visualized with a Chemidoc MP Imaging System (Biorad) and quantified with a densitometer using the imager application program (Bio-Rad Image Lab 5).

 Statistical analysis

Categorical variables were presented as numbers and percentages, and group comparisons were performed using chi-square, Yates correction, and Fisher tests. The conformity of the data to the normal distribution was evaluated with histogram, q-q plots, and Shapiro-Wilk test. Intergroup comparisons of numerical variables were performed with the unpaired Student t-tests or Mann-Whitney U tests. The homogeneity of variance was evaluated with Levene’s test. Two dependent samples and the Wilcoxon test were applied to compare the differences between mRNA gene expression results and protein expression levels in tissue samples taken pre and post-operatively. Two independent samples and the Mann-Whitney U test were applied to compare BC and CC group data. Data were performed using GraphPad Prism 8.0. (Version 8.0.1, San Diego, CA, USA) software. P values of <5% were considered statistically significant.

 Results Patient characteristics and laboratory findings

Fifteen patients were included in the BC (BC) and CC groups. Males (9, 60%) and females (6, 40%) were equal in both groups. The mean age of the BC group was 59.9 ± 9.8 years, and the CC group was 52.7 ± 19.5 years; this difference was not found significant (p=0.2135). Clinical and surgical characteristics of the patients are shown in Table 1 , and laboratory findings are shown in Figure 2 (A, B) .

– Clinical and demographical features of the study group
Clinical Findings Blood Cardioplegia (n=15, mean±SD) Custodiol Cardioplegia (n=15, mean±SD) p-value
Age (mean year±SEM) 59.9±9.8 52.7±19.5 p=0.5
Gender (Male n,%) 9 (60%) 9 (60%) p=0.645
Diabetus Mellitus (n,%) 4 (27%) 2 (13%) p=0.075
Hypertension (n,%) 4 (27%) 2 (13%) p=0.075
Smoking (n,%) 5 (33%) 7 (47%) p=0.224
Height (cm) 164±9.5 167.5±10.1 p=0.7
Weight (kg) 76.5±12.4 76.2±15 p>0.9999
BSA (m2) 1.8±0.2 1.8±2 p>0.9999
Hemodynamic parameters
Systolic blood pressure 121.8 ± 16.5 123.8 ± 19.1 p=0.664
Diastolic blood pressure 79.2 ± 11.6 77.7 ± 13.1 p=0.778
Echocardiography
Ejection fraction 54.7 ± 5.4 55.7 ± 6.3 p=0.647
Systolic Diameters 3.49 ± 0.56 3.32 ± 0.3 p=0.310
Diastolic Diameters 5.18 ± 0.72 4.99 ± 0.44 p=0.379
Cross Clamp duration (mean min±SEM) 58.4±8.6 63.7±36.4 p=0.9931
Total bypass duration (mean min±SEM) 119±28 134.5±53.9 p=0.9423
TnT (ng/mL) 0.8 (0.5-1.6) 0.2 (0.16-1.8) p=0.0072
CK-MB (u/L) 60.3 (39.5-145) 41 (28-50) p=0.0731
Surgery
CABGX1 (n) 2 2
CABGX2 (n) 2 1
CABGX3 (n) 6 6
CABGX4 (n) 5 6

CABGxN: Number of bypass GRAFT; BSA: Body surface area; SD: standard deviation; SEM: standard error of mean.

– A, B) Comparison of the postoperative laboratory findings of the patients in Custodiol Cardioplegia and Blood Cardioplegia groups. A) TnT levels were significantly differentiated between the groups (p=0.0072). B) CK-MB levels were not different between the groups (p=0.0731). Figures 2C-E) Expression graphs. C) Western blot membrane images of autophagy markers in Blood Cardioplegia and Custodiol Cardioplegia group. D) Beclin and LC3 gene expression level graphs in myocardial tissue samples in the groups (n=15, BO: Before aortic cross-clamping, AO: after releasing aortic cross-clamping). (*p<0.05). E) Protein expressions of Beclin and LC3 in both groups.

CK-MB and TnT levels were measured in the patient’s preoperative and postoperative blood samples for biochemical parameters and compared in CC and BC groups ( Figure 2A, 2B ). Preoperative levels of CK-MB and TnT were not significantly different. Our data showed that postoperative TnT levels significantly differed between the groups (p=0.0072).

 Autophagic and apoptotic gene expression results in myocardial tissue

BECLIN gene expression in myocardial tissue samples was significant and decreased after aortic cross-clamping in the BC group ( Figure 2D ) (p=0.0078). LC3 gene expression decreased after aortic cross-clamping but was insignificant ( Figure 2D ). BECLIN gene expression in myocardial tissue samples taken after aortic cross-clamping was not differentiated from myocardial tissue samples taken before aortic cross-clamping in the CC group. LC3 gene expression in the myocardial tissue sample taken before aortic cross-clamping was found to be decreased when compared to the myocardial tissue sample taken after aortic cross-clamping, but this decrease was not statistically significant (p=0.7263, Figure 2E ).

The expression of CASPASE 3 in the BC group was significantly lower in the tissue sample taken after aortic cross-clamping (p=0.0188, Figure 3B ). CASPASE 8 and CASPASE 9 gene expressions were similar before and after aortic cross-clamping (p=0.8552, p=0.8891). In the CC group, CASPASE 3, CASPASE 8, and CASPASE 9 gene expression levels were not found to be significantly different in tissue samples taken after aortic cross-clamping (p=0.7354, p=0.0758, p=0.4128, respectively).

– Western Blot Results. A) Western blot membrane images of apoptotic markers in Blood Cardioplegia and Custodiol Cardioplegia group. B) Caspase 3, 8, and 9 gene expression level graphs in myocardial tissue samples in the groups (n=15, BO: Before aortic cross-clamping, AO: after releasing aortic cross-clamping). (*p<0.05).

When mRNA expression levels of myocardial tissue samples were compared before and after aortic cross-clamping, BECLIN and LC3 mRNA gene expression levels were not different in the BC group compared to the CC group ( Table 2 ).

– Comparison of gene expression levels between myocardial tissue samples from patients with Blood Cardioplegia and Custodiol Cardioplegia
Genes BC (BO) (n=15) CC (BO) (n=15) BC (AO) (n=15) CC (AO) (n=15) p-value (BO/AO)
BECLIN 0.8(0.3-1.6) 0.6(0.5-1.4) 0.6(0.3-0.9) 0.5(0.3-1) 0.8943/ 0.8123
LC3 1(0.6-1.3) 0.6(0.4-1.1) 0.5(0.4-0.7) 0.6(0.3-1.4) 0.3821/ 0.6934

The BC and CC groups’ preoperative values (BO) were compared with the Mann-Whitney test. The BC and CC groups’ postoperative values (AO) were compared with the Mann-Whitney test. Data are expressed as median (1st and 3rd quarter). BC: blood cardioplegia; CC: custodiol cardioplegia; BO: before aortic cross-clamping; AO: after releasing aortic cross-clamping.

 Western Blot Study results in myocardial tissue

Beclin protein expression level in myocardial tissue samples taken after aortic cross-clamping was found to be increased, and this value was statistically significant compared to tissue samples taken before aortic cross-clamping in the BC group (p<0.05) ( Figure 2C, E ). LC3-II protein expression levels were found to be decreased after aortic cross-clamping, but the difference was not significant. There was no difference in the expression levels of Beclin protein in the myocardial tissue sample taken before aortic cross-clamping of CC patients (p>0.05), but LC3-II protein expression was statistically significant and decreased after aortic cross-clamping (p<0.05) ( Figure 2C, 2E ). In both groups, the protein levels of cleaved Caspases 3, 8, and 9 were found to be decreased in tissue samples taken after aortic cross-clamping. Total Caspase 3, 8, and 9 protein levels were not changed between the groups ( Figure 3A, 3B ).

 Discussion

This study investigated the effects of the main autophagy and apoptosis markers-caspases, LC3 and Beclin, on the myocardium. Additionally, the question regarding the extent of protection provided by two different cardioplegic solutions used for myocardial protection during surgery was discussed in this study. We detected differences in the abundance of key autophagy proteins in the right atrial myocardium of patients undergoing coronary bypass surgery. To our knowledge, this is the first study of this type in the literature. Numerous studies are being conducted for the continuation of homeostasis during heart surgery. The most remarkable studies in this field are related to inflammatory markers and gene pathways other than cell death mechanisms such as autophagy and apoptosis.8

Troponin and CK-MB levels indicate necrosis and ischemia within tissues. The elevation of such clinical data is also proportional to the degree of ischemia. Only a difference in the troponin level was found between the groups from the comparison of biochemical data in serum (p=0.0072). Both TnT and CK-MB are the most important markers of myocardial damage. This study investigated the heart protection levels of two cardioplegia solutions to determine myocardial damage in the early postoperative period with these markers. The difference in troponin may arise in a small number of patients; it is considered that the exact effect may be obtained with a larger number of patients. In addition, it may be useful to plan larger and different studies for determining the cause of differentiation to reveal structural damage on the myocardium at the troponin level.

Prathanee et al.18 conducted a retrospective case-control study in CABG patients. The patients were divided into two groups, applying cold BC and Custodiol-HTK cardioplegia solution. There was significantly more spontaneous ventricular fibrillation after cross-clamping was released in the Custodiol group. The clinical outcome of single doses of antegrade CC solution in CABG surgery protected myocardium equally and repetitive antegrade cold BC.18 In total, 1.900 cardiac surgical procedures were identified, of which 126 (7%) utilized Custodiol and 1.774 (93%) used BC as the primary cardioplegic agent in Viana et al.’s study. The results showed that Custodiol might be convenient and at least as safe as BC for myocardial protection in complex cardiac surgery.1 Elcik et al.17 showed that blood mRNA results gave better results in BC. In this study, unlike our study, the fact that the cross-clamp times were different and longer may also be the comparison of the data in the blood. This may be due to the short cross-clamp times and lack of complete clear ischemia in myocardial tissue.17

Apoptosis may be responsible for a significant amount of cardiomyocyte death, contributing to heart failure’s development and progression. The available data have shown that cardiomyocyte apoptosis is controversial.13 , 19 In congenital cardiac surgery, Busro et al. used a control group consisting of 55 patients with only histidine-tryptophan-ketoglutarate and a treatment group of 54 patients with histidine-tryptophan-ketoglutarate and terminal warm BC. An immunohistochemistry technique was used to examine Caspase 3 in right atrial samples. The results of troponin I and Caspase-3 did not differ significantly between the groups.20 Two right atrium tissues were obtained from 24 patients undergoing coronary artery bypass grafting at the start of grafting and 10 minutes after the release of the aortic clamp. Active Caspase 9 and Caspase 8 were detected by immunostaining to identify the pathways of apoptosis induction. The investigators concluded that warm blood cardioplegic arrest induces mitochondria-mediated cardiomyocyte apoptosis.10 In our BC group, Caspase 3 expression decreased in the tissue removed after aortic cross-clamp, and this data was statistically significant. In the CC group, Caspase 8 and Caspase 9 expressions decreased after the aortic cross-clamp, but this was insignificant. This indicates that CC suppresses apoptotic cell death and is thought to protect against apoptotic cell death. Besides, we think the intrinsic pathway may be triggered in the BC group, and both intrinsic and extrinsic pathways are triggered in the CC group. As summarized above, no studies in the literature compared the cardioplegic solutions used for myocardial protection at the molecular level. This is the first study to investigate the mechanism of apoptosis in myocardial tissue at both transcriptome and protein levels.

Garcia et al. studied whether atrial autophagy is activated in patients who develop postoperative atrial fibrillation (POAF). LC3B was markedly reduced in POAF patients. Impaired cardiac autophagy is present in patients developing POAF after coronary artery bypass surgery.21 It was shown that LC3 and BECLIN were not differentiated in left ventricular myocardial tissue from patients undergoing cardiopulmonary bypass surgery. When the autophagy mechanism is advanced, autophagic proteins are also degraded, potentially explaining the depletion of autophagic proteins during longer CPB.7 Supporting this information, protein and transcript levels of autophagic proteins (Beclin-1 and LC3-II) were also decreased in failing left ventricular (LV) myocardium of patients with idiopathic dilated cardiomyopathy after explantation of an LV assist device.22 It was reported in the literature that the autophagy mechanism plays a significant role in the protection of the myocardium. This study examined mRNAs and protein expression of Caspases, LC3, and Beclin in myocardial tissue during coronary bypass surgery to determine any differences between the two cardioprotective solutions (BC versus CC). In groups undergoing BC and CC, a comparison was made in the myocardium protection via the autophagy mechanism. The LC3 and Beclin gene expressions were not statistically significant in both groups in this study. Moreover, according to the western blot result, Beclin protein expression was higher in the groups of BC and CC. Furthermore, Beclin has an anti-autophagic role in interaction with BCL-2; therefore, it may not always act with LC3. It is also stated that Beclin has a protective role against cardiac diseases in other mechanisms within the cell (tumor suppression, development, immunity) besides its role in autophagy.23 , 24 Also, it was found that Beclin is stored in different areas within the cell.22 Thus, we may consider that the increased protein expression is an indicator that Beclin is stored in the cell even though the mRNA expression of Beclin decreased post-surgery. No difference was observed regarding myocardium protection in comparing the two cardioplegic solutions. Neither blood nor CC groups showed any difference in myocardial protection regarding autophagic markers.

The literature search indicated that the number of studies on myocardium samples taken during surgery is scarce. The number of studies conducted with transcriptome and western blot is very small. Besides, there is no study on the usage and comparison of two different cardioplegic solutions similar to this study. Therefore, this study is differentiated from other studies due to these aspects. Our findings were related to myocardial protection in the early postoperative period. It would be suitable to plan new studies supporting the results of our study with a larger number of patients in the groups. The biggest limitation of this study is the small number of patients. Results may be different with a multicenter study. The second major limitation is the short cross-clamp times. Long cross-clamp times will require additional cardioplegia, and these results may vary.

 Conclusion

This study may enlighten future studies on the surgical treatment of heart diseases and contribute to scientific developments for treating such diseases. Autophagy has bidirectional effects as a cell death mechanism. We found no difference between BC and CC solutions used in this study from examining cell death or survival. For this reason, we believe that both cardioprotective solutions may be used during operations, and our study results may make a difference in future heart surgeries with this method.

 Acknowledgments

This study was supported by the Research Fund of Erciyes University (Project Number: TCD-2016-6339).

Study association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Erciyes University under the protocol number 2015/360. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.

Sources of funding: This study was partially funded by Erciyes University (Project number: TCD-2016-6339).