Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC 69kkNyPy6v78bJkzFfqqRdt S0066-782X2023000600306 00306 10.36660/abc.20220816 Artigo Original Scaffolds Vasculares Descelularizados Provenientes de Vasos Sanguíneos de Placenta Bovina Oliveira Tarley Santos Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados e Redação do manuscrito Obtenção de dados 1 0000-0001-6405-388X Smirnow Igor Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados e Redação do manuscrito Obtenção de dados 1 Santee Kadija Mohamed Obtenção de dados 1 0000-0003-4979-115X Miglino Maria Angelica Obtenção de financiamento 1 0000-0001-5240-6959 Barreto Rodrigo da Silva Nunes Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados e Redação do manuscrito Obtenção de dados Obtenção de financiamento Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 Departamento de Cirurgia Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Universidade de São Paulo São Paulo SP Brasil Departamento de Cirurgia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP – Brasil Correspondência: Rodrigo da Silva Nunes Barreto • Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Universidade Estadual Paulista (FCAV-UNESP) - Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane s/n. CEP 14884-900, Jaboticabal, SP – Brasil E-mail: rodrigo.barreto@unesp.br

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo

 09 06 2023 2023 120 6 e20220816 23 11 2022 10 02 2023 05 04 2023 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

As doenças associadas ao aparelho circulatório são as principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, implicando a necessidade de implantes vasculares. Assim, a produção de biomateriais vasculares tem se mostrado uma alternativa promissora às terapias utilizadas em estudos e pesquisas relacionados à fisiologia vascular.

 Objetivos

O presente projeto visa ao desenvolvimento artificial de vasos sanguíneos pela recelularização de scaffolds vasculares derivados de vasos placentários bovinos.

 Métodos

A superfície corioalantoide da placenta bovina foi utilizada para produzir biomateriais descelularizados. Para a recelularização, 2,5 x 104 células endoteliais foram semeadas acima de cada fragmento de vaso descelularizado durante três ou sete dias, quando a cultura foi interrompida e os fragmentos foram fixados para análise de adesão celular. Biomateriais descelularizados e recelularizados foram avaliados por histologia básica, microscopia eletrônica de varredura e imuno-histoquímica.

 Resultados

o processo de descelularização produziu vasos que mantiveram a estrutura natural e o conteúdo de elastina, e não foram observadas células e gDNA remanescentes. Além disso, células precursoras endoteliais se ligaram ao lúmen e à superfície externa do vaso descelularizado.

 Conclusão

nossos resultados mostram a possibilidade de usos futuros desse biomaterial na medicina cardiovascular, como, por exemplo, no desenvolvimento de vasos artificiais.

 Matriz Extracelular Descelularizada Bioengenharia Vasos Sanguíneos FAPESP 2014/50844-3 Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (bolsa FAPESP nº 2014/50844-3) e parcialmente financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior. Introdução

As doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) têm aumentado principalmente devido ao sedentarismo, alimentação industrializada, ingestão calórica alta, consumo de álcool e tabagismo. Dentre as DCNT, as relacionadas à insuficiência do sistema circulatório são as principais causas de morbidade e mortalidade mundial.1-3 Essa insuficiência é majoritariamente tratada por cirurgia vascular e são necessários vasos viáveis, que geralmente são derivados da dissecção de vasos periféricos autólogos e implantação no local afetado. No entanto, são comumente descritas complicações infecciosas, necrose e deiscência no local da retirada dos vasos. Em alguns casos, coloca-se um stent no vaso lesionado em vez do fragmento do vaso periférico, porém possíveis complicações são fraturas e hiperplasia intimal.4,5

Nesse cenário, avanços significativos foram alcançados pela bioengenharia na produção de novos órgãos funcionais ou funcionalizados, como o desenvolvimento de vasos sanguíneos projetados para dar suporte à vascularização funcional.6-8 Até agora, vasos de pequena escala foram produzidos e a maioria deles é formada a partir de derivados de polímeros sintéticos rígidos.6,9 Por outro lado, vasos projetados que mantenham sua função estrutural e celular por períodos longos ainda não foram produzidos.

Assim, a produção de biomateriais vasculares por recelularização, e especialmente por bioimpressão, tem se mostrado uma alternativa promissora às terapias utilizadas em doenças e estudos relacionados à fisiologia vascular.9,10 Nosso objetivo aqui é produzir biomateriais vasculares derivados de vasos placentários bovinos descelularizados que possam ser usados como sua estrutura tridimensional natural ou como biogéis.

 Materiais e Métodos Amostra e células

Para isolamento dos vasos, placenta bovina com idade estimada de 270 dias de gestação foi obtida em abatedouro. Para os ensaios de citocompatibilidade, duas células progenitoras endoteliais foram utilizadas: saco vitelino canino (SV) e células do saco vitelino canino com superexpressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e da proteína verde fluorescente (eGFP) (SV-VEGF).11 Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, sob o protocolo número 9715100718.

 Protocolo de descelularização

A superfície corioalantóide da placenta bovina foi utilizada para produzir biomateriais descelularizados. O corioalantoide foi individualizado e as artérias umbilicais foram canuladas com cateteres nº 14 e conectadas ao biorreator ORCA (Harvard Aparattus, EUA). Inicialmente, a perfusão foi realizada com solução tampão de fosfato (PBS: 136,9 mM NaCl, 26,8 mM KCl, 14,7 MM KH2PO4 e 8,1 mM Na2HPO4.7H2O; pH 7,2) com volume constante de 0,5 ml/min até completa limpeza do sistema vascular, aproximadamente 24 horas. Em seguida, uma solução de dodecil sulfato de sódio a 0,01% (SDS, Sigma-Aldrich 11767289001) foi perfundida em água destilada também a 0,5ml/min por 24 horas. Posteriormente, a solução foi alterada para SDS 0,1% por dois dias, para 0,25% por um dia, para 0,5% por 1 dia e para 1,0% por um dia. O corioalantoide descelularizado foi então perfundido com Triton X-100 a 1% (#0694-1L, Amresco-Solon, EUA) por três horas. Por fim, foi lavado com PBS por 24 horas, perfazendo um total de 10 dias.

Após a descelularização, todo o sistema vascular da superfície alantocoriônica foi isolado do cotilédone e da membrana. Em seguida, os vasos foram preservados em paraformaldeído (PFA) a 4% para validação da descelularização ou congelados rapidamente para ensaio de citocompatibilidade e produção de hidrogel.

 Validação da descelularização

Para validação da descelularização por análise histológica, as amostras preservadas em PFA foram rotineiramente desidratadas, diafanizadas e embebidas em parafina. Em seguida, foram seccionadas em micrótomo manual (Leica RM2125 RT) em fatias de 5 µm de espessura e transferidas para lâminas histológicas. Para verificar a ausência de núcleos celulares visíveis, as lâminas foram coradas em hematoxilina e eosina (HE) ou 4’,6’-diamino-2-fenil-indol (DAPI) e observadas em microscópio Nikon Eclipse 80l sob luz ou epifluorescência, respectivamente.

Além disso, a validação da descelularização foi realizada pela quantificação do ácido desoxirribonucleico genômico remanescente (gDNA) que foi extraído por precipitação de sal, adaptado de Olerup e Zetterquist,12 conforme descrito por Barreto et al.13

 Ensaio de recelularização

Primeiramente, fragmentos de vasos descelularizados de 4 cm foram esterilizados por lavagem com suplemento de PBS com 2% de antibióticos (penicilina e estreptomicina), seguido de banho de álcool 70% e luz ultravioleta (UV).

Para a recelularização, 2,5 x 104 células SV ou 2,5 x 104 células SV-VEGF foram semeadas acima de cada fragmento de vaso descelularizado durante três ou sete dias, quando a cultura foi interrompida e os fragmentos foram fixados para análise de adesão celular. A cultura foi realizada com meio alfa mínimo essencial (α-MEM) (LGC Biotechnology), suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de estreptomicina/penicilina, sob temperatura de 37 °C e 5% de CO2.

 Validação da recelularização

Para verificar a adesão celular, alguns fragmentos de vasos recelularizados foram corados com DAPI e observados sob microscópio confocal a laser (Olympus Fluo View 1000 - FV1000). Os demais fragmentos foram fixados em Karnovsky (4% PFA e 2,5% glutaraldeído em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2) e posteriormente fixados em tetróxido de ósmio a 1% (SEM R 148- HATFIELD, EUA) por 90 minutos. Eles foram desidratados em uma série crescente de etanol sob agitação, depois passaram por um processo de secagem automatizado (MSCPD 300, Leica) e foram metalizados com ouro (#K550, Emitech-Ashford, Reino Unido). Também foi realizada imuno-histoquímica, consequentemente,13 para verificar a elastina na parede do vaso e VEGF da linha celular SV-VEGF.

 Resultados

Após a descelularização, não foram observados núcleos visíveis nos fragmentos dos vasos nem pela coloração por hematoxilina e eosina (HE) nem pela coloração por DAPI (Figura Central – D2). Além disso, foi quantificado menos de 50 ng de gDNA por mg de vaso descelularizado (Figura 1). Com relação à conservação do arranjo vascular dos vasos da placenta bovina, observou-se, mesmo em vasos de até 5 mm de diâmetro (Figura 1-F), pela microscopia eletrônica de varredura, que os vasos descelularizados apresentavam manutenção estrutural e lúmen poroso (Figura Central – A4).

: <italic>Scaffolds</italic> Vasculares Descelularizados Provenientes de Vasos Sanguíneos de Placenta Bovina Análise de vasos de placenta bovina descelularizada. Hematoxilina eosina, (A1) Vaso nativo, Bar= 20 μm, (^) lúmen: fibras da matriz extracelular coradas em rosa e núcleo celular em roxo; (B1) Descelularizado, Bar= 20 μm, (*) superfície externa: núcleos celulares ausentes; (C-F1) Recelularizado, Bar= 20 μm, (*) superfície externa: (C1), Recelularizado três dias (linha SV), núcleos celulares corados em roxo aderidos à superfície externa do biomaterial; (D1), Recelularizado três dias com células do saco vitelino canino com superexpressão de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e proteína verde fluorescente aumentada (eGFP) (linhagem SV-VEGF), fibras da matriz extracelular coradas em rosa e núcleos celulares em roxo aderidos à superfície externa do biomaterial; (E1), Células do saco vitelino caninas recelularizadas com sete dias (linhagem SV), núcleos celulares corados em roxo aderidos à superfície externa do biomaterial; (F1), Recelularizado sete dias com células (linhagem SV-VEGF), fibras da matriz extracelular coradas em rosa, núcleos celulares em roxo aderidos à superfície externa do biomaterial. (A4) bar = 2 μm, descelularizado: Observe a preservação das fibras da matriz extracelular do biomaterial vascular; Recelularização com três dias de cultura (B4, C4): (B4) bar = 30 μm, com células da VS aderidas à parede do biomaterial vascular; (C4) bar = 10 μm, células SV-VEGF aderidas à parede do biomaterial vascular. Ensaio de imuno-histoquímica: expressão de elastina no biomaterial vascular da superfície corioalantoide bovina nativa e recelularizada com células SV-VEGF. Legenda: Bar=20 µm, (A3) Vaso sanguíneo nativo da superfície corioalantoide da placenta bovina, observe a expressão de elastina em toda a parede vascular; (B3) Vaso sanguíneo nativo da superfície corioalantoide da placenta bovina, controle negativo corado com hematoxilina; (C3) Recelularização de 7 dias de biomaterial vascular placentário bovino com células SV-VEGF, observando a expressão de elastina em toda a parede vascular; (D3) Recelularização de 7 dias de biomaterial vascular placentário bovino com células SV-VEGF, controle negativo corado com hematoxilina. Ensaio de recelularização: Barra 20 µm; (A2-C2) 3 dias de cultivo; (A2) Biomaterial vascular controle descelularizado, observe a ausência de núcleos; (B2) Biomaterial recelularizado com células progenitoras endoteliais (SV) do saco vitelino canino, observe núcleos corados em azul por 4’,6’-diamino-2-fenil-indol (DAPI); (C2) Biomaterial recelularizado com células SV-VEGF, observe núcleos corados em azul por DAPI, eGFP não observada; (D2-F2) 7 dias de cultivo; (D2) controle descelularizado de biomaterial vascular, observe a ausência de núcleos; (E2) Biomaterial recelularizado com células SV, observe núcleos corados em azul por DAPI; (F2) Biomaterial recelularizado com células SV-VEGF, observe núcleos corados em azul por DAPI.

– Descelularização dos vasos placentários bovinos: A: bar = 10 cm, placenta dissecada e artéria e veia umbilical canuladas. B: bar = 10 cm, início do processo de descelularização. C-E: bar = 10 cm, avanço da descelularização. F: bar = 10 cm, conclusão da descelularização, com manutenção da estrutura. G: ácido desoxirribonucleico genômico (gDNA) nos scaffolds vasculares da superfície corioalantoide da placenta bovina descelularizada.

Após a recelularização, mesmo no terceiro dia de cultura, foi possível observar células na superfície e no lúmen do vaso descelularizado; entretanto, visualmente, o número de células aumentou no sétimo dia. Além disso, as células SV-VEGF foram mais numerosas do que as células SV, tanto no terceiro quanto no sétimo dia. Essas células foram observadas pelas colorações HE e DAPI (Figura Central – D1 e F2).

O padrão de distribuição da elastina foi semelhante nos vasos placentários nativos, descelularizados e recelularizados (Figura Central – A3, B3 e D3).

 Discussão

A placenta bovina é um órgão que, após a descelularização, pode ser utilizado como fonte de biomaterial, principalmente scaffolds vasculares. Mesmo após o processo de descelularização, tanto os cotilédones13 quanto a membrana corioalantoide14 mantiveram sua estrutura e composição da matriz extracelular preservadas. Aqui produzimos vasos descelularizados com estrutura e manutenção da elastina, mesmo em vasos de pequeno diâmetro. Além disso, esses vasos descelularizados apresentavam citocompatibilidade com células precursoras endoteliais (células SV e SV-VEGF) e os resultados morfológicos e comportamentais dessas linhagens celulares já haviam sido descritos e permanecem de acordo com os apresentados pela recelularização em outros biomateriais, conforme demonstrado por Fratini et al.15

Ademais, outra alternativa para o uso desse vaso descelularizado é sua digestão para produzir biogéis ricos em colágeno, que podem ser usados para produzir vasos de bioengenharia com diâmetros e tamanhos diferentes.6,16,17

 Conclusão

Os vasos da placenta bovina podem produzir biomateriais descelularizados viáveis e citocompatíveis que podem ser uma fonte de biomateriais vasculares estruturalmente naturais, bem como perspectivas futuras para vasos de bioengenharia.

 Agradecimentos

Todas as imagens de microscópio tiveram o apoio do Centro Avançado em Diagnóstico por Imagem (CADI-FMVZ-USP).

 Referências 1. Malta DC, Silva Jr JB. Brazilian Strategic Action Plan to Combat Chronic Non-Communicable Diseases and the global targets set to confront these diseases by 2025: A Review. Epidemiol Ser Saúde. 2013;22(1):151-64. doi: 10.5123/S1679-49742013000100016. Malta DC Silva JB Jr Brazilian Strategic Action Plan to Combat Chronic Non-Communicable Diseases and the global targets set to confront these diseases by 2025: A Review Epidemiol Ser Saúde 2013 22 1 151 164 10.5123/S1679-49742013000100016 2. Brasil. Plano de Ações Estratégicas para o Enfrentamento das Doenças Crônicas Não Transmissíveis (DCNT) no Brasil 2011-2022. Brasília: Ministério da Saúde; 2011. Brasil Plano de Ações Estratégicas para o Enfrentamento das Doenças Crônicas Não Transmissíveis (DCNT) no Brasil 2011-2022 Brasília Ministério da Saúde 2011 3. World Health Organization. Global Status Report on Noncommunicable Diseases 2010. Genova: World Health Organization; 2011. World Health Organization Global Status Report on Noncommunicable Diseases 2010 Genova World Health Organization 2011 4. Imada BC, Chen SR. Regional Vascular Anatomy. In: Gilani R,Mills JL Sr, editors. Vascular Complications of Surgery and Intervention. New York: Springer; 2022. p. 3-35. Imada BC Chen SR Regional Vascular Anatomy Gilani R Mills JL editors Vascular Complications of Surgery and Intervention New York Springer 2022 3 35 5. Bertanha M. Perspectivas de Uso de Células-Tronco em Cirurgia Vascular. J Vasc Bras. 2016;15(3):173-5. doi: 10.1590/1677-5449.006516. Bertanha M Perspectivas de Uso de Células-Tronco em Cirurgia Vascular J Vasc Bras 2016 15 3 173 175 10.1590/1677-5449.006516 6. Kolesky DB, Homan KA, Skylar-Scott MA, Lewis JA. Three-Dimensional Bioprinting of Thick Vascularized Tissues. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113(12):3179-84. doi: 10.1073/pnas.1521342113. Kolesky DB Homan KA Skylar-Scott MA Lewis JA Three-Dimensional Bioprinting of Thick Vascularized Tissues Proc Natl Acad Sci USA 2016 113 12 3179 3184 10.1073/pnas.1521342113 7. Debbi L, Zohar B, Shuhmaher M, Shandalov Y, Goldfracht I, Levenberg S. Integrating Engineered Macro Vessels with Self-Assembled Capillaries in 3D Implantable Tissue for Promoting Vascular Integration In-Vivo. Biomaterials. 2022;280:121286. doi: 10.1016/j.biomaterials.2021.121286. Debbi L Zohar B Shuhmaher M Shandalov Y Goldfracht I Levenberg S Integrating Engineered Macro Vessels with Self-Assembled Capillaries in 3D Implantable Tissue for Promoting Vascular Integration In-Vivo Biomaterials 2022 280 121286 10.1016/j.biomaterials.2021.121286 8. Moore MJ, Tan RP, Yang N, Rnjak-Kovacina J, Wise SG. Bioengineering Artificial Blood Vessels from Natural Materials. Trends Biotechnol. 2022;40(6):693-707. doi: 10.1016/j.tibtech.2021.11.003. Moore MJ Tan RP Yang N Rnjak-Kovacina J Wise SG Bioengineering Artificial Blood Vessels from Natural Materials Trends Biotechnol 2022 40 6 693 707 10.1016/j.tibtech.2021.11.003 9. Solis DM, Czekanski A. 3D and 4D Additive Manufacturing Techniques for Vascular-Like Structures – A Review. Bioprinting. 2022;25: e00182. Solis DM Czekanski A 3D and 4D Additive Manufacturing Techniques for Vascular-Like Structures – A Review Bioprinting 2022 25 e00182 10. Novosel EC, Kleinhans C, Kluger PJ. Vascularization is the Key Challenge in Tissue Engineering. Adv Drug Deliv Rev. 2011;63(4-5):300-11. doi: 10.1016/j.addr.2011.03.004. Novosel EC Kleinhans C Kluger PJ Vascularization is the Key Challenge in Tissue Engineering Adv Drug Deliv Rev 2011 63 4-5 300 311 10.1016/j.addr.2011.03.004 11. Fratini P, Carreira AC, Alcântara D, Oliveira e Silva FM, Rodrigues MN, Miglino MA. Endothelial Differentiation of Canine Yolk Sac Cells Transduced with VEGF. Res Vet Sci. 2016;104:71-6. doi: 10.1016/j.rvsc.2015.11.010. Fratini P Carreira AC Alcântara D Oliveira e Silva FM Rodrigues MN Miglino MA Endothelial Differentiation of Canine Yolk Sac Cells Transduced with VEGF Res Vet Sci 2016 104 71 76 10.1016/j.rvsc.2015.11.010 12. Olerup O, Zetterquist H. HLA-DR Typing by PCR Amplification with Sequence-Specific Primers (PCR-SSP) in 2 Hours: An Alternative to Serological DR Typing in Clinical Practice Including Donor-Recipient Matching in Cadaveric Transplantation. Tissue Antigens. 1992;39(5):225-35. doi: 10.1111/j.1399-0039.1992.tb01940.x. Olerup O Zetterquist H HLA-DR Typing by PCR Amplification with Sequence-Specific Primers (PCR-SSP) in 2 Hours: An Alternative to Serological DR Typing in Clinical Practice Including Donor-Recipient Matching in Cadaveric Transplantation Tissue Antigens 1992 39 5 225 235 10.1111/j.1399-0039.1992.tb01940.x 13. Barreto RDSN, Romagnolli P, Mess AM, Miglino MA. Decellularized Bovine Cotyledons May Serve as Biological Scaffolds with Preserved Vascular Arrangement. J Tissue Eng Regen Med. 2018;12(4):e1880-e1888. doi: 10.1002/term.2618. Barreto RDSN Romagnolli P Mess AM Miglino MA Decellularized Bovine Cotyledons May Serve as Biological Scaffolds with Preserved Vascular Arrangement J Tissue Eng Regen Med 2018 12 4 e1880 e1888 10.1002/term.2618 14. Ballesteros AC, Puello HRS, Lopez-Garcia JA, Bernal-Ballen A, Mosquera DLN, Forero DMM, et al. Bovine Decellularized Amniotic Membrane: Extracellular Matrix as Scaffold for Mammalian Skin. Polymers. 2020;12(3):590. doi: 10.3390/polym12030590. Ballesteros AC Puello HRS Lopez-Garcia JA Bernal-Ballen A Mosquera DLN Forero DMM et al Bovine Decellularized Amniotic Membrane: Extracellular Matrix as Scaffold for Mammalian Skin Polymers 2020 12 3 590 10.3390/polym12030590 15. Fratini P, Rigoglio NN, Matias GSS, Carreira ACO, Rici REG, Miglino MA. Canine Placenta Recellularized Using Yolk Sac Cells with Vascular Endothelial Growth Factor. Biores Open Access. 2018;7(1):101-6. doi: 10.1089/biores.2018.0014. Fratini P Rigoglio NN Matias GSS Carreira ACO Rici REG Miglino MA Canine Placenta Recellularized Using Yolk Sac Cells with Vascular Endothelial Growth Factor Biores Open Access 2018 7 1 101 106 10.1089/biores.2018.0014 16. Choudhury D, Tun HW, Wang T, Naing MW. Organ-Derived Decellularized Extracellular Matrix: A Game Changer for Bioink Manufacturing? Trends Biotechnol. 2018;36(8):787-805. doi: 10.1016/j.tibtech.2018.03.003. Choudhury D Tun HW Wang T Naing MW Organ-Derived Decellularized Extracellular Matrix: A Game Changer for Bioink Manufacturing? Trends Biotechnol 2018 36 8 787 805 10.1016/j.tibtech.2018.03.003 17. Pati F, Jang J, Ha DH, Won Kim S, Rhie JW, Shim JH, et al. Printing Three-Dimensional Tissue Analogues with Decellularized Extracellular Matrix Bioink. Nat Commun. 2014;5:3935. doi: 10.1038/ncomms4935. Pati F Jang J Ha DH Won Kim S Rhie JW Shim JH et al Printing Three-Dimensional Tissue Analogues with Decellularized Extracellular Matrix Bioink Nat Commun 2014 5 3935 10.1038/ncomms4935

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de doutorado de Tarley Santos Oliveira pela Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.

Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (bolsa FAPESP nº 2014/50844-3) e parcialmente financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior.

 Original Article Decellularized Vascular Scaffolds Derived from Bovine Placenta Blood Vessels Oliveira Tarley Santos Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data and Writing of the manuscript Acquisition of data 1 0000-0001-6405-388X Smirnow Igor Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data and Writing of the manuscript Acquisition of data 1 Santee Kadija Mohamed Acquisition of data 1 0000-0003-4979-115X Miglino Maria Angelica Obtaining financing 1 0000-0001-5240-6959 Barreto Rodrigo da Silva Nunes Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data and Writing of the manuscript Acquisition of data Obtaining financing Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 Brasil Departamento de Cirurgia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP – Brasil Mailing Address: Rodrigo da Silva Nunes Barreto • Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Universidade Estadual Paulista (FCAV-UNESP) - Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane s/n. Postal Code 14884-900, Jaboticabal, SP – Brazil E-mail: rodrigo.barreto@unesp.br

Potential conflict of interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Background

Diseases associated with the circulatory system are the main causes of worldwide morbidity and mortality, implying the need for vascular implants. Thus, the production of vascular biomaterials has proven to be a promising alternative to therapies used in studies and research related to vascular physiology.

Objectives

The present project aims to achieve the artificial development of blood vessels through the recellularization of vascular scaffolds derived from bovine placental vessels.

 Methods

The chorioallantoic surface of the bovine placenta was used to produce decellularized biomaterials. For recellularization, 2.5 x 104 endothelial cells were seeded above each decellularized vessel fragment during three or seven days, when culture were interrupted, and the fragments were fixed for cell attachment analysis. Decellularized and recellularized biomaterials were evaluated by basic histology, scanning electron microscopy, and immunohistochemistry.

 Results

The decellularization process produced vessels that maintained natural structure and elastin content, and no cells or gDNA remains were observed. Endothelial precursor cells were also attached to lumen and external surface of the decellularized vessel.Conclusion: Our results show a possibility of future uses of this biomaterial in cardiovascular medicine, as in the development of engineered vessels.

 Decellularized Extracellular Matrix Bioengineering Blood Vessels Introduction

Noncommunicable diseases (NCDs) have been increased mainly due to a sedentary lifestyle, industrial food, high-calorie intake, alcohol, and tobacco consumption. Among NCDs, those related to the circulatory system’s failure are the main causes of worldwide morbidity and mortality.1 This failure is mainly treated by vascular surgery and viable vessels are needed, which are generally derived from autologous peripheral vessel dissection and implantation in the affected site. However, commonly infectious complications, necrosis, and dehiscence are described at the vessel removal site. In some cases, a stent is placed in the injured vessel instead of a peripheral vessel fragment; however, possible complications include fractures and intimal hyperplasia.4,5

In this scenario, significant advances have been made by bioengineering in the production of new functional or functionalized organs, such as engineered blood vessel development to support functional vascularization.6-8 So far, small-scale vessels have been produced, most of which are formed from derivatives of rigid synthetic polymers.6,9 Otherwise, engineered vessels that maintain their structural and cellular function for long periods have not yet been produced.

Thus, the development of vascular biomaterials by recellularization, and especially by bioprinting, have proven to be promising alternatives to support therapies used in diseases and studies related to vascular physiology.9,10 The present study thus aimed to produce vascular biomaterials derived from decellularized bovine placental vessels that could be used as its natural tridimensional structure or as biogels.

 Materials and Methods Sample and cells

For vessel isolation, bovine placenta, with an estimated age of 270 days of pregnancy, was obtained at a slaughterhouse. For cytocompatibility assays, two endothelial progenitor cells were used: canine yolk sac (SV) and canine yolk sac cells with vascular endothelial growth factor (VEGF) and enhanced green fluorescent protein (eGFP) overexpression (SV-VEGF).11 All experiments were approved by the Committee on Ethics in the Use of Animals of the Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science at the University of São Paulo, logged under protocol number 9715100718.

 Decellularization protocol

The chorioallantoic surface of the bovine placenta was used to produce decellularized biomaterials. The chorioallantois was individualized and the umbilical arteries cannulated with #14 catheters and attached to the ORCA bioreactor (Harvard Aparattus, USA). Initially, perfusion was performed with a phosphate buffer solution (PBS: 136.9 mM NaCl, 26.8 mM KCl, 14.7 MM KH2PO4, and 8.1 mM Na2HPO4.7H2O; pH 7.2) with a constant volume of 0.5 ml/min until complete cleaning of the vascular system, approximately 24 hours. A 0.01% solution of sodium dodecyl sulfate (SDS, Sigma-Aldrich 11767289001) was then perfused in distilled water, also under 0.5ml/min for 24 hours. Subsequently the solution was changed to 0.1% SDS for two days, to 0.25% for one day, to 0.5% for 1 day, and to 1.0% for one day, respectively. The decellularized chorioallantois was then perfused with 1% Triton X-100 (#0694-1L, Amresco-Solon, USA) for three hours. Finally, it was washed with PBS for 24 hours, making a total of 10 days.

After decellularization, the entire vascular system from the allantochorionic surface was isolated from the cotyledon and the membrane. The vessels were then preserved in 4% paraformaldehyde (PFA) for decellularization validation or snap frozen for cytocompatibility assay and hydrogel production.

 Decellularization validation

For decellularization validation by histological analysis, the PFA preserved samples were routinely dehydrated, diaphanized, and paraffin embedded. These were then sectioned using a manual microtome (Leica RM2125 RT) into 5 µm thick slices and transferred to histological slides. To verify the absence of visible cell nuclei, the slides were stained in Hematoxylin and Eosin (H&E) or 4’,6’-diamino-2-fenil-indol (DAPI) stained and observed under a Nikon Eclipse 80l microscope under light or epifluorescence, respectively.

The decellularization validation was also performed by quantifying the remaining genomic deoxyribonucleic acid (gDNA), which was extracted by salt precipitation, adapted from Olerup and Zetterquist,12 as described by Barreto et al.13

 Recellularization assay

First, decellularized vessel fragments of 4 cm were sterilized by washing with PBS supplement with 2% antibiotics (penicillin and streptomycin), followed by a 70% alcohol bath and ultraviolet (UV) light.

For recellularization, 2.5 x 104 SV cells or 2.5 x 104 SV-VEGF cells were seeded above each decellularized vessel fragment for three or seven days, when the cultures were interrupted and the fragments were fixed for cell attachment analysis. Culture was performed with alpha minimum essential medium (α-MEM) (LGC Biotechnology), supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% streptomycin/penicillin antibiotic, under 37°C and 5% CO2.

 Recellularization validation

To verify cell attachment, some recellularized vessel fragments were DAPI stained and observed under laser confocal microscope (Olympus Fluo View 1000 - FV1000). Other fragments were fixed in Karnovsky (4% PFA and 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer at pH 7.2) and then post-fixed in 1% osmium tetroxide (SEM R 148- HATFIELD, USA) for 90 minutes. These were then dehydrated in an increasing series of Ethanol under agitation, passed through an automated drying process (MSCPD 300, Leica), and metallized with gold (#K550, Emitech-Ashford, UK). Immunohistochemistry was also performed13 to verify elastin on the vessel wall and VEGF from the SV-VEGF cell line.

 Results

After decellularization, no visible nuclei were observed in the vessel fragments, neither by hematoxylin and eosin (HE) nor by DAPI stains (Central Illustration - D2). Moreover, less than 50 ng of gDNA per mg of the decellularized vessel was quantified (Figure 1). Regarding the conservation of the vascular arrangement of the bovine placenta vessels, it was observed, even in vessels up to 5 mm in diameter (Figure 1-F), viewed through scanning electron microscopy, that the decellularized vessels showed structural maintenance and a porous lumen (Central Illustration – A4).

: Decellularized Vascular Scaffolds Derived from Bovine Placenta Blood Vessels Analysis of decellularized bovine placental vessel. Hematoxylin eosin, (A1) Native vessel, Bar= 20 μm, (^) lumen: extracellular matrix fibers stained in pink and cell nucleus in purple; (B1) Decellularized, Bar= 20 μm,(*) external surface: absent cell nuclei; (C-F1) Recellularized, Bar= 20 μm, (*) external surface: (C1), Recellularized three days (SV line), cell nuclei stained in purple adhered to the external surface of the biomaterial; (D1), Recellularized three days with canine yolk sac cells with vascular endothelial growth factor (VEGF) and enhanced green fluorescent protein (eGFP) overexpression (SV-VEGF lineage), extracellular matrix fibers stained in pink and cell nuclei in purple adhered to the external surface of the biomaterial; (E1), Recellularized seven days canine yolk sac cells (SV-lineage), cell nuclei stained in purple adhered to the external surface of the biomaterial; (F1), Recellularized seven days with cells (SV-VEGF lineage), extracellular matrix fibers stained in pink, cell nuclei in purple adhered to the external surface of the biomaterial. (A4) bar = 2 μm, decellularized: Observe preservation of fibers of the extracellular matrix of the vascular biomaterial; Recellularization with three days of culture (B4, C4): (B4) bar = 30 μm, with SV cells adhered to the vascular biomaterial wall; (C4) bar = 10 μm, SV-VEGF cells adhered to the vascular biomaterial wall. Immunohistochemistry assay: elastin expression in the vascular biomaterial of the native bovine chorioallantoic surface, and recellularized with SV-VEGF cells. Caption: Bar=20 µm, (A3) native blood vessel of the chorioallantoic surface of the bovine placenta, observe elastin expression in the entire vascular wall; (B3) native blood vessel from the chorioallantoic surface of the bovine placenta, negative control stained with hematoxylin; (C3) 7-day recellularization of bovine placental vascular biomaterial with SV-VEGF cells, observing elastin expression in the entire vascular wall; (D3) 7-day recellularization of bovine placental vascular biomaterial with SV-VEGF cells, negative control stained with hematoxylin. Recellularizarion assay: Bar 20 µm ; (A2-C2) 3 days of cultivation; (A2) decellularized control vascular biomaterial, observe absent nuclei; (B2) biomaterial recellularized with canine yolk sac endothelial progenitor cells (SV), observe nuclei stained in blue by 4’,6’-diamino-2-fenil-indol (DAPI); (C2) recellularized biomaterial with SV-VEGF cells, observe nuclei stained blue by DAPI, eGFP not observed; (D2-F2) 7 days of cultivation; (D2) vascular biomaterial decellularized control, observe absent nuclei; (E2) biomaterial recellularized with SV cells, observe nuclei stained in blue by DAPI; (F2) Biomaterial recellularized with SV-VEGF cells, observe nuclei stained in blue by DAPI.

– Decellularization of the bovine placenta vessels: A: bar = 10 cm, placenta dissected, and umbilical artery and vein cannulated. B: bar = 10 cm, beginning of the decellularization process. C-E: bar = 10 cm, progression of decellularization. F: bar = 10 cm, completion of decellularization, with maintenance of the structure. G: genomic deoxyribonucleic acid (gDNA) in the vascular scaffolds of the chorioallantoic surface of the decellularized bovine placenta.

After recellularization, even on day three of the culture, it was possible to observe the cells on the decellularized vessel surface and lumen; however, visually, the number of cells increased on day seven. The SV-VEGF cells were also more numerous than the SV cells, both on day three and seven. Those cells were observed both by HE and DAPI stains (Central Illustration – D1 and F2).

The elastin distribution pattern was similar in native, decellularized, and recellularized placental vessels (Central Illustration – A3, B3 and D3).

 Discussion

Bovine placenta is an organ that, after decellularization, can be used as a source of biomaterial, especially vascular scaffolds. Even after the decellularization process, both the cotyledons,13 as well as the chorioallantoic membrane,14 maintained their structure and extracellular matrix composition preserved. Here, we produced decellularized vessels with structure and elastin maintenance, even in small diameter vessels. Those decellularized vessels had cytocompatibility with endothelial precursor cells (SV and SV-VEGF cells), and the morphological and behavioral results of these cell lines had already been described and remain in accordance with those presented by recellularization in other biomaterials, as demonstrated by Fratini et al.15

Furthermore, another alternative to use this decellularized vessel is its digestion to produce biogels that are rich in collagen and can be used to produce bioengineered vessels with different diameters and sizes.6,16,17

 Conclusion

The bovine placenta vessels can produce viable and cytocompatible decellularized biomaterials that can be a source of structurally natural vascular biomaterials, as well as future prospects for bioengineered vessels.

 Acknowledgements

All microscope imaging was supported by the Advanced Center of Image Diagnosis (CADI-FMVZ-USP).

Study association

This article is part of the thesis of doctoral submitted by Tarley Santos Oliveira, from Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.

Sources of funding: This study was funded by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP number 2014/50844-3) and partially funded by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior.