Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC qB7BtKsHk6GnPrdV9DLq3gJ S0066-782X2023000600308 00308 10.36660/abc.20220770 Artigo Original Consumo de Frutose Altera Aminas Biogênicas Associadas a Fatores de Risco Cardiovasculares 0000-0003-2910-4308 Francisqueti-Ferron Fabiane Valentini Concepção e desenho da pesquisa,Obtenção de dados,Análise e interpretação dos dados,Análise estatística,Redação do manuscrito,Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 0000-0002-1656-405X Belin Matheus Antônio Filiol Obtenção de dados 1 Palacio Thiago Luiz Novaga Obtenção de dados 1 0000-0001-7089-3033 Ferron Artur Junio Togneri Obtenção de dados,Análise e interpretação dos dados,Análise estatística 1 0000-0002-3670-243X Garcia Jéssica Leite Obtenção de dados 1 0000-0003-3172-2199 Siqueira Juliana Silva Obtenção de dados 1 Nakandakare-Maia Erika Tiemi Obtenção de dados 1 Vieira Taynara Aparecida Obtenção de dados 1 Kano Hugo Tadashi Obtenção de dados 1 Moreto Fernando Obtenção de dados 1 Lima Giuseppina Pace Pereira Concepção e desenho da pesquisa,Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 0000-0001-8493-5329 Corrêa Camila Renata Concepção e desenho da pesquisa,Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 0000-0002-9922-2871 Minatel Igor Otavio Concepção e desenho da pesquisa,Obtenção de dados,Análise e interpretação dos dados,Redação do manuscrito,Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 1 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho Faculdade de Medicina Botucatu SP Brasil Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho Câmpus de Botucatu Faculdade de Medicina, Botucatu, SP – Brasil Correspondência: Fabiane Valentini Francisqueti-Ferron • Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho Câmpus de Botucatu Faculdade de Medicina – Av. Prof. Mario Rubens Guimarães Montenegro, s/n. CEP 18618-970, Botucatu, SP - Brasil E-mail: fabiane_vf@yahoo.com.br

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo

 19 06 2023 05 2023 120 6 e20220770 09 11 2022 06 02 2023 05 04 2023 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

As doenças cardiovasculares (DCV) são a principal causa de mortalidade do mundo, e um de seus fatores de risco são os hábitos alimentares não saudáveis, tais como, o alto consumo de frutose. As aminas biogênicas (ABs) realizam funções importantes no corpo humano. Entretanto, o efeito do consumo de frutose nos níveis das ABs ainda não está claro, bem como a associação entre estes e os fatores de risco da DCV.

 Objetivo

Este estudo teve o objetivo de estabelecer a associação entre os níveis de ABs e os fatores de risco de DCV em animais que consumiram frutose.

 Métodos

Ratos Wistar machos receberam ração convencional (n=8) ou ração convencional + frutose na água de beber (30%) (n=8) durante 24 semanas. Ao final, foram analisados os parâmetros nutricionais e da síndrome metabólica (SM) e os níveis plasmáticos das ABs. Foi adotado um nível de significância de 5%.

 Resultados

O consumo de frutose levou à SM, reduziu os níveis de triptofano e 5-hidroxitriptofano e aumentou a histamina. Os níveis de triptofano, histamina e dopamina apresentaram correlação com parâmetros de síndrome metabólica.

 Conclusão

O consumo de frutose altera as ABs associadas a fatores de risco de doenças cardiovasculares.

 Poliaminas Síndrome Metabólica Doenças Cardiovasculares

: Consumo de Frutose Altera Aminas Biogênicas Associadas a Fatores de Risco Cardiovasculares O aumento do consumo de frutose leva a alterações em aminas biogênicas, que estão associadas a fatores de risco cardiovascular, tais como, diabetes tipo 2,hipertensão e dislipidemia.

Introdução

As doenças cardiovasculares (DCV) são a principal causa de morbidade e mortalidade tanto em países desenvolvidos quanto em desenvolvimento, e apresentam como principais fatores de risco dislipidemia, hipertensão, diabetes, obesidade abdominal, fatores psicossociais, consumo excessivo de álcool, falta de atividade física regular e hábitos alimentares pouco saudáveis.1 Um dos principais contribuintes para distúrbios metabólicos associados a DCV é a frutose, um açúcar simples naturalmente presente em frutas, vegetais e mel, que tem sido usado para indústrias alimentícias como adoçante desde a década de 1970. A literatura relata que o consumo crônico e excessivo de produtos industrializados contendo frutose está associado a diversos distúrbios metabólicos2 - 4 por mecanismos não totalmente compreendidos.

As aminas biogênicas (ABs) são compostos nitrogenados quimicamente categorizados como monoaminas, diaminas e poliaminas, que podem ser obtidos a partir de alimentos, síntese celular e/ou síntese microbiana no intestino, e estão presentes em todos os organismos vivos, desde bactérias até seres humanos.5 Entre todas as ABs, as mais comuns presentes no tipo de célula procariótica e eucariótica são putrescina, espermidina e espermina.6 Embora a primeira descrição das ABs remonte ao século XVII, só foram alcançados grandes avanços em seu metabolismo e funções na segunda metade do século passado.7

Vários experimentos mostraram que, devido à sua natureza policatiônica, as ABs podem se ligar a biomoléculas carregadas negativamente como DNA, RNA, proteínas e fosfolipídios. Esse comportamento pode modificar os mecanismos celulares de tradução, transcrição, transdução de sinal, proliferação e diferenciação celular, apoptose e resposta celular ao estresse.8 , 9 Todas essas modificações foram associadas a alguns distúrbios relacionados à idade, incluindo Alzheimer, câncer e DCV.5 Doenças crônicas e relacionadas à idade têm desequilíbrio inflamatório e oxidativo envolvido em sua patogênese, e esses processos podem ser influenciados pelos efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes exercidos por algumas ABs.10 No entanto, a associação entre ABs e DCV precisa ser elucidada.7

A participação do consumo de frutose nas DCV já é demonstrada pela literatura.2 - 4 , 11 , 12 Entretanto, o efeito do consumo de frutose nos níveis das ABs ainda é incerto, e sua associação com fatores de risco para DCV precisa ser esclarecida. Assim, este estudo teve como objetivo estabelecer a associação entre níveis de ABs e fatores de risco para DCV em animais que consumiram frutose.

 Materiais e métodos Protocolo experimental

Todos os experimentos e procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu (protocolo número 1065/2013) e realizados de acordo com o Guia do Instituto Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.13 Ratos Wistar machos (8 semanas de idade) foram alojados em gaiolas individuais por 24 semanas com condições ambientais controladas (22 °C ± 3 °C; ciclo claro-escuro de 12 horas e umidade relativa de 60 ± 5%). Os animais receberam ração convencional (grupo controle, n=8 animais) ou ração convencional + frutose na água de beber (30%) (grupo frutose, n=8 animais) ad libitum . Os animais de cada grupo foram convenientemente alocados de forma a obter o mesmo peso corporal inicial entre os grupos. O tamanho da amostra foi calculado usando SigmaStat para Windows versão 3.5 (Systat Software Inc., San Jose, CA, EUA) considerando as médias de diferença esperadas e desvio padrão esperado para fatores de risco de doença cardiovascular (resistência à insulina, pressão arterial sistólica e dislipidemia), poder de teste de 90% e α de 0,05. Portanto, o tamanho mínimo da amostra é de 6 animais/grupo. Ao final do experimento, foram excluídos deste estudo os animais dos grupos controle que desenvolveram alterações nos fatores de risco para DCV e os animais do grupo frutose que não apresentaram alterações nesses parâmetros. Portanto, cada grupo permaneceu com 8 animais.

 Parâmetros nutricionais

Os parâmetros nutricionais incluíram os seguintes: ingestão calórica, peso corporal final e índice de adiposidade. A ingestão calórica foi determinada pela multiplicação do valor energético da dieta pelo consumo alimentar diário (3,83 kcal x g consumido). A ingestão calórica para o grupo frutose também considerou as calorias provenientes da água (0,30 × 4 × mL consumidos). O peso corporal foi medido semanalmente. Após a eutanásia, os depósitos de gordura visceral (LAV), epididimal (TAE), e retroperitoneal (RAT) foram usados para calcular o índice de adiposidade (IA) pela seguinte fórmula: [(VAT+EAT+RAT)/FBW]×100 .14 , 15

Pressão arterial sistólica

A avaliação da pressão arterial sistólica (PAS) foi realizada em ratos conscientes pelo método não invasivo de manguito de cauda com um eletroesfigmomanômetro NarcoBioSystems® (International Biomedical, Austin, TX, EUA). Os animais foram mantidos em uma caixa de madeira (50 x 40 cm) entre 38–40 °C por 4–5 minutos para estimular a vasodilatação arterial.16 Após esse procedimento, um manguito com sensor de pulso pneumático foi fixado à cauda de cada animal. O manguito foi inflado até a pressão de 200 mmHg e, em seguida, esvaziado. Os valores da pressão arterial foram registrados em um polígrafo Gould RS 3200 (Gould Instrumental Valley View, Ohio, EUA). A média de três leituras de pressão foi registrada para cada animal.

 Análise metabólica e hormonal plasmática

Após 12h de jejum, o sangue foi coletado e o plasma foi utilizado para as análises seguintes. Um kit enzimático-colorimétrico foi usado para medir glicose e triglicerídeos (Bioclin®; Belo Horizonte) usando um sistema analisador enzimático automático (Chemistry Analyzer BS-200, Mindray Medical International Limited, Shenzhen, China). O nível de insulina foi medido usando o método de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) usando kits comerciais (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA). O modelo homeostático de resistência à insulina (HOMA-IR) foi utilizado como índice de resistência à insulina, calculado de acordo com a fórmula: HOMA-IR = (glicose em jejum (mmol/L) x insulina em jejum (μU/mL))/22,5 .

 Níveis de aminoácidos e ABs por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa

O plasma (200µL) foi misturado com 800µL de ácido perclórico frio 5% (v/v). Depois disso, a mistura foi centrifugada a 3800 g (Hettich Zentrifugen, Mikro220R) por 20 min a 4°C, e ao sobrenadante (200μl) foram adicionados 400μl de cloreto de dansila e 200μl de carbonato de sódio saturado (2M). Após incubação por 1h a 60°C, 200μl de prolina foram adicionados à mistura e mantidos no escuro por 30 min em temperatura ambiente. A essa mistura foram adicionados 1000μl de tolueno mal homogeneizado e o sobrenadante foi seco sob nitrogênio gasoso. As amostras foram ressuspensas em 0,5 mL de acetonitrila e 20µL foram injetados no sistema HPLC (Dionex UltiMate 3000; Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemanha) equipado com bomba quaternária, amostrador automático 3000, detector de arranjo de diodos (DAD-3000) e um ACE C18 coluna (4,6×250mm; 5um) a 25°C. A análise foi monitorada em 280 nm, e o pico de integração e as calibrações foram realizadas entre 210 e 350 nm usando o software Chromeleon 7 (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemanha). O gradiente do cromatógrafo foi estabelecido para uma mistura de solventes (A) 100% de acetonitrila e (B) 50% de acetonitrila, como segue: 0–2 min, 40% A + 60% B; 2–4 min, 60% A + 40% B; 4–8 min, 65% A + 35% B; 8–12 min, 85% A + 15% B; 12–15 min, 95% A + 5% B; 15–21 min, 85% A + 15% B; 21–22 min, 75% A + 25% B; 22–25 min, 40% A + 60% B. A quantidade de cada AB e aminoácido foi calculada comparando as áreas dos picos com os padrões e a área abaixo da curva obtida por meio de curvas de calibração.

 Análise estatística

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov. As variáveis paramétricas foram comparadas pelo teste t de Student não pareado e os resultados são relatados como média ± desvio padrão. As variáveis não paramétricas foram comparadas pelo teste de Mann-Whitney e os resultados são relatados como mediana (faixa interquartil (25-75)). A correlação de Spearman foi utilizada para avaliar a associação entre aminas biogênicas e fatores de risco para DCV. As análises estatísticas foram realizadas usando Sigma Stat para Windows versão 3.5 (Systat Software Inc., San Jose, CA, EUA). Um p valor <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

 Resultados

O peso corporal inicial foi semelhante entre os grupos (grupo controle= 258 ±16 g; grupo frutose= 257 ± 16g, p= 0,80). A figura 1 mostra os parâmetros avaliados em ambos os grupos e associados a maior risco de DCV. É possível notar que o grupo frutose apresentou níveis elevados de pressão arterial sistólica, HOMA-IR e triglicerídeos. Não foram observadas alterações na ingestão calórica, peso corporal final, índice de adiposidade e glicose plasmática.

– Fatores de risco para DCV. A) Ingestão calórica (kcal/dia); B) Peso corporal final (g); C) Índice de adiposidade (%); D) Glicose (mg/dl); E) Modelo homeostático de resistência à insulina (HOMA-IR); F) Pressão arterial sistólica (mmHg); G) Níveis de triglicerídeos (mg/dL). Comparação pelo teste T de Student (p<0,05 como significativo).

Os níveis plasmáticos de aminoácidos e ABs são apresentados na tabela 1 . O consumo de frutose reduziu os níveis plasmáticos de triptofano e 5-hidroxitriptofano (5-HTP) e aumentou os níveis de histamina. Não foram observadas alterações para as demais ABs.

– Níveis de aminoácidos e aminas biogênicas
Controle Frutose p valor
Triptofano (µg/mL) 25,5 (24,8, 26,3) 18,4 (16,7, 19,6) 0,003*
5-HTP (µg/mL) 120 (113 - 123) 82,0 (79,0, 88,1) 0,002*
Triptamina (µg/mL) 200 (178 - 245) 192 (166 - 207) 0,996
Agmatina (µg/mL) 3,45 (2,66, 4,52) 3,28 (2,67, 4,04) 1,00
Putrescina (µg/mL) 343 (221 - 343) 257 (215 - 297) 0,310
Histamina (µg/mL) 5,00 (3,84, 6,32) 16,0 (16,0, 17,8) <0,001*
Tiramina (µg/mL) 17,5 (16,0, 19,4) 21,8 (19,1, 26,3) 0,053
Espermidina (µg/mL) 8,99 (7,75, 11,0) 11,2 (10,5, 11,5) 0,143
Dopamina (µg/mL) 2,30 (1,31, 2,34) 2,70 (2,54, 3,54) 0,132
Espermina (µg/mL) 1,10 (1,04, 1,27) 0,65 (0,59, 0,67) 0,052

Os dados foram expressos como mediana (faixa interquartil). Comparação pelo teste de Mann-Whitney (*p<0,05 considerado significativo). Os valores em negrito representam diferenças estatísticas significativas entre os grupos de frutose e de controle. 5-HTP - 5-hidroxitriptofano

A Tabela 2 apresenta a correlação de Spearman entre os aminoácidos e ABs e os fatores de risco cardiovascular. É possível verificar que os níveis de 5-HTP correlacionaram-se negativamente com insulina, HOMA-IR e triglicerídeos. Os níveis de histamina foram positivamente correlacionados com insulina, HOMA-IR e triglicerídeos. Os níveis de dopamina foram positivamente correlacionados ao HOMA-IR.

– Correlação de Spearman entre as variáveis

PAS: pressão arterial sistólica; TG: triglicerídeos. Valores vermelhos indicam correlação positiva e valores azuis indicam correlação negativa. Quanto mais intensa a cor, maior a correlação. Os valores em negrito mostram os resultados significativos (p<0,05). 5-HTP - 5-hidroxitriptofano.

 Discussão

O objetivo deste estudo foi estabelecer a associação entre ABs e os fatores de risco para DCV em animais que consumiram frutose. A frutose é um açúcar comumente encontrado em frutas. No entanto, a indústria tem utilizado o xarope de milho, rico em frutose, como adoçante para bebidas e alimentos, aumentando a ingestão desse açúcar pela população.3 O alto consumo de frutose pode levar ao aumento da obesidade e comorbidades relacionadas à obesidade, como dislipidemia, resistência à insulina, hipertensão e diabetes mellitus tipo II, todos fatores de risco para DCV.17 , 18 Dentro desse contexto, é possível verificar que a ingestão de frutose foi capaz de induzir dislipidemia, resistência à insulina e hipertensão nos animais, confirmando os efeitos negativos de seu consumo. Além disso, o grupo frutose apresentou diminuição dos níveis plasmáticos de triptofano e 5HTP e aumento dos níveis de histamina.

O triptofano é um aminoácido essencial para o ser humano envolvido em vias metabólicas cruciais que resultam em vários produtos finais, entre os quais as proteínas. O triptofano tem sido implicado em várias doenças e condições, incluindo DCV, devido ao seu papel fundamental como precursor de muitos metabólitos bioativos. Também foi demonstrado que o triptofano suprime os níveis séricos de glicose e insulina e inibe a absorção de glicose no intestino, sugerindo que esse aminoácido suprime a elevação dos níveis de glicose no sangue e reduz os efeitos adversos associados à insulina plasmática elevada.19 Algumas evidências indicam que o triptofano serve como fonte de nitrogênio para o crescimento de alguns microrganismos patogênicos no intestino, o que representa uma perturbação da microbiota intestinal. Essa condição também pode explicar os níveis reduzidos de triptofano no grupo da frutose. A disbiose intestinal tem sido associada a DCV, especialmente por alterar o metabolismo da glicose e lipídios e desencadear inflamação.20

O 5-HTP é produzido a partir do triptofano pela triptofano hidroxilase (TPH) e sua descarboxilação produz a serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT), um neurotransmissor monoamínico envolvido na modulação do humor, cognição, recompensa, aprendizado, memória, sono e vários outros processos fisiológicos.21 A serotonina intestinal tem diversas funções em sistemas neuronais e não neuronais, atuando como hormônio e mitógeno, além de neurotransmissor. A serotonina regula diversos processos fisiológicos e patológicos, que são mediados por inúmeros receptores, destacando-se o 5-HT2B que se expressa em tecidos periféricos como fígado, rim, coração e estômago. Está associada à função cardíaca, à doença cardíaca valvular, e à morfogênese cardíaca.22 Entretanto, embora muitas funções do 5-HPT ocorram nos tecidos, mais de 90% do 5-HTP corporal total são produzidos no intestino. A serotonina é liberada por células e neurônios enterocromafins e é regulada por meio do transportador de recaptação de serotonina (SERT), que está localizado nas células epiteliais e nos neurônios do intestino.23 No entanto, a literatura já relatou que alguns nutrientes, como a frutose, promovem danos à barreira intestinal e comprometimento do SERT, levando à translocação de lipopolissacarídeos (LPS). O comprometimento do SERT pode explicar os níveis mais baixos de 5-HTP nos animais que consumiram frutose. Além disso, a translocação do LPS está associada à inflamação, condição que explica as alterações metabólicas apresentadas pelo grupo frutose mesmo na ausência de obesidade.24 , 25 Outra explicação para níveis mais baixos de 5-HTP em baixos níveis de triptofano, uma vez que este aminoácido é substrato para sintetizar 5-HTP.26

A histamina é uma amina de baixo peso molecular sintetizada a partir da L-histidina exclusivamente pela histidina descarboxilase e produzida por várias células em todo o corpo. Participa da regulação de muitas funções fisiológicas, incluindo proliferação e diferenciação celular, hematopoiese, desenvolvimento embrionário e regeneração. No sistema nervoso central, afeta a cognição e a memória, a regulação do ciclo do sono e da vigília, a homeostase energética e endócrina. A histamina é um neurotransmissor bem conhecido envolvido em condições alérgicas e fisiológicas que podem regular as funções cardiovasculares.27 Os níveis plasmáticos aumentados de histamina foram significativamente correlacionados com os fatores de risco de doença cardíaca observados no grupo da frutose. No entanto, faltam estudos que avaliem os níveis de ABs em indivíduos com comprometimento metabólico decorrente da ingestão de frutose. Outras ABs analisadas, como a putrescina e a tiramina, embora não tenham apresentado correlação com fatores de risco cardíaco, poderiam estar potencializando a toxicidade da histamina ao interagir com as aminas oxidases e favorecer a absorção intestinal e diminuir a desintoxicação da histamina.7 No entanto, o grupo frutose apresentou menores teores de triptofano, o que pode ser explicado pela reação que pode ocorrer entre a frutose e proteínas e aminoácidos como o triptofano, levando à formação de um complexo frutose-triptofano que pode resultar na diminuição da qualidade da proteína devido à perda de resíduos de aminoácidos e diminuição da digestibilidade da proteína.28

Embora evidências substanciais tenham se acumulado sobre o metabolismo, receptores e transdução de sinal da histamina, a complexa inter-relação e interferência da histamina e os efeitos fisiológicos e patológicos precisam ser esclarecidos. Em humanos, a histamina desencadeia sintomas agudos devido à sua atividade muito rápida no endotélio vascular e nas células brônquicas e musculares lisas, levando a sintomas como rinite aguda, broncoconstrição, cólicas, diarreia ou vermelhidão cutânea e respostas exacerbadas.29 , 30 Apesar da alta variabilidade dos teores de ABs nos alimentos, a dieta ocidental moderna é caracterizada por quantidades excessivas de frutose. Essas grandes quantidades sobrecarregam o transportador de frutose nas células epiteliais intestinais, resultando em maiores quantidades de frutose não completamente absorvidas pela mucosa intestinal ou ainda, intolerância à frutose.31 A intolerância à frutose é uma das condições associadas a reações adversas à histamina, também conhecida como intolerância à histamina. É uma condição causada por um desequilíbrio entre a histamina liberada dos alimentos e a capacidade do organismo de degradar tal quantidade, levando a um aumento da concentração de histamina no plasma e ao surgimento de reações adversas.32 , 33 Essa condição de intolerância à frutose pode explicar os altos níveis de histamina encontrados no plasma de animais que consumiram frutose.34

Limitações do estudo

A limitação deste estudo é não avaliar as vias pelas quais as aminas biogênicas estão associadas a DCV.

 Conclusão

Em conclusão, este estudo mostrou que o consumo de frutose leva à resistência à insulina, aumento da pressão arterial sistólica e dislipidemia. Também foi demonstrado que a ingestão de frutose alterou os níveis de aminas biogênicas, principalmente por aumentar a histamina e reduzir os níveis de triptofano e 5-hidroxitriptofano, e essas alterações podem estar associadas a fatores de risco para DCV.

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Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Fontes de financiamento: O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

 Original Article Fructose Consumption Alters Biogenic Amines Associated with Cardiovascular Disease Risk Factors 0000-0003-2910-4308 Francisqueti-Ferron Fabiane Valentini Conception and design of the research,Acquisition of data,Analysis and interpretation of the data,Statistical analysis,Writing of the manuscript,Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 0000-0002-1656-405X Belin Matheus Antônio Filiol Acquisition of data 1 Palacio Thiago Luiz Novaga Acquisition of data 1 0000-0001-7089-3033 Ferron Artur Junio Togneri Acquisition of data,Analysis and interpretation of the data,Statistical analysis 1 0000-0002-3670-243X Garcia Jéssica Leite Acquisition of data 1 0000-0003-3172-2199 Siqueira Juliana Silva Acquisition of data 1 Nakandakare-Maia Erika Tiemi Acquisition of data 1 Vieira Taynara Aparecida Acquisition of data 1 Kano Hugo Tadashi Acquisition of data 1 Moreto Fernando Acquisition of data 1 Lima Giuseppina Pace Pereira Conception and design of the research,Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 0000-0001-8493-5329 Corrêa Camila Renata Conception and design of the research,Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 0000-0002-9922-2871 Minatel Igor Otavio Conception and design of the research,Acquisition of data,Analysis and interpretation of the data,Writing of the manuscript,Critical revision of the manuscript for important intellectual content 1 Brazil Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho Câmpus de Botucatu Faculdade de Medicina, Botucatu, SP – Brazil Mailing Address: Fabiane Valentini Francisqueti-Ferron • Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho Câmpus de Botucatu Faculdade de Medicina – Av. Prof. Mario Rubens Guimarães Montenegro, s/n. Postal Code 18618-970, Botucatu, SP - Brazil E-mail: fabiane_vf@yahoo.com.br

Potential conflict of interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background

Cardiovascular diseases (CVD) are the major cause of mortality worldwide, whose most prominent risk factor is unhealthy eating habits, such as high fructose intake. Biogenic amines (BAs) perform important functions in the human body. However, the effect of fructose consumption on BA levels is still unclear, as is the association between these and CVD risk factors.

 Objective

This study aimed to establish the association between BA levels and CVD risk factors in animals that consumed fructose.

 Methods

Male Wistar rats received standard chow (n=8) or standard chow + fructose in drinking water (30%) (n=8) over a 24-week period. At the end of this period, the nutritional and metabolic syndrome (MS) parameters and plasmatic BA levels were analyzed. A 5% level of significance was adopted.

 Results

Fructose consumption led to MS, reduced the levels of tryptophan and 5-hydroxitryptophan, and increased histamine. Tryptophan, histamine, and dopamine showed a correlation with metabolic syndrome parameters.

 Conclusion

Fructose consumption alters BAs associated with CVD risk factors.

 Polyamines Metabolic Syndrome Cardiovascular Diseases

: Fructose Consumption Alters Biogenic Amines Associated with Cardiovascular Disease Risk Factors Increased fructose intake leads to changes in biogenic amines, which are associated with cardiovascular risk factors, such as type 2 Diabetes, hypertension, and dyslipidemia.

Introduction

Cardiovascular diseases (CVD) are the major cause of morbidity and mortality in both developed and developing countries, presenting the main risk factors of dyslipidemia, hypertension, diabetes, abdominal obesity, psychosocial factors, excessive alcohol consumption, the lack of regular physical activity, and unhealthy eating habits.1One of the major contributors to metabolic disorders associated with cardiovascular disease is fructose, a simple sugar naturally present in fruits, vegetables, and honey, which has been used for food industries as a sweetener since the 1970s. The literature reports that the chronic and excessive consumption of industrialized products containing fructose is associated with several metabolic disorders2 - 4 by mechanisms that are not fully understood.

Biogenic amines (BAs) are nitrogenous compounds chemically categorized as monoamines, diamines, and polyamines, which can be obtained from food, cell synthesis, and/or microbial synthesis in the gut, and are present in all living organisms from bacteria to humans.5Among all BAs, the most common types, which appear in prokaryotic and eukaryotic cell types, are putrescine, spermidine, and spermine.6Although the first description of BAs dates back to the seventeenth century, major advances in their metabolism and functions were achieved only in the second part of the last century.7

Several experiments have shown that, due to their polycationic nature, BAs can bind into negatively charged biomolecules, such as DNA, RNA, proteins, and phospholipids. This behavior can modify a cell’s mechanism of translation, transcription, signal transduction, cell proliferation and differentiation, apoptosis, and cell stress response.8 , 9 All these modifications have been associated with some age-related disorders, including Alzheimer, cancer, and CVD.5Chronic and age-related diseases have an inflammatory and oxidative imbalance involved in their pathogenesis, and these processes may be influenced by the anti-inflammatory and antioxidant effects exerted for some BAs.10However, the association between BAs and CVDs needs to be elucidated.7

The participation of fructose consumption in cardiovascular diseases has already been demonstrated by the literature.2 - 4 , 11 , 12 However, the effect of fructose consumption on BA levels is still lacking, and its association with CVD risk factors needs to be clarified. Thus, this study aimed was to establish the association between BA levels and CVD risk factors in animals that consumed fructose.

 Material and methods Experimental Protocol

All the experiments and procedures were approved by the Animal Ethics Committee of Botucatu Medical School (protocol number 1065/2013) and were performed in accordance with the National Institute of Health’s Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.13Male Wistar rats (8 weeks old) were housed in individual cages for 24 weeks under environmentally controlled conditions (22 °C ± 3 °C; 12-h light-dark cycle and relative humidity of 60 ± 5%). Animals received standard chow (control group, n=8 animals) or standard chow + fructose in drinking water (30%) (fructose group, n=8 animals) ad libitum . Animals of each group were conveniently allocated in order to obtain the same initial body weight between the groups. The sample size was calculated by using SigmaStat for Windows Version 3.5 (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA) considering the means of expected difference and expected standard deviation for CVD risk factors (insulin resistance, systolic blood pressure, and dyslipidemia), a test power of 90%, and α of 0.05. Therefore, the minimum sample size was 6 animals/ group. At the end of the experiment, animals from control groups that developed changes in CVD risk factors and animals from the fructose group that did not show changes in these parameters were excluded from this study. Thus, each group remained with 8 animals.

 Nutritional Parameters

The nutritional parameters included the following parameters: caloric intake, final body weight, and adiposity index. Caloric intake was determined by multiplying the energy value of diet by the daily food consumption (3.83 kcal x g consumed). The caloric intake for the fructose group also considered the calories from water (0.30 × 4 × mL consumed). Body weight was measured weekly. After euthanasia, the visceral (VAT), epididymal (EAT), and retroperitoneal (RAT) fat deposits were used to calculate the adiposity index (AI) by the following formula: [(VAT+EAT+RAT)/FBW]×100 .14 , 15

Systolic blood pressure

The evaluation of systolic blood pressure (SBP) was assessed in conscious rats by the non-invasive tail-cuff method with a NarcoBioSystems®Electro-Sphygmomanometer (International Biomedical, Austin, TX, USA). The animals were kept in a wooden box (50 x 40 cm) between 38–40°C for 4–5 minutes to stimulate arterial vasodilation.16After this procedure, a cuff with a pneumatic pulse sensor was attached to the tail of each animal. The cuff was inflated to 200 mmHg pressure and subsequently deflated. The blood pressure values were recorded on a Gould RS 3200 polygraph (Gould Instrumental Valley View, Ohio, USA). The average of three pressure readings was recorded for each animal.

 Plasma metabolic and hormonal analysis

After 12h of fasting, blood was collected and plasma was used for the following analysis. An enzymatic- colorimetric kit was used to measure glucose and triglycerides (Bioclin®; Belo Horizonte) using an automatic enzymatic analyzer system (Chemistry Analyzer BS-200, Mindray Medical International Limited, Shenzhen, China). The insulin level was measured using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method using commercial kits (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA). The homeostatic model of insulin resistance (HOMA-IR) was used as an insulin resistance index, calculated according to the formula: HOMA-IR = (fasting glucose (mmol/L) x fasting insulin (μU/mL))/22.5 .

 Amino acids and BAs levels by reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC)

The plasma (200µL) was mixed with 800µL of cold perchloric acid 5% (v/v). The mixture was then centrifuged at 3800 g (Hettich Zentrifugen, Mikro220R) for 20 min at 4°C, and 400μl of dansyl chloride and 200μl of saturated sodium carbonate (2M) were added to the supernatant (200 μl). After incubation for 1 h at 60°C, 200μl of proline was added to the mixture and maintained in the dark for 30 min at room temperature. To this mixture was added 1000μl of toluene, strongly homogenated, and the supernatant was dried under gaseous nitrogen. The samples were resuspended in 0.5mL of acetonitrile and 20µL were injected into the HPLC system (Dionex UltiMate 3000; Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) equipped with quaternary pump, automatic sampler 3000, diode array detector (DAD-3000), and an ACE C18 column (4.6 × 250 mm; 5um) at 25°C. The analysis was monitored at 280nm, and the integration peak and calibrations were realized between 210 and 350nm using Chromeleon 7 software (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany). The chromatograph gradient was set to a mixture of solvents, (A) 100% acetonitrile and (B) 50% acetonitrile, as follows: 0–2 min, 40% A + 60% B; 2–4 min, 60% A + 40% B; 4–8 min, 65% A + 35% B; 8–12 min, 85% A + 15% B; 12–15 min, 95% A + 5% B; 15–21 min, 85% A + 15% B; 21–22 min, 75% A + 25% B; 22–25 min, 40% A + 60% B. The amount of each BA and amino acid was calculated by comparing the peak areas with standards and the area under the curve (AUC) obtained through calibration curves.

 Statistical analysis

The data were submitted to the Kolmogorov-Smirnov normality test. Parametric variables were compared by unpaired Student’s t-test, and the results are reported as mean ± standard deviation. Non-parametric variables were compared using the Mann-Whitney test, and the results were reported as median (interquartile range (25-75)). Spearman correlation was used to assess the association among biogenic amines and CVD risk factors. Statistical analyses were performed using Sigma Stat for Windows Version 3.5 (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA). A p value < 0.05 was considered statistically significant.

 Results

Initial body was similar between the groups (control group= 258 ±16 g; fructose group= 257 ± 16g, p= 0.80). Figure 1 shows parameters assessed in both groups and associated with a higher risk for CVD. It is possible to note that the fructose group presented high systolic blood pressure, HOMA-IR, and triglyceride levels. No changes were observed in caloric intake, final body weight, adiposity index, and plasmatic glucose.

– Cardiovascular disease (CVD) risk factors. A) Caloric intake (kcal/day); B) Final body weight (g); C) Adiposity index (%); D) Glucose (mg/dl); E) Homeostatic model of insulin resistance (HOMA-IR); F) Systolic blood pressure (mmHg); G) Triglyceride levels (mg/dL). Comparison conducted using the Student’s T test (p<0.05 considered significant).

Plasmatic levels of amino acids and BAs are presented in the Table 1 . The fructose consumption reduced the plasma levels of tryptophan and 5-hydroxytryptophan (5-HTP) and increased the levels of histamine. No changes were observed for the other BAs.

– Plasma amino acids and biogenic amines levels
Control Fructose p value
Tryptophan (µg/mL) 25.5 (24.8 – 26.3) 18.4 (16.7 - 19.6) 0.003*
5-HTP (µg/mL) 120 (113 - 123) 82.0 (79.0 - 88.1) 0.002*
Tryptamine (µg/mL) 200 (178 - 245) 192 (166 - 207) 0.996
Agmatine (µg/mL) 3.45 (2.66 - 4.52) 3.28 (2.67 - 4.04) 1.00
Putrescine (µg/mL) 343 (221 - 343) 257 (215 - 297) 0.310
Histamine (µg/mL) 5.00 (3.84 - 6.32) 16.0 (16.0 - 17.8) < 0.001*
Tyramine (µg/mL) 17.5 (16.0 - 19.4) 21.8 (19.1 - 26.3) 0.053
Spermidine (µg/mL) 8.99 (7.75 - 11.0) 11.2 (10.5 - 11.5) 0.143
Dopamine (µg/mL) 2.30 (1.31 - 2.34) 2.70 (2.54 - 3.54) 0.132
Spermine (µg/mL) 1.10 (1.04 - 1.27) 0.65 (0.59 - 0.67) 0.052

Data are presented as median (interquartile range). Comparison conducted using the Mann-Whitney test (*p<0.05 as significant). Bold values represent significative statistical differences between fructose and control groups. 5-HTP - 5-hydroxytryptophan.

Table 2 presents the Spearman Correlation among the amino acids and BAs and CVD risk factors. It is possible to verify that the levels of 5-HTP were negatively correlated with insulin, HOMA-IR and triglycerides. Histamine levels were positively correlated with insulin, HOMA-IR, and triglycerides. Dopamine levels were positively correlated with HOMA-IR.

– Spearman correlation among the variables

SBP: systolic blood pressure; TG: triglycerides. Red values indicate positive correlation and blue values indicate negative correlation. The more intense the color, the greater the correlation. Bold values show the significant results (p<0.05). 5-HTP - 5-hydroxytryptophan.

 Discussion

The aim of this study was to establish the association between BAs and CVD risk factors in animals that consumed fructose. Fructose is a sugar commonly found in fruits. However, the industry has used corn syrup, which is rich in fructose, as a sweetener for beverages and foods, increasing the intake of this sugar by the population.3High fructose consumption can lead to increased obesity and obesity-related comorbidities, such as dyslipidemia, insulin resistance, hypertension, and diabetes mellitus type II, all risk factors for CVD.17 , 18 Within this context, it is possible to verify that the fructose intake was able to induce dyslipidemia, insulin resistance, and hypertension in the animals, confirming the negative effects of its consumption. In addition, the fructose group showed decreased plasmatic levels of tryptophan and 5HTP, as well as increased levels of histamine.

Tryptophan is an essential amino acid for humans involved in crucial metabolic pathways that results in various end-products, among them proteins. Tryptophan has been found in various diseases and conditions, including CVD, because of its key role as a precursor of many bioactive metabolites. It was also demonstrated that tryptophan suppresses both serum glucose and insulin levels and inhibits glucose absorption from the intestine, suggesting that this amino acid suppresses the elevation of blood glucose levels and reduces the adverse effects associated with high plasm insulin.19Some evidence has indicated that tryptophan serves as a nitrogen source for the growth of some pathogenic microbes in the gut, which represents an intestinal microbiota perturbation. This condition may also explain the reduced tryptophan levels in the fructose group. Gut dysbiosis has been associated with CVD, especially by altering glucose and lipid metabolism and triggering inflammation.20

5-HTP is produced from tryptophan by tryptophan hydroxylase (TPH), and its decarboxylation yields serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT), a monoamine neurotransmitter involved in the modulation of mood, cognition, reward, learning, memory, sleep, and numerous other physiological processes.21Intestinal serotonin has diverse functions in neuronal and non-neuronal systems, by acting as a hormone and a mitogen, as well as a neurotransmitter. Serotonin regulates several physiological and pathological processes, which are mediated through numerous receptors, highlighting the 5- HT2B expressed in peripheral tissues including the liver, kidney, heart, and stomach. It is associated with cardiac function, valvular heart disease, and heart morphogenesis.22However, although many functions of 5-HTP occur in tissues, over 90% of the total body 5-HTP is produced in the gut. Serotonin is released by enterochromaffin cells and neurons, and is regulated via the serotonin re-uptake transporter (SERT), which is located on epithelial cells and neurons in the gut.23However, the literature has already reported that some nutrients, such as fructose, promote damage to intestinal barriers and an impairment of SERT, leading to lipopolysaccharide (LPS) translocation. The impairment of SERT can explain the lower levels of 5-HTP in the animals that consumed fructose. Moreover, LPS translocation is associated with inflammation, a condition that explains the metabolic changes presented by the fructose group even in the absence of obesity,24 , 25 which is another explanation for lower 5-HTP levels in low levels of tryptophan, since this amino acid is a substrate used to synthesize 5-HTP.26

Histamine is a low-molecular-weight amine synthesized from L-histidine exclusively by histidine decarboxylase and produced by various cells throughout the body. It participates in the regulation of many physiological functions, including cell proliferation and differentiation, hematopoiesis, embryonic development, and regeneration. In the central nervous system, it affects cognition and memory, the regulation of the cycles of sleeping and waking, as well as energy and endocrine homeostasis. Histamine is a well-known neurotransmitter involved in allergic and physiological conditions that can regulate cardiovascular functions.27The increased plasm levels of histamine were significantly correlated with CVD risk factors observed in the fructose group. However, there is a lack of studies evaluating BA levels in individuals with metabolic impairment arising from fructose intake. Other analyzed BAs, such as putrescine and tyramine, although these have presented no correlation with cardiac risk factors, could be enhancing the histamine toxicity by interacting with amine oxidases, thus favoring intestinal absorption and decreasing histamine detoxification.7However, the fructose group presented lower levels of tryptophan, which can be explained by the reaction that can occurs between fructose and proteins and amino acids, such as tryptophan, leading to a fructose-tryptophan complex that can be formed, which results in a decrease in protein quality due to the loss of amino acid residues and decreased protein digestibility.28

Although substantial evidence has accumulated on histamine metabolism, receptors, and signal transduction, the complex interrelationship and cross-talk by histamine and physiological and pathological effects needs to be clarified. In humans, histamine triggers acute symptoms due to its very rapid activity on vascular endothelium and bronchial and smooth muscle cells, leading to such symptoms as acute rhinitis, bronchoconstriction, cramping, diarrhea, or cutaneous weal and flare responses.29 , 30 Despite the high variability of the BA content in foods, the modern Western diet is characterized by excessive amounts of fructose. These large quantities overload the fructose transporter on the intestinal epithelial cells, resulting in larger amounts of fructose not completely absorbed by the intestinal mucosa, or even fructose intolerance.31Fructose intolerance is one of the conditions associated with adverse reactions to histamine, also known as histamine intolerance. It is a condition caused by an imbalance between the histamine released from food and the ability of the organism to degrade such an amount, leading to an increased concentration of histamine in plasma and the emergence of adverse reactions.32 , 33 This condition of fructose intolerance can explain the high levels of histamine found in the plasma of animals that consumed fructose.34

Study limitations

The limitation of this study is not evaluating the pathways by which biogenic amines are associated with cardiovascular diseases.

 Conclusion

In conclusion, this study showed that fructose consumption led to insulin resistance, increased systolic blood pressure and dyslipidemia. It was also demonstrated that the fructose intake altered biogenic amines levels, mainly by increasing histamine and reducing tryptophan and 5-hydroxytryptophan levels, and these changes may be associated with CVD risk factors.

Study association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Sources of funding: There were no external funding sources for this study.